CN114533763A - 一种新型体外培育牛黄电结石方法 - Google Patents

一种新型体外培育牛黄电结石方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及中药原料药制备的技术领域，特别是涉及一种新型体外培育牛黄电结石方法，提供一种可以有效地提高胆汁酶促反应效率，缩短整体发酵时间，生产步骤简洁，提高牛黄体外凝结效率，降低能耗，安全性更高，得到的体外培育牛黄有效成分优于天然牛黄，达到中国药典2020年版对体外培育牛黄的要求；包括：S1胆汁处理；S2菌种繁殖：将大肠杆菌甘油菌种接种于扩增繁殖液体培养基中恒温培养6～7h；S3酶促反应：胆汁中加入发酵菌液水浴加热恒温震荡1～2h；S4灭菌处理；S5过滤沉淀；S6制备可聚沉胆汁胶体；S7凝结核准备：将牛黄颗粒插入针状银质电极负极，并浸泡至5％的稀盐酸中；S8牛黄电结石：将正负极同时插入至胆汁胶体中，控制牛黄颗粒缓慢转动；S9后处理。

Description

一种新型体外培育牛黄电结石方法
技术领域
本发明涉及牛黄培育的技术领域，特别是涉及一种新型体外培育牛黄电结石方法。
背景技术
牛黄，即牛的胆结石，是中医常用细贵药材，具有清热解毒、清心豁痰、开窍凉肝、镇惊消肿、强心利胆等功用，我国许多名贵中成药，如：安宫牛黄丸、六神丸等均以牛黄为主药配制而成。现代医学研究表明，牛黄对于大脑皮层电信号紊乱产生的惊厥有明显抑制作用，且有显著的强心作用，能明显增强心肌收缩力，增加心率，是中药中罕见地具有急救功效的珍贵药材。但是天然牛黄的自然发生率仅约千分之一，因此牛黄药源匮乏，价格昂贵，国家药品监督管理部门现已批准体外培育牛黄作为天然牛黄的等效替代品，现在我国体外培育牛黄的生产工艺已经成熟，临床应用也已经积累了丰富经验，并且体外培育牛黄在外观、结构、成分、药效上与天然牛黄基本相同，根据指纹图谱的对比，体外培育牛黄的有效成分含量更高，均一性更优，现有的体外培育牛黄的技术线路主要有两条：
第一种路线为：公告号为CN102429927B和CN102512457B提供的专利中提出：使用大肠杆菌、变形杆菌或肠球菌的单一菌种或组合菌种，直接加入胆汁中进行数天的发酵，或者在培养基中进行扩增培养后，使用超声波震荡破损菌体，使菌体内部的β-葡萄糖醛酸苷酶释放进入培养液，后加入胆汁中进行酶促反应，凝结时在胶体中加入酸性溶液作为促发剂，调节胆汁胶体PH值为弱酸性，打破胆汁胶体平衡状态，然后进行偏轴旋转，利用漩涡产生的向心力使悬浊颗粒向心聚集，从而产生牛黄凝结体。
该方法在胆汁发酵和酶促反应时间过长，并且由于偏轴旋转形成凝结核心难度较大，因此偏轴旋转凝结的速度缓慢，时间也较长，并且耗能较大，偏轴旋转凝结的效率很低。
第二种路线为：公告号为CN103690563B提供的专利中提出：通过使用活化壳聚糖作为螯合剂，将预制好的人造牛黄粉末喷涂螯合于牛黄成石核心上，不断喷涂聚集扩大，使之形成类似牛黄形态，该方法使得牛黄成型较为简单。
但是本方法中使用的壳聚糖等螯合剂本身并不是天然牛黄所应有的自然成分，牛黄产生药效是由包含多种微量成分参与复杂反应的结果，大量使用螯合剂将带来不确定的药理作用，壳聚糖、β-环糊精、白蛋白等螯合剂的使用使得牛黄成型更容易，但是缺乏药理学的安全论证。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种可以有效地提高胆汁酶促反应效率，缩短整体发酵时间，并且可以提高牛黄体外凝结效率，降低能耗，得到的体外培育牛黄有效成分与天然牛黄相似性的新型体外培育牛黄电结石方法。
本发明的一种新型体外培育牛黄电结石方法，包括以下步骤：
S1、胆汁处理：将新鲜牛胆汁使用400目无菌过滤网过滤去除残留肝胆组织，并将过滤后的胆汁水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃备用；
