CN113975462A - 一种多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，过程如下：S1、合成甲基丙烯酰胺改性明胶；S2、向步骤S1的溶液中加入用多巴胺采用酰胺化反应功能化甲基丙烯酰胺改性明胶；S3、将冻干的S1和S2单体在温度80℃下分别溶解于光引发剂中，制备成预聚的溶液；随后将其置于紫外点光光源下聚合即可得到多巴胺功能化的神经活性水凝胶。该水凝胶具有良好的多孔结构、溶胀性和与中枢神经组织相似的力学性能，该水凝胶中的显着促进三维培养神经干细胞的神经突触生长和的神经元方向分化；该水凝胶用于神经细胞递送在体内可显著促进脊髓损伤后的组织再生，是一种很有前景的神经干细胞载体。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料技术领域，具体涉及一种多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法。
背景技术
神经干细胞是存在于神经系统中，能够自我更新，具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能的干细胞。因此神经干细胞可直接替换损伤部位丢失的细胞，已经成为中枢神经系统损伤后细胞移植治疗的理想细胞来源。然而，由于缺乏适合的微环境和特定的诱导因素，移植的神经干细胞通常表现出低存活率和不可控的分化。例如，移植到损伤部位的神经干细胞主要分化成星形胶质细胞，可能导致神经胶质瘢痕的形成，从而抑制神经损伤后轴突生长。
细胞-细胞外基质相互作用机制之外，细胞命运还取决于许多信号分子介导的细胞之间相互信号传导，神经递质是神经系统中一类重要的化学信号分子，已有研究表明其在早期胚胎发生过程中对神经元生长、增殖和存活中起关键作用。而作为中枢神经系统中重要的神经递质多巴胺，对于胚胎期和成体海马神经元生长至关重要。多巴胺功能化的表面更能促进PC12细胞神经元突触生长。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的上述缺陷，提供一种多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，通过酰胺化反应在可光交联的甲基丙烯酸酯明胶水凝胶中共价引入神经递质多巴胺分子，合成多巴胺功能化的神经活性水凝胶，可用于后续的体内移植治疗应用。本发明所制备的多巴胺功能化水凝胶具有良好的多孔结构、溶胀性和与中枢神经组织相似的力学性能
本发明的目的可以通过采取如下技术方案达到：
一种多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
S1、合成甲基丙烯酰胺改性明胶：称取10％明胶(GEL)加入到磷酸缓冲盐溶液中，在50℃以下进行搅拌直至明胶完全溶解成澄清溶液；然后量取8％的甲基丙烯酸酐以0.5ml/min的速度缓慢滴加到上述溶液中，在50℃的条件下磁力搅拌连续反应3h后，使用50℃磷酸缓冲盐溶液(PBS)进行稀释以终止反应；随后将溶液置入12-14kDa的透析袋中，在50℃下的纯水中进行透析5～6天；将透析后的溶液在2000rpm下进行离心10min，取上层清液作为第一溶液，在冷冻干燥机中进行冻干5～6天，最终得到泡沫状的甲基丙烯酸改性明胶样品，即为第一单体，冷冻保存；S2、向步骤S1制备的第一溶液中加入用多巴胺采用酰胺化反应功能化甲基丙烯酰胺改性明胶：在50℃温度下，将1％甲基丙烯酰胺改性明胶溶于0.1MMES缓冲液，即2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，同时不断搅拌并鼓入N2以除去溶液中的氧气；待温度稳定后，向该溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)中一种或者组合，在50℃条件和N2气氛下充分搅拌反应15分钟以活化明胶链上的羧基；然后将盐酸多巴胺加入到该溶液，并通过滴加盐酸将溶液pH值调节至pH＝5，随后该溶液在N2保护下于50℃温度下搅拌，将混合溶液置入12-14kDa的透析袋中，在0.01mol/L盐酸中透析5～6天，最后用0.01mol/LNaOH进行中和，最终产物通过冻干得到第二单体；
S3、将所述第一单体和第二单体在温度80℃下分别溶解于浓度为0.5w/v％的光引发剂Irgacure 2959溶液中，“w/v”代表质量浓度，制备成浓度为1w/v％～5w/v％单体预聚溶液；并使用载体将单体预聚溶液置于紫外点光光源下聚合即可得到多巴胺功能化的神经活性水凝胶。
进一步地，所述甲基丙烯酸酐的比例为4％～12％。用甲基丙烯酸酐对明胶进行改性，在明胶分子链上进行结合，形成生物学性能优异的甲基丙烯酸酯明胶水凝胶；
