CN102014945B - 具有高含量的1,25-二羟基维生素d3糖苷和槲皮甙的粉绿叶茄植物提取物的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从粉绿叶茄中制备具有高含量1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇的浓缩的且平衡的植物提取物,所述黄酮醇尤其是槲皮苷。本发明特别记载了一种工业规模或实验室规模制备前述提取物的方法。本发明还记载了前述植物提取物或者与其类似的(合成的)组合物用于预防和治疗骨质量减少相关的疾病,例如骨质减少或骨质疏松,用于预防和治疗胫骨软骨发育异常,优选家禽胫骨软骨发育异常,用于治疗产乳热,以及用作人体或动物体的饮食补充剂。
Description
技术领域
本发明涉及具有高含量1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,尤其是槲皮甙的粉绿叶茄植物浓缩的且平衡的植物提取物的制备。本发明具体记载了一种既适用于工业规模又适用于实验室规模的制备这种植物提取物的方法。此外,本发明还记载了该植物提取物或类似的(合成的)组合物的用途,其可以用于预防和治疗骨量减少相关的疾病,例如骨质减少或骨质疏松,其还可以用于预防和治疗胫骨软骨发育异常,尤其是家禽胫骨软骨发育异常,其还可用于治疗产乳热,此外其还可以用作人体或动物的食品补充剂。
在个体的整个生命周期,健康的骨都处于骨吸收和骨形成的微妙平衡中,以使骨骼适应需求的变化。这种平衡使得骨骼在童年期生长,这可以通过头骨的生长直观地看出,头骨生长时矿物质沉积在头骨外侧而骨质则被吸收到头骨内侧进而为脑部生长提供空间。成年期时,骨可以自行加强以适应体育运动或者负担重物时负重的变化。骨重建过程具有一个典型的顺序:骨吸收破骨细胞进入到特定区域的表面并开始吸收骨质材料。该过程的结果是形成陷窝或突起。骨形成成骨细胞进入到突起位置,并沉积新的骨质材料。这种循环周期结束后会留下更坚固的骨结构。然而,在老年人或绝经后女性中,这种平衡会朝向骨质净流失方向发展。长期卧床休养或者处于低重力状态下也会发生骨质流失。如图1所示,骨量峰值出现在中年期,然后就缓慢下降。对于女性,在雌性激素停止分泌的绝经期之后骨量流失会加速发展。骨量流失通常被诊断为骨质疏松或骨质减少(骨质疏松的早期形式),其中骨质疏松症已经成为预期寿命较长人群的主要健康问题,特别是在西方社会。
不仅人体,年老的动物或者正处在快速成长期的年幼动物也会遭受到与骨形成受损相关的疾病。例如,动物(尤其是处在快速成长期的食用动物,例如家禽)的腿衰弱以及由此造成的胫骨软骨发育异常(简称“TD”)是导致肉质流失和肉品质下降的主要原因。此外,出于动物福利方面的考虑,也必须要避免胫骨软骨发育异常(参见publication Tibial Dyschondroplasia,a Poultry Leg Problem.Rath NC,USDA/ARS,Poultry Production and Product Safety Research,Poultry Science Center,University of Arkansas,USA(09/04/2003))。此外,因为生产蛋壳的原因,产卵鸡具有大量的钙质代谢。产卵鸡每天需要从营养物中补充吸收将近为动物钙质储量十分之一的钙质,并将这些钙质储存到骨质中然后在生产蛋壳期间的数小时内通过代谢方式来利用这些钙质。因此,未适当的补充维生素D也可能导致产卵鸡的骨质疏松。
现有技术已经建议了许多方法来用于防止年龄相关的骨质流失和女性绝经后的骨质流失,例如通过体育锻炼和药物治疗方式来治疗骨质疏松。目前,药物治疗通常是根据治疗方法进行,其中治疗是在已经诊断出病理症状后才开始进行,例如骨质量或者骨密度已经下降到它们必要的最小水平时,或者最坏的情形,骨折时。因此,预防出现骨质量或者骨密度低于必要的最小量将是优选的治疗方式,但应该在骨密度仍处于较高水平时就开始治疗并且该治疗应该持续较长时间,例如,如图1所示的。因此,可以维持生理机制并采用天然来源的药物进行治疗的方式是对于采用合成药物进行治疗的方式的有价值的替换方案。
到目前为止,抗骨质疏松药根据不同的作用机制通常可以分为:抗吸收剂,同化激素类或者激素甾类,骨形成剂以及其它药物。此外,抗骨质疏松药也可以根据化学结构进行分类,但这些化学结构通常与上面列出的一个作用机制相对应。已知的抗骨质疏松药例如包括,双磷酸盐类、合成的雌激素、维生素D以及它的代谢产物等。
目前,大部分的处方药都属于双磷酸盐类,这类药物作用于骨吸收破骨细胞从而减少骨吸收(参见例如Fleisch H.等人,Endocrine Reviews(1998)19(1):80-100Bisphosphonates:Mechanisms of Action)。用双磷酸盐类药物治疗的一个缺点是其会阻碍骨代谢进而减少骨重建。
绝经后出现骨质量大量流失这一现象可以证明雌性激素对于骨质也具有很强的作用。因此,使用合成的雌激素进行激素替代疗法也是治疗骨质疏松的有效方法。但是该治疗方法仅适用于女性,目前已经不推荐使用该方法,因为大量临床研究显示该方法具有提高乳腺癌发生率的副作用。
一种更符合生理机制从而更有前景的方法是通过维持患者的钙质调节从而维持患者天然骨矿物存储来预防或者治疗上述疾病。
钙质调节和正常的骨矿物存储涉及到许多因素。对钙质平衡起作用的药物包括例如激素类,比如激素降钙素或者甲状旁腺激素以及它们的合成衍生物。但是这些肽激素不能口服,而需要注射或者鼻腔吸入,因此会造成患者使用不便。
动物和人体钙质调节(包括天然骨矿物的存储)最重要的因素是钙,所述钙通常优选地以可溶性盐或者Ca2+的形式存在。除前面所说作用外,钙也是细胞内信号传导、神经冲动传递和肌肉收缩的重要介质(Cashman等人,Novartis Found Symp.2007,282:123-38,discussion138-42,212-8;和Parfitt AM.Bone.1987,8Suppl.1:S1-8)。人体或动物体内钙供应不足可以导致钙聚集物从而使得骨质量或者骨密度低于最小的必要量。另一方面,若没有进行有效调节,人体或动物体内的钙浓度可能达到过高浓度,这会干扰细胞内信号的传导、神经冲动的传递和肌肉收缩,或者产生毒副作用。因此,所有的温血动物都有一套严格的调节系统以预防体内出现有毒的钙聚集物。
天然骨矿物存储钙调节的另外一个主要物质是维生素D。维生素D是促使骨质良好发育所必须的营养素,这一点可以从它能防止和治愈佝偻病中得到证明,已知可以使用维生素D代谢产物的天然和非天然的衍生物来防止和治疗佝偻病。但是,胆钙化甾醇(维生素D3)或者麦角钙化甾醇(维生素D2)形式的天然存在的维生素D不具有生物活性。因此,就如在共识会议(Osteoporosis Prevention,Diagnosis,and Therapy.NIH Consens Statement Online 2000March 27-29;17(1):1-36)中所说的,天然存在的维生素D不能治疗缓慢发展的骨疾病,例如骨质疏松病。这是因为天然存在的维生素D需要经过两个转化步骤才能转化成有活性的物质,其中第二个步骤受到严格调整。根据第一个步骤,在皮肤中形成或者通过消化摄入后,胆钙化甾醇(维生素D3)在人体或动物体的肝脏中转化成它的存储形式25-羟基维生素D3(缩写“25(OH)D3”)。充分存储维生素D3可以保护人体在2-3个月内免遭佝偻病。但是,该存储形式的维生素D3仍然不具有生物活性,其需要在第二个步骤中通过肾脏酶活化成活化形式的维生素D3,也就是1,25-二羟基维生素D3(缩写“1,25(OH)2D3”,骨化三醇)。活化形式的1,25-二羟基维生素D3然后在敏感组织中激活基因产物。在肠中,该基因产物是钙结合蛋白,这种钙结合蛋白最终可以从食物中吸收钙。所形成的具有活性的代谢产物1,25-二羟基维生素D3进一步调控钙质在肠道中的吸收和沉积,以及骨质到钙质的代谢过程。
尽管如此,这种天然的调控机制经常无法在人体或动物体内产生足够浓度的具有活性的代谢产物以预防缓慢发展的骨疾病,例如骨质疏松病,尤其是在老年人中,或者不能预防动物体内的其它疾病,例如家禽中的胫骨软骨发育异常。
从第一次发现该活性成分开始,已经尝试了利用各种方法来提供作为药品使用的维生素D3,因为维生素D3在营养物中的含量并不高,只有海产品油中的含量较高。因此,提供维生素D3或它的代谢产物是有效治疗前面所提到的疾病的关键基础,也是一种挑战。例如,美国专利第US 5,508,392号公开了利用合成的维生素D3糖苷、维生素D3原酸酯苷、维生素D3类似物的糖苷,以及维生素D3类似物的原酸酯苷用于治疗骨质疏松。
使用维生素D3以及它的合成类似物所存在的一个缺点是其作为药物和引起高血钙风险之间的治疗窗特别窄,所述高血钙也就是不正常的且具有毒性作用的高血钙浓度,其最终会对软组织和肾脏产生严重损害。维生素D3(维生素D3过多)中毒可以引起高血钙,例如当维生素D3的使用量超过推荐的每日允许量100倍时。已知1,25-二羟基维生素D3的这种缺点更为突出,因为其作为药物使用时的有效剂量和开始产生毒副作用的剂量之间的范围较小,两者之间的比值只有2至5。例如,高剂量的1,25-二羟基维生素D3所产生的一个可检测到的副作用就是导致饲养的家禽重量明显偏低。但是,尽管存在上面所提到的缺点,维生素D3和它的类似物仍然是用于治疗前面所提到疾病的优选化合物。
至于判断治疗方式是否合适,这还取决于其它因素,例如制备治疗中使用的活性成分所需的成本。因此,使用维生素D3或它的类似物经济有效地治疗前面提到的疾病的瓶颈在于如何降低维生素D3代谢产物的供应和制备成本。
