CN1164276C - 利用天然牛胆汁在动物牛体外培育药用牛胆结石的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用天然牛胆汁在动物牛体外培育药用牛胆结石的方法。先对天然牛胆汁进行牛磺酸调节和细菌发酵，制取发酵牛胆汁。在发酵牛胆汁中加入澄清饱和钙盐溶液，搅拌、加热至沸，滤取棕红色沉淀物，对其加水进行搅拌、洗涤，静置滤去上清液后，根据药用要求加入胆红素、胆酸、去氧胆酸、无机盐等药用有效成份，搅拌混匀，制取复合胆红素钙。按适当的比例定量取出发酵牛胆汁和复合胆红素钙，加入水溶液进行搅拌后，用酸性溶液调节其pH值在6.8以下，对其进行偏轴定向旋转，待结石形成后静置培育，取出结石进行干燥处理。其产品的性状、结构、成份及其含量、药效及临床疗效均与优质天然牛黄一致，并且质量稳定、成石率高，能规模化生产。
Description
一、技术领域
本发明属于制药技术领域，特别涉及一种中药原料药的制造方法。
二、背景技术
牛胆结石即牛黄，是珍贵的中药材。它具有清心、豁痰、开窍、凉肝、息风、清热解毒等功用。我国许多名贵中成药，如：安宫牛黄丸、六神丸等均以牛黄为主药配制而成。但是牛体内自然成石率仅为1～2％，因此，药源奇缺，价格昂贵、依赖进口，不仅花费了大量的外汇，而且也制约了我国传统医药工业的发展。
1956年以来，我国的医药工作者积极从事人工牛黄的研究，1971年人工牛黄应用于中成药组方中，部分缓解了天然牛黄的供需矛盾。但这种人工牛黄主要是胆酸、猪去氧胆酸和极微量的胆红素以及大量淀粉研末过筛而得的粉末，不是牛胆结石，其成份、结构、含量及已知各种微量成份均与天然牛黄相差太远，不具备天然牛黄的性状、结构、成份、含量特征，临床疗效远不及天然牛黄。
上世纪70年代以来，我国云南、广东、内蒙等地的医药工作者，在活牛胆囊内培植牛黄的实验研究获得了成功。但需对牛体进行剖腹手术并且该手术比较复杂，而且2-3年才能剖腹取出尼龙丝网、刮下棕黄色附着物。成石率低，产量小，胆红素含量低，质量不稳定。而且，此产品并不是牛胆结石，而是沉积在尼龙丝网上的棕黄色胆色素钙颗粒及粘液。刮下干燥后所形成的粉末。因此，不可能规模化生产。
上世纪70年代初，武汉同济医科大学附属同济医院肝胆外科蔡红娇医师(即本发明的发明人)在对人类胆结石形成的原因和机理进行研究，并获得成功的基础上，进一步用此原理进行牛胆囊胆汁内培育牛胆结石的研究，取得了成功并于1989年1月25日申报了“一种人工体外制作牛胆结石的方法”的发明专利(申请号89100505.6)。利用该方法制作的牛胆结石，其外观、结构、成份、含量与天然牛黄基本相同。但是限于当时的条件，特别是1985年版《中国药典》对牛黄的胆酸、胆红素含量未作规定，因此，其制成的牛胆结石的胆红素、胆酸等含量较低。不仅如此，上述方法除配方的牛胆汁之外，制备胆红素钙，多用猪胆汁代替，胆汁未经细菌发酵即可以成石。因此，但其制成的牛胆结石却含有猪去氧胆酸。1990年(《中国药典》1990年版一部)明确规定：牛黄是牛胆结石，含胆红素35％以上，胆酸7％以上，并规定了相应的鉴别和检测方法。因此用上述方法制成的牛胆结石不能满足新的《中国药典》对牛胆结石规定的药用要求。
三、发明的内容
本发明是在ZL89100505.6发明专利的基础上，根据新的《中国药典》要求而研制的一种既能规模化生产，又能满足新的《中国药典》要求的在动物牛体外制作牛胆结石(即体外培育牛黄)的方法。
本发明的技术方案如下：
1.制备发酵牛胆汁：
(1)调节天然牛胆汁中的牛磺酸含量，使其达到药用要求。
(2)将大肠杆菌、变形杆菌或肠球菌的单一菌液或其组合菌液适量按常规接种方法接种到天然牛胆汁中，对天然牛胆汁进行细菌发酵处理。
2.利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙：
