CN116421678B - 用于治疗骨质疏松症的组合物、其制备方法及药物制剂 - Google Patents

用于治疗骨质疏松症的组合物、其制备方法及药物制剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于治疗骨质疏松症的组合物、其制备方法及药物制剂，所述用于治疗骨质疏松症的组合物由以下质量份的组分组成：知母提取物20‑30份、黄柏提取物20‑30份、牡蛎壳提取物10‑20份、花生芽提取物5‑8份、葛根提取物0.5‑2.4份、黄粉虫发酵提取物2.5‑4份、槲皮素‑硒聚合物3‑7份；知母提取物和黄柏提取物的质量比为1:（0.9‑1.1）；花生芽提取物、葛根提取物和黄粉虫发酵提取物的质量比为1:（0.1‑0.3）:0.5。本发明通能够显著促进骨细胞的分化、抑制破骨细胞分化，并促进骨钙吸收，对骨质疏松症发挥更好的治疗效果，为骨质疏松症的治疗和预防提供了一种安全高效的药物来源。

Description

用于治疗骨质疏松症的组合物、其制备方法及药物制剂
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及用于治疗骨质疏松症的组合物、其制备方法及药物制剂。
背景技术
骨质疏松症是一种以骨量低下、骨微结构破坏、导致骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身性代谢性骨病，多见于老年人群和绝经后妇女，造成骨质疏松症的主要原因是体内骨代谢失衡，由破骨细胞激活的骨吸收活动增强，导致骨量丢失增加，此外，骨细胞功能受到抑制，骨生成活动降低，形成骨量不足，也是导致骨质疏松症的原因。
目前，针对骨质疏松症的治疗具有多种方法，包括药物治疗、针灸治疗、脉冲电磁场治疗等，但针灸治疗和脉冲电磁场治疗等物理治疗方法具有较多局限性，对骨质疏松症的治疗仍以药物治疗为主。其中，西医药物主要采用骨吸收抑制药物（雌激素类药物、双膦盐酸类药物）、钙与维生素D类药物、促进骨形成药物（氟化物类药物、他汀类药物）等。这些药物虽然在临床上对骨质疏松症取得了较好的效果，但副作用也比较明显，例如，长期服用雌激素类药物容易引发脑卒中、心血管疾病或者乳腺癌等，过多的钙容易导致高尿钙症和肾结石，由于副作用较多限制了西药在骨质疏松症治疗方面的应用。传统中医并不具有骨质疏松症的说法，根据骨质疏松症的特点，骨质疏松症的临床症状和传统中医中“骨蚀”、“骨萎”较为相近，中医理论认为，此类疾病是由肾气、脾胃虚损、淤血、痰浊阻等原因导致，结合传统中医理论以及现代中医研究，已发现了二仙汤、独活寄生汤、龟鹿补肾丸等中药组合物对骨质疏松症具有良好的治疗效果，但目前应用于骨质疏松症治疗的中医药多数基于传统的复方制剂，对骨质疏松症的针对性一般，影响了对骨质疏松症的治疗效果，且由于市场上中药材质量不一、中药成分较为复杂的因素导致治疗效果稳定性差，影响了其在骨质疏松症治疗方面的临床应用。
发明内容
本发明解决的技术问题在于提供对骨质疏松症针对性好，具有更好的治疗效果，且治疗效果稳定性高的用于治疗骨质疏松症的组合物。
为解决上述问题，本发明提供了一种用于治疗骨质疏松症的组合物，由以下质量份的组分组成：知母提取物20-30份、黄柏提取物20-30份、牡蛎壳提取物10-20份、花生芽提取物5-8份、葛根提取物0.5-2.4份、黄粉虫发酵提取物2.5-4份、槲皮素-硒聚合物3-7份；
其中，所述知母提取物和所述黄柏提取物的质量比为1:（0.9-1.1）；
所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物的质量比为1:（0.1-0.3）:0.5。
优选地，该用于治疗骨质疏松症的组合物由以下质量份的组分组成：知母提取物25份、黄柏提取物25份、牡蛎壳提取物15份、花生芽提取物6份、葛根提取物1.2份、黄粉虫发酵提取物3份、槲皮素-硒聚合物5份；
其中，所述知母提取物和所述黄柏提取物的质量比为1:1；
所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物的质量比为1:0.2:0.5。
优选地，该用于治疗骨质疏松症的组合物还包括质量份为800-1200份的氧化石墨烯，所述知母提取物、所述黄柏提取物、所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物均负载于所述氧化石墨烯上。
本发明通过对多种天然物质的有效成分进行提取，并控制组合物的组成和含量，使组合物中各个组分相互配合，能够显著促进骨细胞的分化、抑制破骨细胞分化，并促进骨钙吸收，对骨质疏松症发挥更好的治疗效果，此外，通过将各类天然物质经过提取后获得提取物后进行复配的方式，能够避免市场上中药质量不一、含有杂质所导致的治疗效果稳定性差的问题，且能够提升药物的有效利用率，降低组合物中不同组分之间的不良影响，除了对组合物中组分配比进行约束外，还对知母提取物、黄柏提取物之间的配比以及花生芽提取物、葛根提取物和黄粉虫发酵提取物之间的配比进行严格控制，使各组分之间能够更好地发挥相互作用，提高对骨质疏松症的治疗效果，为骨质疏松症的治疗和预防提供了一种安全高效的药物来源。
