CN114848916A - 一种治疗脊髓损伤的携载中药单体及神经干细胞的导电性组织工程材料的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种治疗脊髓损伤的携载中药单体及神经干细胞的导电性组织工程材料的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：S1、电活性水凝胶制备；S2、高剂量川芎嗪‑电活性水凝胶制备；S3、携川芎嗪及神经干细胞电活性水凝胶制备；利用细胞移植技术将其与胚胎神经干细胞共培养，使胚胎神经干细胞负载于电活性水凝胶，构建导电性、组织相容性、可降解性及与脊髓匹配性等理化性质优良的新型复合材料，可显著提高胚胎神经干细胞的纯度、细胞活力、细胞增殖速度并可抑制胚胎神经干细胞的分化而维持其多能分化潜能。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体地说是一种治疗脊髓损伤的携载中药单体及神经干细胞的导电性组织工程材料的制备方法。
背景技术
脊髓损伤后神经修复困难一直是难以解决的难题。导电性组织工程材料在神经修复与再生领域展现出良好的应用前景。但是，电性组织工程材料的作用仅局限于改善脊髓局部电学微环境，有利于电传导通路的修复，对于脊髓损伤微环境、神经修复及神经细胞再生无明显改善作用，限制了疗效和应用。
目前应用较广泛的导电组织工程材料是电活性水凝胶，其可以填充脊髓空洞，提供电学微环境，并作为良好的载药平台。但是，其也有许多不足，特别是：
(1)对脊髓微环境改善不显著；
(2)单纯电活性水凝胶对脊髓损伤后神经修复促进作用有限；
(3)不具备神经保护作用，不能抑制继发性脊髓损伤病理反应；
(4)不能很好的匹配脊髓生理特性及力学特性。
发明内容
本发明的目的在于提出一种治疗脊髓损伤的携载中药单体及神经干细胞的导电性组织工程材料的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种治疗脊髓损伤的携载中药单体及神经干细胞的导电性组织工程材料的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
S1、电活性水凝胶制备；
S2、高剂量川芎嗪-电活性水凝胶制备；
S3、携川芎嗪及神经干细胞电活性水凝胶制备。
所述步骤S1具体内容包括：
(1)共混
①在4mlEP管中加入1ml去离子水，并用锡纸包裹住瓶身和盖子；
②4摄氏度冰箱取出光引发剂，解开封口膜，在暗室中称重，0.01g光引发剂，随后倒入离心管(避光操作)；
③将其摇匀后放置60摄氏度水浴锅加热，溶解至清澈液体，时间约5min；
④溶解后，在暗室中称取0.03g导电颗粒，将其导入锡纸中碾压，捣碎；同时称取0.1gGel，将其先后加入至EP管中；
⑤使用旋涡震荡器，使两种物质和溶液充分接触，呈下部黑色，上部略泡沫状，放入60摄氏度水浴锅中加热，约10min(锡箔纸包住，保持避光状态)；
⑥加热溶解，溶液呈均匀的炭黑色混悬液体状态；
(2)聚合
①采用PDMS制造模型，按照大鼠脊髓大小制作相应模具，即长2mm，宽2mm的模具孔；
②安装UV固化机，在避光状态，使用移液枪抽取10ulEP管中水凝胶液体，使其填充满模子(不可有气泡产生)，在自制UV箱中照射约20秒，使其由液态变为果冻状即可(紫外线照射时长决定其软硬程度，不可太硬，否则脆性增加)；
(3)灭菌
①使用镊子小心将其完整取出，放入75％酒精在4度环境浸泡3小时，每3小时更换一次酒精，共4次，即浸泡12小时；
②浸泡后用PBS冲洗三次，浸泡约2-4h。
所述步骤S2具体内容包括：
(1)共混
①配置川芎嗪溶液，高剂量川芎嗪组为300ug+100ml去离子水中
②在4mlEP管中加入1ml川芎嗪溶液，并用锡纸包裹住瓶身和盖子；
③4摄氏度冰箱取出光引发剂，解开封口膜，在暗室中称重，0.01g光引发剂，随后倒入离心管(避光操作)；
④将其摇匀后放置60摄氏度水浴锅加热，溶解至清澈液体，时间约5min；
⑤溶解后，在暗室中称取0.03g导电颗粒，将其导入锡纸中碾压，捣碎；同时称取0.1gGel，将其先后加入至EP管中；
⑥使用旋涡震荡器，使两种物质和溶液充分接触，呈下部黑色，上部略泡沫状，放入60摄氏度水浴锅中加热，约10min(锡箔纸包住，保持避光状态)
⑦加热溶解，溶液呈均匀的炭黑色混悬液体状态；
(2)聚合
①采用PDMS制造模型，按照大鼠脊髓大小制作相应模具，即长2mm，宽2mm的模具孔；
②安装UV固化机，在避光状态，使用移液枪抽取10ulEP管中水凝胶液体，使其填充满模子(不可有气泡产生)，在自制UV箱中照射约20秒，使其由液态变为果冻状即可(紫外线照射时长决定其软硬程度，不可太硬，否则脆性增加)；
(3)灭菌
①使用镊子小心将其完整取出，放入75％酒精在4度环境浸泡3小时，每3小时更换一次酒精，共4次，即浸泡12小时；