进一步地，所述以活化明胶链上的羧基的过程中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)中一种或者组合的浓度范围为0.01g/mL～0.2g/mL。两者在碳二亚胺偶联反应中活化羧基，用来偶联伯胺形成酰胺，为常用的活化高分子链上活化羧基的方式。
进一步地，步骤S2中加入的盐酸多巴胺的浓度为0.01g/mL～0.1g/mL。上面步骤活化的羧基与多巴胺产生酰胺化反应，将多巴胺接枝到主链上，由于多巴胺为神经递质分子，使得改性凝胶具有神经活性。
进一步地，所述步骤S3中光引发剂Irgacure 2959溶液的浓度范围为0.1w/v％～2w/v％。光引发剂的浓度，直接决定了聚合链反应的聚合度，进而决定了最终凝胶的强度与状态，在此引发剂的浓度下，水凝胶的模量，溶胀和结构为最适于三维封装神经干细胞，同时利于神经细胞之间的相互交流，展现出更高的细胞活性和功能。
进一步地，所述步骤S3中单体预聚浓度为3w/v％。此单体预聚浓度为配合光引发剂，更利于凝胶的形成与稳定。
进一步地，所述步骤S3中多巴胺功能化的神经活性水凝胶的载体为载玻片、无纺布和敷贴中的一种。
进一步地，所述步骤S1中制备得到的第一单体置于-20℃的冰箱中冷冻保存。
进一步地，所述步骤S2中2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的pH＝6。缓冲溶液特性，在弱酸性条件下，羧基的活化与酰胺化反应可顺利进行。
进一步地，所述步骤S3中制备得到的多巴胺功能化的神经活性水凝胶置于37℃下的PBS溶液下浸泡24h，以除去未交联的单体。将未形成交联的短链祛除，凝胶内外的模量结构等均一稳定。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、多巴胺功能化明胶水凝胶在体外可以促进三维生长的神经突触生长、神经元分化和成熟，通过本发明制备方法制备的水凝胶可作为载体促进体内移植神经干细胞介导的神经再生，以用于脊髓损伤的修复。
2、多巴胺功能化水凝胶显著促进三维培养神经干细胞的神经突触生长和神经元方向分化；多巴胺功能化水凝胶用于神经干细胞递送在体内可显著促进脊髓损伤后的组织再生，是一种很有前景的神经干细胞载体。
3、本发明的制备工艺简单，多巴胺官能团可以在温和条件下较容易地接枝到本水凝胶链上，从而减少不必要的副作用对神经细胞的影响。
附图说明
图1是本发明实施例一中制备的多巴胺功能化的神经活性水凝胶扫描电子显微镜图；
图2是本发明实施例二中制备的纳米颗粒的扫描电子显微镜图；
图3是本发明实施例一中制备的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的核磁谱图；
图4是本发明实施例一中制备的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的紫外-可见吸收光谱图；
图5是多巴胺功能化的神经活性水凝胶内部的细胞死活染色荧光图；
图6是神经细胞在多巴胺功能化的神经活性水凝胶中神经球的生长情况示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
本实施例提供一种新型神经递质多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
T1、合成甲基丙烯酰胺改性明胶，具体过程如下：
先称取5g明胶(Gel)加入到50mL磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)中，在50℃以下进行搅拌直至明胶完全溶解成澄清溶液。然后量取4mL的甲基丙烯酸酐以0.5ml/min的速度缓慢滴加到上述溶液中，在50℃的条件下磁力搅拌连续反应3h后，使用50℃的200mL PBS溶液进行稀释以终止反应。随后将溶液置入透析袋(12-14kDa)中，在50℃下的纯水中进行透析5～6天。将透析后的溶液在2000rpm下进行离心10min，取上层清液作为第一溶液，在冷冻干燥机中进行冻干5～6天，最终得到泡沫状的甲基丙烯酸改性明胶样品，即为第一单体，置于-20℃的冰箱中保存。T2、向步骤T1的第一溶液中加入多巴胺，通过产生酰胺化反应以达到功能化甲基丙烯酰胺改性明胶，具体过程如下：