另一方面，本发明还提供一种用于治疗骨质疏松症的组合物的制备方法，用于制备如上所述的用于治疗骨质疏松症的组合物，包括以下步骤：
步骤S1、分别将知母和黄柏进行清洗后干燥，粉碎后通过水提法得到知母提取液和黄柏提取液；
步骤S2、将牡蛎壳清洗干净，放入混合酸中浸泡后进行蒸煮，烘干后粉碎，得到牡蛎壳提取物；
步骤S3、取发芽2-10天的花生芽，研磨处理后，采用乙醇溶液提取，过滤去除滤渣后，真空浓缩，得到花生芽提取液；
步骤S4、将葛根粉碎后，采用乙醇溶液提取，过滤去除滤渣后，真空浓缩，得到葛根提取液；
步骤S5、将黄粉虫烘干粉碎后，去除其中的油脂，使用酵母菌进行发酵，然后采用乙醇溶液提取，过滤去除滤渣后，真空浓缩，得到黄粉虫发酵提取液；
步骤S6、将亚硒酸钠溶解于溶剂中，得到亚硒酸钠溶液，向所述亚硒酸钠溶液中加入槲皮素，然后加入抗坏血酸，避光孵育后，离心得到沉淀物，将所述沉淀物冷冻干燥后得到槲皮素-硒聚合物；
步骤S7、分别将所述知母提取液、所述黄柏提取液、所述花生芽提取液、所述葛根提取液和所述黄粉虫发酵提取液进行干燥处理后，得到知母提取物、黄柏提取物、花生芽提取物、葛根提取物和黄粉虫发酵提取物；
步骤S8、按照比例将所述知母提取物、所述黄柏提取物、所述牡蛎壳提取物、所述花生芽提取物、所述葛根提取物、所述黄粉虫发酵提取物和所述槲皮素-硒聚合物混合后，得到用于治疗骨质疏松的组合物。
优选地，所述步骤S7包括：
分别对所述知母提取液、所述黄柏提取液、所述花生芽提取液、所述葛根提取液和所述黄粉虫发酵提取液进行预处理，去除所述知母提取液、所述黄柏提取液、所述花生芽提取液、所述葛根提取液和所述黄粉虫发酵提取液中的鞣质，然后进行干燥处理，得到所述知母提取物、所述黄柏提取物、所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物。
优选地，所述步骤S7包括：
将所述知母提取液、所述黄柏提取液、所述花生芽提取液、所述葛根提取液和所述黄粉虫发酵提取液混合后真空浓缩，得到混合溶液，向所述混合溶液中加入氧化石墨烯，避光搅拌后，离心得到沉淀物，进行干燥，使所述知母提取物、所述黄柏提取物、所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物负载至所述氧化石墨烯，得到载药氧化石墨烯；
所述步骤S8包括：
按照比例将所述载药氧化石墨烯、所述牡蛎壳提取物和所述槲皮素-硒聚合物混合后，得到用于治疗骨质疏松的组合物。
优选地，所述步骤S2包括：
步骤S21、将牡蛎壳清洗干净，置于复合酸溶液中，于25-40℃条件下浸泡2-4h，得到酸处理牡蛎壳；
步骤S22、将所述酸处理牡蛎壳在150-200KPa条件下用水煎煮30-60min，得到高温煎煮牡蛎壳；
步骤S23、将所述高温煎煮牡蛎壳烘干后，进行超微粉碎，得到超微粉碎牡蛎壳；
步骤S24、将所述超微粉碎牡蛎壳在500-700℃条件下煅烧20-50min，得到煅烧牡蛎壳；
步骤S25、再次对所述煅烧牡蛎壳进行超微粉碎，得到所述牡蛎壳提取物。
优选地，所述步骤S3包括：
步骤S31、将花生进行催芽，获取发芽2-10天的花生芽，去皮后进行研磨处理，得到预处理花生芽；
步骤S32、采用50-90%的乙醇溶液对所述预处理花生芽提取2-5次，合并提取液，得到预提取液；
步骤S33、将所述预提取液进行真空浓缩，去除有机溶剂，得到所述花生芽提取液。
优选地，所述步骤S5包括：
步骤S51、将黄粉虫幼虫浸泡于油相有机溶剂中，分离去除油脂成分，干燥粉碎后，得到黄粉虫幼虫粉；
步骤S52、将所述黄粉虫幼虫粉、酵母提取物和葡萄糖配制成液体培养基，于100℃灭菌45min后冷却至室温，接种酿酒酵母，在27-32℃条件下发酵72h，得到黄粉虫发酵液；
步骤S53、采用60-100%乙醇溶液对所述黄粉虫发酵液进行提取，真空浓缩后，得到黄粉虫发酵提取液。
本发明提供的用于治疗骨质疏松症的组合物的制备方法相对于现有技术的有益效果，与用于治疗骨质疏松症的组合物相同，在此不再赘述。
再一方面，本发明提供一种药物制剂，包括如上所述的用于治疗骨质疏松症的药物组合物，所述药物制剂为胶囊、粉剂、颗粒剂和片剂中的任意一种。
本发明提供的药物制剂相对于现有技术的有益效果，与用于治疗骨质疏松症的组合物相同，在此不再赘述。
附图说明
图1为本发明实施例中用于治疗骨质疏松症的组合物的制备方法的流程示意图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。如无特殊说明的，材料、设备、试剂均为市售。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、质量分数的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了一种用于治疗骨质疏松症的组合物，由以下质量份的组分组成：知母提取物20-30份、黄柏提取物20-30份、牡蛎壳提取物10-20份、花生芽提取物5-8份、葛根提取物0.5-2.4份、黄粉虫发酵提取物2.5-4份、槲皮素-硒聚合物3-7份；
其中，所述知母提取物和所述黄柏提取物的质量比为1:（0.9-1.1）；