②浸泡后用PBS冲洗三次，浸泡约2-4h。
所述步骤S3具体内容包括：
应用本团队研发的公开号为CN110628706A中的方法和培养基体外提取并培养胚胎神经干细胞，将体外提取的胚胎神经干细胞与川芎嗪-电活性水凝胶共培养48h，无菌盐水冲洗后即可应用。
与现有技术相比，本发明有益效果如下：
本发明在电活性水凝胶的基础上，改善其配方，增加其导电性、组织相容性、可降解性及与脊髓匹配性等理化性质；同时利用细胞移植技术将其与胚胎神经干细胞共培养，使胚胎神经干细胞负载于该材料；最后，利用氢键可逆化学键将川芎嗪负载于电活性水凝胶实现可控缓释。本项目最终实现构建导电性、组织相容性、可降解性及与脊髓匹配性等理化性质优良的新型复合材料，该新型复合材料植入大鼠体内，可以以电活性水凝胶为支架提供电学微环境，其作为负载平台可以释放胚胎神经干细胞和川芎嗪，川芎嗪改善脊髓微环境发挥神经保护作用，为胚胎神经干细胞的增殖和分化提供良好环境，有利于移植的胚胎干细胞分化为神经元，促进神经修复。
本发明可显著提高胚胎神经干细胞的纯度、细胞活力、细胞增殖速度并可抑制胚胎神经干细胞的分化而维持其多能分化潜能，制备方法简单可行，疗效可靠。
附图说明
图1为本发明流程示意图。
具体实施方式
为阐明技术问题、技术方案、实施过程及性能展示，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释。本发明，并不用于限定本发明。以下将参考附图详细说明本公开的各种示例性实施例、特征和方面。附图中相同的附图标记表示功能相同或相似的元件。尽管在附图中示出了实施例的各种方面，但是除非特别指出，不必按比例绘制附图。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
另外，为了更好的说明本公开，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本公开同样可以实施。在一些实例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、元件和电路未作详细描述，以便于凸显本公开的主旨。
实施例1
如图1所示，一种治疗脊髓损伤的携载中药单体及神经干细胞的导电性组织工程材料的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
S1、电活性水凝胶制备；
S2、高剂量川芎嗪-电活性水凝胶制备；
S3、携川芎嗪及神经干细胞电活性水凝胶制备。
所述步骤S1具体内容包括：
(1)共混
①在4mlEP管中加入1ml去离子水，并用锡纸包裹住瓶身和盖子；
②4摄氏度冰箱取出光引发剂，解开封口膜，在暗室中称重，0.01g光引发剂，随后倒入离心管(避光操作)；
③将其摇匀后放置60摄氏度水浴锅加热，溶解至清澈液体，时间约5min；
④溶解后，在暗室中称取0.03g导电颗粒，将其导入锡纸中碾压，捣碎；同时称取0.1gGel，将其先后加入至EP管中；
⑤使用旋涡震荡器，使两种物质和溶液充分接触，呈下部黑色，上部略泡沫状，放入60摄氏度水浴锅中加热，约10min(锡箔纸包住，保持避光状态)；
⑥加热溶解，溶液呈均匀的炭黑色混悬液体状态；
(2)聚合
①采用PDMS制造模型，按照大鼠脊髓大小制作相应模具，即长2mm，宽2mm的模具孔；
②安装UV固化机，在避光状态，使用移液枪抽取10ulEP管中水凝胶液体，使其填充满模子(不可有气泡产生)，在自制UV箱中照射约20秒，使其由液态变为果冻状即可(紫外线照射时长决定其软硬程度，不可太硬，否则脆性增加)；
(3)灭菌
①使用镊子小心将其完整取出，放入75％酒精在4度环境浸泡3小时，每3小时更换一次酒精，共4次，即浸泡12小时；
②浸泡后用PBS冲洗三次，浸泡约2-4h。
所述步骤S2具体内容包括：
(1)共混
①配置川芎嗪溶液，高剂量川芎嗪组为300ug+100ml去离子水中
②在4mlEP管中加入1ml川芎嗪溶液，并用锡纸包裹住瓶身和盖子；
③4摄氏度冰箱取出光引发剂，解开封口膜，在暗室中称重，0.01g光引发剂，随后倒入离心管(避光操作)；
④将其摇匀后放置60摄氏度水浴锅加热，溶解至清澈液体，时间约5min；
⑤溶解后，在暗室中称取0.03g导电颗粒，将其导入锡纸中碾压，捣碎；同时称取0.1gGel，将其先后加入至EP管中；
⑥使用旋涡震荡器，使两种物质和溶液充分接触，呈下部黑色，上部略泡沫状，放入60摄氏度水浴锅中加热，约10min(锡箔纸包住，保持避光状态)
⑦加热溶解，溶液呈均匀的炭黑色混悬液体状态；
(2)聚合
①采用PDMS制造模型，按照大鼠脊髓大小制作相应模具，即长2mm，宽2mm的模具孔；
②安装UV固化机，在避光状态，使用移液枪抽取10ulEP管中水凝胶液体，使其填充满模子(不可有气泡产生)，在自制UV箱中照射约20秒，使其由液态变为果冻状即可(紫外线照射时长决定其软硬程度，不可太硬，否则脆性增加)；