(1)取出定量的发酵牛胆汁，加入1-4倍量的澄清饱和钙盐溶液，对其进行搅拌，加热至沸，滤取棕红色沉淀物。
(2)在棕红色沉淀物中，加入适量的水对其进行搅拌、洗涤，静置后滤去上清液，再依据药用要求加入适量的胆红素、胆酸，去氧胆酸和无机盐后，对其进行搅拌、混匀(可即用或干燥备用)。
3.在15℃-37℃条件下，利用发酵牛胆汁和复合胆红素钙在牛体外培育牛胆结石：
(1)制备成石胆汁：取出定量体积的发酵牛胆汁，按发酵牛胆汁量500～1500ml/kg的比例加入复合胆红素钙(复合胆红素钙按干燥后的重量计算)，再加入适量的水溶液，充分搅拌后，静置。
(2)培育牛胆结石：
①对成石牛胆汁用酸液进行PH调节，使其PH值在6.8以下；
②对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待其类球形结石形成后，停止旋转，静置培育，取出结石进行干燥处理。
本发明形成牛胆结石的机理是：利用上述物理、生物和化学的方法，改变牛胆汁的理化性，从而形成了成石牛胆汁。成石胆汁经过调节PH，在适度温度条件下形成蛋白氢键，部分蛋白变形、凝固，形成结石的核心。核心的活动中心由于静电吸引，使成石胆汁中的胆红素钙盐颗粒和胆红素高聚物颗粒向中心沉积。高分子有机物质对沉淀颗粒起架桥作用，即线型聚合物的功能对颗粒的吸附作用，呈网状层层吸附，逐渐增大，从而形成牛胆红素钙结石。
根据本发明在牛体外培育的牛胆结石，其结石机理与天然牛胆结石形成机理基本相同，其性状、结构、成份乃至氨基酸，微量元素含量与天然牛黄一致，其镇静、抗惊厥、退热、降压作用和抗菌、消炎作用的强度与天然牛黄一致。本发明的工艺条件完备，其产品的有效成份及其含量稳定，完全符合现行《中国药典》的规定。成石效率高，可进行规模化工业生产。其生产成本大大低于天然牛黄，具有较好的社会效益和经济效益。
四、具体实施方式
1.实施方式一：
(1)天然牛胆汁的获取：取出新鲜牛胆汁，按优质牛黄要求，调节牛磺酸含量使其达到7％，置入消毒罐内，低温保存备用。
(2)制备发酵牛胆汁：将牛胆汁置于发酵罐内，按每10000ml牛胆汁接种100ml菌体溶液的比例，将大肠杆菌和变形杆菌的组合菌液接种至牛胆汁中，发酵80小时备用。
(3)制备复合胆红素钙：
①取发酵牛胆汁20000ml加入22000ml澄清饱和氧化钙溶液，搅拌、煮沸，冷却后，取出棕红色沉淀物。
②棕红色沉淀物加纯净水10000ml，充分搅拌，静置后倾去上清液，加入胆红素至其含量达45％以上，再加入硫酸锌3g、硫酸镁3g，搅拌、混匀，备用。
(4)在37℃室温条件下培育药用牛胆结石：
①制备成石牛胆汁：取发酵牛胆汁1000ml加入到经过上述步骤(3)制备的2kg复合胆红素钙中，再加水3000ml，搅拌成悬浮液，备用。
②制取牛胆结石：a.用稀硫酸对成石胆汁进行PH调节，使其PH值为5.8；b.对成石牛胆汁进行偏轴定向旋转，待类球形结石形成后，停止旋转、静置培育，取出进行干燥处理，即得约800g的牛胆结石成品。
按干燥品计算，上述牛胆结石成品含胆酸为13％，含胆红素为36％，其它成份及其含量与天然牛黄基本一致，符合现行《中国药典》的规定。
2.实施方式二：
(1)天然牛胆汁的获取：杀牛时，在无菌操作的条件下，摘取胆囊，选用无杂质、未受污染、金黄色者，倾出胆汁于消毒罐内，按优质牛黄要求，调节牛磺酸，使其含量至6％，低温保存备用。
(2)制备发酵牛胆汁：将牛胆汁置于发酵罐内，按每10000ml牛胆汁接种200ml菌体溶液的比例，将大肠杆菌接种至牛胆汁中，发酵96小时，备用。
(3)制备复合胆红素钙：
①取发酵牛胆汁20000ml加入60000ml澄清饱和氢氧化钙液，搅拌、煮沸、冷却至50℃，取出棕红色沉淀物。