S2、菌种繁殖：将大肠杆菌甘油菌种(ATCC25922)接种于扩增繁殖液体培养基(质量比为1：1：1的LB肉汤培养基、EC肉汤培养基和胰酪大豆胨液体培养基混合均匀而成)中，并在36～38℃下恒温培养6～7h，得到发酵菌液，其中含有大量的β-葡萄糖醛酸苷酶；
S3、酶促反应：每1000ml处理后的胆汁中加入50ml富含β-葡萄糖醛酸苷酶的发酵菌液，混合均匀后，在36～38℃下水浴加热恒温震荡1～2h，水浴震荡进行进行酶促反应；
S4、灭菌处理：将经过酶促反应后的胆汁水浴加热至96～98℃，维持30min，完成高温灭菌，并使残留的酶失活，得到免超声振荡的发酵灭菌胆汁；
S5、过滤沉淀：每1000ml灭菌胆汁中添加1.5g氢氧化钙固体，充分搅拌后，加入灭菌胆汁等体积的纯水进行稀释，最后采用400目滤网将其中的沉淀物过滤出来，过滤出的沉淀物放入至真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h，得到胆红素钙盐沉淀；
S6、制备可聚沉胆汁胶体：将干燥沉淀物与胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌、硫酸镁和偏重亚硫酸钠混合均匀后，每1000ml过滤后的灭菌胆汁中添加700～2000g的混合物，搅拌混合得到浑浊的胆汁胶体；
S7、凝结核准备：将直径3mm的牛黄颗粒插入直径0.05mm的针状银质电极，并将牛黄颗粒浸泡至5％的稀盐酸中2～3min；
S8、牛黄电结石：将插有牛黄颗粒的针状银质电极接入负极，另一针状银质电极接入正极，将正负极同时插入至待凝结的胆汁胶体中，并控制牛黄颗粒缓慢转动，牛黄颗粒快速凝结，3min左右停止增大，将其取出并浸入至5％稀盐酸中2～3min，重复上述步骤直至牛黄颗粒不再变大，牛黄微粒分层吸附于牛黄凝结核心之上，形成层纹结构；
正负极之间的距离为5～7cm，并且插有牛黄颗粒的负极针状银质电极以2cm为半径进行圆周运动，旋转的角速度为1.5～2πrad/s，连接高压电泳仪电源，调节正负极通电电压为750～1300V，电流为25～30mA，并且正负极的通电电压和电流随着正负极之间距离的增加而增大；
S9、后处理：将培育后的牛黄颗粒取下后置于-5℃冷冻保存5h，再放入真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h。
具体的，S6中的干燥沉淀物与其他物料的使用质量份数为：
Figure BDA0003508556830000041
与现有技术相比本发明的有益效果为：
本发明将大肠杆菌优先培养于新型液体培养基中，相比于现有的胆汁培养，可以加快繁殖速度，使大肠杆菌产生的胞内酶β-葡萄糖醛酸苷酶随着分裂繁殖而大量的释放到培养基中，从而无需超声破破碎菌体，可以得到更高的反应速度的反应效率，将发酵时间由2～3天减少至7～8h，并且产率相同；
并且本发明中未添加肠球菌、变形杆菌等，减少α毒素、θ毒素等的产生，本发明将大肠杆菌(ATCC25922)作为发酵菌种，避免产生毒素的潜在风险；
本发明通过电结石技术产生的洛伦兹力代替传统的偏轴旋转机械运动，使用3mm左右的牛黄颗粒作为凝结核，使牛黄小颗粒更容易附着，使用电泳的原理，通过异性电荷的吸引，配合盐酸中带正电的氢离子，使牛黄小颗粒更高效的分层吸附，实现体外培育牛黄更快的凝结速度和更高的产率，电结石时间耗时短，消耗能量低，将原有的依靠机械偏轴旋转的方法将凝结时间从5～12h缩短至30min；
本发明改进为通过改变胶体内局部电荷分布，使胶粒自然凝结，不添加螯合物，更加逼近天然牛黄的形成过程和组成成分，避免螯合物对药效产生的影响和未知安全隐患；