所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物的质量比为1:（0.1-0.3）:0.5。
在一个实施例中，所述用于治疗骨质疏松症的组合物，由以下质量份的组分组成：知母提取物25份、黄柏提取物25份、牡蛎壳提取物15份、花生芽提取物6份、葛根提取物1.2份、黄粉虫发酵提取物3份、槲皮素-硒聚合物5份；
其中，所述知母提取物和所述黄柏提取物的质量比为1:1；
所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物的质量比为1:0.2:0.5。
在另一个实施例中，所述用于治疗骨质疏松症的组合物还包括质量份为800-1200份的氧化石墨烯，所述知母提取物、所述黄柏提取物、所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物均负载于所述氧化石墨烯上。
氧化石墨烯具有纳米层状结构，相对于石墨，氧化石墨烯结构的规整性有所降低，比表面积较大，表面具有丰富的官能团，载药效率较高，进入人体后，提取物负载至氧化石墨烯上后能够具有缓释性和pH依赖性，使提取物达到靶标位置后缓慢释放，且氧化石墨烯能够抑制破骨细胞的分化活性，对骨质疏松症具有良好的治疗效果。此外，通过将知母提取物、黄柏提取物、花生芽提取物、葛根提取物和黄粉虫发酵提取物负载至氧化石墨烯上后，能够与组合物中牡蛎壳提取物和槲皮素-硒聚合物实现先后释放，通过控制各个组分的释放时间更好地实现对骨质疏松症的治疗。
知母、黄柏、牡蛎壳、花生芽、葛根、黄粉虫和槲皮素均为天然物质，硒是人体重要的微量元素。其中，槲皮素能够影响骨细胞分化过程，促进骨形成，还能够对破骨细胞的形成起到抑制作用，而硒对骨骼健康具有重要作用，能够调节体内硒蛋白的功能，维持身体的氧化平衡，并减少骨吸收，但过量的硒会存在一定毒性。将槲皮素与硒形成槲皮素-硒聚合物，能够使槲皮素和硒的功效相互促进，且提高硒的安全性。
通过对各种天然物质中有效成分进行提取，以及多种提取物之间的相互配合，能够显著促进骨细胞的分化、抑制破骨细胞分化，并促进骨钙吸收，对骨质疏松症发挥更好的治疗效果，并能够避免市场上中药质量不一、含有杂质所导致的治疗效果稳定性差的问题，且能够提升药物的有效利用率，降低组合物中不同组分之间的不良影响，除了对组合物中组分配比进行约束外，还对知母提取物、黄柏提取物之间的配比以及花生芽提取物、葛根提取物和黄粉虫发酵提取物之间的配比进行严格控制，使各组分之间能够更好地发挥相互作用，提高对骨质疏松症的治疗效果，为骨质疏松症的治疗和预防提供了一种安全高效的药物来源。
本发明的另一实施例提供一种用于治疗骨质疏松症的组合物的制备方法，用于制备如上所述的用于治疗骨质疏松症的组合物，如图1所示，包括以下步骤：
步骤S1、分别将知母和黄柏进行清洗后干燥，粉碎后通过水提法得到知母提取液和黄柏提取液；
步骤S2、将牡蛎壳清洗干净，放入混合酸中浸泡后进行蒸煮，烘干后粉碎，得到牡蛎壳提取物；
步骤S3、取发芽2-10天的花生芽，研磨处理后，采用乙醇溶液提取，过滤去除滤渣后，真空浓缩，得到花生芽提取液；
步骤S4、将葛根粉碎后，采用乙醇溶液提取，过滤去除滤渣后，真空浓缩，得到葛根提取液；
步骤S5、将黄粉虫烘干粉碎后，去除其中的油脂，使用酵母菌进行发酵，然后采用乙醇溶液提取，过滤去除滤渣后，真空浓缩，得到黄粉虫发酵提取液；
步骤S6、将亚硒酸钠溶解于溶剂中，得到亚硒酸钠溶液，向所述亚硒酸钠溶液中加入槲皮素，然后加入抗坏血酸，避光孵育后，离心得到沉淀物，将所述沉淀物冷冻干燥后得到槲皮素-硒聚合物；
步骤S7、分别将所述知母提取液、所述黄柏提取液、所述花生芽提取液、所述葛根提取液和所述黄粉虫发酵提取液进行干燥处理后，得到知母提取物、黄柏提取物、花生芽提取物、葛根提取物和黄粉虫发酵提取物；
步骤S8、按照比例将所述知母提取物、所述黄柏提取物、所述牡蛎壳提取物、所述花生芽提取物、所述葛根提取物、所述黄粉虫发酵提取物和所述槲皮素-硒聚合物混合后，得到用于治疗骨质疏松的组合物。
步骤S1中，知母和黄柏采用水提法进行提取，具体为，分别将知母和黄柏以质量体积比为1:10的固液比置于纯水中，于100℃条件下保温2h进行提取，过滤后，对滤渣再次进行提取，合并多次提取的滤液，经过真空浓缩后，得到知母提取液和黄柏提取液。
通过水提法能够将知母和黄柏中水溶性的有效物质充分提取，有效物质主要包括黄柏碱、小檗碱、芒果苷和木兰苷等物质。
应理解的是，知母和黄柏采用相同工艺进行提取，可以先按照一定比例将知母和黄柏混合后，对混合物进行提取，得到知母/黄柏提取液，能够简化提取工艺；为了提高知母和黄柏的提取效率，可以先对知母和黄柏进行粉碎后再进行提取。
步骤S2包括：
步骤S21、将牡蛎壳清洗干净，置于复合酸溶液中，于25-40℃条件下浸泡2-4h，得到酸处理牡蛎壳；
步骤S22、将所述酸处理牡蛎壳在150-200KPa条件下用水煎煮30-60min，得到高温煎煮牡蛎壳；
步骤S23、将所述高温煎煮牡蛎壳烘干后，进行超微粉碎，得到超微粉碎牡蛎壳；
步骤S24、将所述超微粉碎牡蛎壳在500-700℃条件下煅烧20-50min，得到煅烧牡蛎壳；
步骤S25、再次对所述煅烧牡蛎壳进行超微粉碎，得到所述牡蛎壳提取物。
