CN117398524A - 用于sci神经元再生和轴突再生的复合水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于促进SCI后神经元再生和轴突再生的复合水凝胶及其制备方法，所述复合水凝胶由脊髓脱细胞基质dECM、胶质细胞源性神经营养因子GDNF、甲基丙烯酰化明胶GelMA和光交联引发剂LAP混合后进行光交联得到。复合水凝胶搭载间充质干细胞获得的再细胞化水凝胶，兼具各组分的优势，通过光交联原位成胶植入小鼠体内后抑制神经炎症反应、促进神经元再生和轴突再生，最终实现脊髓损伤后小鼠功能恢复。

Description

用于SCI神经元再生和轴突再生的复合水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料和组织工程技术领域，具体涉及一种用于SCI神经元再生和轴突再生的复合水凝胶及其制备方法。
背景技术
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是指脊髓或椎管末端神经受损后，受损平面以下的运动功能及感受功能受到不同程度的影响甚至完全丧失。临床上脊髓损伤主要分为两类：原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤是在损伤发生后不久导致的即时影响，例如创伤、出血、轴突截断、神经细胞体损伤、挫伤和血肿等。继发性损伤是指在原发性损伤基础上发生的多种因素参与的、序列性组织自毁性破坏的过程，主要因素包括：细胞凋亡、微循环障碍、小血管破裂出血和炎症等。在脊髓损伤中继发性损伤产生的组织破坏程度甚至会超过原发性损伤。然而，目前的治疗手段仅能针对相应病症表现进行缓解改善，无法彻底治愈SCI。因此，制备一种适宜的生物支架来联合干细胞以促进SCI后的组织修复是当务之急。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是来源于中胚层的一类非造血系统多能干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可由微环境中的细胞因子和生长因子等物质调控并诱导分化成不同功能的细胞，包括神经元和神经胶质细胞。骨髓间充质干细胞因为具有易于采集、易于保存和运输、无异体排斥、刺激组织再生、调节免疫功能等诸多优点而成为了神经修复与再生医学的研究热点。已有研究证明，骨髓间充质干细胞可以通过分化作用和旁分泌作用修复神经损伤并改善损伤部位的功能。
生物支架的制备是组织工程学研究的重要内容之一。脱细胞基质无免疫原性且具有优异的仿生性、生物相容性和细胞粘附性，可为细胞迁移、增殖、分化和生长提供适宜微环境，已被广泛用作组织工程的支架材料。由于这些优异特性，脱细胞基质材料在组织工程中常用作细胞培养的三维载体，用于促进器官或组织的修复再生。
胶质细胞源性神经营养因子(glial cell derived neurotrophic factor,GDNF)是一种在中枢神经系统中表达的营养因子，研究表明GDNF能有效地诱导脊髓固有轴突再生并促进中枢神经系统功能恢复，这使补充GDNF成为治疗神经系统疾病的一种有前途的治疗方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于SCI神经元再生和轴突再生的复合水凝胶及其制备方法。
本发明的第一方面，提供一种复合水凝胶，所述复合水凝胶由脊髓脱细胞基质dECM、胶质细胞源性神经营养因子GDNF、甲基丙烯酰化明胶GelMA和光交联引发剂LAP混合后进行光交联得到，其中，
LAP和GelMA的质量比为1∶5-1∶35；
GelMA和dECM的质量比为1∶1-10∶1；
dECM和GDNF的质量比为20∶1-200∶1。
本发明的复合水凝胶的孔径在50-90μm的范围内，该孔径有利于细胞粘附和增长，适宜于封装间充质干细胞。
在另一优选例中，LAP和GelMA的质量比为1∶15-1∶25，较佳为1∶20。
在另一优选例中，GelMA和dECM的质量比为3:1-8:1，较佳为5:1。
在另一优选例中，dECM和GDNF的质量比为50∶1-150∶1，较佳为100:1。
在另一优选例中，利用化学酶解法处理脊髓组织制备脊髓脱细胞基质dECM。
在另一优选例中，GDNF粉末纯度≥95％。
在另一优选例中，甲基丙烯酰化明胶GelMA中氨基取代度为20％-45％，较佳为25％-35％，更佳为30％。
本发明的第二方面，提供第一方面所述的复合水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
i.提供LAP溶液；
ii.将甲基丙烯酰化明胶GelMA溶解于LAP溶液中得到GelMA溶液；
iii.将脊髓脱细胞基质dECM溶解于GelMA溶液中得到dECM/GelMA溶液，将GDNF溶解于dECM/GelMA溶液得到水凝胶预聚溶液；或将脊髓脱细胞基质dECM与GDNF交联得到dECM-GDNF，随后将dECM-GDNF溶解于GelMA溶液中得到水凝胶预聚溶液；