且产出体外培育牛黄经液相色谱仪多批次化验测试，各种药物活性成分含量不低于现有培育方法体外培育的牛黄和天然牛黄，满足药用需求，胆酸、结合胆红素、游离胆红素、水分等的含量均满足中国药典(2020版)对于体外培育牛黄的要求。
附图说明
图1是本发明培育的牛黄和坦然牛黄的各成分含量对比图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：胆汁发酵方式对比
现有技术试验1：
1.处理牛胆汁：将新鲜牛胆汁过滤去除残留肝胆组织，水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃；
2.直接将大肠杆菌菌种(ATCC25922)加入1000ml胆汁；
3.将1000ml接种大肠杆菌(ATCC25922)的胆汁在37℃水浴恒温震荡发酵，发酵6h；
4.将完成发酵的胆汁高温灭菌，保持96～98℃，30min；
5.加入1.5g氢氧化钙搅拌溶解，然后加热至常温常压下沸腾30min；
6.将胆汁通过400目滤网过滤，发现不产生沉淀。
结果证明：可溶性胆红素葡萄糖醛酸脂并为被水解产生不溶性的胆红素钙，所以并未发生酶促反应。
现有技术试验2：
1.处理牛胆汁：将新鲜牛胆汁过滤去除残留肝胆组织，水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃；
2.直接将大肠杆菌菌种(ATCC25922)加入1000ml胆汁；
3.将1000ml接种大肠杆菌(ATCC 25922)的胆汁在37℃水浴恒温震荡发酵，发酵24h；
4.将完成发酵的胆汁高温灭菌，保持96～98℃，30min；
5.加入1.5g氢氧化钙搅拌溶解，然后加热至常温常压下沸腾30min；
6.将胆汁通过400目滤网过滤，然后将沉淀物放入真空干燥箱中，将压力降至0.085Mpa,干燥24h；
7.计量沉淀物干重，产生3.5g沉淀。
结果证明：已经开始产生酶促反应，但是不能确定酶促反应是否已进行完毕。
现有技术试验3：
1.处理牛胆汁：将新鲜牛胆汁过滤去除残留肝胆组织，水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃；
2.将大肠杆菌菌种(ATCC25922)加入1000ml胆汁；
3.将1000ml接种大肠杆菌(ATCC25922)的胆汁在37℃水浴恒温震荡发酵，发酵48h；
4.将完成发酵的胆汁高温灭菌，保持96～98℃，30min；
5.加入1.5g氢氧化钙搅拌溶解，然后加热至常温常压下沸腾30min；
6.将胆汁通过400目滤网过滤，然后将沉淀物放入真空干燥箱中，将压力降至0.085Mpa,干燥24h；
7.计量沉淀物干重，产生8g沉淀，
结果证明：产生酶促反应，但是不能确定酶促反应是否已经进行完毕。
现有技术试验4：
1.处理牛胆汁：将新鲜牛胆汁过滤去除残留肝胆组织，水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃；
2.将大肠杆菌菌种(ATCC25922)加入1000ml胆汁；
3.将1000ml接种大肠杆菌(ATCC25922)的胆汁在37℃水浴恒温震荡发酵，发酵60h；
4.将完成发酵的胆汁高温灭菌，保持96～98℃，30min；
5.加入1.5g氢氧化钙搅拌溶解，然后加热至常温常压下沸腾30min；
6.将胆汁通过400目滤网过滤，然后将沉淀物放入真空干燥箱中，将压力降至0.085Mpa,干燥24h；
7.计量沉淀物干重，产生8g沉淀。
结果证明：与发酵48小时产生等量沉淀，说明产生酶促反应，且48小时发酵所产生的β葡萄糖醛酸苷酶已经足以将胆汁中的葡萄糖醛酸酯全部反应完毕。
本发明的胆汁发酵方式：
1.处理牛胆汁：将新鲜牛胆汁过滤去除残留肝胆组织，水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃；