具体地，步骤S21中，复合酸为乙酸、枸橼酸和乳酸的混合物，通过有机酸对牡蛎壳进行处理，能够得到水溶性更好的钙，加入组合物中，能够促进钙吸收，补充骨质疏松症患者流失的骨钙，提高成骨效果。
经过酸处理的牡蛎壳再依次进行高温高压煎煮、烘干、第一次超微粉碎、煅烧和第二次超微粉碎之后，能够得到粒径大小均匀，容易被吸收利用的牡蛎壳提取物，为骨质疏松症患者补充钙质。其中，高温高压煎煮过程能够有效去除牡蛎壳中杂质，在煅烧前后进行两次煅烧能够提高煅烧质量，保证牡蛎壳提取物的品质，提高吸收利用效率。
步骤S3包括：
步骤S31、将花生进行催芽，获取发芽2-10天的花生芽，去皮后进行研磨处理，得到预处理花生芽；
步骤S32、采用50-90%的乙醇溶液对所述预处理花生芽提取2-5次，合并提取液，得到预提取液；
步骤S33、将所述预提取液进行真空浓缩，去除有机溶剂，得到所述花生芽提取液。
花生芽中含有大量的大豆皂苷等有效物质，对促进骨合成，降低骨分解具有良好的作用，且花生芽提取物能够促进对钙的吸收效率。通过醇提的方式能够将花生芽中有效物质充分提取出来。
步骤S4中，葛根提取液的提取方法与花生芽提取液类似，也采用醇提的方式进行。
花生芽提取物和葛根提取物复配后能够相互作用，提升效果，且提取方法相同，可采用花生芽与葛根混合后提取的方式进行。
步骤S5包括：
步骤S51、将黄粉虫幼虫浸泡于油相有机溶剂中，分离去除油脂成分，干燥粉碎后，得到黄粉虫幼虫粉；
步骤S52、将所述黄粉虫幼虫粉、酵母提取物和葡萄糖配制成液体培养基，于100℃灭菌45min后冷却至室温，接种酿酒酵母，在27-32℃条件下发酵72h，得到黄粉虫发酵液；
步骤S53、采用60-100%乙醇溶液对所述黄粉虫发酵液进行提取，真空浓缩后，得到黄粉虫发酵提取液。
其中，步骤S51中，油相有机溶剂包括丙酮、己烷、乙醚、氯仿、乙酸乙酯、N-N-二甲基甲酰胺和二甲亚砜的其中一种或多种，优选为己烷，提取时间为20-30h，通过相似相溶原理将黄粉虫幼虫中的油脂成分分离出去，去除杂质，减少对发酵过程的干扰。
步骤S52中，将黄粉虫幼虫粉作为培养基原料之一，采用酿酒酵母进行发酵，能够对黄粉虫幼虫粉中的有效物质进行降解，提高促进骨细胞分化的活性。
黄粉虫幼虫含有丰富的蛋白质，还含有多种糖类、氨基酸、维生素、激素、酶及矿物质，营养元素较高，已有研究表明黄粉虫具有抗疲劳、抗衰老、降血脂和抗癌等功效。
步骤S6中，将亚硒酸钠溶解于溶剂中，得到亚硒酸钠溶液，向所述亚硒酸钠溶液中加入槲皮素，然后加入抗坏血酸，避光孵育后，离心得到沉淀物，将所述沉淀物冷冻干燥后得到槲皮素-硒聚合物。
得到的槲皮素-硒聚合物中，硒为纳米硒状态，槲皮素包裹在纳米硒周围形成槲皮素-硒聚合物。
槲皮素为3,3',4',5,7-五羟基黄酮，主要存在于洋葱、橙子、蓝莓和苹果中，是植物雌激素，对骨质疏松症引起的骨钙流失具有作用，能够影响骨细胞分化过程和骨形成，且由于其是天然物质提取得到的，安全性较好。但是槲皮素一般以糖基化形式存在，在水中溶解性较低，且进入人体后生物利用度较低，不易被人体吸收。而通过将槲皮素与硒反应形成槲皮素-硒聚合物，能够在低剂量下发挥较好的作用，从而提升槲皮素的效果。
在一个实施例中，步骤S7中，为了提高组合物的效果，分别对所述知母提取液、所述黄柏提取液、所述花生芽提取液、所述葛根提取液和所述黄粉虫发酵提取液进行预处理，去除所述知母提取液、所述黄柏提取液、所述花生芽提取液、所述葛根提取液和所述黄粉虫发酵提取液中的鞣质，然后进行干燥处理，得到所述知母提取物、所述黄柏提取物、所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物。
中药提取物中一般含有鞣质，鞣质能够与钙发生反应，形成沉淀，一定程度上影响组合物的效果，去除提取液中的鞣质能够进一步提高效果。
应说明的是，可采用冷热处理法、石灰法、铅盐法、明胶法、聚酰胺吸附法或溶剂法去除提取液中的鞣质，在此不做限定。
示例性地，可在各提取液中加入明胶溶液，使鞣质形成沉淀，过滤去除沉淀后，对滤液进行减压浓缩，然后加入过量地乙醇去除多余的明胶，即可去除提取液中的鞣质。
在另一个实施例中，步骤S7包括：
将所述知母提取液、所述黄柏提取液、所述花生芽提取液、所述葛根提取液和所述黄粉虫发酵提取液混合后真空浓缩，得到混合溶液，向所述混合溶液中加入氧化石墨烯，避光搅拌后，离心得到沉淀物，进行干燥，使所述知母提取物、所述黄柏提取物、所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物负载至所述氧化石墨烯，得到载药氧化石墨烯；
相应地，步骤S8包括：
按照比例将所述载药氧化石墨烯、所述牡蛎壳提取物和所述槲皮素-硒聚合物混合后，得到用于治疗骨质疏松的组合物。
通过将氧化石墨烯加入提取液中避光搅拌，能够使提取液中有效物质负载至氧化石墨烯上，负载在氧化石墨烯上的提取物具有缓释性，且提取物的释放并受到pH影响，使提取物能够在合适的靶标位置释放，同时，氧化石墨烯也对骨细胞分化具有促进作用，从而提升对骨质疏松症的治疗效果。
本发明的再一实施例提供一种药物制剂，包括如上所述的用于治疗骨质疏松症的药物组合物，所述药物制剂为胶囊、粉剂、颗粒剂和片剂中的任意一种。