(3)灭菌
①使用镊子小心将其完整取出，放入75％酒精在4度环境浸泡3小时，每3小时更换一次酒精，共4次，即浸泡12小时；
②浸泡后用PBS冲洗三次，浸泡约2-4h。
所述步骤S3具体内容包括：
应用本团队研发的公开号为CN110628706A中的方法和培养基体外提取并培养胚胎神经干细胞，将体外提取的胚胎神经干细胞与川芎嗪-电活性水凝胶共培养48h，无菌盐水冲洗后即可应用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (4)
1.一种治疗脊髓损伤的携载中药单体及神经干细胞的导电性组织工程材料的制备方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
S1、电活性水凝胶制备；
S2、高剂量川芎嗪-电活性水凝胶制备；
S3、携川芎嗪及神经干细胞电活性水凝胶制备。
2.根据权利要求1所述的一种治疗脊髓损伤的携载中药单体及神经干细胞的导电性组织工程材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S1具体内容包括：
(1)共混
①在4mlEP管中加入1ml去离子水，并用锡纸包裹住瓶身和盖子；
②4摄氏度冰箱取出光引发剂，解开封口膜，在暗室中称重，0.01g光引发剂，随后倒入离心管(避光操作)；
③将其摇匀后放置60摄氏度水浴锅加热，溶解至清澈液体，时间约5min；
④溶解后，在暗室中称取0.03g导电颗粒，将其导入锡纸中碾压，捣碎；同时称取0.1gGel，将其先后加入至EP管中；
⑤使用旋涡震荡器，使两种物质和溶液充分接触，呈下部黑色，上部略泡沫状，放入60摄氏度水浴锅中加热，约10min(锡箔纸包住，保持避光状态)；
⑥加热溶解，溶液呈均匀的炭黑色混悬液体状态；
(2)聚合
①采用PDMS制造模型，按照大鼠脊髓大小制作相应模具，即长2mm，宽2mm的模具孔；
②安装UV固化机，在避光状态，使用移液枪抽取10ulEP管中水凝胶液体，使其填充满模子(不可有气泡产生)，在自制UV箱中照射约20秒，使其由液态变为果冻状即可(紫外线照射时长决定其软硬程度，不可太硬，否则脆性增加)；
(3)灭菌
①使用镊子小心将其完整取出，放入75％酒精在4度环境浸泡3小时，每3小时更换一次酒精，共4次，即浸泡12小时；
②浸泡后用PBS冲洗三次，浸泡约2-4h。
3.根据权利要求1所述的一种治疗脊髓损伤的携载中药单体及神经干细胞的导电性组织工程材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S2具体内容包括：
(1)共混
①配置川芎嗪溶液，高剂量川芎嗪组为300ug+100ml去离子水中
②在4mlEP管中加入1ml川芎嗪溶液，并用锡纸包裹住瓶身和盖子；
③4摄氏度冰箱取出光引发剂，解开封口膜，在暗室中称重，0.01g光引发剂，随后倒入离心管(避光操作)；
④将其摇匀后放置60摄氏度水浴锅加热，溶解至清澈液体，时间约5min；
⑤溶解后，在暗室中称取0.03g导电颗粒，将其导入锡纸中碾压，捣碎；同时称取0.1gGel，将其先后加入至EP管中；
⑥使用旋涡震荡器，使两种物质和溶液充分接触，呈下部黑色，上部略泡沫状，放入60摄氏度水浴锅中加热，约10min(锡箔纸包住，保持避光状态)
⑦加热溶解，溶液呈均匀的炭黑色混悬液体状态；
(2)聚合
①采用PDMS制造模型，按照大鼠脊髓大小制作相应模具，即长2mm，宽2mm的模具孔；
②安装UV固化机，在避光状态，使用移液枪抽取10ulEP管中水凝胶液体，使其填充满模子(不可有气泡产生)，在自制UV箱中照射约20秒，使其由液态变为果冻状即可(紫外线照射时长决定其软硬程度，不可太硬，否则脆性增加)；
(3)灭菌
①使用镊子小心将其完整取出，放入75％酒精在4度环境浸泡3小时，每3小时更换一次酒精，共4次，即浸泡12小时；
②浸泡后用PBS冲洗三次，浸泡约2-4h。
4.根据权利要求1-3之一的一种治疗脊髓损伤的携载中药单体及神经干细胞的导电性组织工程材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S3具体内容包括：
应用本团队研发的公开号为CN110628706A中的方法和培养基体外提取并培养胚胎神经干细胞，将体外提取的胚胎神经干细胞与川芎嗪-电活性水凝胶共培养48h，无菌盐水冲洗后即可应用。
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- 2022-04-15 CN CN202210397845.3A patent/CN114848916A/zh active Pending
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