CN114848919B - 用于tbi免疫调控及组织修复的复合水凝胶及其制备方法 - Google Patents
用于tbi免疫调控及组织修复的复合水凝胶及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于TBI免疫调控及组织修复的复合水凝胶及其制备方法,所述复合水凝胶由脑脱细胞基质dBECM、甲基丙烯酰化明胶GelMA和光交联引发剂LAP混合后进行光交联得到。dBECM为复合水凝胶提供适宜细胞生存和生长的微环境并诱导间充质干细胞向神经细胞分化,GelMA为复合水凝胶提供适当的力学强度和光敏性。本发明的复合水凝胶兼具两组分的优势,其联合间充质干细胞可调控TBI后的免疫反应,改善神经炎症微环境并促进组织修复。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料和组织工程技术领域,具体为一种用于TBI免疫调控及组织修复的复合水凝胶及其制备方法。
背景技术
创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是一个全球性的公共健康问题,具有高死亡率和高致残率。TBI的发病机制包括受伤瞬间的原发性损伤和随后的继发性损伤,其中,继发性损伤包括出血、缺氧、水肿、血脑屏障破坏和神经炎症等,并在TBI中发挥重大作用。原发性损伤造成的细胞死亡和组织损失无法挽救,通过药物、手术等措施减轻继发性损伤的治疗方法也只能防止进一步的损伤,而不能促进组织再生。近年来,随着再生医学技术的发展,干细胞疗法和组织工程修复技术给TBI治疗带来了新的希望。然而,同时满足功能性和生物相容性的组织工程支架是个难点。因此,制备一种适宜的生物支架来联合干细胞以促进TBI后的组织修复是当务之急。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞,广泛存在于脐带、骨髓、牙髓、脂肪或胎盘组织中,是组织工程最为常用的种子细胞之一。骨髓间充质干细胞因为具有易于采集、易于保存和运输、无异体排斥、刺激组织再生、调节免疫功能等诸多优点而成为了神经修复与再生医学的研究热点。已有研究证明,骨髓间充质干细胞可以通过分化作用和旁分泌作用修复神经损伤并改善损伤部位的功能。
生物支架的制备是组织工程学研究的重要内容之一。脱细胞基质无免疫原性且具有优异的仿生性、生物相容性和细胞粘附性,可为细胞迁移、增殖、分化和生长提供适宜微环境,已被广泛用作组织工程的支架材料。然而,像脑组织这种软组织在脱细胞后得到的脱细胞基质力学强度太低,不适宜单独作为生物支架来搭载种子细胞。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于TBI免疫调控及组织修复的复合水凝胶及其制备方法。
本发明的第一方面,提供一种复合水凝胶,所述复合水凝胶由甲基丙烯酰化明胶GelMA、脑脱细胞基质dBECM和光交联引发剂LAP混合后进行光交联得到,其中,GelMA和dBECM的质量比为1∶1-10∶1。
在另一优选例中,GelMA和dBECM的质量比为1.5∶1-5∶1,较佳为2∶1。
本发明的复合水凝胶的孔径在30-100μm的范围内,适宜于封装间充质干细胞;孔隙率为60%-80%,压缩模量可控制在1.0-5.0kPa的范围,这模拟脑组织的力学环境并有益于干细胞的增殖和分化。
在另一优选例中,利用以下步骤制备脑脱细胞基质dBECM:
a)冻融循环:将脑组织经液氮冷冻,融化后用PBS溶液清洗,重复冷冻、融化、清洗3-5次;
b)在振荡条件下进行化学酶解三个周期处理得到脱细胞基质:
第一周期:dH2O处理5-10h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第二周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第三周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
c)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脑脱细胞基质dBECM。
在另一优选例中,利用以下步骤制备甲基丙烯酰化明胶GelMA:
a')将明胶溶解于PBS溶液中,得到明胶溶液;
b')将甲基丙烯酸酐MA滴加到明胶溶液中,在40-60℃下搅拌2-3h,加入30-40℃的PBS溶液使反应停止;
c')用10-14kDa的透析袋将步骤b')所得溶液在45-50℃下透析,以除去未反应的甲基丙烯酸酐MA;
d')将透析后的溶液离心取上清液,冻干得到泡沫状的甲基丙烯酰化明胶GelMA。
本发明的第二方面,提供第一方面所述的复合水凝胶的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
i.提供LAP溶液;
ii.将甲基丙烯酰化明胶GelMA、脑脱细胞基质dBECM分别溶解于LAP溶液中得到GelMA溶液、dBECM溶液;
iii.将GelMA溶液、dBECM溶液混合得到水凝胶预聚溶液;
iv.用波长405nm的蓝光照射上述预聚溶液20-40s,得到所述复合水凝胶。
在另一优选例中,复合水凝胶的制备方法包括以下步骤:
步骤1:利用冻融循环联合化学酶解周期处理的脱细胞方法制备dBECM,然后进行冷冻干燥,得到dBECM粉末并对其灭菌。
步骤2:利用典型的GelMA合成方法合成GelMA并冻干成泡沫状。