2.将大肠杆菌菌种(ATCC25922)加入50ml新型液体培养基(将LB肉汤培养基、EC肉汤培养基与胰酪大豆胨液体培养基按照1：1：1的比例混合均匀制成扩增繁殖液体培养基)，在37℃水浴恒温震荡发酵，发酵6h；
3.将扩增繁殖的富含β-葡萄糖醛酸苷酶的大肠杆菌液体培养基加入至1000ml胆汁中，36～38℃搅拌2h，进行酶促反应；
4.将完成酶促反应的胆汁高温灭菌，保持96～98℃，30min；
5.加入1.5g氢氧化钙搅拌溶解，然后加热至常温常压下沸腾；
6.将胆汁通过400目滤网过滤，然后将沉淀物放入真空干燥箱中，将压力降至0.085Mpa,干燥24h；
7.计量沉淀物干重，产生8g沉淀。
Figure DA00035085568361217714
结果证明：本发明的胆汁发酵方法与现有的直接将大肠杆菌(ATCC25922)加入胆汁发酵48h所产生沉淀的质量相等，说明产生酶促反应，且反应进行完毕，6h新型液体培养基发酵所产生的β-葡萄糖醛酸苷酶已经足以将胆汁中的葡萄糖醛酸酯全部反应完毕，与现有技术试验3中48h胆汁发酵的效果一致。
本发明提供一种更快速的胆汁发酵方式，与现有技术相比，可以得到更高的反应速度的反应效率，将发酵时间由2～3天减少至7～8h，并且产率相同，本发明将大肠杆菌优先培养于新型液体培养基中，相比于现有的胆汁培养，可以加快繁殖速度，使大肠杆菌产生的胞内酶β-葡萄糖醛酸苷酶随着分裂繁殖而大量的释放到培养基中，从而无需超声破破碎菌体。
实施例2：牛黄凝结方式对比
现有技术试验：
1.在1000g成石胆汁中加入1.2g偏重亚硫酸钠；
2.按照1:1的体积比，加入纯化水搅拌均匀；
3.将成石胆汁的pH值调节为6.5；
4.将成石胆汁装入底部半径5cm，高20cm的圆柱形容器中进行偏轴定向旋转，容器中线与水平线夹角60°，旋转半径20cm，旋转角速度4πrad/s；
5.偏轴旋转10小时；
6.取出圆形结石；
7.干燥培育完成的牛黄颗粒取下置于-5℃冷冻保存5h，然后放入真空干燥箱中，将压力降至0.085Mpa,干燥24h；
8.称得干重为60g。
本发明的电结石试验1：
1.首先将一颗直径约为3mm的牛黄颗粒作为凝结核，插入直径为0.05mm的针状银质电极末端，并浸泡于5％稀盐酸溶液中3min，然后将牛黄颗粒浸入至成石但还胶体中，并将插有牛黄颗粒的针状银质电极接电极负极，将同为银质的正极放入成石胆汁胶体中；
2.两极相隔10cm；
3.调节电压至300v-320v，电流为5mA；
4.将牛黄颗粒在胆汁胶体中缓缓搅动，使牛黄颗粒做圆周运动，以距离正极10cm的质点为圆心半径2cm做圆周运动，角速度1.5πrad/s；
5.牛黄颗粒以很慢的速度凝结，30分钟后牛黄凝结颗粒仅增加了0.5g重量；
6.重复操作并不能使牛黄凝结颗粒生长速度加快，可凝结胆汁胶体颜色也并未发现明显改变；
7.培育完成的牛黄颗粒取下置于-5℃冷冻保存5h，然后放入真空干燥箱中，将压力降至0.085Mpa,干燥24h；
8.称得干重为1.5g。
本发明的电结石试验2：
1.首先将一颗直径约为3mm的牛黄颗粒作为凝结核，插入直径为0.05mm的针状银质电极末端，并浸泡于5％稀盐酸溶液中3min，然后将牛黄颗粒浸入至成石但还胶体中，并将插有牛黄颗粒的针状银质电极接电极负极，将同为银质的正极放入成石胆汁胶体中；
2.两极相隔5cm；
3.调节电压至750v-800v，电流为25mA；
4.将牛黄颗粒在胆汁胶体中缓缓搅动，使牛黄颗粒做圆周运动，以距离正极5cm的质点为圆心半径2cm做圆周运动，角速度1.5πrad/s；
5.牛黄颗粒会快速凝结，大约3min后牛黄颗粒停止增大，此时取出牛黄凝结颗粒浸泡于5％稀盐酸中3min，重复上述操作；
6.可凝结胆汁胶体的颜色发生明显改变，由棕红色变为透明浅黄色；