iv.用蓝光照射上述预聚溶液40-90s，得到所述复合水凝胶。
在另一优选例中，复合水凝胶的制备方法包括以下步骤：
步骤1：利用化学酶解处理的脱细胞方法制备dECM，然后进行冷冻干燥，得到dECM粉末并对其灭菌。
步骤2：将泡沫状GelMA(氨基取代度为20％-45％)溶于LAP溶液中并搅拌至溶解，得到GelMA溶液。
步骤3：将dECM粉末溶于GelMA溶液中并搅拌均匀，得到dECM/GelMA溶液，将dECM/GelMA溶液加入含有GDNF粉末(纯度≧95％)的离心管中混合均匀得到预聚溶液；
或者，将脊髓脱细胞基质dECM粉末与GDNF粉末(纯度≧95％)在EDC交联液中交联得到dECM-GDNF；将dECM-GDNF溶解于GelMA溶液中并搅拌均匀，得到dECM-GDNF/GelMA预聚溶液。
步骤4：用蓝光照射上述预聚溶液40-90s，形成复合水凝胶。
在另一优选例中，dECM粉末的灭菌方式为紫外线照射24-48h或者钴源辐照灭菌，LAP溶液和GelMA溶液采用0.22μm针头式过滤器过滤除菌，且灭菌后的操作均为无菌操作。
在另一优选例中，利用以下步骤制备脊髓脱细胞基质dECM：
a)在振荡条件下进行化学酶解处理得到脱细胞基质：
dH2O处理5-10h、0.01-0.2g/ml脱氧胆酸钠处理12-24h、PBS处理30-80min、DNaseⅠ处理40-90min、PBS处理30-60min、dH2O处理2-6h、1v/v％-5v/v％Triton X-100处理1-4h、PBS处理30-60min、DNaseⅠ处理40-90min、PBS处理30-60min；
b)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脊髓脱细胞基质dECM。
在另一优选例中，利用以下步骤制备脊髓脱细胞基质dECM：
a)在振荡条件下进行化学酶解处理得到脱细胞基质：
dH2O处理6-8h、0.02-0.1g/ml脱氧胆酸钠处理14-20h、PBS处理40-60min、DNaseⅠ处理50-80min、PBS处理40-60min、dH2O处理3-5h、1v/v％-4v/v％Triton X-100处理2-3h、PBS处理40-60min、DNaseⅠ处理50-80min、PBS处理40-60min；
b)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脊髓脱细胞基质dECM。
在另一优选例中，所述LAP溶液为LAP的PBS溶液，浓度为0.0020-0.0075g/ml。
在另一优选例中，步骤ii)中，
将氨基取代度为20％-45％的甲基丙烯酰化明胶GelMA加入LAP溶液，于40-60℃烘箱内溶解20-50min得到GelMA溶液。
在另一优选例中，步骤iii)中，将脊髓脱细胞基质dECM加入GelMA溶液，于30-45℃下搅拌1-2h得到dECM/GelMA溶液。
在另一优选例中，步骤iii)中，将脊髓脱细胞基质dECM与GDNF通过EDC交联得到dECM-GDNF，将dECM-GDNF加入到GelMA溶液，于30-45℃下搅拌1-2h得到dECM-GDNF/GelMA预聚溶液。
在另一优选例中，步骤iii)中，将dECM/GelMA溶液加入含有GDNF粉末(纯度≧95％)的离心管中，混合5-30min得到水凝胶预聚溶液。
在另一优选例中，步骤iii)中，所述预聚溶液中LAP的含量为0.0020-0.0075g/ml。
在另一优选例中，步骤iii)中，所述预聚溶液中GelMA的含量为30-120mg/ml，较佳50mg/ml。
在另一优选例中，步骤iii)中，所述预聚溶液中dECM的含量为5-30mg/ml，较佳10mg/ml。
在另一优选例中，步骤iii)中，所述预聚溶液中GDNF的含量为1-1000μg/ml，较佳100μg/ml。
在另一优选例中，步骤iv)中，所述预聚溶液中dECM、GDNF、GelMA、LAP的含量分别为5-30mg/ml、1-1000μg/ml、30-120mg/ml、0.0020-0.0075g/ml。
本发明的第三方面，提供一种再细胞化水凝胶，包含第一方面所述的复合水凝胶以及间充质干细胞。
再细胞化水凝胶，组织或器官脱细胞后构建的细胞外基质水凝胶重新植入体外培养的细胞而再细胞化的体系。
在另一优选例中，再细胞化水凝胶MSC的含量为105-109cells/ml。
在另一优选例中，再细胞化复合水凝胶由脊髓脱细胞基质dECM、胶质细胞源性神经营养因子GDNF、间充质干细胞MSC和甲基丙烯酰化明胶GelMA在蓝光照射下通过光交联引发剂LAP引发光交联制得；
dECM和GDNF的质量比为20∶1-200∶1；
MSC的细胞含量为105-109cells/ml；
dECM和GelMA的质量比为1∶10-1∶1；
LAP和GelMA的质量比为1∶5-1∶35。