本发明实施例提供的药物制剂相对于现有技术的有益效果，与用于治疗骨质疏松症的组合物相同，在此不再赘述。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
本实施例中用于治疗骨质疏松症的组合物，由以下质量份的组分组成：知母提取物25份、黄柏提取物25份、牡蛎壳提取物15份、花生芽提取物6份、葛根提取物1.2份、黄粉虫发酵提取物3份、槲皮素-硒聚合物5份；
其中，所述知母提取物和所述黄柏提取物的质量比为1:1；
所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物的质量比为1:0.2:0.5。
制备方法包括以下步骤：
1.1、分别将知母和黄柏以质量体积比为1:10的固液比置于纯水中，于100℃条件下保温2h进行提取，过滤后，对滤渣再次进行提取，合并多次提取的滤液，经过真空浓缩后，得到知母提取液和黄柏提取液；
1.2、将牡蛎壳干净，置于醋酸、枸橼酸和乳酸体积比为1:1:2的复合酸溶液中，于30℃条件下浸泡3h，然后在175KPa条件下用水煎煮40min，得到高温煎煮牡蛎壳；
1.3、将高温煎煮牡蛎壳烘干后，进行第一次超微粉碎，然后在600℃条件下煅烧40min，再进行第二次超微粉碎，得到牡蛎壳提取物；
1.4、获取发芽6天的花生芽，去皮后进行研磨处理，采用70%的乙醇溶液对研磨后的花生芽进行3次提取，合并提取液，进行真空浓缩，去除乙醇，得到花生芽提取液；
1.5、将葛根研磨处理，采用70%的乙醇溶液对研磨后的葛根进行3次提取，合并提取液，进行真空浓缩，去除乙醇，得到葛根提取液；
1.6、将黄粉虫幼虫浸泡于己烷中，分离去除油脂成分，干燥粉碎后，得到黄粉虫幼虫粉；
1.7、将黄粉虫幼虫粉、酵母提取物和葡萄糖配制成液体培养基，培养基中黄粉虫幼虫粉、酵母提取物和葡萄糖的比例分别为2%、1%和2%，于100℃灭菌45min后冷却至室温，接种酿酒酵母，在30℃条件下发酵72h，得到黄粉虫发酵液；采用80%乙醇溶液对黄粉虫发酵液进行提取，真空浓缩后，得到黄粉虫发酵提取液；
1.8、将1g亚硒酸钠溶解于100mL纯水中，边搅拌边加入1mL槲皮素原液（浓度为80mg/mL，溶剂为丙酮），然后缓慢滴加4mL浓度为400mM的抗坏血酸，在55℃条件下避光孵育24h，期间不断搅拌，然后再15000rpm转速下离心15min，将沉淀进行洗涤后，冷冻干燥得到槲皮素-硒聚合物；
1.9、分别对在知母提取液、黄柏提取液、花生芽提取液、葛根提取液和黄粉虫发酵提取液中加入明胶溶液，使提取液中鞣质形成沉淀，过滤去除沉淀后，对滤液进行减压浓缩，然后加入滤液4倍的乙醇去除多余的明胶，再蒸发去除乙醇，然后将提取液混合形成混合液，按照比例加入氧化石墨烯，避光搅拌24h，离心得到沉淀物，进行干燥，得到载药氧化石墨烯；
1.10、按照比例将载药氧化石墨烯、牡蛎壳提取物和槲皮素-硒聚合物混合后，得到用于治疗骨质疏松的组合物。
实施例2
本实施例中用于治疗骨质疏松症的组合物，由以下质量份的组分组成：知母提取物28份、黄柏提取物25份、牡蛎壳提取物15份、花生芽提取物5份、葛根提取物1.5份、黄粉虫发酵提取物2.5份、槲皮素-硒聚合物6份；
其中，知母提取物和黄柏提取物的质量比为1:0.9；
花生芽提取物、葛根提取物和黄粉虫发酵提取物的质量比为1: 0.3:0.5。
制备方法包括以下步骤：
2.1、分别将知母和黄柏以质量体积比为1:10的固液比置于纯水中，于100℃条件下保温2h进行提取，过滤后，对滤渣再次进行提取，合并多次提取的滤液，经过真空浓缩后，得到知母提取液和黄柏提取液；
2.2、将牡蛎壳干净，置于醋酸、枸橼酸和乳酸体积比为1:1:2的复合酸溶液中，于25℃条件下浸泡2h，然后在150KPa条件下用水煎煮30min，得到高温煎煮牡蛎壳；
2.3、将高温煎煮牡蛎壳烘干后，进行第一次超微粉碎，然后在500℃条件下煅烧50min，再进行第二次超微粉碎，得到牡蛎壳提取物；
2.4、获取发芽2天的花生芽，去皮后进行研磨处理，采用50%的乙醇溶液对研磨后的花生芽进行5次提取，合并提取液，进行真空浓缩，去除乙醇，得到花生芽提取液；
2.5、将葛根研磨处理，采用50%的乙醇溶液对研磨后的葛根进行5次提取，合并提取液，进行真空浓缩，去除乙醇，得到葛根提取液；
2.6、将黄粉虫幼虫浸泡于己烷中，分离去除油脂成分，干燥粉碎后，得到黄粉虫幼虫粉；
2.7、将黄粉虫幼虫粉、酵母提取物和葡萄糖配制成液体培养基，培养基中黄粉虫幼虫粉、酵母提取物和葡糖糖的比例分别为2%、1%和2%，于100℃灭菌45min后冷却至室温，接种酿酒酵母，在27℃条件下发酵72h，得到黄粉虫发酵液；采用100%乙醇溶液对黄粉虫发酵液进行提取，真空浓缩后，得到黄粉虫发酵提取液；
2.8、将1g亚硒酸钠溶解于100mL纯水中，边搅拌边加入1mL槲皮素原液（浓度为80mg/mL，溶剂为丙酮），然后缓慢滴加3mL浓度为400mM的抗坏血酸，在55℃条件下避光孵育24h，期间不断搅拌，然后再15000rpm转速下离心15min，将沉淀进行洗涤后，冷冻干燥得到槲皮素-硒聚合物；
2.9、分别对在知母提取液、黄柏提取液、花生芽提取液、葛根提取液和黄粉虫发酵提取液中加入明胶溶液，使提取液中鞣质形成沉淀，过滤去除沉淀后，对滤液进行减压浓缩，然后加入滤液3倍的乙醇去除多余的明胶，再蒸发去除乙醇，然后将提取液混合形成混合液，按照比例加入氧化石墨烯，避光搅拌24h，离心得到沉淀物，进行干燥，得到载药氧化石墨烯；