7.新的带电胶粒继续向牛黄颗粒凝聚，使牛黄颗粒不断增大，且随着操作次数的增加，形成类似天然牛黄的层纹结构；
8.培育完成的牛黄颗粒取下置于-5℃冷冻保存5h，然后放入真空干燥箱中，将压力降至0.085Mpa,干燥24h；
9.称得干重为60g。
本发明的电结石试验3：
1.首先将一颗直径约为3mm的牛黄颗粒作为凝结核，插入直径为0.05mm的针状银质电极末端，并浸泡于5％稀盐酸溶液中3min，然后将牛黄颗粒浸入至成石但还胶体中，并将插有牛黄颗粒的针状银质电极接电极负极，将同为银质的正极放入成石胆汁胶体中；
2.两极相隔7cm；
3.调节电压至1260v-1300v，电流为30mA；
4.将牛黄小颗粒在胆汁胶体中缓缓搅动，使牛黄颗粒做圆周运动，以距离正极7cm的质点为圆心半径2cm做圆周运动，角速度2πrad/s；
5.牛黄颗粒会快速凝结，大约3min后牛黄颗粒停止增大，此时取出牛黄凝结颗粒浸泡于5％稀盐酸中3min，重复上述操作；
6.可凝结胆汁胶体的颜色发生明显改变，由棕红色变为透明浅黄色；
7.新的带电胶粒继续向牛黄颗粒凝聚，使牛黄颗粒不断增大，且随着操作次数的增加，形成类似天然牛黄的层纹结构；
8.培育完成的牛黄颗粒取下置于-5℃冷冻保存5h，然后放入真空干燥箱中，将压力降至0.085Mpa,干燥24h；
9.称得干重为60g。
本发明的电结石试验4：
1.首先将一颗直径约为3mm的牛黄颗粒作为凝结核，插入直径为0.05mm的针状银质电极末端，并浸泡于5％稀盐酸溶液中3min，然后将牛黄颗粒浸入至成石但还胶体中，并将插有牛黄颗粒的针状银质电极接电极负极，将同为银质的正极放入成石胆汁胶体中；
2.两极相隔7cm；
3.调节电压至1260v-1300v，电流为30mA；
4.将牛黄小颗粒在胆汁胶体中缓缓搅动，搅动方式为使牛黄颗粒做圆周运动，以距离正极7cm的质点为圆心半径2cm做圆周运动，角速度4πrad/s；
5.胶体中的带电胶粒在牛黄颗粒的表面发生凝结并聚沉，最终变成沉淀聚集于反应容器底部；
6.可凝结胆汁胶体的颜色发生明显改变，由棕红色变为透明浅黄色；
7.重复操作30min，牛黄颗粒并没有显著变大，但可以发现胆汁中凝结物质已经凝结，并沉淀于反应容器底部；
8.培育完成的牛黄颗粒取下置于-5℃冷冻保存5h，然后放入真空干燥箱中，将压力降至0.085Mpa,干燥24h；
9.称得干重为15g。
Figure BDA0003508556830000111
胆汁胶体中胶粒带有同种负电荷，彼此相斥形成稳定体系，将牛黄颗粒使用5％稀盐酸浸泡后，可以靠表层带正电的氢离子打破局部的平衡状态，并通过牛黄颗粒缝隙中完全电离的盐酸溶液形成导电的离子通道，加速对带负电荷胶粒的吸附，从而快速形成牛黄凝结颗粒，适当速度的搅拌可以加速补充凝结颗粒周围立体空间的胶粒，并且避免附着的胶粒在过快的流体冲击下脱落；
本发明通过电结石技术产生的洛伦兹力代替传统的偏轴旋转机械运动，使带有负电荷的胶粒快速凝结于结石核心之上，从而实现体外培育牛黄更快的凝结速度和更高的产率，电结石时间耗时短，消耗能量低，将原有的依靠机械偏轴旋转的方法将凝结时间从5～12h缩短至30min。
实施例3
一种新型体外培育牛黄电结石方法，包括以下步骤：
S1、胆汁处理：将新鲜牛胆汁使用400目无菌过滤网过滤去除残留肝胆组织，并将过滤后的胆汁水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃备用；
S2、菌种繁殖：将大肠杆菌甘油菌种(ATCC25922)接种于扩增繁殖液体培养基(质量比为1：1：1的LB肉汤培养基、EC肉汤培养基和胰酪大豆胨液体培养基混合均匀而成)中，并在36～38℃下恒温培养7h，得到发酵菌液，其中含有大量的β-葡萄糖醛酸苷酶；