所述再细胞化水凝胶将脊髓脱细胞基质dECM与胶质细胞源性神经营养因子GDNF交联得到的dECM-GDNF，和骨髓间充质干细胞MSC，共同包覆在甲基丙烯酰化明胶GelMA中，该水凝胶是在蓝光照射下由光引发剂LAP引发交联制备得到的。在再细胞化复合水凝胶体系中MSC抑制神经炎症反应，dECM为细胞生存和生长提供适宜的微环境并诱导间充质干细胞向神经细胞分化，GDNF化学诱导轴突再生，GelMA为复合水凝胶提供适当的力学强度和光敏性。再细胞化水凝胶兼具各组分的优势，通过光交联原位成胶植入小鼠体内后抑制神经炎症反应、促进神经元再生和轴突再生，最终实现脊髓损伤后小鼠功能恢复。
所述再细胞化水凝胶的构建方法包括以下步骤：
步骤1：将MSC细胞悬液离心后弃去上清液，加入第二方面所述预聚溶液，得到再细胞化水凝胶预聚溶液。
步骤2：用蓝光照射上述再细胞化水凝胶预聚溶液40-90s，形成再细胞化水凝胶。
在另一优选例中，所述再细胞化水凝胶的制备方法包括以下步骤：
i.提供LAP溶液；
ii.将甲基丙烯酰化明胶GelMA溶解于LAP溶液中得到GelMA溶液；
iii.将脊髓脱细胞基质dECM溶解于GelMA溶液中得到dECM/GelMA溶液，将GDNF溶解于dECM/GelMA溶液得到水凝胶预聚溶液；或将脊髓脱细胞基质dECM与GDNF交联得到dECM-GDNF，随后将dECM-GDNF溶解于GelMA溶液中得到水凝胶预聚溶液；
iv将MSC细胞悬液离心后弃去上清液，加入所述水凝胶预聚溶液，得到再细胞化水凝胶预聚溶液；
v.用蓝光照射上述预聚溶液40-90s，得到所述再细胞化水凝胶。
在另一优选例中，步骤iv)中，所述预聚溶液中dECM、GDNF、MSC、GelMA、LAP的含量分别为5-30mg/ml、1-1000μg/ml、105-109cells/ml、30-120mg/ml、0.0020-0.0075g/ml。
在另一优选例中，所述再细胞化水凝胶的制备方法包括以下步骤：
步骤1：利用化学酶解法处理脊髓组织制备脱细胞脊髓，随后进行冷冻干燥，得到dECM并对其灭菌；
步骤2：将泡沫状GelMA(氨基取代度为20％-45％)加入到LAP溶液，加热溶解得到GelMA溶液；
步骤3：将脊髓脱细胞基质dECM与GDNF(纯度≧95％)在EDC交联液中交联得到dECM-GDNF；将dECM-GDNF加入到GelMA溶液中并加热搅拌至溶解，得到dECM-GDNF/GelMA预聚溶液；
步骤4：将MSC细胞悬液离心后弃去上清液，加入水凝胶预聚溶液，得到再细胞化水凝胶预聚溶液；
步骤5：用蓝光照射上述预聚溶液40-90s，制备再细胞化复合水凝胶。
本发明的第四方面，提供第一方面所述的复合水凝胶或第三方面所述的再细胞化水凝胶的用途，用于制备治疗脊髓损伤的材料。
在另一优选例中，所述复合水凝胶用于搭载骨髓间充质干细胞促进SCI组织修复。在另一优选例中，再细胞化水凝胶用于植入脊髓损伤部位，促进脊髓损伤后组织学修复。
在另一优选例中，所述复合水凝胶用于搭载骨髓间充质干细胞对SCI后的免疫微环境进行调控，并促进损伤处神经元再生和轴突再生。在另一优选例中，再细胞化水凝胶用于植入脊髓损伤部位，调控病变处免疫微环境，并促进损伤处神经元再生和轴突再生。
在另一优选例中，所述复合水凝胶用于搭载骨髓间充质干细胞促进SCI后小鼠行为学恢复。
在另一优选例中，所述再细胞化水凝胶用于植入脊髓损伤部位，促进SCI后小鼠行为学恢复。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明构建了一种dECM、GDNF和GelMA的复合水凝胶，搭载骨髓间充质干细胞后得到再细胞化水凝胶，具有细胞粘附性、光敏性、生物相容性和天然的细胞外基质微环境，材料的孔径可控，是一种良好的组织工程生物支架。
(2)本发明构建了一种治疗脊髓损伤的再细胞化复合水凝胶，具有生物相容性和适宜细胞生长的多孔网络结构，作为生物支架搭载MSCs用于SCI后的组织修复和行为学恢复，具有明显的修复效果。
(3)本发明的复合水凝胶和间充质干细胞共同调节SCI后损伤微环境中的免疫反应，抑制炎性反应，促进神经再生和轴突再生，且引入的GDNF可以在体内持续释放促进脊髓损伤处轴突再生，最终实现组织修复和行为学恢复。本发明为SCI的原位组织修复提供了新的策略。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征，可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示的是本发明的脊髓经脱细胞流程后细胞脱除情况的表征，其中a是经DAPI染色后正常组和脱细胞组的图像，b是经H&E染色后正常组和脱细胞组的图像。
图2显示的是本发明中dECM冻干样品(顶部曲线)和dECM-GDNF冻干样品(底部曲线)的红外谱图。
图3显示的是本发明中GelMA水凝胶、dECM/GelMA水凝胶和dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶冻干后的微观形貌图，其中a是GelMA水凝胶的扫描电镜图，b是dECM/GelMA水凝胶的扫描电镜图，c是dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶的扫描电镜图。
图4显示的是正常组、SCI组、MSC组、dECM/MSC组和dECM-GDNF/MSC组处理小鼠术后8周的脊髓组织H&E染色图。