一种可能是,通过化学立体选择合成方法来提供维生素D代谢产物。但不幸的是,立体选择合成通常劳动量较大,并且这种方法还需要多个合成和纯化步骤才能获得对映体浓缩的或者纯的维生素D3或者它的代谢产物。因此,虽然许多合成的维生素D3药品被批准上市和使用,但是立体选择合成维生素D仍是一种高成本的方法,其在现阶段不能实现对于前面提到疾病经济有效地治疗。此外,通过合成方法生产的1,25-二羟基维生素D3高浓度给药时还具有药物治疗窗特别窄的缺点,和引起高血钙的风险。因此,寻找维生素D3或者它的代谢产物的其它来源或许是优选的解决方案。
已经发现很多植物都含有高浓度的维生素D代谢产物。这种类型的植物包括,例如茄科(Solanacea)种的植物(茄属植物),特别是粉绿叶茄(Solanum glaucophyllum)(也称作软木茄(Solanum malacoxylon)或Solanium glaucum)、水茄(Solanum torvum)、Solanum esuriale、山烟草(Solanum verbascifolium)、洋丁香(Cestrum diurnum)等等,Nierembergia veichtii种植物,禾本科(Gramineae)种植物,特别是黄燕麦草(Trisetum flavescens)。最近十年的大量研究进一步揭示番茄植物(来自茄科的番茄(Lycopersicon esculentum))具有特定含量的25(OH)D3和1,25(OH)2D3-糖苷形式的维生素D3(Prema和Rhagamulu,1996,Phytochem.42(3),617-620)。类似地,马铃薯植物(马铃薯)、茄子植物(茄子)和小胡瓜植物(Cucurbita pepo L.ssp.pepo convar.Giromontina)(参见例如Aburjaj等人,1998,Phytochem.46(6),1005-1018)以及粉蓝烟草(Nicotiana glauca)(茄科蓝绿烟草)(Skliar等人,2000,Plant Science 156,193-199)也具有大量的维生素D。因此,存在许多可以用来供应维生素D或者其代谢产物的潜在植物。
上述发现的基础是因为在用这些植物的叶子或者其它部位喂养动物时出现了许多有益效果。已经公开了这些钙质沉积性植物的干燥叶具有多种有益效果(参见例如Boland等人,Plant Science 00,1-13(2003))。此外,一些专利还公开了这些植物提取物的用途。例如美国专利第US 5,776,461号公开了含有植物维生素D的化妆品组合物,特别是植物来源的天然皮肤护理组合物,这种组合物含有特定基团被羟基化的维生素D化合物或者它们的糖苷(植物维生素D)。
维生素D含量最高的一种植物是粉绿叶茄。已经发现粉绿叶茄(以前称作Solanum malacoxylon)含有维生素D。已经确定部分粉绿叶茄种植物的活性成分是维生素D3代谢产物,1,25-二羟基维生素D3(参见例如De Vernejoul等人,La Nouvelle Presse medicale,7,22,1941-43(1978))。
很多文献报道都提到粉绿叶茄的活性成分是维生素D,很少有文献提到该植物的其它成分。只有一篇文献提到了该植物中存在生物碱澳洲茄铵(solasodine)(参见Jain和Sahoo,Pharmazie(1986)41:820-821),还有一篇文献提到了酚类化合物,但是并未记载任何化合物定量的内容(Rappapport等人,Phytochemistry(1977)16:1115-6)。除了主要成分1,25-二羟基维生素D3外,粉绿叶茄的丁醇提取物中还发现了一系列酚苷,包括氢醌、山萘酚(kaempferol)和槲皮素(quercetin)以及下面这些已知的苷:熊果苷,O-甲基熊果苷,异槲皮素,篇蓄苷 (vicularin),芸香苷,山萘酚-3-O-芸香糖苷以及异鼠李素-3-O-芸香糖苷。在粉绿叶茄中还发现了一种新的槲皮素三糖苷(quercetin trioside),该槲皮素化合物是3-O-[2G-b-D-芹菜糖基]芸香糖苷。这些酚类化合物中的大部分都是所有植物的成分,但是Rappaport等人的文献(1977,supra)并未提到任何定量的内容。此外,植物酚的子类别黄酮化合物通常被作为抗氧化剂进行讨论,但是并未提到这些化合物在骨形成中的活性。此外,只记载了(植物酚的子类别)黄酮醇(槲皮素和山萘酚)对于骨细胞的作用。例如,最近,体外实验显示槲皮素和芸香苷可以抑制破骨细胞的形成和分化破骨细胞的前体细胞。Yamaguchi发现槲皮素和山萘酚在体外对于破骨细胞形成和骨吸收(而非骨形成)具有很强的抑制作用(Yamaguchi等人,MoI Cell Biochem.2007Jun 1)。在染色体水平上,槲皮素和它的葡萄糖苷酸可以提高骨唾液蛋白(bone sialoprotein)的mRNA水平(Kim等人,J Cell Biochem.2007Jun 1)。其它的破骨性谱系细胞(osteoclastic lineage)的体外细胞研究证实其对于破骨细胞分化具有抑制作用,但对于骨形成并未显示出积极的作用,所述破骨细胞分化是骨吸收过程中的关键步骤(Wattel等人,J Cell Biochem.2004May 15;92(2):285-95)。
更高水平的研究,在小骨组织培养物中进行的实验(Sziklai和Ribari,Acta Otolaryngol.1995Mar;115(2):296-9)以及在大鼠颅盖造骨细胞中进行的实验(Yang等人,Zhong Yao Cai.2006May;29(5):467-70)也显示槲皮素对于成骨细胞具有抑制作用。此外,在两个用正常动物中进行的研究发现,槲皮素在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠中对于骨矿物代谢、生物力学强度以及骨结构具有促进作用(Kanter等人,Cell Biochem Funct.2007Jan 31),芸香苷在卵巢切除诱导的骨质减少的大鼠中也是有用的(Horcajada-Molteni等人,J Bone Miner Res.2000Nov;15(11):2251-8.Comment in:J Bone Miner Res.2001May;16(5):970-1)。尽管如此,即使已经证实了这些化合物存在于粉绿叶茄植物中,但是现有技术仍认为维生素D是治疗前面提到的疾病的唯一活性成分。
发现粉绿叶茄中含有高浓度维生素D代谢产物1,25-二羟基维生素D3时,已经开始推测该植物是否可以用作治疗男性和动物的骨疾病,并且已经在实验动物中对提取物的生物活性进行了实验。这些实验使用维生素D耗竭的动物以证明维生素D的活性(参见例如De Vernejoul等人,(1978),supra)。Azcona(Azcona等人,Zootechnica Intern.February 1982p.12-13)。Morris(Morris KML,The Veterinary Record,101,502-504(1977))发现在喂食了粉绿叶茄干燥叶后蛋壳强度变强。Norrdin(Norrdin et al.,Calcified Tissue International(1979)28(1):239-243)提到在喂食粉绿叶茄干燥叶后小鸡骨骼的骨质量和断裂强度都得到了提高。在使用牛或羊的瘤胃液(rumen fluid)进行培养后,叶子的水提取物显示出更高的维生素D活性(MeIIo和Habermehl,Dtsch Tierarztl Wochenschr.1992Sep;99(9):371-6)。从WO 85/051 10可以知道,南美植物粉绿叶茄(South-American plant Solanum glaucophyllum)叶子的提取物含有1,25-二羟基维生素D3以及一种水溶性成分,该水溶性成分不同于1,25-二羟基维生素D3,其在用瘤胃液处理后可以获得1,25-二羟基维生素D3和一种水溶性糖。该专利文件进一步提到粉绿叶茄的水溶性提取物具有与1,25-二羟基维生素D3相似的生物活性。从奥地利专利说明 书AT 398372B(该专利说明书公开时间大约晚于WO 85/051109年)中可以获知,粉绿叶茄的干燥叶确实具有声称的活性,但同时也具有前面提到的高毒性这一缺点。此后,Cheng等人(2004)(Cheng等人,Poult Sci.2004Mar;83(3):406-13.)发现喂食粉绿叶茄叶子可以提高肉鸡中磷的利用。此外,Foote等人(2004)(Foote等人,J Anim Sci.2004Jan;82(1):242-9)发现在斩杀动物前喂食维生素D和它的代谢产物可以提高肉的嫩度。但是,所有的这些尝试都具有上面提到过的高毒性缺点。
此外,让甲状腺机能亢进和肾功能不全的患者服用植物干燥叶7天后可以观察到血钙浓度恢复正常(参见例如Mautalen等人,Calcif Tissue Res.1977May;22Suppl:534-7.;以及Herrath等人,Vitamin D,Chemical and Clinical Aspects related to Calcium Metabolism.Pp.703-708.W.de Gruyter,Berlin,Germany,1977)。这种方式受到的限制是要使用未知活性的未纯化提取物,而这样的提取物通常含有有毒的生物碱。
这些实验的共同特点是没有对所用的材料进行表征,没有测量活性成分。此外,除维生素D-类似作用外,也都没有记载粉绿叶茄的其它作用。