S3、酶促反应：每1000ml处理后的胆汁中加入50ml富含β-葡萄糖醛酸苷酶的发酵菌液，混合均匀后，在36～38℃下水浴加热恒温震荡2h，水浴震荡进行进行酶促反应；
S4、灭菌处理：将经过酶促反应后的胆汁水浴加热至96～98℃，维持30min，完成高温灭菌，并使残留的酶失活，得到免超声振荡的发酵灭菌胆汁；
S5、过滤沉淀：每1000ml灭菌胆汁中添加1.5g氢氧化钙固体，充分搅拌后，加入灭菌胆汁等体积的纯水进行稀释，最后采用400目滤网将其中的胆红素钙盐沉淀过滤出来，过滤出的沉淀物放入至真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h，得到胆红素钙盐沉淀；
S6、制备可聚沉胆汁胶体：将干燥沉淀物与胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌、硫酸镁和偏重亚硫酸钠混合均匀后，每1000ml过滤后的灭菌胆汁中添加700g的混合物，搅拌混合得到浑浊的胆汁胶体，干燥沉淀物与其他物料的使用质量份数为：
Figure BDA0003508556830000131
S7、凝结核准备：将直径3mm的牛黄颗粒插入直径0.05mm的针状银质电极末端，并将牛黄颗粒浸泡至5％的稀盐酸中3min；
S8、牛黄电结石：将正负极同时插入至待凝结的胆汁胶体中，将插有牛黄颗粒的针状银质电极接入负极，另一针状银质电极接入正极，并控制牛黄颗粒缓慢转动，牛黄颗粒快速凝结，3min左右停止增大，将其取出并浸入至5％稀盐酸中3min，重复上述步骤直至牛黄颗粒不再变大，牛黄微粒分层吸附于牛黄凝结核心之上，形成层纹结构；
正负极之间的距离为5cm，并且插有牛黄颗粒的负极针状银质电极以2cm为半径进行圆周运动，旋转的角速度为1.5πrad/s，连接高压电泳仪电源，调节正负极通电电压为750～800V，电流为25mA；
S9、后处理：将培育后的牛黄颗粒取下后置于-5℃冷冻保存5h，再放入真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h。
实施例4
一种新型体外培育牛黄电结石方法，包括以下步骤：
S1、胆汁处理：将新鲜牛胆汁使用400目无菌过滤网过滤去除残留肝胆组织，并将过滤后的胆汁水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃备用；
S2、菌种繁殖：将大肠杆菌甘油菌种(ATCC25922)接种于扩增繁殖液体培养基(质量比为1：1：1的LB肉汤培养基、EC肉汤培养基和胰酪大豆胨液体培养基混合均匀而成)中，并在36～38℃下恒温培养7h，得到发酵菌液，其中含有大量的β-葡萄糖醛酸苷酶；
S3、酶促反应：每1000ml处理后的胆汁中加入50ml富含β-葡萄糖醛酸苷酶的发酵菌液，混合均匀后，在36～38℃下水浴加热恒温震荡2h，水浴震荡进行进行酶促反应；
S4、灭菌处理：将经过酶促反应后的胆汁水浴加热至96～98℃，维持30min，完成高温灭菌，并使残留的酶失活，得到免超声振荡的发酵灭菌胆汁；
S5、过滤沉淀：每1000ml灭菌胆汁中添加1.5g氢氧化钙固体，充分搅拌后，加入灭菌胆汁等体积的纯水进行稀释，最后采用400目滤网将其中的胆红素钙盐沉淀过滤出来，过滤出的沉淀物放入至真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h，得到胆红素钙盐沉淀；
S6、制备可聚沉胆汁胶体：将干燥沉淀物与胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌、硫酸镁和偏重亚硫酸钠混合均匀后，每1000ml过滤后的灭菌胆汁中添加1380g的混合物，搅拌混合得到浑浊的胆汁胶体，干燥沉淀物与其他物料的使用质量份数为：
Figure BDA0003508556830000141