图5显示的是正常组、SCI组、MSC组、dECM/MSC组和dECM-GDNF/MSC组小鼠术后2周时对小胶质细胞/巨噬细胞标志物(CD68)、M1型小胶质细胞/巨噬细胞标志物(CCR7)和M2型小胶质细胞/巨噬细胞标志物(CD206)进行的免疫荧光染色图，其中a为CD68/CCR7/DAPI以及CD68/CD206/DAPI染色荧光图，b为定量分析CCR7以及CD206荧光强度。图中**是指在两个实验组之间进行t检验，p值小于0.01；***是指在两个实验组之间进行t检验，p值小于0.001；****是指在两个实验组之间进行t检验，p值小于0.0001。以上均认为比较的两组之间具有统计学差异，p值越小，统计学差异越显著。ns是指在两个实验组之间进行t检验，p值大于0.05，两组之间无显著的统计学差异。
图6显示的是正常组、SCI组、MSC组、dECM/MSC组和dECM-GDNF/MSC组小鼠术后4周时对成熟神经元标志物(NeuN)和未成熟神经元标志物(βⅢtubulin)进行的免疫荧光染色图，其中a为βⅢtubulin/NeuN/DAPI染色荧光图，b为定量分析NeuN和βⅢtubulin荧光强度。图中**是指在两个实验组之间进行t检验，p值小于0.01；***是指在两个实验组之间进行t检验，p值小于0.001；****是指在两个实验组之间进行t检验，p值小于0.0001，认为两组之间具有显著的统计学差异。ns是指在两个实验组之间进行t检验，p值大于0.05，两组之间无显著的统计学差异。
图7显示的是正常组、SCI组、MSC组、dECM/MSC组和dECM-GDNF/MSC组小鼠术后8周时对成熟少突胶质细胞标志物(MBP)进行的免疫荧光染色图，其中a为MBP/DAPI染色荧光图。b为定量分析MBP荧光强度。图中****是指在两个实验组之间进行t检验，p值小于0.0001，认为两组之间具有显著的统计学差异。
图8显示的是正常组、SCI组、MSC组、dECM/MSC组和dECM-GDNF/MSC组小鼠术后10周内，每周检测的BBB评分图。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入的研究，采用dECM、GDNF和GelMA构建的复合水凝胶，具有细胞粘附性、光敏性、生物相容性和天然的细胞外基质中的重要组分，孔径可控，搭载MSCs后用于脊髓损伤修复治疗。在此基础上，完成了本发明。
缩写说明
dECM：脊髓脱细胞基质；GDNF：胶质细胞源性神经营养因子；
GelMA：甲基丙烯酰化明胶；MSC：间充质干细胞
PBS：磷酸盐缓冲液；dH2O：蒸馏水
DNaseⅠ：脱氧核糖核酸酶；Triton X-100：曲拉通X-100
SCI：脊髓损伤；LAP：苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂
DAPI：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚；H&E：苏木精-伊红
CD68：小胶质细胞/巨噬细胞标志物；
CCR7：M1型小胶质细胞/巨噬细胞标志物；
CD206：M2型小胶质细胞/巨噬细胞标志物；
βⅢtubulin：未成熟神经元标志物；NeuN：成熟神经元标志物；
MBP：成熟少突胶质细胞标志物
再细胞化水凝胶
本发明提供一种再细胞化水凝胶，由脊髓脱细胞基质dECM、胶质细胞源性神经营养因子GDNF、间充质干细胞MSC、甲基丙烯酰化明胶GelMA和光交联引发剂LAP混合后进行光交联得到，其中，GelMA和dECM、dECM和GDNF的质量比分别为1∶1-10∶1、20∶1-200∶1，MSC的细胞含量为105-109cells/ml。
本发明还提供再细胞化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
i.提供LAP溶液；
ii.将甲基丙烯酰化明胶GelMA溶解于LAP溶液中得到GelMA溶液；
iii.将脊髓脱细胞基质dECM溶解于GelMA溶液中得到dECM/GelMA溶液，将GDNF溶解于dECM/GelMA溶液得到水凝胶预聚溶液；或将脊髓脱细胞基质dECM与GDNF交联得到dECM-GDNF，随后将dECM-GDNF溶解于GelMA溶液中得到水凝胶预聚溶液；
iv.将MSC细胞悬液离心后弃去上清液，加入上述预聚溶液，得到再细胞化水凝胶预聚溶液；
v.用蓝光照射上述预聚溶液40-90s，得到所述复合水凝胶。
其中，利用以下步骤制备脊髓脱细胞基质dECM：
a)在振荡条件下进行化学酶解处理得到脱细胞基质：
dH2O处理5-10h、0.01-0.2g/ml脱氧胆酸钠处理12-24h、PBS处理30-80min、DNaseⅠ处理40-90min、PBS处理30-60min、dH2O处理2-6h、1v/v％-5v/v％Triton X-100处理1-4h、PBS处理30-60min、DNaseⅠ处理40-90min、PBS处理30-60min；