在50℃温度下，将1g甲基丙烯酸改性明胶溶于100mL 0.1M 2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液(MES缓冲液)(pH＝6)，同时不断搅拌并鼓入N2以除去溶液中的氧气。待温度稳定后，向该溶液中加入0.8g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和0.5gN-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合液，在50℃条件和N2气氛下充分搅拌反应15分钟以活化明胶链上的羧基。然后将1g盐酸多巴胺加入到该溶液，并通过滴加HCl将溶液pH值快速调节至pH＝5，随后该溶液在N2保护下于50℃温度下搅拌。将混合溶液装入透析袋(12-14kDa)中，在0.01mol/L HCl中的透析5～6天，最后用0.01mol/LNaOH进行中和；最终产物通过冻干得到第二单体；
T3、将所述第一单体和第二单体在温度80℃下分别溶解于浓度为0.5w/v％的光引发剂Irgacure 2959溶液中，“w/v”代表质量浓度，制备成浓度为3w/v％的单体预聚溶液。并使用盖玻片作为载体将其置于紫外点光光源下聚合即可得到多巴胺功能化的神经活性水凝胶；置于37℃下的PBS溶液下浸泡24h，以除去未交联的单体。
实施例二
本实施例提供一种新型神经递质多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
P1、合成甲基丙烯酰胺改性明胶，具体过程如下：
先称取5g明胶(Gel)加入到50mL PBS溶液中，在50℃以下进行搅拌直至明胶完全溶解成澄清溶液。然后量取6mL的甲基丙烯酸酐以0.5ml/min的速度缓慢滴加到上述溶液中，在50℃的条件下磁力搅拌连续反应3h后，使用50℃的200mL PBS溶液进行稀释以终止反应。随后将溶液置入透析袋(12-14kDa)中，在50℃下的纯水中进行透析5～6天。将透析后的溶液在2000rpm下进行离心10min，取上层清液作为第一溶液，在冷冻干燥机中进行冻干5～6天，最终得到泡沫状的甲基丙烯酸改性明胶样品，即为第一单体，置于-20℃的冰箱中保存。
P2、向步骤P1的第一溶液中加入用多巴胺采用酰胺化反应功能化甲基丙烯酰胺改性明胶，具体过程如下：
在50℃温度下，将1g甲基丙烯酸改性明胶溶于100mL 0.1M MES缓冲液(pH＝6)，同时不断搅拌并鼓入N2以除去溶液中的氧气。待温度稳定后，向该溶液中加入1g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和1g N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合液，在50℃条件和N2气氛下充分搅拌反应15分钟以活化明胶链上的羧基。然后将0.5g盐酸多巴胺加入到该溶液，并通过滴加HCl将溶液pH值快速调节至pH＝5，随后该溶液在N2保护下于50℃温度下搅拌。将混合溶液装入透析袋(12-14kDa)中，在0.01mol/L HCl中的透析5～6天，最后用0.01mol/LNaOH进行中和；最终产物通过冻干得到第二单体；
P3、将所述第一单体和第二单体在温度80℃下分别溶解于浓度为1.5w/v％的光引发剂Irgacure 2959溶液中，“w/v”代表质量浓度，制备成浓度为5w/v％的单体预聚溶液。并使用盖玻片作为载体将其置于紫外点光光源下聚合即可得到多巴胺功能化的神经活性水凝胶；置于37℃下的PBS溶液下浸泡24h，以除去未交联的单体。
对实施例一和实施例二进行性能分析如下：
图1是实施例一中制备的多巴胺功能化的神经活性水凝胶扫描电子显微镜图，从图中可以看出，其形貌分布均匀；
图2是实施例二中制备的纳米颗粒的扫描电子显微镜图，从图中可以看出，与实施例一相近，分布均匀，。
图3是实施例一中制备的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的核磁图谱，其中Gelatin为明胶，GelMA为甲基丙烯酰胺改性明胶，GelMADA为多巴胺功能化的神经活性水凝胶，从图中可以看出，甲基丙烯酰胺改性明胶(GelMA)在5.3ppm和5.5ppm新出现了两个属于甲基丙烯酰胺的质子峰，表明甲基丙烯酰胺已成功接枝到明胶分子上；通过核磁共振测试显示，多巴胺功能化甲基丙烯酰酸改性明胶(GelMADA)样品在大约7ppm出现了多巴胺邻苯二酚质子峰，证实成功地将多巴胺基团结合到明胶主链上。
图4是实施例一中制备的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的紫外-可见吸收光谱，从图中可以看出，证实在280nm处出现了属于邻苯二酚(多巴胺的功能基团)的单一吸收峰，并且在波长大于300nm没有其它的峰出现，表明功能化的邻苯二酚没有发生氧化。