步骤3:分别将dBECM粉末和泡沫状GelMA溶于LAP溶液中并搅拌均匀,得到dBECM溶液和GelMA溶液,然后将两种溶液等体积混合得到预聚溶液。
步骤4:用波长405nm的蓝光照射上述预聚溶液30-40s,形成复合水凝胶。
在另一优选例中,dBECM粉末的灭菌方式为紫外线照射24-48h或者钴源辐照灭菌,LAP溶液和GelMA溶液采用0.22μm针头式过滤器过滤除菌,且灭菌后的操作均为无菌操作。
在另一优选例中,利用以下步骤制备脑脱细胞基质dBECM:
a)冻融循环:将脑组织经液氮冷冻,融化后用PBS溶液清洗,重复冷冻、融化、清洗3-5次;
b)在振荡条件下进行化学酶解三个周期处理得到脱细胞基质:
第一周期:dH2O处理5-10h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第二周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第三周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
c)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脑脱细胞基质dBECM。
在另一优选例中,利用以下步骤制备脑脱细胞基质dBECM:
a)冻融循环:将脑组织经液氮冷冻,融化后用PBS溶液清洗,重复冷冻、融化、清洗3-4次;
b)在振荡条件下进行化学酶解三个周期处理得到脱细胞基质:
第一周期:dH2O处理6-8h、0.03-0.05g/mL脱氧胆酸钠处理12-16h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min、dH2O处理3-5h、2v/v%-4v/v%Triton X-100处理1.5-2.5h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min;
第二周期:dH2O处理3-5h、0.03-0.05g/mL脱氧胆酸钠处理10-14h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min、dH2O处理3-5h、2v/v%-4v/v%Triton X-100处理1.5-2.5h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min;
第三周期:dH2O处理3-5h、0.03-0.05g/mL脱氧胆酸钠处理10-14h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min、dH2O处理3-5h、2v/v%-4v/v%Triton X-100处理1.5-2.5h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min;
c)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脑脱细胞基质dBECM。
在另一优选例中,利用以下步骤制备甲基丙烯酰化明胶GelMA:
a')将明胶溶解于PBS溶液中,得到明胶溶液;
b')将甲基丙烯酸酐MA滴加到明胶溶液中,在40-60℃下搅拌2-3h,加入30-40℃的PBS溶液使反应停止;
c')用10-14kDa的透析袋将步骤b')所得溶液在45-50℃下透析,以除去未反应的甲基丙烯酸酐MA;
d')将透析后的溶液离心取上清液,冻干得到泡沫状的甲基丙烯酰化明胶GelMA。
在另一优选例中,明胶溶液的浓度为0.08-0.12g/mL。
在另一优选例中,所述LAP溶液为LAP的PBS溶液,浓度为0.0025-0.0050g/mL。
在另一优选例中,步骤ii)中:
将甲基丙烯酰化明胶GelMA加入LAP溶液,于45-60℃下搅拌5-15min得到GelMA溶液;
将脑脱细胞基质dBECM加入LAP溶液,于20-37℃下搅拌2-4h得到dBECM溶液。
在另一优选例中,步骤iii)中,所述预聚溶液中GelMA的含量为3-8w/v%,较佳5w/v%。
在另一优选例中,步骤iii)中,所述预聚溶液中dBECM的含量分别为0.5-5w/v%,较佳2.5w/v%。
在另一优选例中,步骤iii)中,所述预聚溶液中LAP的含量为0.25-0.5w/v%。
本发明的第三方面,提供一种试剂盒,所述试剂盒包含:
组分a:脑脱细胞基质dBECM、甲基丙烯酰化明胶GelMA和光交联引发剂LAP的水凝胶预聚溶液;
组分b:间充质干细胞悬液。
在另一优选例中,水凝胶预聚溶液与间充质干细胞悬液混合,注射到损伤区域,然后原位成胶,进行组织修复。
在另一优选例中,利用以下步骤制备脑脱细胞基质dBECM:
a)冻融循环:将脑组织经液氮冷冻,融化后用PBS溶液清洗,重复冷冻、融化、清洗3-5次;
b)在振荡条件下进行化学酶解三个周期处理得到脱细胞基质:
第一周期:dH2O处理5-10h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第二周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第三周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
c)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脑脱细胞基质dBECM。