2.10、按照比例将载药氧化石墨烯、牡蛎壳提取物和槲皮素-硒聚合物混合后，得到用于治疗骨质疏松的组合物。
实施例3
本实施例中用于治疗骨质疏松症的组合物，由以下质量份的组分组成：知母提取物25份、黄柏提取物26.5份、牡蛎壳提取物20份、花生芽提取物8份、葛根提取物0.8份、黄粉虫发酵提取物4份、槲皮素-硒聚合物3份；
其中，知母提取物和黄柏提取物的质量比为1:1.1；
花生芽提取物、葛根提取物和黄粉虫发酵提取物的质量比为1:0.1:0.5。
制备方法包括以下步骤：
3.1、分别将知母和黄柏以质量体积比为1:10的固液比置于纯水中，于100℃条件下保温2h进行提取，过滤后，对滤渣再次进行提取，合并多次提取的滤液，经过真空浓缩后，得到知母提取液和黄柏提取液；
3.2、将牡蛎壳干净，置于醋酸、枸橼酸和乳酸体积比为1:1:2的复合酸溶液中，于40℃条件下浸泡4h，然后在200KPa条件下用水煎煮60min，得到高温煎煮牡蛎壳；
3.3、将高温煎煮牡蛎壳烘干后，进行第一次超微粉碎，然后在700℃条件下煅烧50min，再进行第二次超微粉碎，得到牡蛎壳提取物；
3.4、获取发芽10天的花生芽，去皮后进行研磨处理，采用90%的乙醇溶液对研磨后的花生芽进行2次提取，合并提取液，进行真空浓缩，去除乙醇，得到花生芽提取液；
3.5、将葛根研磨处理，采用90%的乙醇溶液对研磨后的葛根进行2次提取，合并提取液，进行真空浓缩，去除乙醇，得到葛根提取液；
3.6、将黄粉虫幼虫浸泡于己烷中，分离去除油脂成分，干燥粉碎后，得到黄粉虫幼虫粉；
3.7、将黄粉虫幼虫粉、酵母提取物和葡萄糖配制成液体培养基，培养基中黄粉虫幼虫粉、酵母提取物和葡糖糖的比例分别为2%、1%和2%，于100℃灭菌45min后冷却至室温，接种酿酒酵母，在32℃条件下发酵72h，得到黄粉虫发酵液；采用60%乙醇溶液对黄粉虫发酵液进行提取，真空浓缩后，得到黄粉虫发酵提取液；
3.8、将1g亚硒酸钠溶解于100mL纯水中，边搅拌边加入1mL槲皮素原液（浓度为80mg/mL，溶剂为丙酮），然后缓慢滴加5mL浓度为400mM的抗坏血酸，在55℃条件下避光孵育24h，期间不断搅拌，然后再15000rpm转速下离心15min，将沉淀进行洗涤后，冷冻干燥得到槲皮素-硒聚合物；
3.9、分别对在知母提取液、黄柏提取液、花生芽提取液、葛根提取液和黄粉虫发酵提取液中加入明胶溶液，使提取液中鞣质形成沉淀，过滤去除沉淀后，对滤液进行减压浓缩，然后加入滤液3-5倍的乙醇去除多余的明胶，再蒸发去除乙醇，然后将提取液混合形成混合液，按照比例加入氧化石墨烯，避光搅拌24h，离心得到沉淀物，进行干燥，得到载药氧化石墨烯；
3.10、按照比例将载药氧化石墨烯、牡蛎壳提取物和槲皮素-硒聚合物混合后，得到用于治疗骨质疏松的组合物。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于知母提取物和黄柏提取物的质量比为1:0.5，即，知母提取物的重量份为25份，黄柏提取物的重量份为12.5份，其余条件与实施例1一致。
对比例2
本对比例与实施例1的区别在于花生芽提取物、葛根提取物和黄粉虫发酵提取物的质量比为1:0.5:0.5，即，花生芽提取物的重量份为花生芽提取物6份、葛根提取物3份、黄粉虫发酵提取物3份，其余条件与实施例1一致。
对比例3
本对比例与实施例1的区别在于知母、黄柏、花生芽和葛根不经过提取，通过煎煮方式得到煎煮液，再与其他物质混合，其余条件与实施例1一致。
对比例4
本对比例与实施例1的区别在于黄粉虫不经过发酵，即，黄粉虫提取物的制备方法为：将黄粉虫幼虫浸泡于己烷中，分离去除油脂成分，干燥粉碎后，得到黄粉虫幼虫粉；采用80%乙醇溶液对黄粉虫幼虫粉进行提取，真空浓缩后，得到黄粉虫发酵提取液；其余条件与实施例1一致。
对比例5
本对比例与实施例1的区别在于，槲皮素和硒以单体形式加入组合物，其中硒的形态为硒粉，其余条件与实施例1一致。
实验例1 不同实施例和对比例对成骨细胞分化促进作用的验证
将MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨细胞前体细胞）加入96孔板中，每孔细胞浓度均为2×104，并在96孔板中加入α-MEM培养基培养过夜，然后加入0.1μM地塞米松、50μM维生素C和10mM β-甘油磷酸盐形成成骨分化培养基，并在不同孔中分别加入实施例1和对比例1-5中的组合物，以空白成骨分化培养基作为空白对照组，每种样品设置3个重复，加入浓度均为0.25μg/mL，空白对照组中加入等量的水，培养5天。
然后，使用裂解缓冲液对培养后的MC3T3-E1细胞进行裂解，在37℃下与50μL的pNPP底物反应1h，使用酶标仪在405nm处测量吸光度的变化，根据吸光度判断不同处理组中碱性磷酸酶（ALP）活性，以空白对照组的吸光度作为100%，根据不同处理组相对于空白对照组的变化得到ALP活性，结果如表1所示。
表1 不同处理中碱性磷酸酶（ALP）活性对比表（%）
对照组 实施例1 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5