b)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脊髓脱细胞基质dECM。
本发明还提供dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶联合MSCs(dECM-GDNF/MSC)在SCI治疗中的应用。
本发明通过构建一种再细胞化水凝胶，实现了生物活性、生物相容性、结构可调性等优势的集合。所制备的再细胞化水凝胶用于SCI治疗，植入后治疗并修复脊髓损伤带来的神经功能和运动功能障碍，促进脊髓损伤部位的组织修复。本发明的复合水凝胶协同MSCs植入到SCI损伤部位后，可调控SCI损伤处的炎症反应，并促进神经元再生及轴突再生，最终实现损伤部位组织修复和功能恢复。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
一种用于SCI神经元再生和轴突再生的复合水凝胶的制备
一种用于促进SCI后神经元再生和轴突再生的复合水凝胶，由dECM、GDNF和GelMA构建，其dECM和GelMA的质量比为1∶5，dECM和GDNF的质量比为100∶1，制备步骤如下：
(1)制备脊髓脱细胞基质dECM
从6-8周雌性C57BL/6小鼠获得的脊髓组织，放置于PBS溶液中。
在振荡条件下进行化学酶解周期处理，所用试剂有：蒸馏水(dH2O)、0.04g/ml的脱氧胆酸钠(SDC，Sigma，30970)、PBS溶液、40KU/ml的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ，Sigma，D4263)、3v/v％的Triton X-100(Sigma，X100)溶液。按照次序列出处理试剂和处理时间。
dH2O(7h)、0.04g/ml SDC(14h)、PBS(30min)、DNaseⅠ(1h)、PBS(30min)、dH2O(4h)、3v/v％Triton X-100(2h)、PBS(30min)、DNaseⅠ(1h)、PBS(30min)。
将所得脊髓脱细胞基质在-20℃下冷冻1h，再于-80℃下真空冷冻干燥机中干燥24h，得到dECM粉末。对dECM粉末进行Co-60(Co-60为钴的放射性同位素钴60，其为伽马射线源)辐照灭菌，剂量为10kGy。
(2)构建dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶
用PBS溶液配制0.0025g/ml的LAP溶液，并用0.22μm针头式过滤器过滤除菌。
称取氨基取代度为30％的泡沫状GelMA加入到上述LAP溶液中，在40-60℃烘箱中溶解30min，得到0.05g/ml的GelMA溶液，此溶液用0.22μm针头式过滤器过滤除菌。
将EDC与NHS(质量比5:2)加入到PBS溶液中，配置EDC/NHS溶液，再将GDNF(纯度≧95％)加入PBS溶液中，配置10μg/ml的GDNF溶液；将脱细胞脊髓dECM加入到EDC/NHS溶液中并在20-30℃摇床中活化60min；随后将活化的脱细胞脊髓dECM加入到GDNF溶液中交联反应2h，得到dECM-GDNF。
称取dECM-GDNF加入到上述GelMA溶液中，在30-45℃下缓慢搅拌1-2h使其充分分散均匀，得到dECM-GDNF浓度为10mg/ml的dECM-GDNF/GelMA预聚溶液。
用蓝光照射上述预聚溶液60s，形成dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶。
用于SCI修复的再细胞化复合水凝胶的制备
由dECM、GDNF、MSC和GelMA构建，其dECM和GDNF的质量比为100∶1，dECM-GDNF和GelMA的质量比为1∶5，MSC的细胞含量为107cells/ml，制备步骤基本同dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶的制备，不同之处在于，在蓝光照射之前，加入MSC细胞悬液，具体地：将MSC细胞悬液离心后弃去上清液，计算细胞浓度后加入水凝胶预聚溶液，配置含107cells/ml的MSC的再细胞化水凝胶预聚溶液，之后用蓝光照射上述预聚溶液60s，形成再细胞化复合水凝胶dECM-GDNF/MSC/GelMA。
实施例2
脊髓脱细胞基质的表征
对实施例1获得的dECM进行细胞核去除效果的评估。采用DAPI染色和H&E染色作定性评估，采用DNA含量检测作定量评估。具体方法如下：
用4％多聚甲醛在室温下固定脱细胞脊髓切片和未脱细胞脊髓切片，用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色，用共聚焦显微镜观察。如图1中a所示，DAPI染色显示未脱细胞脊髓切片中存在明显的细胞核蓝色染色，而脱细胞脊髓切片中无细胞核染色。说明脱细胞处理显著减少了组织中的细胞成分。
用石蜡包埋法固定脱细胞脊髓切片和未脱细胞脊髓切片，用苏木精-伊红(H&E)染色，用显微镜观察。如图1中b所示，H&E染色显示未脱细胞脊髓切片中存在明显的细胞核和蛋白组分，而脱细胞脊髓切片中保留了蛋白组分，但未观察到细胞核。进一步说明，脱细胞处理显著减少了组织中的细胞成分，但保留了蛋白组分。