在另一优选例中,利用以下步骤制备甲基丙烯酰化明胶GelMA:
a')将明胶溶解于PBS溶液中,得到明胶溶液;
b')将甲基丙烯酸酐MA滴加到明胶溶液中,在40-60℃下搅拌2-3h,加入30-40℃的PBS溶液使反应停止;
c')用10-14kDa的透析袋将步骤b')所得溶液在45-50℃下透析,以除去未反应的甲基丙烯酸酐MA;
d')将透析后的溶液离心取上清液,冻干得到泡沫状的甲基丙烯酰化明胶GelMA。
本发明的第四方面,提供一种再细胞化水凝胶,包含第一方面所述的复合水凝胶以及间充质干细胞。
再细胞化水凝胶,组织或器官脱细胞后构建的细胞外基质水凝胶重新植入体外培养的细胞而再细胞化的体系。
本发明的第五方面,提供第一方面所述的复合水凝胶、第三方面所述的试剂盒或第四方面所述的再细胞化水凝胶的用途,用于制备治疗创伤性脑损伤的材料。
在另一优选例中,所述复合水凝胶用于诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。
在另一优选例中,所述复合水凝胶用于搭载骨髓间充质干细胞对TBI后的免疫微环境进行调控,促进组织修复和神经再生。
与现有技术相比,本发明的有益效果主要体现在:
(1)本发明构建了一种dBECM和GelMA的复合水凝胶,具有细胞粘附性、光敏性、生物相容性和天然的细胞外基质微环境,材料的孔径和力学强度可控,是一种良好的组织工程生物支架。
(2)本发明的用于TBI免疫调控及组织修复的复合水凝胶,兼具天然材料的生物相容性、合成材料的机械性能和适宜细胞生长的多孔网络结构,能够诱导MSCs向神经细胞分化,作为生物支架搭载MSCs用于TBI后的组织修复,具有明显的修复效果。
(3)本发明的复合水凝胶和间充质干细胞共同调节TBI后大脑微环境中的免疫反应,抑制炎性反应,为神经再生和组织修复提供有利微环境。本发明为TBI的原位组织修复提供了新的策略。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。说明书中所揭示的各个特征,可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示的是本发明的GelMA水凝胶和dBECM/GelMA复合水凝胶冻干后的微观形貌,其中a是GelMA水凝胶的扫描电镜图,b是dBECM/GelMA复合水凝胶的扫描电镜图。
图2是对培养3天的间充质干细胞染色得到的荧光图像,其中a是用基础培养基培养的间充质干细胞的图像,b是用dBECM/GelMA复合水凝胶浸提液培养的间充质干细胞的图像。
图3是用标准神经分化培养基或dBECM/GelMA复合水凝胶浸提液的神经分化培养基培养间充质干细胞7天后,对神经标志物巢蛋白(Nestin)和β-Ⅲ微管蛋白(Tuj1)进行的免疫染色图。
图4为用流式细胞术表征的不同实验组两种表型的BV-2细胞的相对数量表示。图中*是指在两个实验组之间进行t检验,p值小于0.05;**是指在两个实验组之间进行t检验,p值小于0.01;***是指在两个实验组之间进行t检验,p值小于0.001。以上均认为比较的两组之间具有统计学差异,p值越小,统计学差异越显著。
图5为不同条件处理的活化BV-2细胞培养液中促炎物质TNF-α和亚硝酸盐的含量。图中ns是指在两个实验组之间进行t检验,p值大于0.05,没有显著的统计学差异。*是指在两个实验组之间进行t检验,p值小于0.05;**是指在两个实验组之间进行t检验,p值小于0.01;***是指在两个实验组之间进行t检验,p值小于0.001。
图6为处理3天后不同实验组的TBI小鼠的脑组织形态照片。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入的研究,采用dBECM和GelMA构建复合水凝胶,具有光敏性、生物相容性和天然的细胞外基质中的重要组分,孔径和力学强度可控,搭载MSCs后用于TBI治疗。在此基础上,完成了本发明。
缩写说明
dBECM:脑脱细胞基质
GelMA:甲基丙烯酰化明胶
MSCs:间充质干细胞
LPS:脂多糖
PBS:磷酸盐缓冲液
dH2O:蒸馏水
DNaseⅠ:脱氧核糖核酸酶
Triton X-100:曲拉通X-100
TBI:创伤性脑损伤
LAP:苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亚磷酸锂
DAPI:4’,6-二脒基-2-苯基吲哚
TNF-α:肿瘤坏死因子α
IL-6:白细胞介素6
复合水凝胶
本发明提供一种用于TBI免疫调控及组织修复的复合水凝胶,由甲基丙烯酰化明胶GelMA、脑脱细胞基质dBECM和光交联引发剂LAP混合后进行光交联得到,其中,GelMA和dBECM的质量比为1∶1-10∶1。
本发明还提供复合水凝胶的制备方法,包括以下步骤:
i.提供LAP溶液;
ii.将甲基丙烯酰化明胶GelMA、脑脱细胞基质dBECM分别溶解于LAP溶液中得到GelMA溶液、dBECM溶液;
iii.将GelMA溶液、dBECM溶液混合得到水凝胶预聚溶液;
iv.用波长405nm的蓝光照射上述预聚溶液20-40s,得到所述复合水凝胶。
其中,利用以下步骤制备脑脱细胞基质dBECM:
a)冻融循环:将脑组织经液氮冷冻,融化后用PBS溶液清洗,重复冷冻、融化、清洗3-5次;
b)在振荡条件下进行化学酶解三个周期处理得到脱细胞基质:
第一周期:dH2O处理5-10h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第二周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第三周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
c)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脑脱细胞基质dBECM。
利用以下步骤制备甲基丙烯酰化明胶GelMA:
a')将明胶溶解于PBS溶液中,得到明胶溶液;
b')将甲基丙烯酸酐MA滴加到明胶溶液中,在40-60℃下搅拌2-3h,加入30-40℃的PBS溶液使反应停止;
c')用10-14kDa的透析袋将步骤b')所得溶液在45-50℃下透析,以除去未反应的甲基丙烯酸酐MA;
d')将透析后的溶液离心取上清液,冻干得到泡沫状的甲基丙烯酰化明胶GelMA。
本发明还提供dBECM/GelMA复合水凝胶联合MSCs在TBI治疗中的应用。
本发明通过构建一种复合水凝胶,实现了生物活性、生物相容性、结构可调性、力学强度可控性等优势的集合。所制备的复合水凝胶用于TBI治疗,不仅可以将MSCs控制在损伤区域,还可以诱导MSCs向神经谱系细胞分化。本发明的复合水凝胶协同MSCs在TBI后的损伤环境中发挥免疫调控作用,减轻神经炎症并促进组织修复。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件(如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件)或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。本发明中w/v是指g/ml。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
复合水凝胶的制备
一种用于TBI免疫调控及组织修复的复合水凝胶,由dBECM和GelMA构建,其dBECM和GelMA的质量比为1∶2,制备步骤如下:
(1)制备脑脱细胞基质dBECM
从6-8周雄性C57BL/6小鼠获得的脑组织,经液氮冷冻10min,融化至室温后用PBS溶液清洗5min,如此重复3次。
在振荡条件下进行化学酶解周期处理,所用试剂有:蒸馏水(dH2O)、0.04g/mL的脱氧胆酸钠(SDC,Sigma,30970)、PBS溶液、40kU/ml的DNA酶Ⅰ(DNaseⅠ,Sigma,D4263)、3v/v%的Triton X-100(Sigma,X100)溶液。按照次序列出处理试剂和处理时间。
第一周期:dH2O(7h)、0.04g/mL SDC(14h)、PBS(30min)、DNaseⅠ(1h)、PBS(30min)、dH2O(4h)、3v/v%Triton X-100(2h)、PBS(30min)、DNaseⅠ(1h)、PBS(30min);
第二周期:dH2O(4h)、0.04g/mL SDC(12h)、PBS(30min)、DNaseⅠ(1h)、PBS(30min)、dH2O(4h)、3v/v%Triton X-100(2h)、PBS(30min)、DNaseⅠ(1h)、PBS(30min);
第三周期:dH2O(4h)、0.04g/mL SDC(12h)、PBS(30min)、DNaseⅠ(1h)、PBS(30min)、dH2O(4h)、3v/v%Triton X-100(2h)、PBS(30min)、DNaseⅠ(1h)、PBS(30min)。
将所得脑脱细胞基质在-20℃下冷冻,再在-80℃下真空冷冻干燥2-3d,得到dBECM粉末。对dBECM粉末进行Co-60(Co-60为钴的放射性同位素钴60,其为伽马射线源)辐照灭菌,剂量为10kGy。
(2)制备泡沫状GelMA
将明胶溶解于PBS溶液中,得到0.1g/mL的溶液,将甲基丙烯酸酐(MA)滴加到明胶溶液中并在50℃下搅拌2h,加入40℃的PBS溶液使反应停止后,用10-14kDa的透析袋将所得溶液在45℃下透析一周,以除去未反应的MA。然后,将透析后的溶液以8000rpm离心15min,得到上清液。最后,在-80℃真空冷冻干燥5-7d,得到泡沫状GelMA。
(3)构建dBECM/GelMA复合水凝胶
用PBS溶液配制0.0025g/mL的LAP溶液,并用0.22μm针头式过滤器过滤除菌。
称取dBECM粉末加入到上述LAP溶液中,在30-37℃下缓慢搅拌3h使其分散均匀,得到0.05g/mL的dBECM溶液。
称取泡沫状GelMA加入到上述LAP溶液中,在50-60℃下缓慢搅拌10min使其溶解,得到0.10g/mL的GelMA溶液,此溶液也用0.22μm针头式过滤器过滤除菌。
将dBECM溶液和GelMA溶液等体积混合,得到水凝胶预聚溶液。
用波长405nm的蓝光照射上述预聚溶液30s,形成复合水凝胶。
实施例2
复合水凝胶的制备
一种用于TBI免疫调控及组织修复的复合水凝胶,由dBECM和GelMA构建,其中dBECM和GelMA的质量比为1∶10,具体是dBECM的含量为0.5w/v%,GelMA的含量为5w/v%,制备方法参照实施例1,步骤(3)中dBECM溶液浓度为0.01g/mL,其余步骤均与实施例1相同。
实施例3
一种用于TBI免疫调控及组织修复的复合水凝胶的制备