另一方面,有数篇文献都报道了尝试对粉绿叶茄的活性成分进行分析,以及尝试制备植物提取物。例如,Peterlik和Wasserman(1975)(参见Peterlik和Wasserman,FEBS Letters(1975)56:16-19)使用氯仿/甲醇混合溶剂来提取干燥叶,而MeIIo和Habermehl(1998)则使用热水来提取干燥植物材料(参见MeIIo和Habermehl,Dtsch Tierarztl Wochenschr.1998Jan;105(1):25-9)。然后使用Sephadex G15和Sephadex LH20进行色谱分离纯化(参见Vidal等人,Turrialba(1985)35:65-70),或者在采用硅胶和C18改良后的硅胶作为固定相的柱子上通过制备HPLC色谱进行分离纯化(Skliar等人,J Steroid Biochem MoI Biol.1992Dec;43(7):677-82)。
Von Rosenberg S.J.,2006年的公开(Rosenberg S.J.,2006,PhD-thesis,Ludwigs-Maximilians-University,Munich,Germany)以及Von Rosenberg S.J.等人2007的进一步公开(Rosenberg S.J.等人,The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology,Volume 103,Issues 3-5,March 2007,Pages 596-600)揭露了利用粉绿叶茄和黄燕麦草的植物提取物来作为食品补充剂或者用作人体治疗用途,尤其是治疗骨质疏松。此处公开的植物提取物由HerbonisAG,Basel,Switzerland提供,这种植物提取物先是用水从干燥植物(叶子)中提取,然后以Sephadex作为基质材料进行高效液相色谱(HPLC)来纯化提取物。所述提取物只含有有活性的维生素D代谢产物1,25-二羟基维生素D3作为活性成分。
虽然已经公开了一些实验室提取方法,但是上述文献似乎都没有公开具有足够高产率的,即适于工业应用的,用于制备含有维生素D化合物的植物提取物的提取/纯化方法。这些文献公开的方法都是在于寻找活性成分1,25-二羟基维生素D3,但都没有尝试对产率进行优化也没有尝试降低有毒副产物的含量。已经尝试使用纯水或者水性溶剂进行提取从而将游离的1,25-二羟基维生素D3从其结合形式分离出来,或者使用本身有毒的溶剂氯仿从水溶性成分中分离 出游离的1,25-二羟基维生素D3。已经报道了数种使用硅胶材料或者交联葡聚糖凝胶(Sephadex gels)进行柱色谱分离进而纯化活性成分1,25-二羟基维生素D3的方法,但是这些方法都不适用于提取物的大规模生产。尤其是,在硅胶材料上进行色谱分离所获得的维生素D代谢产物的产率都比较低,从而不能使含有植物提取物的维生素D实现工业化生产,所述工业化生产是指维生素D的大规模生产。此外,上面提到的方法都没能提供一种植物提取物,其至少部分克服前面提到的当高浓度用药时产生高毒性这一缺点。
因此,本发明的一个目的是克服前面提到的缺点,提供一种具有更好耐受性的粉绿叶茄提取物,该提取物可以通过低成本方式进行大规模生产。尤其是不受高浓度时维生素D毒性这一缺点限制的提取物。
为解决上述问题,本发明提供了如下文及所附权利要求书所记载的技术方案。
本发明通过提供一种新的从粉绿叶茄中制备浓缩的(以及均衡的)植物提取物的方法来解决上述问题,本发明方法具有产率高且适于工业化生产的特点,本发明方法获得的植物提取物同时含有1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,尤其含有槲皮苷。
本发明发明人惊奇地发现,具有浓缩含量的1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇(尤其是槲皮苷)的粉绿叶茄植物提取物没有显示出上面提到的高毒性缺点,也就是说维生素D代谢产物的使用浓度可以比现有技术中提到的更高,同时又不会有引发高血钙的风险。此外,本发明发明人还发现,以低浓度1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇(尤其是槲皮苷)给药时,本发明植物提取物也可以产生可检测到的良好效果。换言之,本发明发明人惊奇地发现,与现有技术中提到的只含有高含量维生素D3化合物的提取物不同,粉绿叶茄植物提取物同时含有高含量的1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇(尤其是槲皮苷)时能够明显扩大维生素D的治疗窗。但是,现有技术即未公开这种浓缩的植物提取物的制备方法,也没有公开具有这种性能的植物提取物。
从粉绿叶茄制备和纯化浓缩的植物提取物的方法
根据第一个实施方式,本发明提供了一种从粉绿叶茄制备和纯化浓缩的(以及均衡的)植物提取物的方法,该植物提取物含有浓缩含量的1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,尤其是槲皮苷,所述方法优选包括以下步骤:
a)使用醇类溶剂提取粉绿叶茄种的植物或植物部分;
b)纯化步骤a)获得的提取物,优选用以下步骤:
b1)将步骤a)获得的植物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子中;
b2)可选地,用水和/或此处定义的醇类溶剂冲洗柱子;
b3)从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物;以及
b4)可选地,浓缩和/或干燥所述浓缩的植物提取物。
根据本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤a),其使用了醇类溶剂对粉绿叶茄种的植物或植物部分进行提取,这种方法优于现有技术公开的方法而且该方法还适用于工业规模的生产。与此相反,现有技术公开的方法都只关注分析工作,这些方法都不适用于工业规模的生产。此外,现有公开的方法只是为了获得纯的维生素D3活性化合物。此外,现有技术公开的有些方法也不适用于人体或动物,因为这些方法所用的溶剂具有毒性。例如,现有技术公开的使用氯仿-甲醇提取粉绿叶茄的方法最为有效,但该方法不适用于大规模生产而且该方法还使用了有毒试剂。此外,现有技术公开的只使用水进行提取的方法所获得的维生素D活性太低。根据申请人自己的发现,使用醇类溶剂提取可以取得最佳效果。因此,适用于本发明制备和提取方法提取步骤a)的醇类溶剂优选自水和醇的混合物,或者只有醇,所述醇优选自甲醇、乙醇或者异丙醇,更优选乙醇或者甲醇。虽然获得的植物提取物组合物可能并非最理想,但本发明的范围也包括,使用其它合适的和广泛使用的溶剂(例如水)来根据本发明提取步骤a)的方法提取粉绿叶茄植物或植物部分。更优选地,本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)的溶剂选自:乙醇/水混合物,其中乙醇与水的比率(%)在约100/0至约0/100(v/v),例如乙醇/水比率(%)为约100/0乙醇/水(v/v),约95/5乙醇/水(v/v),约90/10乙醇/水(v/v),约85/15乙醇/水(v/v),约80/20乙醇/水(v/v),约75/25乙醇/水(v/v),约70/30乙醇/水(v/v),约65/35乙醇/水(v/v),约60/40乙醇/水(v/v),约55/45乙醇/水(v/v),约50/50乙醇/水(v/v),约45/55乙醇/水(v/v),约40/60乙醇/水(v/v),约35/65乙醇/水(v/v),约30/70乙醇/水(v/v),约25/75乙醇/水(v/v),约20/80乙醇/水(v/v),约15/85乙醇/水(v/v),约10/90乙醇/水(v/v),约5/95乙醇/水(v/v),或者约0/100乙醇/水(v/v),或者由前面提到的任意两种特定值所组成的范围。本发明人发现使用这样的混合物提取可以使得浓缩植物提取物中两种所需成分的产率最高,也就是1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇的产率最高,尤其是槲皮苷。最优选地,本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)中所用的溶剂选自乙醇/水混合物,其中乙醇/水(v/v)比率(%)为约80/20至约50/50和/或约35/65至约20/80。乙醇/水(v/v)的特定比率还可以根据1,25-二羟基维生素D3糖苷在浓缩的植物提取物中的含量来作进一步选择。本领域技术人员可以根据特定的提取和纯化方法来选择乙醇/水(v/v)的特定比率,优选此处定义的比率。
可选但不是最优地,从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)中的溶剂可以选自甲醇/水混合物,其中甲醇/水的比率与上面记载的乙醇/水的比率相同。更优选地,甲醇/水的比率可以选自比率(%)(v/v)约90/10至约25/75之间,例如可以选自甲醇/水的比率(%)为约90/10(v/v),约85/15甲醇/水(v/v),约80/20甲醇/水(v/v),约75/25甲醇/水(v/v),约70/30甲醇/水(v/v),约65/35甲醇/水(v/v),约60/40甲醇/水(v/v),约55/45甲醇/水(v/v),约50/50甲醇/水(v/v),约45/55甲醇/水(v/v),约40/60甲醇/水(v/v),约35/65甲醇/ 水(v/v),约30/70甲醇/水(v/v),或者约25/75甲醇/水(v/v),或者由前面提到的任意两种特定值所组成的范围,特别为约90/10至约60/40和/或约40/60至约25/75甲醇/水(v/v)。