利用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen，Hilden，Germany)提纯DNA，然后用荧光定量仪(Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA)定量检测dsDNA含量。检测结果发现，未脱细胞组DNA含量为350.31ng/mg，脱细胞后DNA含量为47.75±1.40ng/mg，达到低于50ng/mg的要求，这被认为是临床应用的安全水平。
实施例3
dECM和dECM-GDNF交联情况表征
按照实施例1的方法制备dECM与dECM-GDNF。按照实施例1的方法制备脊髓脱细胞基质dECM与交联后的dECM-GDNF，在真空冻干机中真空冻干24h，得到冻干的dECM样本和dECM-GDNF样本。使用傅立叶变换红外光谱仪(FTIR，Nicolet is50，Thermo Electron，USA)对dECM样品和dECM-GDNF样品中官能团进行检测。
详细步骤是，将1-2mg dECM样品或dECM-GDNF样品与200mg干燥的纯KBr在玛瑙研钵中混和均匀，充分研磨后(使颗粒达到约2μm)，将混合物均匀地放入固体压片模具的顶模和底模之间，然后把模具放入压力机中，在5×107～1×108Pa左右的压力下保持1-2分钟即可得到透明或均匀半透明的锭片。取出锭片，装入固体样品测试架中进行红外光谱表征。红外光谱图如图2所示，dECM-GDNF样品在波数1640-1550cm-1处的NH弯曲振动峰强度减弱，表明交联过程中组织中游离氨基发生酰胺化反应，从而表明EDC/NHS交联反应发生，GDNF交联于dECM。
实施例4
dECM-GDNF中GDNF的释放
按照实施例1的方法制备dECM-GDNF，将dECM-GDNF置于神经基础培养基中，并在37℃培养箱中培养。分别在第1、3、7、14、21、28、35天提取培养基，并更换新培基，用Elisa试剂盒定量提取后的培养基中GDNF的浓度，最后绘制曲线。结果显示GDNF在第1天、第3天、第7天、第14天、第21天、第28天、第35天的累积释放量分别为2.23±0.26ng/ml、4.16±0.25ng/ml、6.42±0.82ng/ml、8.16±0.88ng/ml、10.47±0.93ng/ml、12.65±0.92ng/ml、14.77±0.96ng/ml。结果表明，GDNF成功交联在dECM上，并能在35天内持续释放。
实施例5
dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶的形貌表征
按照实施例1的方法，配制浓度为0.05g/ml的GelMA溶液，并将其用蓝光照射60s，得到GelMA水凝胶(氨基取代度为30％)。按照实施例1的方法配置dECM-GDNF浓度为0.01g/ml，GelMA浓度为0.05g/ml的dECM-GDNF/GelMA溶液，并将其用蓝光照射60s，得到dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶。对照组配置dECM浓度为0.01g/ml，GelMA浓度为0.05g/ml的dECM/GelMA溶液，并将其用蓝光照射60s，得到dECM/GelMA水凝胶。使用扫描电子显微镜(SEM，S-4800，Hitachi，Japan)对GelMA水凝胶、dECM/GelMA水凝胶和dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶进行微观形貌表征。
详细步骤是，水凝胶冷冻后在真空冻干机中真空冻干24h，将冻干后的水凝胶切成小块，喷金后，在5kV的加速电压下进行SEM表征。扫描电镜图如图3所示，图片显示GelMA水凝胶、dECM/GelMA水凝胶和dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶在干燥状态下呈现多孔网络结构，这是适宜于细胞生存和生长的结构。
基于水凝胶的扫描电镜图，用Image-Pro Plus 6.0软件计算孔径。孔径为电镜图中所有孔直径的平均值。测量结果显示：上述GelMA水凝胶、dECM/GelMA水凝胶和dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶的孔径分别为79.38±17.63μm、63.46±11.83μm和66.31±11.51μm。有利于细胞粘附和增长，并与微环境进行物质交换。
实施例6
再细胞化复合水凝胶对SCI小鼠组织修复效果评估
建立雌性C57BL/6小鼠脊髓半切模型。首先，对小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉，将小鼠背部脱毛，并固定四肢。然后，剪开背部皮肤、肌肉，暴露椎管。在脊柱T9-T10处暴露脊髓。使用手术刀，将T9-T10右半部脊髓剔除，建立脊髓半切模型。