ALP活性 100 141.2** 110.3## 115.6## 103.9## 118.5## 121.8##
碱性磷酸酶（ALP）是成骨标志物，其活性能够反映成骨细胞的分化水平，活性越高，说明成骨细胞向成熟的成骨细胞分化趋势越明显。
表1中**表示与对照组相比P＜0.01，##表示与实施例1相比，P＜0.01，从表1可以看出，实施例1和对比例1-5中组合物加入后相对于对照组的ALP活性均有提升，但实施例1中ALP活性的提升显著高于对比例1-5，说明其对成骨细胞分化具有更加显著的促进效果，而改变组合物中配比和工艺后，会导致促进效果显著下降。
实验例2 不同实施例和对比例对破骨细胞分化抑制作用的验证
将MC3T3-E1（小鼠胚胎成骨细胞前体细胞）加入96孔板中，每孔细胞浓度均为2×104，并在96孔板中加入完全培养基培养过夜，吸弃原培养基，加入破骨细胞诱导分化培养基，其中，对照组不加入组合物，其他处理组则分别加入实施例1和对比例1-5中组合物，加入浓度为0.25μg/mL，对照组中加入等量的水，每个处理设置3个重复，每隔两天更换一次培养基，培养5天后，使用4%多聚甲醛进行固定，然后使用TRAP（抗酒石酸酸性磷酸酶）进行染色，观察破骨细胞的形态和数量。被诱导分化后的成骨细胞前体细胞能够形成多核破骨细胞，能够被TRAP染色，而未分化的细胞则无法被染色，对分化的破骨细胞进行数量统计，结果如表2所示。
表2 不同处理中破骨细胞数量对比（个）
对照组 实施例1 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5
破骨细胞数量 82.3 15.7** 45.3## 52.0## 65.3## 48.0## 44.3##
表2中**表示与对照组相比P＜0.01，##表示与实施例1相比，P＜0.01，从表2可以看出，对照组中形成破骨细胞的平均数为82.3，而加入组合物后的实施例1即对比例1-5处理组，成骨细胞的数量均有所下降，其中实施例1下降更加明显，对破骨细胞的分化抑制效果显著高于其他处理组和对照组，说明本发明实施例1中组合物对破骨细胞的分化具有良好的抑制作用。
实施例3 不同实施例和对比例对骨钙含量和骨密度的影响
将80只Wistar雄性大鼠适应性饲养一周后，按照体重随机分为8组，包括1个正常对照组，1个模型对照组，6个处理组（包括实施例1和对比例1-5处理组），模型对照组和处理组每周注射两次地塞米松，注射量为2.5mg/kg，正常对照组则每周注射等量的生理盐水，共注射8周，构建糖皮质激素致大鼠骨质疏松模型。
在模型构建过程中，对各组大鼠进行灌胃连续给药，其中，正常对照组和模型对照组每天灌胃给予生理盐水0.4g/kg，各处理组则分别每天灌胃给予实施例1及对照组1-5中组合物0.4g/kg。
将大鼠处死后，迅速剥离两侧股骨，并去掉附着的软组织，采用双能X射线骨密度仪测定右侧股骨的骨密度。
将左侧股骨烘干后加入混合酸（硝酸和高氯酸为4：1）3mL，进行加热消化，然后置于氟化炉内灰化6h，得到股骨灰，采用EDTA滴定法测定股骨灰中钙的含量，具体方法为：准确称取0.1g的股骨灰分于锥形瓶中，加12mol/L的盐酸1mL，溶解后加l0mL纯水。滴加二乙胺调解PH至中性后加2滴10g／L的KCN，4滴0 .05mol／L的柠檬酸钠。摇匀后加二乙胺调节至pH12-13，再加入4滴钙羧酸钠指示剂，用0 .01mol/L的EDTA标准溶液滴定溶液由粉红色变为纯蓝色即为终点。根据消耗体积计算灰中钙含量，即为骨钙含量。
各处理中骨密度和骨钙含量的结果如表3和表4所示。
表3 不同处理组中骨密度对比表（g/cm3）
正常组 模型组 实施例1 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5
骨密度 0.143 0.821 0.128** 0.112# 0.097## 0.092## 0.101## 0.108##
表4 不同处理组中骨钙含量对比表（%）
正常组 模型组 实施例1 对比例1 对比例2 对比例3 对比例4 对比例5
骨钙 9.43 7.02 8.91** 7.68## 7.19## 7.23## 7.64## 7.73##
表3和表4中，**表示与模型组相比P＜0.01，#表示与实施例1相比P＜0.05，##表示与实施例1相比P＜0.01，从表3和表4可以看出，实施例1和对比例1-5中组合物均能够提高糖皮质激素致大鼠骨质疏松模型的骨密度和骨钙含量提高，但实施例1中组合物相对于对比例1-5中组合物的提升程度显著提高，说明本发明实施例1中组合物对提高骨质疏松症骨密度和骨钙含量有显著效果，且对组合物中配比、工艺进行调整后均会对治疗效果产生影响。
综上所述，本发明实施例中组合物能够促进成骨细胞分化，抑制破骨细胞分化，且能够显著改善骨密度和骨钙含量，对骨质疏松症具有良好的效果，而对本发明实施例中成分配比及工艺进行改变调整均会对效果产生影响，此外，本发明实施例中所用物质均为天然物质提取物，一方面具有较高的安全性，另一方面，降低了杂质和天然物质质量不一导致的效果稳定性差的问题。