Figure BDA0003508556830000151
S7、凝结核准备：将直径3mm的牛黄颗粒插入直径0.05mm的针状银质电极末端，并将牛黄颗粒浸泡至5％的稀盐酸中3min；
S8、牛黄电结石：将正负极同时插入至待凝结的胆汁胶体中，将插有牛黄颗粒的针状银质电极接入负极，另一针状银质电极接入正极，并控制牛黄颗粒缓慢转动，牛黄颗粒快速凝结，3min左右停止增大，将其取出并浸入至5％稀盐酸中3min，重复上述步骤直至牛黄颗粒不再变大，牛黄微粒分层吸附于牛黄凝结核心之上，形成层纹结构；
正负极之间的距离为6cm，并且插有牛黄颗粒的负极针状银质电极以2cm为半径进行圆周运动，旋转的角速度为1.8πrad/s，连接高压电泳仪电源，调节正负极通电电压为970～1030V，电流为28mA；
S9、后处理：将培育后的牛黄颗粒取下后置于-5℃冷冻保存5h，再放入真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h。
实施例5
一种新型体外培育牛黄电结石方法，包括以下步骤：
S1、胆汁处理：将新鲜牛胆汁使用400目无菌过滤网过滤去除残留肝胆组织，并将过滤后的胆汁水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃备用；
S2、菌种繁殖：将大肠杆菌甘油菌种(ATCC25922)接种于扩增繁殖液体培养基(质量比为1：1：1的LB肉汤培养基、EC肉汤培养基和胰酪大豆胨液体培养基混合均匀而成)中，并在36～38℃下恒温培养7h，得到发酵菌液，其中含有大量的β-葡萄糖醛酸苷酶；
S3、酶促反应：每1000ml处理后的胆汁中加入50ml富含β-葡萄糖醛酸苷酶的发酵菌液，混合均匀后，在36～38℃下水浴加热恒温震荡2h，水浴震荡进行进行酶促反应；
S4、灭菌处理：将经过酶促反应后的胆汁水浴加热至96～98℃，维持30min，完成高温灭菌，并使残留的酶失活，得到免超声振荡的发酵灭菌胆汁；
S5、过滤沉淀：每1000ml灭菌胆汁中添加1.5g氢氧化钙固体，充分搅拌后，加入灭菌胆汁等体积的纯水进行稀释，最后采用400目滤网将其中的胆红素钙盐沉淀过滤出来，过滤出的沉淀物放入至真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h，得到胆红素钙盐沉淀；
S6、制备可聚沉胆汁胶体：将干燥沉淀物与胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌、硫酸镁和偏重亚硫酸钠混合均匀后，每1000ml过滤后的灭菌胆汁中添加2000g的混合物，搅拌混合得到浑浊的胆汁胶体，干燥沉淀物与其他物料的使用质量份数为：
Figure BDA0003508556830000161
S7、凝结核准备：将直径3mm的牛黄颗粒插入直径0.05mm的针状银质电极末端，并将牛黄颗粒浸泡至5％的稀盐酸中3min；
S8、牛黄电结石：将正负极同时插入至待凝结的胆汁胶体中，将插有牛黄颗粒的针状银质电极接入负极，另一针状银质电极接入正极，并控制牛黄颗粒缓慢转动，牛黄颗粒快速凝结，3min左右停止增大，将其取出并浸入至5％稀盐酸中3min，重复上述步骤直至牛黄颗粒不再变大，牛黄微粒分层吸附于牛黄凝结核心之上，形成层纹结构；
正负极之间的距离为7cm，并且插有牛黄颗粒的负极针状银质电极以2cm为半径进行圆周运动，旋转的角速度为2πrad/s，连接高压电泳仪电源，调节正负极通电电压为1260～1300V，电流为30mA；
S9、后处理：将培育后的牛黄颗粒取下后置于-5℃冷冻保存5h，再放入真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h。
将以上实施例3-5制备出的牛黄颗粒进行药物活性测定，得到如下结果：