设置1个实验组和4个对照组。其中，实验组用实施例1所得到的dECM-GDNF/MSC/GelMA复合水凝胶治疗上述SCI小鼠。具体为：将dECM-GDNF/GelMA复合水凝胶预聚溶液，添加到离心后弃去上清液的MSC中，得到浓度为5×107cells/ml的再细胞化水凝胶预聚溶液，将其注射到损伤区域，然后用蓝光照射60s进行光交联反应。随后，缝合肌肉与皮肤，并标记为dECM-GDNF/MSC组。对照组分别为：正常小鼠、植入GelMA水凝胶组(SCI组)、植入MSC/GelMA水凝胶组(MSC组)与植入dECM/MSC/GelMA水凝胶组(dECM/MSC组)。
于治疗后第8周处死小鼠，取出脊髓组织进行H&E染色并观察。如图4所示，可以观察到与SCI组小鼠相比dECM-GDNF/MSC组、dECM/MSC组和MSC组的小鼠脊髓组织的缺损面积显著减小，其中dECM-GDNF/MSC组优于dECM/MSC组优于MSC组。表明dECM-GDNF/MSC/GelMA复合水凝胶促进了SCI后的组织修复。
实施例7
再细胞化复合水凝胶抑制SCI小鼠神经炎症的效果评估
同实施例6，建立雌性C57BL/6小鼠脊髓半切模型，并设置1个实验组和4个对照组。
于治疗后第2周处死小鼠，取出脊髓组织进行免疫荧光染色并观察。其中CD68为小胶质细胞/巨噬细胞标志物，CCR7为M1型小胶质细胞/巨噬细胞标志物，CD206为M2型小胶质细胞/巨噬细胞标志物。小胶质细胞为神经系统内固有的免疫效应细胞，其参与一系列神经退行性疾病的发生，介导中枢神经系统损伤和疾病的内源性免疫反应。
如图5所示，可以观察到与SCI组小鼠相比，dECM-GDNF/MSC组、dECM/MSC组和MSC组的小鼠脊髓损伤处的M1型小胶质细胞/巨噬细胞显著减小，M2型小胶质细胞/巨噬细胞显著增多。表明dECM-GDNF/MSC/GelMA复合水凝胶植入可以诱导小胶质细胞/巨噬细胞由M1型转化为M2型，进而抑制SCI损伤处的炎症反应。
实施例8
再细胞化复合水凝胶促进SCI小鼠神经元再生的效果评估
同实施例6，建立雌性C57BL/6小鼠脊髓半切模型，并设置1个实验组和4个对照组。
于治疗后第4周处死小鼠，取出脊髓组织进行免疫荧光染色并观察。其中βⅢtubulin为未成熟神经元标志物，NeuN为成熟神经元标志物。
如图6所示，可以观察到与SCI组小鼠相比dECM-GDNF/MSC组、dECM/MSC组和MSC组的小鼠脊髓损伤处的未成熟神经元与成熟神经元显著增多。表明dECM-GDNF/MSC/GelMA复合水凝胶和dECM/MSC/GelMA水凝胶植入均对SCI后神经元再生具有促进效果。
实施例9
再细胞化复合水凝胶促进SCI小鼠轴突再生的效果评估
同实施例6，建立雌性C57BL/6小鼠脊髓半切模型，并设置1个实验组和4个对照组。
在治疗后第8周处死小鼠，取出脊髓组织进行免疫荧光染色并观察。其中MBP为少突胶质细胞标志物。少突胶质细胞的主要功能是在中枢神经系统中包绕轴突、形成绝缘的髓鞘结构、协助生物电信号的跳跃式高效传递并维持和保护神经元的正常功能。
如图7所示，可以观察到dECM-GDNF/MSC组与SCI组、MSC组和dECM/MSC组相比小鼠脊髓损伤处的少突胶质细胞显著增多。表明dECM-GDNF/MSC/GelMA复合水凝胶植入对SCI后轴突再生具有促进效果。
实施例10
再细胞化复合水凝胶对SCI小鼠行为学恢复评估
同实施例6，建立雌性C57BL/6小鼠脊髓半切模型，并设置1个实验组和4个对照组。
在复合水凝胶植入后10周内对实验组与对照组小鼠进行BBB评分以表征其行为学恢复情况。
BBB评分步骤：将动物置于平台上，分别于术前3天，术后10周内每周一次，观察并记录其后肢的行走及肢体活动。评分根据行为学恢复分为三个阶段，第一阶段为0-7分，评判小鼠后肢各关节活动；第二阶段为8-13分，评判后肢的步态及协调功能；第三阶段为14-21分，评判运动中爪的精细动作。三项满分为21分。
如图8所示，随着治疗天数的增加dECM-GDNF/MSC组、dECM/MSC组、MSC组与SCI组小鼠行为学均得到恢复，且dECM-GDNF/MSC组、dECM/MSC组、MSC组均优于SCI组。同时，dECM-GDNF/MSC组BBB评分均高于其他组，表明dECM-GDNF/MSC/GelMA复合水凝胶能显著促进SCI小鼠后肢行为学恢复。
对比例1
干细胞注射植入脊髓损伤
建立脊髓损伤模型，将干细胞直接注射植入损伤部位，然后缝合肌肉与皮肤。研究发现，直接将干细胞注射到脊髓损伤中，会导致大量抑制细胞丢失和死亡(M.H.Amer,etal.Translational considerations in injectable cell-based therapeutics forneurological applications:concepts,progress and challenges.Npj RegenerativeMedicine,2017)，导致这一结果的原因可主要归结为两点：一是干细胞悬液在注入脊髓损伤部位后，由于细胞悬液具有流动性，导致部分干细胞未能保留在损伤部位，无法达到在损伤部位进行修复的效果；二是由于脊髓损伤处形成了恶劣的微环境，该微环境不适宜于干细胞的增殖与生存，最终导致干细胞在损伤处存活率低，未能达到在损伤部位进行修复的效果。