可选但不是最优地,从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)中的溶剂可以选自异丙醇/水混合物,其中异丙醇/水的比率与前面记载的乙醇/水混合物相同或者与甲醇/水混合物相同。
粉绿叶茄种的(干燥)植物或植物部分在前面所定义的醇类溶剂中的浓度,可要求一特定的所用溶剂与溶剂中(干燥)植物或植物部分(药材)(总量)之间的比率,也就是溶剂/药材的比率(%),其优选为约4-40(v/w),更优选为约4-30(v/w)或者约4-25(v/w),此外还可以根据所用的提取方法来作进一步优选,例如对于渗滤类型的提取,进一步优选为约7-12或8-10(v/w),最优选为约9(v/w);或者,对于浸渍类型的提取,进一步优选为约3-7或者4-6(v/w),最优选为约5(v/w)。渗滤类型的提取和浸渍类型的提取在本发明提取步骤a)中可以看作是等同替换的方法。
从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤a)中所用的溶剂可以进一步含有添加剂。这些添加剂可被添加以改进所得提取物的质量。一般而言,这些添加剂在本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法步骤a)所用溶剂中的浓度能满足特定目的,本领域技术人员可以根据提取步骤的特定要求来确定此等浓度。通常,所选添加剂的浓度应该不会对步骤a)的提取产生任何损害,但同时又能起到稳定和/或保护抗氧化等作用。本发明中的添加剂可以包括,例如抗氧化剂如抗坏血酸,优选浓度为约0.01%(w/v)至约2%(w/v),优选浓度为约0.05%(w/v)至约1%(w/v),最优选浓度为约0.05%(w/v)至约0.5%(w/v),或者是生育酚或胶体类型的抗氧化剂(E310,E21或者E312),优选浓度为约0.02至约1%(w/v),更优选浓度为约0.05%(w/v)至约0.25%(w/v)等。添加剂可以进一步包括合适的酸,优选有机酸,更优选植物来源的酸或者存在于植物中的酸,包括例如醋酸、硫酸、柠檬酸等,优选浓度为约0.05%(w/v)至约1%(w/v),更优选浓度为约0.1%(w/v)至约0.5%(w/v)。前面所述的浓度%(w/v)是相对于提取步骤a)中所用溶剂的总体积。添加这些酸的作用优选是为了减少提取和后续步骤中的棕黄反应。因此,可以在本创新方法提取步骤a)的提取过程中将pH调节至约4.0至约8.0,更优选至约5.5至约6.5。可以通过添加适当量的合适的酸来调节pH值,所述酸例如是上面定义的那些酸,或者如果必要的话,也可以添加适当量的合适的碱,例如氢氧化钠,氢氧化钾等。
从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤a)可以包括对粉绿叶茄种的植物或植物部分,比如叶子,进行研磨、渗滤和/或浸渍的步骤。所述研磨、渗滤和/或浸渍可以是连续过程或者不连续过程。
从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤a)可以在室温至约85℃下进行,例如约20或者30℃至约85℃,更优选温度范围约30℃至约70℃,最优选 温度范围约40℃至约60℃,特别是约40℃,约45℃,约50℃,约55℃,或者约60℃,更优选温度约50℃,约55℃或约60℃,或者是前面所提到的任意温度值所组成的温度范围。
从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤a)可以重复至少一次,优选1-2次,1-3次,1-5次或者更多次,为提高活性成分的提取率,优选使用与提取所用同样的醇类溶剂,其用量为约1至约5,1至4,1至3,1至2或者1倍(柱床)体积进行重复提取。提取后合并提取液。根据所用的提取方法来选择适当的重复提取次数,例如浸渍或者渗滤类型的提取。当采用浸渍提取时,提取步骤a)优选重复1-2次,使用与第一次提取所用的同样醇类溶剂,其用量为约2至约5倍(柱床)体积进行重复提取。需特别说明的是,发明人因此惊奇地发现在提取步骤a)中不需要为了取得高产率而对植物或植物部分进行研磨。
可选地,从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤a)可以按照特定时间间隔来进行,其中,所述时间间隔,也就是提取时间,可以在约1至约48,24,或者约10小时,优选约6至约48小时,更优选24小时。
可对提取步骤a)获得的植物提取物进行过滤。可以使用现有技术中已知的任何方法进行过滤。例如,将溶剂泵送通过40至60μm的滤筛,优选50μm的滤筛。提取步骤a)获得的提取物可以在提取步骤a)的每次提取步骤后或者所有提取步骤完成后进行连续过滤。
从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)获得的提取物可以采用适当的方法进行浓缩(在过滤前进行或过滤后进行)和/或干燥。提取步骤a)以及本发明其它部分提及的浓缩和/或干燥通常是指任何减少植物提取物中水分或液体含量的过程,例如在步骤a)渗滤或浸渍粉绿叶茄种的植物或植物部分后进行浓缩和/或干燥。例如,可以通过浓缩提取物的方法来减少提取步骤a)获得的植物提取物的水分或液体含量,优选使用常规的浓缩和/或干燥手段和方法,更优选使用可以安全地减少浓缩的植物提取物中水分或液体含量的方法,该方法不会分解提取物的主要成分,尤其是1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,特别是槲皮苷。用于浓缩(和/或干燥)的方法包括但不限于,例如蒸发比如真空蒸发,或者在平稳温度(smooth temperatures)下蒸馏溶剂。可以对已经浓缩后的提取物进行干燥但也可以直接干燥提取(和/或纯化)后获得植物提取物。这些干燥方法包括但不限于,例如喷雾干燥、带式干燥(band drying)、冷冻干燥等,特别是当需要将所述(中间的)植物提取物干燥至约100%或者将近100%的不挥发物质。
优选地,浓缩或者干燥提取步骤a)获得的植物提取物时,先除去有机溶剂,然后除去水直到获得含有特定含量(%)水和特定含量(%)不挥发物质的溶液。例如,提取步骤a)获得的植物提取物可以浓缩或干燥至植物提取物含有约90-80%水和约10-20%不挥发物质,约85-75%水和约15-25%不挥发物质,约80-70%水和约20-30%不挥发物质,约75-65%水和约25-35%不挥发物质,约70-60%水和约30-40%不挥发物质,约65-55%水和约35-45%不挥发物质,约60-50%水和约40-50%不挥发物质,约55-45%水和约45-55%不挥发物质,约50-40% 水和约50-60%不挥发物质,约45-35%水和约55-65%不挥发物质,约40-30%水和约60-70%不挥发物质,约35-25%水和约65-75%不挥发物质,约30-20%水和约70-80%不挥发物质,约25-15%水和约75-85%不挥发物质,约20-10%水和约80-90%不挥发物质,约15-5%水和约85-95%不挥发物质,或者约10-0%水和约90-100%不挥发物质,优选约85-75%水和约15-25%不挥发物质,约80-70%水和约20-30%不挥发物质,约75-65%水和约25-35%不挥发物质,约70-60%水和约30-40%不挥发物质,约65-55%水和约35-45%不挥发物质,最优选约75-65%水和约25-35%不挥发物质。前述百分含量基于浓缩或者干燥前植物提取物的总重量,例如基于渗滤或者浸渍类型的提取直接获得的提取物的总重量。这样的浓缩和/或干燥至特定含量不挥发物质,可以使活性成分的不同浓度与根据提取步骤a)获得的植物提取物的特定浓度一致,其中所述提取步骤a)获得的提取物可能是使用不同体积的前面提到的溶剂提取而来,例如重复提取步骤a)。将步骤a)获得的植物提取物浓缩和/或干燥至约100%不挥发物质还可以使提取物在使用前能保存在最小空间中。
最后,对步骤a)获得的植物提取物进行热-/高温处理以增加提取物的贮藏时间,优选使得提取物可以(长期)贮藏。该处理步骤可以在浓缩和/或干燥步骤a)获得的植物提取物之前进行或者之后进行。所述热-/高温处理可以通过本领域的已知技术来进行。更优选地,所述热-/高温处理在温和条件下进行,优选在100℃至约145℃,例如在最低温度100℃下进行处理,优选处理30至40秒,或者在最高温度145℃下进行处理,优选处理约2至10秒,或者在上述两个温度之间的任何温度下进行处理,例如约105℃,110℃,115℃,120℃,125℃,130℃,135℃,或约140℃。
根据特别优选的实施方式,本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的提取步骤a)可以适用于实验室规模或者工业规模的生产,其中此处定义的实验室规模的生产条件也可以转化成工业规模的生产。