②棕红色沉淀物加冷开水10000ml，搅拌、静置30分钟，倾去上清液，加入胆红素至其含量达45％以上，再加入胆酸120g，去氧胆酸50g、硫酸镁5g，硫酸锌5g，搅拌、混匀，冷却备用。
(4)在26℃室温条件下，培育药用牛胆结石：
①制备成石牛胆汁：取发酵牛胆汁1000ml，加入到经过上述步骤(3)制备的1kg复合胆红素钙中，再加入复合胆红素钙制备过程中滤出的水溶液3000ml，搅拌成悬浮液，制成成石牛胆汁。
②制取牛胆结石：a.用稀盐酸对成石牛胆汁进行PH调节，使其PH值为6。b.利用偏心摇转机(ZL99238345.5)对成石牛胆汁定向旋转，在旋转速率60转/分的条件下，旋转20分钟，即形成类球形物，静置培育4小时后，取出进行干燥处理，即可制成约800g的牛胆结石成品。
上述成品呈类球形形状，直径0.5～3cm，表面黄红色至棕红色，体轻、质松脆，有同心层纹，气香，味苦而后甘，.有清凉感，嚼之易碎，不粘牙。按干燥品计算，其胆酸含量17％，胆红素含量36％，其余成份乃至氨基酸，微量元素含量与优质天然牛黄基本一致。符合现行《中国药典》的规定。
3.实施方式三：
(1)天然牛胆汁的获取：取出新鲜牛胆汁，置入消毒罐内，低温保存备用。
(2)制备发酵牛胆汁：将牛胆汁置于发酵罐内，按10000ml牛胆汁接种300ml菌体溶液的比例，将肠球菌接种至牛胆汁中，发酵92小时，备用。
(3)制备复合胆红素钙：
①取发酵牛胆汁29600ml，滤过加入88800ml澄清饱和氧化钙溶液，搅拌、煮沸，冷却后取出棕红色沉淀物。
②棕红色沉淀物加水充分搅拌， 静置后倾去上清液再加入胆红素至其含量达45％以上，然后加入胆酸100g、去氧胆酸40g、硫酸锌3g、硫酸镁3g，搅拌、混匀。
(4)在15℃室温条件下，培育药用牛胆结石：
①制备成石牛胆汁：取发酵牛胆汁1250ml加入到经过上述步骤(3)制备的1kg复合胆红素钙中，再加入复合胆红素钙制备过程中滤出的水溶液3000ml，搅拌成悬浮液，备用。
②制取牛胆结石：(a)用稀盐酸对成石胆汁进行PH调节，使其PH值为5.6；(b)对成石牛胆汁进行偏轴定向旋转，待类球形结石形成后，停止旋转，静置培育，取出进行干燥处理，即制成约1000g的牛胆结石成品。
按干燥品计算，上述牛胆结石成品的胆酸含量在15％，胆红素含量在36.5％，其它成份及其含量与天然牛黄基本一致，符合现行《(中国药典》的规定。
Claims (1)
1.一种利用天然牛胆汁在动物牛体外培育药用牛胆结石的方法，其特征在于：
(1)制备发酵牛胆汁：
①调节天然牛胆汁中的牛磺酸含量，使其达到药用要求；
②将大肠杆菌、肠球菌、变形杆菌的单一菌液或其组合菌液接种到天然牛胆汁中，对天然牛胆汁进行细菌发酵处理；
(2)利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙：
①取出定量的发酵牛胆汁，加入1～4倍量的澄清饱和钙盐溶液，对其进行搅拌、加热至沸，滤取棕红色沉淀物；
②在棕红色沉淀物中，加入适量的水对其进行搅拌、洗涤，静置后滤去上清液，再依据药用要求加入适量的胆红素、胆酸、去氧胆酸和无机盐后，搅拌、混匀；
(3)在15℃～37℃条件下，利用发酵牛胆汁和复合胆红素钙在牛体外培育牛胆结石：
①制备成石胆汁：取出定量体积的发酵牛胆汁，按其500～1500ml/kg的比例加入复合胆红素钙，再加入适量的水溶液，充分搅拌后静置；
②培育牛胆结石：a.用酸性溶液调节成石胆汁的PH，使其PH值在6.8以下；b.对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待其类球形结石形成后，停止旋转，静置培育，然后取出结石进行干燥处理。
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