而本发明再细胞化复合水凝胶能够封装MSC，在植入损伤部位后能防止MSC的扩散，使MSC保留在损伤部位发挥修复效果；同时，该再细胞化复合水凝胶的dECM组分可以为MSC提供一个适合生存的环境，防止因损伤处恶劣的微环境导致的干细胞存活率低的问题。
对比例2
dECM/MSC/GelMA水凝胶对SCI小鼠的轴突修复效果评估
同实施例6，建立雌性C57BL/6小鼠脊髓半切模型。用dECM/GelMA水凝胶封装MSC(dECM/MSC/GelMA)治疗上述SCI小鼠。具体为：将dECM溶解于GelMA溶液中得到水凝胶预聚溶液，然后将水凝胶预聚溶液添加到离心后弃去上清液的MSC中，得到浓度为5×107cells/ml的再细胞化水凝胶预聚溶液，将其注射到损伤区域，然后用蓝光照射60s进行光交联反应。随后，缝合肌肉与皮肤，并标记为dECM/MSC组。
如图7所示，可以观察到用dECM/MSC治疗的SCI小鼠中少突胶质细胞显少于dECM-GDNF/MSC治疗组，导致这一结果的原因可以归结为：dECM/MSC组治疗脊髓损伤的过程中缺乏足够的因子促进轴突再生，导致未能观察到明显的少突胶质细胞标志物的增多，轴突再生不明显。
而本发明dECM-GDNF/MSC/GelMA复合水凝胶中补充了神经营养因子GDNF，GDNF能有效地诱导脊髓固有轴突再生并促进中枢神经系统功能恢复。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种复合水凝胶，其特征在于，所述复合水凝胶由脊髓脱细胞基质dECM、胶质细胞源性神经营养因子GDNF、甲基丙烯酰化明胶GelMA和光交联引发剂LAP混合后进行光交联得到，其中，
LAP和GelMA的质量比为1∶5-1∶35；
GelMA和dECM的质量比为1∶1-10∶1；
dECM和GDNF的质量比为20∶1-200∶1。
2.一种如权利要求1所述的复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
i.提供LAP溶液；
ii.将甲基丙烯酰化明胶GelMA溶解于LAP溶液中得到GelMA溶液；
iii.将脊髓脱细胞基质dECM溶解于GelMA溶液中得到dECM/GelMA溶液，将GDNF溶解于dECM/GelMA溶液得到水凝胶预聚溶液；或将脊髓脱细胞基质dECM与GDNF交联得到dECM-GDNF，随后将dECM-GDNF溶解于GelMA溶液中得到水凝胶预聚溶液；
iv.用蓝光照射上述预聚溶液40-90s，得到所述复合水凝胶。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，利用以下步骤制备脊髓脱细胞基质dECM：
a)在振荡条件下进行化学酶解处理得到脱细胞基质：
dH2O处理5-10h、0.01-0.2g/ml脱氧胆酸钠处理12-24h、PBS处理30-80min、DNaseⅠ处理40-90min、PBS处理30-60min、dH2O处理2-6h、1v/v％-5v/v％Triton X-100处理1-4h、PBS处理30-60min、DNaseⅠ处理40-90min、PBS处理30-60min；
b)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脊髓脱细胞基质dECM。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述LAP溶液为LAP的PBS溶液，浓度为0.0020-0.0075g/ml。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤ii)中，
将氨基取代度为20％-45％的甲基丙烯酰化明胶GelMA加入LAP溶液，于40-60℃烘箱内溶解20-50min得到GelMA溶液。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤iii)中，
将脊髓脱细胞基质dECM加入GelMA溶液，于30-45℃下搅拌1-2h得到dECM/GelMA溶液；或者
将脊髓脱细胞基质dECM与GDNF通过EDC交联得到dECM-GDNF，将dECM-GDNF加入到GelMA溶液，于30-45℃下搅拌1-2h得到dECM-GDNF/GelMA预聚溶液。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤iv)中，所述预聚溶液中dECM、GDNF、GelMA、LAP的含量分别为5-30mg/ml、1-1000μg/ml、30-120mg/ml、0.0020-0.0075g/ml。
8.一种再细胞化水凝胶，其特征在于，包含权利要求1所述的复合水凝胶以及间充质干细胞。
9.如权利要求1所述的复合水凝胶或权利要求8所述的再细胞化水凝胶的用途，其特征在于，用于制备治疗脊髓损伤的材料。
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