一种用于TBI免疫调控及组织修复的复合水凝胶,由dBECM和GelMA构建,其中dBECM和GelMA的质量比为3∶10,dBECM的含量为1.5w/v%,GelMA的含量为5w/v%,制备方法参照实施例1,步骤(3)中dBECM溶液浓度为0.03g/mL,其余步骤均与实施例1相同。
实施例4
脑脱细胞基质的表征
对实施例1获得的dBECM进行细胞核去除效果的评估。采用DAPI染色作定性评估,采用DNA含量检测作定量评估。具体方法如下:
用4%多聚甲醛在室温下固定脱细胞脑切片和未脱细胞脑切片,用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色,用共聚焦显微镜观察。DAPI染色显示未脱细胞脑切片中存在明显的细胞核蓝色染色,而脱细胞脑切片中无细胞核染色。说明脱细胞处理显著减少了组织中的细胞成分。
利用DNeasy Blood&Tissue Kit(Qiagen,Hilden,Germany)提纯DNA,然后用荧光定量仪(Thermo Fisher Scientific,Waltham,USA)定量检测dsDNA含量。检测结果发现,脑组织脱细胞后与脱细胞前的DNA含量之比为2.3%,且脱细胞后的DNA含量低于50ng/mg,这被认为是临床应用的安全水平。
实施例5
dBECM/GelMA复合水凝胶的表征
(1)形貌表征
按照实施例1的方法,配制浓度为0.05g/mL的GelMA溶液,并将其用405nm的蓝光照射30s,得到GelMA水凝胶。使用扫描电子显微镜(SEM,S-4800,Hitachi,Japan)对GelMA水凝胶和实施例1获得的dBECM/GelMA复合水凝胶进行微观形貌表征。详细步骤是,水凝胶被冷冻并真空冻干3天,将冻干后的水凝胶切成小块,喷金后,在5kV的加速电压下进行SEM表征。扫描电镜图如图1所示,图片显示GelMA水凝胶和dBECM/GelMA水凝胶在干燥状态下呈现多孔网络结构,这是适宜于细胞生存和生长的结构。
基于水凝胶的扫描电镜图,用Image-Pro Plus 6.0软件计算孔径和孔隙率。孔径为电镜图中所有孔直径的平均值,孔隙率是孔的面积与总面积的比值。测量结果显示:上述GelMA水凝胶和实施例1的dBECM/GelMA水凝胶的孔径分别为65.21±15.09μm和43.75±7.95μm,孔隙率分别为74.0%和63.5%。有利于细胞与微环境进行物质交换。
(2)压缩模量测试
为了确保水凝胶具有足够的机械强度以支持细胞生长,对实施例1-3制备的3种不同dBECM含量的水凝胶进行了压缩测试,通过计算应力-应变曲线线性区域(限于前20%应变)的斜率来确定水凝胶的压缩模量。具体方法如下:
首先,利用特制模具制备了直径10mm、厚度3mm的圆柱状水凝胶试样,然后,利用Instron万能试验机(Model 4302)以5mm/min的恒定应变速率对试样进行压缩测试。结果发现,随着水凝胶中dBECM含量增加,水凝胶的压缩模量逐渐降低。实施例1的水凝胶的压缩模量为1.02±0.20kPa,实施例2的水凝胶的压缩模量为2.80±0.22kPa,实施例3的水凝胶的压缩模量为1.54±0.30kPa,是有益于细胞存活和骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的压缩模量。
实施例6
dBECM/GelMA复合水凝胶搭载干细胞的生物相容性检测
为了检测水凝胶的生物相容性,用实施例1的dBECM/GelMA复合水凝胶的浸提液培养MSCs。
将实施例1的dBECM/GelMA复合水凝胶于MSCs培养基中37℃浸泡24h,用0.22μm过滤器过滤,得到dBECM/GelMA复合水凝胶的浸提液。
将MSCs接板于24孔板,用dBECM/GelMA复合水凝胶浸提液培养,在37℃培养箱中低氧培养,3天后进行免疫荧光染色(用异硫氰酸荧光素标记的鬼笔环肽染丝状肌动蛋白,用DAPI染核)并在共聚焦显微镜下拍摄。
采用基础培养基培养MSCs作为对照组,dBECM/GelMA复合水凝胶浸提液培养MSCs作为实验组,如图2所示,第3天实验组与对照组的细胞形态没有显著性差异,说明dBECM/GelMA复合水凝胶具有良好的生物相容性。
实施例7
dBECM/GelMA复合水凝胶诱导MSCs神经分化的检测
标准神经分化培养基:向MSCs基础培养液中加入人碱性成纤维细胞生长因子、人神经生长因子、人脑源性神经营养因子、B27补充剂、胎牛血清和青霉素-链霉素,最终标准神经分化培养基含有20ng/ml的人碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml的人神经生长因子、20ng/ml的人脑源性神经营养因子、2vol%的B27补充剂、2vol%的胎牛血清和1vol%的青霉素-链霉素。
dBECM/GelMA复合水凝胶的浸提液的神经分化培养基:将实施例1的dBECM/GelMA复合水凝胶于MSCs培养基中37℃浸泡24h,用0.22μm过滤器过滤,得到dBECM/GelMA复合水凝胶浸提液。向其中加入人碱性成纤维细胞生长因子、人神经生长因子、人脑源性神经营养因子、B27补充剂、胎牛血清和青霉素-链霉素,最终dBECM/GelMA复合水凝胶的浸提液的神经分化培养基含有20ng/ml的人碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml的人神经生长因子、20ng/ml的人脑源性神经营养因子、2vol%的B27补充剂、2vol%的胎牛血清和1vol%的青霉素-链霉素。