如果用于实验室规模的生产,本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)所用的粉绿叶茄种的植物或植物部分重量通常(但不限于此)为约0.5g至约1000g,更优选约1g至约100g,最优选约1g至约10g,其中叶子可以经过研磨和用醇类溶剂渗滤或浸渍过的。其中醇类溶剂可以是上面提到的那些溶剂,更优选选自乙醇/水混合物,该混合物中乙醇/水比率(%)为约80/20至20/80,或更优选80/20至65/35,或者35/65至20/80,例如可以选自乙醇/水混合物比率(%)为约80/20乙醇/水(v/v),约75/25乙醇/水(v/v),约70/30乙醇/水(v/v),约65/35乙醇/水(v/v),约60/40乙醇/水(v/v),约55/45乙醇/水(v/v),约50/50乙醇/水(v/v),约45/55乙醇/水(v/v),约40/60乙醇/水(v/v),约35/65乙醇/水(v/v),约30/70乙醇/水(v/v),约25/75乙醇/水(v/v),或者约20/80(v/v)的混合物,或者可以选自前述任意两个特定值组成的范围。此外,实验室规模生产提取过程中采用的pH值和温度通常也可以选自前面定义的那些,其中优选所用的这些条件可以使得提取效率大于3(见下表1,实施例1A)。优选温度为约40℃至60℃,更优选温度为约50℃。可以根据前面提到的方式重复提取,优选重复1-5次。
从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法步骤a)的提取效率可以根据下式计算:
yf=VDM(提取物)·[Qu(提取物)/1000]·ef,
VDM=1,25-二羟基维生素D3(或者它的糖苷或者前面定义的其它具有活性的维生素D化合物)
Qu=槲皮素
ef:经验工艺系数(empirical process factor)
yf:经衡量工艺质量(weighed goodness ofprocess)
其中,[VDM]和[Qu]根据每克(g)提取物计算。系数[ef]是表示如成本、生态和提取物质量(例如溶解性)等因素的经验系数。结果惊奇地发现,本发明提取效率yf可以大于3,这明显优于现有技术中的方法,该提取效率符合本发明的标准。因此,本发明提取步骤a)的优选实施方式是提供一种yf大于2,优选大于2.5,更优选大于3的提取物。
如果工业规模的生产,从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)所用的粉绿叶茄种的植物或植物部分重量通常(但不限于此)为至少约1000g,优选至少约10或约100kg,更优选至少约250kg,更优选至少约500kg,至少约1000kg或者甚至至少约2500kg,至少约3000,至少约4000kg,至少约5000kg,或者更多。本领域技术人员可以根据特定条件来确定粉绿叶茄种的植物或植物部分的用量,例如工厂的规模,需要实际加工的量等条件。粉绿叶茄种的植物或植物部分例如叶子可以在上面定义的醇类溶剂中进行研磨、渗滤和/或浸渍。也可以在提取步骤a)中采用研磨、渗滤和/或浸渍处理。
例如,可以使用本领域已知的方法来进行渗滤,优选地,将粉绿叶茄植物或植物部分例如叶子填充到至少一个容器中(根据工业装置的类型可以使用但不限于,至少1个,2个,3个,4个或5个或更多个(循环填充的)容器),然后往混合物中加入前面所定义的溶剂。所述醇类溶剂通常选自前面定义的用于提取步骤a)的溶剂。优选地,渗滤用的溶剂通常还进一步含有前面定义的用于提取步骤a)的添加剂。此外,工业规模提取工艺中所采用的pH值和温度通常可以采用前面所定义的那些,其中优选采用的这些条件可以使得提取效率大于3(对应于下表1,实施例1A)。优选pH值约4.0至约8.0,更优选约5.5至约6.5。优选将混合物加热到前面定义的温度,优选在约40℃至约75℃之间,更优选在约40℃至约60℃之间。渗滤工艺可以以连续工艺、半连续工艺或者任何其它工艺进行,只要该等可以按照特定流速将醇类溶剂泵送/转移到至少一个容器中。优选地,该流速为约500至1500升每小时,更优选为约800至1200升每小时,最优选为约1000升每小时。提取时间可以按照上面定义的那样进行变化,例如在约6至约48小时,优选约24小时。渗滤后获得的提取物可以按照上面定义的那样进行过滤、浓缩和/或干燥处理。
根据特别优选的实施方式,如果进行工业规模的生产,从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)采用渗滤提取,并且包括下列特定的子步骤(提取工艺EP):
EP1)将粉绿叶茄种的植物或植物部分填充到至少一个(循环填充的)容器中,例如如上面定义数量的容器;
EP2)加入醇类溶剂,其中所述醇类溶剂优选自上面定义的乙醇/水混合物,例如混合物中乙醇/水的比率(%)为约25/75,或者约75/25(v/v),其中溶剂/药材的比率优选如上面定义的范围,例如约7-12(v/w),最优选约9(v/w);
EP3)可选地,按照上面定义的方法将pH调节至约5.5-6.5;
EP4)在醇类溶剂中提取所述粉绿叶茄种的植物或植物部分,优选流速为800-1200升每小时,更优选1000升/小时;优选6-48小时,更优选24小时;
EP5)在提取过程中将混合物加热至前面定义的温度,优选约40-75℃,更优选约40-60℃;
EP6)可选地,按照前面定义的方法真空浓缩步骤EP4和EP5获得的植物提取物,例如,先蒸发有机溶剂然后再蒸发水直至获得的溶液含有约75-65%水和约25-35%不挥发物质;以及
EP7)可选地,喷雾干燥、带干燥或者冷冻干燥(浓缩后的)植物提取物。
可选的,可以按照前面定义的方法来进行浸渍,通常使用带有搅拌器或者搅拌部件的反应器,优选还带有加热系统的反应器。此外,浸渍可以通过先将叶子填充至容器然后加入前面定义的醇类溶剂并进行加热和搅拌混合物(在容器中)的方式来进行,优选在前面定义的提取时间和前面定义的温度以及pH值内进行。优选地,浸渍用的醇类溶剂通常还含有至少一种前面定义的用于提取步骤a)的添加剂。所述醇类溶剂可以选自前面所定义比率(%)的乙醇/水(v/v)混合溶剂。此外,工业规模提取工艺中所用的pH值和温度可以选自前面定义的那些,优选所选的这些条件可以使提取效率大于3(对应于下表1,实施例1A)。优选pH值约4.0至约8.0,更优选约5.5至约6.5。优选地,温度为约55℃且提取时间为24小时。浸渍获得的提取物可以按照前面定义的方法进行过滤、冲洗、浓缩和/或干燥处理。
根据特别优选的实施方式,如果用于工业规模的生产,从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法提取步骤a)是浸渍提取,其包括下列特定的子步骤(提取工艺EM):
EM1)将粉绿叶茄种的植物或植物部分填充到至少一个容器中,优选该容器带有搅拌器,优选该容器带有加热器;
EM2)加入醇类溶剂,其中醇类溶剂优选自前面定义的乙醇/水混合物,例如具有乙醇/水(v/v)比率(%)为约65/35的混合物,其中溶剂/药材的比率优选为上面定义的范围,例如 约4-6(v/w),最优选约5(v/w);所述醇类溶剂优选还含有前面定义的添加剂,例如含有0.1%抗坏血酸。
EM3)可选地,按照前面定义的方法将pH调节至约5.5-6.5,优选约5.5;
EM4)在前面定义的温度和提取时间内,在醇类溶剂中提取粉绿叶茄种的植物或植物部分,优选约55℃下提取约24小时;
EM4)从容器中回收植物提取物并进行过滤,例如泵送植物提取物通过50μm的筛网。
EM5)可选地,使用与前面定义的乙醇/水混合物相同的混合物冲洗提取步骤EM4和EM5留下的固体一次或两次,优选溶剂/药材的比率约为3;
EM6)可选地,真空浓缩植物提取物,该真空浓缩先是在真空条件下蒸发有机溶剂,然后再蒸发水直至获得的溶液中含有75-65%水和25-35%不挥发物质;以及
EM7)可选地,喷雾干燥、带干燥或者冷冻干燥(浓缩后的)植物提取物。
本发明制备和纯化粉绿叶茄的植物提取物的方法进一步包括纯化步骤b)以纯化提取步骤a)获得的提取物。该纯化步骤b)对于获得植物提取物的主要活性成分以及达到较高的产率而言都是非常关键的步骤,所述主要活性成分也就是1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,特别是槲皮苷。最令人惊奇的发现是,纯化步骤b)高产率的实现主要是与使用含有非离子型聚合物树脂的柱子对提取物进行处理这一点有关,这一点是本领域技术人员根据现有技术所预料不到的。只有使用这样的非离子型聚合物树脂才能使得粉绿叶茄植物提取物浓缩两种主要成分,并可以明显提高这些活性成分的产率,所述活性成分也就是1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,尤其是槲皮苷。使用其它柱子材料无法使前述两种活性成分达到这种浓缩含量。本领域中已知的用于植物成分分离的方法,例如说明书背景技术部分记载的那些,包括蒸馏法,以及先进行溶剂-溶剂(逆流)提取然后进行色谱分离的方法,例如柱色谱分离法。只有极少数情况下才可以省去色谱分离过程,例如目标产物具有特殊的物理化学性质从而使得只用液相-液相提取或者蒸馏就可以获得足够纯度的产物。但是,已知现有技术中进行的纯化实验目标都是为了获得纯的具有活性的维生素D产物,而不是上述两种活性成分的组合。如果需要使用色谱分离法进行进一步的纯化,那么本领域的技术专家也都会选择文献中提到的那些硅胶材料和交联葡聚糖作为用于色谱分离纯化植物提取物的基质(参见前面的描述)。就如发明人所发现的,硅胶材料和交联葡聚糖在用于同时纯化两种活性成分时都具有明显缺陷:硅胶材料上进行色谱分离所获得1,25-二羟基维生素D3产率低,而交联葡聚糖色谱分离只浓缩1,25-二羟基维生素D3而无法浓缩黄酮醇,这可以从附图6第9道看出。因此,这些材料都不适用于同时纯化两种物理化学性质略有差异的活性成分。在这一方面,黄酮醇一直都被认为其对于治疗作用并不重要,也没有进行过任何有关纯化同时含有两种活性成分的植物提取物方面的尝试。因此,本领域专家始终都会选择前面定义的硅胶材料或者交联葡聚糖来纯化主要成分为维生素D代谢产物的植物提取物。发明人也已经发现,离子型聚合物树脂 (参见de Boland等人,supra)不是充分的替代物,因为已经发现植物提取物的盐含量超过了柱子的处理能力,这就需要离子盐来进行洗脱。