虽然本公开披露如上，但本公开的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本公开的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于，由以下质量份的组分制成：知母提取物20-30份、黄柏提取物20-30份、牡蛎壳提取物10-20份、花生芽提取物5-8份、葛根提取物0.5-2.4份、黄粉虫发酵提取物2.5-4份、槲皮素-硒聚合物3-7份；
还包括质量份为800-1200份的氧化石墨烯，所述知母提取物、所述黄柏提取物、所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物均负载于所述氧化石墨烯上；
所述用于治疗骨质疏松症的组合物的制备方法为：
步骤S1、分别将知母和黄柏进行清洗后干燥，粉碎后通过水提法得到知母提取液和黄柏提取液；
步骤S2、将牡蛎壳清洗干净，放入复合酸中浸泡后进行煎煮，烘干后粉碎，得到牡蛎壳提取物；
步骤S3、取发芽2-10天的花生芽，研磨处理后，采用50-90%乙醇溶液提取，过滤去除滤渣后，真空浓缩，得到花生芽提取液；
步骤S4、将葛根粉碎后，采用50-90%乙醇溶液提取，过滤去除滤渣后，真空浓缩，得到葛根提取液；
步骤S5、将黄粉虫烘干粉碎后，去除其中的油脂，使用酵母菌进行发酵，然后采用60-100%乙醇溶液提取，过滤去除滤渣后，真空浓缩，得到黄粉虫发酵提取液；
步骤S6、将亚硒酸钠溶解于溶剂中，得到亚硒酸钠溶液，向所述亚硒酸钠溶液中加入槲皮素，然后加入抗坏血酸，避光孵育后，离心得到沉淀物，将所述沉淀物冷冻干燥后得到槲皮素-硒聚合物；
步骤S7、将所述知母提取液、所述黄柏提取液、所述花生芽提取液、所述葛根提取液和所述黄粉虫发酵提取液混合后真空浓缩，得到混合溶液，向所述混合溶液中加入氧化石墨烯，避光搅拌后，离心得到沉淀物，进行干燥，得到所述知母提取物、所述黄柏提取物、所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物的同时使所述知母提取物、所述黄柏提取物、所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物负载至所述氧化石墨烯，得到载药氧化石墨烯；
步骤S8、按照比例将所述载药氧化石墨烯、所述牡蛎壳提取物和所述槲皮素-硒聚合物混合后，得到用于治疗骨质疏松的组合物；
其中，所述步骤S5包括：
步骤S51、将黄粉虫幼虫浸泡于油相有机溶剂中，分离去除油脂成分，干燥粉碎后，得到黄粉虫幼虫粉；
步骤S52、将所述黄粉虫幼虫粉、酵母提取物和葡萄糖配制成液体培养基，于100℃灭菌45min后冷却至室温，接种酿酒酵母，在27-32℃条件下发酵72h，得到黄粉虫发酵液；
步骤S53、采用60-100%乙醇溶液对所述黄粉虫发酵液进行提取，真空浓缩后，得到黄粉虫发酵提取液。
2.根据权利要求1所述的用于治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于，所述知母提取物和所述黄柏提取物的质量比为1:0.9-1.1；
所述花生芽提取物、所述葛根提取物和所述黄粉虫发酵提取物的质量比为1:0.1-0.3:0.5。
3.根据权利要求2所述的用于治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于，知母提取物25份、黄柏提取物25份、牡蛎壳提取物15份、花生芽提取物6份、葛根提取物1.2份、黄粉虫发酵提取物3份、槲皮素-硒聚合物5份。
4.根据权利要求1所述的用于治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于，所述步骤S2包括：
步骤S21、将牡蛎壳清洗干净，置于复合酸溶液中，于25-40℃条件下浸泡2-4h，得到酸处理牡蛎壳；
步骤S22、将所述酸处理牡蛎壳在150-200KPa条件下用水煎煮30-60min，得到高温煎煮牡蛎壳；
步骤S23、将所述高温煎煮牡蛎壳烘干后，进行超微粉碎，得到超微粉碎牡蛎壳；
步骤S24、将所述超微粉碎牡蛎壳在500-700℃条件下煅烧20-50min，得到煅烧牡蛎壳；
步骤S25、再次对所述煅烧牡蛎壳进行超微粉碎，得到所述牡蛎壳提取物。
5.根据权利要求1所述的用于治疗骨质疏松症的组合物，其特征在于，所述步骤S3包括：
步骤S31、将花生进行催芽，获取发芽2-10天的花生芽，去皮后进行研磨处理，得到预处理花生芽；
步骤S32、采用50-90%的乙醇溶液对所述预处理花生芽提取2-5次，合并提取液，得到预提取液；
步骤S33、将所述预提取液进行真空浓缩，去除有机溶剂，得到所述花生芽提取液。
6.一种治疗骨质疏松的药物制剂，其特征在于，包括如权利要求1-5任一项所述的用于治疗骨质疏松症的药物组合物，所述药物制剂为胶囊、粉剂、颗粒剂和片剂中的任意一种。
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槲皮素通过促进成骨分化治疗去势骨质疏松症大鼠的分子机制;郑红;唐薇;角建林;吴超;袁鑫;赵宏斌;;中药药理与临床(第05期) *

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