将MSCs以每孔5×105的密度接种在24孔板中,24h后,将MSCs基础培养液替换为标准神经分化培养基(对照组)或实施例1的dBECM/GelMA复合水凝胶的浸提液的神经分化培养基。每3天更换一次培养基,培养7天后,固定细胞并对神经标志物巢蛋白(Nestin)和β-Ⅲ微管蛋白(Tuj1)进行免疫染色。使用尼康共聚焦显微镜对样品进行成像。免疫染色图像如图3,可以看到,相较于对照组的MSCs,dBECM/GelMA复合水凝胶的浸提液的神经分化培养基处理的MSCs显示出更高的Nestin表达,这表明复合水凝胶有利于MSCs的神经分化。同时,dBECM/GelMA复合水凝胶的浸提液的神经分化培养基处理的MSCs也表达了较高水平的Tuj1,而对照组的MSCs几乎不表达β-III微管蛋白。因此,dBECM/GelMA复合水凝胶可以诱导MSCs向神经干细胞或神经元分化。
实施例8
dBECM/GelMA复合水凝胶协同MSCs调控免疫反应的效力评估
源于小鼠的小胶质细胞永生细胞系的BV-2细胞,保留有小神经胶质细胞多种形态、表征和功能特征,是一种公认的典型神经细胞系。作为中枢神经系统主要的免疫细胞,小胶质细胞的过度活化具有迁移、吞噬、产生各种细胞因子和趋化因子等功能,会造成显著的和高度有害的神经毒性作用。在不同微环境刺激下,BV-2可极化为不同的功能表型,包括M1型和M2型。M1型BV-2细胞通过分泌TNF-α、IL-6等促炎因子加重局部组织炎症,而M2型BV-2细胞会分泌抑制炎症的因子。有研究表明,促进BV-2小胶质细胞由M1向M2极化有利于神经组织的再生修复。
将脂多糖(LPS,Sigma)刺激的BV-2小胶质细胞(Procell,中国)与MSCs和/或实施例1的dBECM/GelMA复合水凝胶的浸提液孵育。具体方法:将复合水凝胶在α-MEM培养基中37℃孵育24h,然后用0.22μm过滤器过滤除菌得到浸提液。同时,将BV-2细胞接种在24孔板底部(每毫升20000个细胞),用含1μg/ml LPS的培养基培养24h。然后用水凝胶浸提液替换LPS诱导培养基,将10000个MSCs放在transwell小室(Corning,美国)中与BV-2细胞共培养。共培养24h后,用流式细胞术评估BV-2的细胞表型。另外,收集BV-2细胞的培养上清液,以评估共培养后的抗炎作用。用NO检测试剂盒(Beyotime,中国)测定一氧化氮(NO)浓度,用Elisa试剂盒(Neobioscience,中国)测定TNF-α的水平。以LPS刺激后换用标准α-MEM培养基培养的BV-2细胞为对照组。结果如图4所示,流式细胞术分析显示,dBECM/GelMA水凝胶协同MSCs抑制CD86(M1标记物)的表达或促进CD206(M2标记物)的表达,从而刺激BV-2细胞由M1向M2极化。此外,如图5,dBECM/GelMA水凝胶和MSCs处理的小胶质细胞,其促炎介质NO和促炎因子TNF-α的水平显著下调,这与M1向M2极化的转变相一致。由此说明,dBECM/GelMA复合水凝胶和MSCs对活化的小胶质细胞具有免疫调节作用,并对其诱导的神经炎症有抵抗作用。
实施例9
dBECM/GelMA复合水凝胶对TBI小鼠的组织修复效果评估
利用可控皮层冲击仪(众实公司,北京,中国)建立雄性C57BL/6小鼠的创伤性脑损伤(TBI)模型。首先,对小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉,并固定在一个立体定位框架中。然后,剪开皮肤、暴露颅骨,在前囟点右侧2.5mm、后侧3mm的位置进行颅骨切除手术。暴露大脑皮层后,使用直径为2.1mm的不锈钢冲击尖端以2.5m/s的速度冲击大脑皮层并造成1.0mm深的损伤,持续100ms。
设置2个实验组和1个对照组,实验组分别用实施例1所得dBECM/GelMA复合水凝胶以及封装MSCs(Procell)的dBECM/GelMA复合水凝胶治疗上述TBI小鼠。具体为:将骨髓间充质干细胞悬液与dBECM/GelMA水凝胶预聚溶液混合,得到封装5×105个MSCs的20μl混合液,将其注入到损伤区域,然后用405nm的蓝光照射30s进行光交联反应。随后,缝合切口,让小鼠恢复,标记为“水凝胶+MSCs”组。将20μl的dBECM/GelMA水凝胶预聚溶液注入到损伤区域,然后用405nm的蓝光照射30s进行光交联反应。随后,缝合切口,让小鼠恢复,标记为“水凝胶”组。未做任何治疗,仅缝合皮肤切口让其恢复的TBI小鼠即为对照组“TBI”组。
于治疗后第3天处死小鼠,取出脑进行观察。照片如图6所示,可以看到与未经治疗的TBI小鼠相比,“水凝胶+MSCs”组小鼠的脑组织的缺损面积明显更小且没有大量瘀血。“水凝胶”组小鼠的脑组织缺损面积介于其它两组之间。表明dBECM/GelMA复合水凝胶和封装MSCs的dBECM/GelMA复合水凝胶对TBI后的组织修复均有有益效果,且后者的效果更明显。
对比例
MSCs对TBI小鼠的组织修复效果评估
建立同实施例9的TBI小鼠模型,将20μl含有5×105个MSCs的细胞悬液注入到损伤区域,等待30s,防止液体流出。然后,缝合皮肤切口,让小鼠在损伤后恢复,标记为“MSCs”组。于治疗后第3天处死小鼠,取出脑进行观察。照片如图6所示,可以看到用MSCs治疗的TBI小鼠与未经治疗的TBI小鼠的脑在外观形态上没有明显区别,导致这一结果的原因可主要归结为两点:一是间充质干细胞悬液在注入损伤部位后因其较好的流动性,一部分间充质干细胞损失,无法在损伤部位形成有效的干细胞浓度;二是恶劣的损伤微环境不适宜于间充质干细胞的生存和生长,其移植存活率低。