与本领域技术人员所期望的相反,发明人惊奇地发现非离子型聚合物树脂反而适于本发明的特定方法,也就是提供含有两种活性成分组合物的方法,所述两种活性成分也就是1,25-二羟基纤维素D3糖苷和黄酮醇,特别是槲皮苷,而且组合物中这些活性成分的含量可以接近最佳,而生物碱的含量则可以降低至最小。
因此,用于纯化步骤a)获得的提取物的纯化步骤b)优选包括下列步骤:
b1)将步骤a)获得的植物提取物填充至含有非离子型聚合物树脂的柱子中;
b2)可选地,使用水和/或前面定义的醇类溶剂冲洗柱子;
b3)从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物;以及
b4)可选地,干燥浓缩的植物提取物。
根据从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的纯化步骤b)的子步骤b1),所述提取物被填充至含有非离子型聚合物树脂的柱子中。本发明中,适于步骤b)子步骤b1)的非离子型聚合物树脂可以包括(多孔的或无孔的)非离子聚合物树脂,包括但不限于:聚苯乙烯、苯乙烯二乙烯苯共聚物、丙烯酸酯聚合物,以及多酚树脂。更优选地,所述(多孔的或无孔的)非离子型材料选自Amberlite XAD-1、XAD-2、XAD-4、XAD-5(这些都是商标名称,它们由Rohm and Haas Co.,U.S.A.生产,这些树脂是由苯乙烯二乙烯苯共聚物组成)以及Diaion HP10、HP20、HP30、HP40、HP50(这些是商标名称,它们由MitsubishiChemical Co.,Japan生产,这些树脂是由苯乙烯二乙烯苯共聚物组成),Amberlite XAD-7、XAD-7HP、XAD-8或者XAD-1180(这些是丙烯酸酯聚合物组成的吸附剂的商标名称,它们是由Rohm and Haas Co.生产),以及Duolite S-30(这些是酚醛树脂组成的吸附剂的商标名称,它们由Chemical Process Co.,U.S.A.生产)或者与前面具体提到的树脂等效的非离子型聚合物树脂,例如,其它供应商提供的任何等效树脂,更优选地,适于本发明步骤b)(多孔的或无孔的)非离子型材料选自树脂:Amberlite XAD-树脂,包括Amberlite XAD-1、XAD-2、XAD-4、XAD-5,以及Amberlite XAD-7、XAD-7HP、XAD-8或者XAD-1180,最优选AmberliteXAD-7、XAD-7HP、XAD-8或者XAD-1180,或者与前面提到的树脂等效的非离子型聚合物树脂,例如,其它供应商提供的任何等效树脂。
此外,适于本发明纯化步骤b)的子步骤b1)的非离子型材料优选不含有基于葡聚糖的树脂,更优选不含有交联葡聚糖和Superdex树脂材料,特别优选不含有非离子型的交联葡聚糖和Superdex树脂材料,优选这些材料明确排除在本发明所述的适于步骤b)的非离子型材料的范围内。
可以使用本领域中任何合适的方法来将植物提取物填充到本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法纯化步骤b)子步骤b1)中所用的柱子。这些方法包括(但 不限于),如果是实验室规模的生产,则使用注射器等设备,如果是工业规模的生产,则使用泵等设备。优选地,适用于植物提取物的柱子具有约2至6的长/宽比。柱子可以在使用前先用前面定义的溶剂进行冲洗,优选使用此处定义的醇类溶剂,和/或水和/或丙酮。柱子还可以在使用前进行平衡处理,优选使用水或者此处定义的醇类溶剂进行平衡处理,优选柱子在平衡处理期间没有发生过跑干。当根据纯化步骤b)子步骤b1)将植物提取物填充到柱子时,可以是将植物提取物(因为其具有前面定义的溶剂含量所以呈水溶液形态)填充或泵送到柱子顶部,优选以1、2、3、4、5倍柱床体积或更高倍的速度进行,优选3倍柱床体积。可以将相同的提取物步骤a)获得的植物提取物填充到柱子中数次,例如1次、2次、3次、4次、5次,或更多次,其中第一次(通常是干净的)柱子洗脱液可以不收集。
根据从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的纯化步骤b)可选的子步骤b2),可选地,可以使用水和/或前面定义的醇类溶剂冲洗填充有植物提取物的柱子。如果使用醇类溶剂,则该醇类溶剂可以是前面提到的任何醇类溶剂,通常优选醇类溶剂所含醇的量不高于20%(v/v),这是为了防止将浓缩的植物提取物或者它的任何成分过早的从柱子中洗脱出来,或者是为了使这种情况最小化。特别合适的醇类溶剂(但不限于此)可以选自比率(%)为约0/100至约20/80乙醇/水(v/v)的混合物,例如可以选自比率(%)为约0/100乙醇/水(v/v),约5/95乙醇/水(v/v),约10/90乙醇/水(v/v),约15/85乙醇/水(v/v),或者约20/80乙醇/水(v/v),更优选乙醇/水混合物具有比率(%)约5/95乙醇/水(v/v),约10/90乙醇/水(v/v),或者约15/85乙醇/水(v/v)。可选但不是最优地,本发明方法纯化步骤b)子步骤b2)中的醇类溶剂可以选自甲醇/水混合物,其中甲醇/水的比率与上面定义的乙醇/水的比率相同。本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法的纯化步骤b)子步骤b2)中所述可选的冲洗步骤可以进行至少一次,优选1-2次,可选1-3次,1-4次,1-5次或更多次。本发明方法步骤b子步骤b2)中的冲洗可以按照水和/或醇类溶剂的特定顺序来进行。例如,先进行第一步冲洗,用水或者其它任何前面提到的醇类溶剂冲洗柱子至少一次,优选用水,例如冲洗1次、2次、3次等,例如用水冲洗1次。优选地,使用水或者另一种溶剂进行第一步冲洗直到洗脱液呈无色。然后,使用不同的溶剂进行可选的第二步冲洗,也就使用水或者前面定义的醇类溶剂进行冲洗,优选使用含有前面具体提到过的浓度的醇类溶剂。优选柱子在第二步冲洗中至少被冲洗1次,2次,1-3次,1-4次,1-5次或者更多次,优选使用前面定义的醇类溶剂冲洗1-3次。所述醇类溶剂优选为前面定义的那些溶剂。优选使用1,2,3,4,5,(1-2,1-3,1-4,1-5)倍柱床体积,或者更多倍柱床体积溶剂来进行所述第二步可选的冲洗,优选1-3倍柱床体积。
根据从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法纯化步骤b)子步骤b3),从柱子中洗脱出来浓缩的植物提取物。可以选择前面记载的那些溶剂从柱子中洗脱出提取物,这些溶剂包括醇,例如乙醇、甲醇、异丙醇,优选乙醇或甲醇,或者酮,例如丙酮,或者前面定义的合适的醇类溶剂。所述合适的醇类溶剂可以是任何前面定义的醇类溶剂,例如乙醇/水混合物,包括但不限于,所述含有比率(%)为约100/00至约70/30乙醇/水(v/v)的乙醇/水混 合物,例如比率(%)为约100/00乙醇/水(v/v),约95/5乙醇/水(v/v),约90/10乙醇/水(v/v),约85/15乙醇/水(v/v),约80/20乙醇/水(v/v),约75/25乙醇/水(v/v),或者约70/30乙醇/水(v/v)。更优选地,乙醇/水混合物中乙醇/水的比率(%)为约100/00乙醇/水(v/v)至约95/5乙醇/水(v/v),最优选约95/5、96/4、97/3、98/2、99/1或者100/0乙醇/水(v/v)。可选但不是最优地,本发明方法纯化步骤b)子步骤b3)中的醇类溶剂可以选自甲醇/水混合物,其中甲醇/水混合物中甲醇/水的比率与前面定义的乙醇/水混合物中乙醇/水的比率相同,或者选自异丙醇/水混合物,其中异丙醇/水混合物中异丙醇/水的比率与前面定义的乙醇/水混合物中乙醇/水的比率相同。用于纯化步骤b)子步骤b3)从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物中所用的溶剂可以是1、2、3、4、5、(1-2、1-3、1-4、1-5)倍柱床体积,或者更多倍柱床体积,优选2-5倍柱床体积。
根据从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法纯化步骤b)可选的子步骤b4),可选地,所获得的浓缩的植物提取物可以按照前面记载的提取步骤a)所用的方法来进行干燥。优选地,植物提取物的干燥方法包括但不限于,喷雾干燥、带干燥、冷冻干燥等,优选干燥至不挥发物质含量为约100%或者接近100%,例如含有约10-0%水和约90-100%不挥发物质,上述含量值以干燥前植物提取物的总重为基数进行计算,例如洗脱后纯化步骤b)子步骤b3)获得的提取物总重。
本发明方法纯化步骤b)子步骤b4)中干燥植物提取物的过程还可以进一步与前面提到的用于提取步骤a)中的热-/高温处理相结合,或者是先进行干燥再进行热-/高温处理,从而提高浓缩的植物提取物的储存时间,优选允许所述浓缩植物提取物的储存,例如如果在使用前所述提取物需要被储存。