Figure BDA0003508556830000171
由此可以证明，如图1所示，本发明的新型体外培育牛黄的电结石方法培育出的牛黄，其中的各种药物活性成分含量不低于老式培育方法所产体外培育牛黄与天然牛黄，满足药用需求。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种新型体外培育牛黄电结石方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、胆汁处理：将新鲜牛胆汁过滤去除残留的肝胆组织，并将过滤后的胆汁水浴加热至96～98℃，保持10min，然后降温至36～38℃备用；
S2、菌种繁殖：将大肠杆菌甘油菌种接种于扩增繁殖液体培养基中，并在36～38℃下恒温培养6～7h，得到发酵菌液；
S3、酶促反应：每1000ml处理后的胆汁中加入50ml发酵菌液，混合均匀后，在36～38℃下水浴加热恒温震荡1～2h，进行酶促反应；
S4、灭菌处理：将经过酶促反应后的胆汁加热至96～98℃，维持30min，完成高温灭菌，并使残留的酶失活，得到灭菌胆汁；
S5、过滤沉淀：每1000ml灭菌胆汁中添加1.5g氢氧化钙固体，充分搅拌后，加入灭菌胆汁等体积的纯水进行稀释，最后将其中的沉淀物过滤出来；
S6、制备可聚沉胆汁胶体：将干燥沉淀物与胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌、硫酸镁和偏重亚硫酸钠混合均匀后，每1000ml过滤后的灭菌胆汁中添加700～2000g的混合物，搅拌混合得到浑浊的胆汁胶体；
S7、凝结核准备：将直径3mm的牛黄颗粒插入直径0.05mm的针状银质电极，并将牛黄颗粒浸泡至5％的稀盐酸中；
S8、牛黄电结石：将插有牛黄颗粒的针状银质电极接入负极，另一针状银质电极接入正极，将正负极同时插入至待凝结的胆汁胶体中，并控制牛黄颗粒缓慢转动，直至牛黄颗粒停止变大，将其取出并浸入至5％稀盐酸中，重复上述步骤直至牛黄颗粒不再变大；
S9、后处理：将培育后的牛黄颗粒取下后冷冻，并干燥处理。
2.如权利要求1所述的一种新型体外培育牛黄电结石方法，其特征在于，所述S2中所用的扩增繁殖液体培养基由质量比为1：1：1的LB肉汤培养基、EC肉汤培养基和胰酪大豆胨液体培养基混合均匀而成。
3.如权利要求1所述的一种新型体外培育牛黄电结石方法，其特征在于，在S5中过滤沉淀采用400目滤网过滤，过滤出的沉淀物放入至真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h。
4.如权利要求1所述的一种新型体外培育牛黄电结石方法，其特征在于，所述S6中的干燥沉淀物与其他物料的使用质量份数为：
Figure FDA0003508556820000021
5.如权利要求1所述的一种新型体外培育牛黄电结石方法，其特征在于，所述S7和S8中，牛黄颗粒在5％的稀盐酸中的浸泡时间均为2～3min。
6.如权利要求1所述的一种新型体外培育牛黄电结石方法，其特征在于，所述S8中，正负极之间的距离为5～7cm，并且正负极通电电压为750～1300V，电流为25～30mA，并且正负极的通电电压和电流随着正负极之间距离的增加而增大。
7.如权利要求1所述的一种新型体外培育牛黄电结石方法，其特征在于，所述S8中，插有牛黄颗粒的负极针状银质电极以2cm为半径进行圆周运动，并且旋转的角速度为1.5～2πrad/s。
8.如权利要求1所述的一种新型体外培育牛黄电结石方法，其特征在于，所述S9中后处理的具体步骤为将培育后的牛黄颗粒取下后置于－5℃冷冻保存5h，再放入真空干燥箱中，0.085Mpa干燥24h。
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