而本发明封装MSCs的dBECM/GelMA复合水凝胶能够让间充质干细胞进入损伤区域并维持在损伤区域一段时间;同时,为植入的干细胞提供一个适合生存的环境。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (22)
1.一种再细胞化水凝胶,其特征在于,包含复合水凝胶以及间充质干细胞,所述复合水凝胶由甲基丙烯酰化明胶GelMA、脑脱细胞基质dBECM和光交联引发剂LAP混合后用波长405nm的蓝光照射进行光交联得到,其中,
GelMA和dBECM的质量比为1∶1-5∶1,
其中,利用以下步骤制备脑脱细胞基质dBECM:
a)冻融循环:将脑组织经液氮冷冻,融化后用PBS溶液清洗,重复冷冻、融化、清洗3-5次;
b)在振荡条件下进行化学酶解三个周期处理得到脱细胞基质:
第一周期:dH2O处理5-10h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第二周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第三周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
c)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脑脱细胞基质dBECM。
2.如权利要求1所述的再细胞化水凝胶,其特征在于,GelMA和dBECM的质量比为1.5∶1-5∶1。
3.如权利要求1所述的再细胞化水凝胶,其特征在于,GelMA和dBECM的质量比为2∶1。
4.如权利要求1所述的再细胞化水凝胶,其特征在于,所述复合水凝胶的孔径在30-100μm的范围内,孔隙率为60%-80%。
5.如权利要求1所述的再细胞化水凝胶,其特征在于,所述复合水凝胶的压缩模量为1.0-5.0kPa。
6.如权利要求1所述的再细胞化水凝胶,其特征在于,利用以下步骤制备甲基丙烯酰化明胶GelMA:
a')将明胶溶解于PBS溶液中,得到明胶溶液;
b')将甲基丙烯酸酐MA滴加到明胶溶液中,在40-60℃下搅拌2-3h,加入30-40℃的PBS溶液使反应停止;
c')用10-14kDa的透析袋将步骤b')所得溶液在45-50℃下透析,以除去未反应的甲基丙烯酸酐MA;
d')将透析后的溶液离心取上清液,冻干得到泡沫状的甲基丙烯酰化明胶GelMA。
7.一种如权利要求1所述的再细胞化水凝胶的制备方法,其特征在于,所述复合水凝胶的制备方法包括以下步骤:
i.提供LAP溶液;
ii.将甲基丙烯酰化明胶GelMA、脑脱细胞基质dBECM分别溶解于LAP溶液中得到GelMA溶液、dBECM溶液;
iii.将GelMA溶液、dBECM溶液混合得到水凝胶预聚溶液;
iv.用波长405nm的蓝光照射上述预聚溶液20-40s,得到所述复合水凝胶。
8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述复合水凝胶的制备方法包括以下步骤:
步骤1:利用冻融循环联合化学酶解周期处理的脱细胞方法制备dBECM,然后进行冷冻干燥,得到dBECM粉末并对其灭菌;
步骤2:利用典型的GelMA合成方法合成GelMA并冻干成泡沫状;
步骤3:分别将dBECM粉末和泡沫状GelMA溶于LAP溶液中并搅拌均匀,得到dBECM溶液和GelMA溶液,然后将两种溶液等体积混合得到预聚溶液;
步骤4:用波长405nm的蓝光照射上述预聚溶液30-40s,形成复合水凝胶。
9.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,利用以下步骤制备脑脱细胞基质dBECM:
a)冻融循环:将脑组织经液氮冷冻,融化后用PBS溶液清洗,重复冷冻、融化、清洗3-5次;
b)在振荡条件下进行化学酶解三个周期处理得到脱细胞基质:
第一周期:dH2O处理5-10h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第二周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第三周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
c)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脑脱细胞基质dBECM。
10.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,利用以下步骤制备脑脱细胞基质dBECM:
a)冻融循环:将脑组织经液氮冷冻,融化后用PBS溶液清洗,重复冷冻、融化、清洗3-4次;
b)在振荡条件下进行化学酶解三个周期处理得到脱细胞基质:
第一周期:dH2O处理6-8h、0.03-0.05g/mL脱氧胆酸钠处理12-16h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min、dH2O处理3-5h、2v/v%-4v/v%Triton X-100处理1.5-2.5h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min;