图5时多巴胺功能化的神经活性水凝胶内部的细胞死活染色荧光图，可见细胞基本存活，密度很大并且分别均匀，在细胞三维培养7天后，观察到细胞快速增殖，神经细胞的神经球直径变大，通过共聚焦三维重建图发现神经细胞开始占据水凝胶内部空间，逐渐形成一个整体。而且培养7天后细胞存活率均可以达到80％以上。上述结果说明本研究合成的两种水凝胶中可以很好的适合神经细胞三维生长，同时也表明多巴胺功能化不影响神经细胞的存活。
图6是神经细胞在多巴胺功能化的神经活性水凝胶中神经球的生长情况，神经细胞的神经球在多巴胺功能化的神经活性水凝胶内也表现出了神经突起生长。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
S1、合成甲基丙烯酰胺改性明胶：称取10％明胶加入到磷酸缓冲盐溶液中，在50℃以下进行搅拌直至明胶完全溶解成澄清溶液；然后量取8％的甲基丙烯酸酐以0.5ml/min的速度缓慢滴加到上述溶液中，在50℃的条件下磁力搅拌连续反应3h后，使用50℃磷酸缓冲盐溶液进行稀释以终止反应；随后将溶液置入12-14kDa的透析袋中，在50℃下的纯水中进行透析5～6天；将透析后的溶液在2000rpm下进行离心10min，取上层清液作为第一溶液，在冷冻干燥机中进行冻干5～6天，最终得到泡沫状的甲基丙烯酸改性明胶样品，即为第一单体，冷冻保存；
S2、向步骤S1制备的第一溶液中加入用多巴胺采用酰胺化反应功能化甲基丙烯酰胺改性明胶：在50℃温度下，将1％甲基丙烯酰胺改性明胶溶于0.1M MES缓冲液，即2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液，同时不断搅拌并鼓入N2以除去溶液中的氧气；待温度稳定后，向该溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺中一种或者组合，在50℃条件和N2气氛下充分搅拌反应15分钟以活化明胶链上的羧基；然后将盐酸多巴胺加入到该溶液，并通过滴加盐酸将溶液pH值调节至pH＝5，随后该溶液在N2保护下于50℃温度下搅拌，将混合溶液置入12-14kDa的透析袋中，在0.01mol/L盐酸中透析5～6天，最后用0.01mol/LNaOH进行中和，最终产物通过冻干得到第二单体；
S3、将所述第一单体和第二单体在温度80℃下分别溶解于浓度为0.5w/v％的光引发剂Irgacure 2959溶液中，“w/v”代表质量浓度，制备成浓度为1w/v％～5w/v％单体预聚溶液；并使用载体将单体预聚溶液置于紫外点光光源下聚合即可得到多巴胺功能化的神经活性水凝胶。
2.根据权利要求1所述的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸酐的比例为4％～12％。
3.根据权利要求1所述的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述以活化明胶链上的羧基的过程中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基丁二酰亚胺中一种或者组合的浓度范围为0.01g/mL～0.2g/mL。
4.根据权利要求1所述的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S2中加入的盐酸多巴胺的浓度为0.01g/mL～0.1g/mL。
5.根据权利要求1所述的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，其特征在于其特征在于，所述步骤S3中光引发剂Irgacure 2959溶液的浓度范围为0.1w/v％～2w/v％。
6.根据权利要求1所述的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中单体预聚浓度为3w/v％。
7.根据权利要求1所述的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中多巴胺功能化的神经活性水凝胶的载体为载玻片、无纺布和敷贴中的一种。
8.根据权利要求1所述的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中制备得到的第一单体置于-20℃的冰箱中冷冻保存。
9.根据权利要求1所述的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中2-(N-吗啡啉)乙磺酸缓冲液的pH＝6。
10.根据权利要求1所述的多巴胺功能化的神经活性水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中制备得到的多巴胺功能化的神经活性水凝胶置于37℃下的PBS溶液下浸泡24h，以除去未交联的单体。
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