根据一个特别优选的实施方式,如果用于实验室规模的生产,优选本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法步骤b)的纯化含有下列特定特征(纯化工艺PL):
PL1)将步骤a)获得的植物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子中,所述树脂优选自Amberlite XAD-7HP或者XAD-1180或者任何其他供应商提供的任何其它等效的树脂;
PL2)用水冲洗柱子1次,优选至少2次,可选3次,优选直至洗脱液呈无色为止;使用乙醇/水混合物冲洗柱子至少1次,优选混合物含有乙醇/水的比率与前面定义的一样,例如,乙醇/水(v/v)的比率为约0/100至约10/90,更优选约5/95,优选用1-3倍柱床体积;和
PL3)使用前面定义的醇类溶剂从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物,优选使用乙醇/水混合物,更优选该混合物中乙醇/水(v/v)的比率(%)为前面定义的比率,例如在约95/5至约100/0之间,最优选约96/4,优选使用2-5倍柱床体积。
PL4)可选地,干燥步骤PL3)获得的浓缩的植物提取物。
根据一个特别优选的实施方式,如果用于工业规模的生产,优选本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法步骤b)的纯化含有下列特定特征(纯化工艺PF):
PF1)将步骤a)获得的植物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子中,优选使用渗滤(提取类型)工艺(工艺步骤EP1至EP7),更优选使用乙醇/水(v/v)比率(%)为约25/75的乙醇/水混合物,所述树脂优选自Amberlite XAD-7HP或者XAD-1180或者任何其他供应商提供的任何其它等效树脂;将柱子洗脱液返回至柱子中,优选返回3次;
PF2)用水冲洗柱子至少1次,优选冲洗至洗脱液呈无色为止;使用乙醇/水(v/v)比率(%)在约10/90至约0/100之间的乙醇/水混合物冲洗柱子至少1次,优选使用2倍柱床体积的溶剂;以及
PF3)使用乙醇/水混合物从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物,该混合物中乙醇/水(v/v)比率(%)为约95/5至约100/0之间,优选约96/4、97/3、98/2、99/1或者约100/0,最优选约96/4。
PF4)可选地,干燥步骤PF3)获得的浓缩的植物提取物。
根据另一个特别优选的实施方式,如果用于工业规模的生产,优选本发明从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法步骤b)的纯化含有下列特定特征(纯化工艺ES):
PS1)将步骤a)获得的植物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子中,优选使用浸渍(提取类型)工艺(工艺步骤EM1至EM7),更优选使用乙醇/水(v/v)比率(%)为约65/35的乙醇/水混合物,所述树脂优选自Amberlite XAD-7HP或者XAD-1180或者任何其他供应商提供的任何其它等效树脂;将柱子洗脱液返回至柱子中,优选返回3次;
PS2)用水冲洗柱子至少1次,优选冲洗至洗脱液呈无色为止;使用乙醇/水(v/v)比率(%)在约10/90至约0/100之间的乙醇/水混合物冲洗柱子至少1次,优选使用2倍柱床体积的溶剂;以及
PS3)使用乙醇/水混合物从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物,该混合物中乙醇/水(v/v)比率(%)为约95/5至约100/0之间,优选约96/4、97/3、98/2、99/1或者约100/0,最优选约96/4。
前面提到的任何可替换方法都可以相互结合使用。例如用于工业化规模生产的提取工艺EP或者EM(或者用于实验室规模生产的提取工艺)可以与用于工业化规模生产的纯化工艺PF或者PS进行适当的结合。
浓缩的植物提取物
本发明进一步涉及一种粉绿叶茄浓缩的植物提取物,该植物提取物是由前面所定义的从粉绿叶茄中制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法直接获得的产品,也就是由前面定义的方法获得的或者可以由前面定义的方法获得的产品。这种浓缩的植物提取物特征在于其含有特殊的有利成分,这些成分只有通过前面定义的特定方法才能获得。更具体地,直接由前面定义的方法或者可由前面定义的方法获得的浓缩的植物提取物优选具有以下成分:
■活性成分:
-维生素D3代谢产物,优选浓度至少为300μg/g活性维生素D3,优选大于500μg/g,更优选大于2000μg/g,优选所述浓度以1,25-二羟基维生素D3的总量来计量确定,优选维生素D3代谢产物以糖苷形式存在或者以1,25-二羟基维生素D3不同糖苷的混合物存在,或者更优选以下式(I)的1,25-二羟基维生素D3-1β-吡喃葡萄糖苷形式存在:
-至少100mg/g的活性槲皮苷,更优选至少150mg/g,以及最优选至少200mg/g,所述浓度根据酸解后的槲皮素计算。
■非活性成分
可选地,本发明方法获得的浓缩的植物提取物可以进一步含有下列成分:
-无机物:最大浓度优选6%(包括含量在0.1至1%之间的元素Ca、K、Mg和S,以及含量小于0.1%的元素Br、Cl、P、Si、Al、Na、Cu、Fe、Zn);
-糖类:优选50-75%;
-蛋白:优选小于2%(其明显降低可能出现的过敏反应);
-脂肪:优选小于2%;
■毒性成分
本发明方法获得的浓缩的植物提取物的另一个特征在于低含量的生物碱。这一点特别值得注意而且是特别有利的,因为本领域技术人员知道茄属植物含有有毒的生物碱,特别是粉绿叶茄中的澳洲茄胺。因此,本发明方法获得的浓缩的植物提取物的另一个特征是生物碱含量低于检测限10μg/g(尤其是澳洲茄胺);
本发明方法获得的浓缩的植物提取物相比于现有技术中的提取物具有以下优越的化学性能:
◆同时存在浓缩含量的两种活性成分,也就是糖苷形式存在的1,25-二羟基维生素D3和黄酮醇槲皮素,这两种活性成分代表了两种类别的骨活性成分;
◆固有的水溶性,其只需配制成简单制剂即可使用,而不需要通过添加洗涤剂制成复杂制剂才能使用;
◆不易褐变/褪色(已经发现褐变/褪色是不利的,因为这会降低植物酚含量,例如黄酮醇的含量)
本发明的方法获得的浓缩的植物提取物相比于现有技术中的提取物具有下列优越的生物学特性:
◆高活性的维生素D,其仅由活性最强的活性成分1,25-二羟基维生素D3所产生;
◆因为以糖苷形式(它可以作为内源性活性维生素D代谢产物1,25-二羟基维生素D3的前药)存在,式(I)化合物1,25-二羟基维生素D3-1β-吡喃葡萄糖苷相比于它的母体化合物1,25-二羟基维生素D3具有更优越的生物耐受性(biological tolerance);
◆相比于单独的维生素D3,本发明提取物产生治疗效果的速度更快;
◆由于存在浓缩含量的两种骨活性成分也就是1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,所以本发明提取物可以明显扩大药物治疗窗,尤其是因为本发明植物提取物中含有可以降低高血钙的风险的1,25-二羟基维生素D3糖;
◆本发明植物提取物在减轻产肉动物腿病和提高骨强度方面显示出优越的性能;
◆本发明植物提取物在提高蛋壳质量上具有很强活性;
◆本发明植物提取物在预防产仔期间(产乳热)血钙下降方面具有很强活性;
◆此外,本发明植物提取物在FDA接受的临床前大鼠模型中对人骨质疏松症显示出很强活性。在一项实验中,给卵巢切除的雌性大鼠(一种诱导产生人体女性绝经后骨质疏松的动物模型)服用未经纯化的粉绿叶茄提取物,结果显示出抗骨质疏松效果但也会使软组织中产生沉积钙质,反之,使用本发明前面定义的方法获得的具有相同维生素D含量的纯化后的提取物也显示出抗骨质疏松效果但没有出现软组织钙化现象。
基于前面提到的令人惊奇的发现,本发明的一个实施方式也涉及(合成的)植物提取物组合物,优选含有下列成分:
a)游离形式和/或糖苷结合形式的天然的或者合成的维生素D活性成分,优选为1-α-羟基取代的维生素D代谢产物,或者更优选为1,25-二羟基维生素D3,优选以总的1,25-二羟基维生素D3的量计量,或者更优选以糖苷结合形式或者以1,25-二羟基维生素D3不同类型的糖苷混合物计,或者更优选以下式(I)1,25-二羟基维生素D3-1β-吡喃葡萄糖苷计,活性维生素D3的浓度为至少300μg/g,优选高于500μg/g,更优选高于2000μg/g。
b)至少一种(有活性的)黄酮醇,浓度至少100mg/g,更优选至少150mg/g,最优选200mg/g。
本发明(合成的)植物提取物组合物中所含的黄酮醇可以选自任何本领域中已知的黄酮醇或者它们的糖苷,优选已知的对于骨生长具有有利治疗效果的黄酮醇或者它们的糖苷。这些黄酮醇可以选自化合物杨梅黄素(myricetin)、槲皮素、山萘酚、非瑟酮(fisetin)、异鼠李素(isohamnetin)、藿香黄酮醇(pachypodol)、甲基鼠李黄酮(rhamnazin)、藤菊黄素(patuletin)、异泽兰素(eupalitin)、去甲泽兰黄醇素(eupatolitin)、5-羟基黄酮、6-羟基黄酮、7-羟基黄酮、5-羟基-7-甲氧基黄酮、7-羟基-5-甲基黄酮,或者它们的糖苷等。更优选地,本发明(合成的)植物组合物所含的黄酮醇选自上述黄酮醇的糖苷,例如选自梅黄素、槲皮苷、山萘酚、非瑟酮、异鼠李素、藿香黄酮醇、甲基鼠李黄酮、藤菊黄素、异泽兰素、去甲泽兰黄醇素、5-羟基黄酮、6-羟基黄酮、7-羟基黄酮、5-羟基-7-甲氧基黄酮、7-羟基-5-甲基黄酮的糖苷等,特别优选槲皮素和它的糖苷。