第二周期:dH2O处理3-5h、0.03-0.05g/mL脱氧胆酸钠处理10-14h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min、dH2O处理3-5h、2v/v%-4v/v%Triton X-100处理1.5-2.5h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min;
第三周期:dH2O处理3-5h、0.03-0.05g/mL脱氧胆酸钠处理10-14h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min、dH2O处理3-5h、2v/v%-4v/v%Triton X-100处理1.5-2.5h、PBS处理25-35min、DNaseⅠ处理50-70min、PBS处理25-35min;
c)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脑脱细胞基质dBECM。
11.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,利用以下步骤制备甲基丙烯酰化明胶GelMA:
a')将明胶溶解于PBS溶液中,得到明胶溶液;
b')将甲基丙烯酸酐MA滴加到明胶溶液中,在40-60℃下搅拌2-3h,加入30-40℃的PBS溶液使反应停止;
c')用10-14kDa的透析袋将步骤b')所得溶液在45-50℃下透析,以除去未反应的甲基丙烯酸酐MA;
d')将透析后的溶液离心取上清液,冻干得到泡沫状的甲基丙烯酰化明胶GelMA。
12.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述LAP溶液为LAP的PBS溶液,浓度为0.0025-0.0050g/mL。
13.如权利要求11所述的制备方法,其特征在于,明胶溶液的浓度为0.08-0.12g/mL。
14.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤ii)中,
将甲基丙烯酰化明胶GelMA加入LAP溶液,于45-60℃下搅拌5-15min得到GelMA溶液;
将脑脱细胞基质dBECM加入LAP溶液,于20-37℃下搅拌2-4h得到dBECM溶液。
15.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤iii)中,所述预聚溶液中GelMA、dBECM、LAP的含量分别为3-8w/v%、0.5-5w/v%、0.25-0.5w/v%。
16.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤iii)中,所述预聚溶液中GelMA的含量为5w/v%。
17.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,步骤iii)中,所述预聚溶液中dBECM的含量为2.5w/v%。
18.一种试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含:
组分a:脑脱细胞基质dBECM、甲基丙烯酰化明胶GelMA和光交联引发剂LAP的水凝胶预聚溶液;
组分b:间充质干细胞悬液;
其中,所述水凝胶预聚溶液与间充质干细胞悬液混合,注射到损伤区域后原位成胶,进行组织修复。
19.如权利要求18所述的试剂盒,其特征在于,利用以下步骤制备脑脱细胞基质dBECM:
a)冻融循环:将脑组织经液氮冷冻,融化后用PBS溶液清洗,重复冷冻、融化、清洗3-5次;
b)在振荡条件下进行化学酶解三个周期处理得到脱细胞基质:
第一周期:dH2O处理5-10h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第二周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
第三周期:dH2O处理2-6h、0.02-0.1g/mL脱氧胆酸钠处理10-24h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min、dH2O处理2-6h、1v/v%-5v/v%Triton X-100处理1-3h、PBS处理20-60min、DNaseⅠ处理45-90min、PBS处理20-60min;
c)将得到的脱细胞基质进行冷冻干燥得到粉末状脑脱细胞基质dBECM。
20.如权利要求18所述的试剂盒,其特征在于,利用以下步骤制备甲基丙烯酰化明胶GelMA:
a')将明胶溶解于PBS溶液中,得到明胶溶液;
b')将甲基丙烯酸酐MA滴加到明胶溶液中,在40-60℃下搅拌2-3h,加入30-40℃的PBS溶液使反应停止;
c')用10-14kDa的透析袋将步骤b')所得溶液在45-50℃下透析,以除去未反应的甲基丙烯酸酐MA;
d')将透析后的溶液离心取上清液,冻干得到泡沫状的甲基丙烯酰化明胶GelMA。
21.如权利要求1所述的再细胞化水凝胶或权利要求18所述的试剂盒的用途,其特征在于,用于制备治疗创伤性脑损伤的材料。
22.如权利要求21所述的用途,其特征在于,在治疗创伤性脑损伤的材料中,所述复合水凝胶诱导骨髓间充质干细胞向神经细胞分化。
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