药物组合物
根据另一个特定的实施方式,本发明也涉及药物组合物,本发明药物组合物含有:
(a)前面定义的浓缩的植物提取物或者前面定义的(合成的)植物组合物,(或者植物提取物成分,特别是1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,尤其是前面定义的槲皮苷);以及
(b)可选的药学上可接受的载体和/或赋形剂。
本发明药物组合物可以含有(a)前面定义的本发明的(合成的)植物组合物,或者植物组合物的成分,优选含有前面定义的浓度。
本发明药物组合物可以进一步含有(b)药学上可接受的载体和/或赋形剂。本发明中,本发明药物组合物中所含的药学上可接受的载体或者赋形剂通常指无毒性的载体或者赋形剂,并且在使用这些载体或赋形剂形成制剂时不会对植物提取物成分的药理活性产生破坏,特别是不会对1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇的药理活性产生破坏,尤其是槲皮苷。
可以用于本发明药物组合物中的药学上可接受的载体或者赋形剂通常可以分成固体或者液体载体或赋形剂,这可以根据所用载体或赋形剂的粘度来确定。
本发明中固体载体和赋形剂通常包括但不限于,例如离子交换剂,氧化铝,硬脂酸铝,卵磷脂以及固体形式的盐,例如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠和锌盐,硅溶胶,三硅酸镁,或者聚乙烯吡咯烷酮,蜡,聚乙烯-聚氧化丙烯-嵌段聚合物,羊毛脂,糖,例如乳糖、葡萄糖和蔗糖;赋形剂例如麦芽糊精,木糖醇,淀粉,包括例如玉米淀粉或者马铃薯淀粉;或者基于纤维素的物质,例如纤维素和它的衍生物,例如羧甲基纤维素钠,乙基纤维素,醋酸纤维素;研磨成粉的黄芪胶;麦芽;凝胶;动物脂(tallow);(固体)润滑剂,例如硬脂酸,硬脂酸镁;硫酸钙;润湿剂,例如十二烷基硫酸钠;着色剂;调味剂;药物(活性剂)载体;片剂成形剂(tablet-forming agents);稳定剂;抗氧剂;防腐剂;包衣剂等。
液体载体或者赋形剂,例如用于水性或者油性悬浮液,通常包括但不限于,例如水;无热原的水;离子交换剂溶液,氧化铝溶液,硬脂酸铝溶液,卵磷脂溶液,或者血清蛋白溶液,例如人血清白蛋白溶液;海藻酸;等渗压盐溶液或者磷酸盐缓冲溶液,林格氏(Ringer)溶液,等压氯化钠溶液等,或者可溶解形式的盐或者电解质类,例如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸盐,比如磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐,或者(其它)缓冲物质包括比如甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾;多元醇液体溶液,例如聚乙二醇、聚丙二醇、甘油、1,3-丁二醇、山梨醇、甘露糖醇;无菌的固定油(fixed oils),任何合适的无刺激的固定油,例如包括合成的单-或二-甘油酯,饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物,脂肪酸,例如油酸和它的甘油酯衍生物,天然的药学上可接受的油,例如植物油,例如花生油、棉籽油、芝麻油、玉米油以及来自可可属植物(Theobroma)的油;橄榄油或者蓖麻油,尤其是聚氧乙烯形式的橄榄油或蓖麻油。这些液体载体或赋形剂也可以含有或包括液体形式存在的长链醇稀释剂或者分散剂,例如羧甲基纤维素或者类似的分散剂,或者通常使用的表面活性剂或者乳化剂,例如吐温 司盘(Spans)和其它乳化剂或者生物利用度促进剂等。
本发明药物组合物可以通过口服给药、直肠给药,通过植入式药盒给药或者可选地通过肠胃外给药。
优选地,前面定义的本发明药物组合物可以通过任何口服(或直肠)可接受的剂型进行口服(或直肠)给药,包括但不限于,胶囊、片剂、水悬浮液或者溶液。如果使用片剂口服给药,则通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还可以添加润滑剂,例如硬脂酸镁。如果需要,也可以添加特定的润滑剂、调味剂或着色剂。如果通过胶囊剂口服给药,则有用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。可以使用特定的载体和赋形剂来制备胶囊,赋形剂优选例如麦芽糖糊精、木糖醇、淀粉,例如包括玉米淀粉或者马铃薯淀粉等。可以使用特定的载体和赋形剂来制备片剂,优选润滑剂,例如硬脂酸、硬脂酸镁;赋形剂,例如麦芽糖糊精、木糖醇、淀粉,例如玉米淀粉或者马铃薯淀粉;以及适用于片剂的包衣材料等。也可以使用这些片剂和胶囊剂的缓释制剂,也就是延缓释放的制剂,优选所述缓释制剂中前面提到的活性成分埋置在生物可降解的生物聚合物中,或者被覆盖物(缓慢释放)包裹起来,这些设计可以使活性成分实现可控扩散。当使用水悬浮液口服给药时,可以将活性成分与乳化剂和助悬剂结合使用。也可以通过植入药盒将这些制剂用于直肠给药。
本发明药物组合物通常含有“安全有效量”的两种主要成分中的至少一种,也就是1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,更优选此处定义的槲皮苷。此处所用的“安全有效量”是指这些主要成分可以对此处定义的疾病或者障碍产生明显的积极调解作用的量。但同时,“安全有效量”也不会产生严重的副作用,也就是说“安全有效量”是在药理作用和毒副作用之间寻求到的 平衡点。可以通过医学判断来确定这些限制量。两种主要成分的“安全有效量”,也就是1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇的“安全有效量”,特别是此处定义的槲皮苷的“安全有效量”,可以根据医生的知识和经验,根据需要治疗的特定症状、患者年龄和生理状况、患者体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、排泄速度、药物组合、所涉及的特定自身抗原蛋白和/或抗体的活性、症状的严重性、治疗周期、同时采取的其它治疗的性质、所用的药学上可接受的载体以及其它类似因素来作进一步调整。本发明药物组合物可以用于人体也可以用于动物。
本发明粉绿叶茄植物提取物和药物组合物的应用
可以通过给需要治疗的人体或动物服用本发明创新的药物组合物,或者服用通过本发明所述的从粉绿叶茄制备和纯化浓缩的植物提取物的方法获得的或可以由这样的方法获得的创新的浓缩植物提取物,或者服用所述创新的(合成的)植物提取物组合物,或者服用所述创新的浓缩的植物提取物或者创新的(合成的)植物提取物组合物中的两种主要成分,也就是1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,尤其是槲皮苷,来治疗此处定义的疾病,尤其是治疗以下疾病:
◆骨量减少相关的疾病,例如骨质减少或(老年的或者绝经后的)骨质疏松,尤其是人体;
◆胫骨软骨发育异常以及其它与骨矿化相关的腿病,优选家禽,更优选小鸡、火鸡、雌鹅和鸭;
◆分娩前后出现的低血钙轻瘫(hypocalcemic paresis around parturition),也称为产奶动物产后轻瘫或者产乳热,尤其是牛或者其它产奶动物。这也包括任何与牛或者其它产奶动物产仔期间出现的血钙减少相关的疾病。本发明中,产乳热是产奶动物在分娩前后出现的代谢疾病,因为分娩前后重新恢复产奶会耗尽母体血液中循环钙。内源性的钙体内平衡无法通过饮食摄入或者骨代谢来产生足够的钙以预防血钙浓度下降。在某些情况下,钙浓度偏低还会引发肌肉轻瘫。目前对于前述疾病的治疗是在产仔前后服用大剂量的钙(参见:The Merck Veterinary Manual,Parturient Paresis in Cows),这种方法的效果不如使用本发明创新的植物提取物。
可以根据前面记载的有关本发明创新的药物组合物的给药方式来治疗此处定义的疾病,特别是给药方式和所用的安全有效量。
因此,本发明的另一个实施方式也涉及,使用通过上面定义的从粉绿叶茄制备和纯化浓缩的植物提取物这一创新方法获得的或可以由这样的方法获得的创新的浓缩植物提取物,或者使用本发明创新的(合成的)植物提取物组合物,或者同时使用本发明创新的浓缩的植物提取物或者创新的(合成的)植物提取物组合物中的两种主要成分,也就是同时使用1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,尤其是槲皮苷,来制备一种用于预防或治疗此处定义的疾病 或症状的(创新的)药物组合物,尤其是预防和治疗骨质量减少相关的疾病,例如骨质减少或者(老年的或绝经后的)骨质疏松,尤其是人体,尤其是预防和治疗人体成年期的骨质减少,或者预防和治疗伴侣动物(companion animals)的骨质减少;预防和治疗胫骨软骨发育异常以及其它与骨矿化相关的腿病,包括提高骨质量和抗断强度,优选家禽,更优选小鸡、火鸡、雌鹅和鸭;提高家禽的蛋壳强度和厚度;提高家禽和猪对钙和磷酸盐的吸收,从而减少或预防磷(增加的)流失到尿和粪肥中去;治疗或预防分娩前后的低血钙轻瘫,也称为产奶动物产后轻瘫或者产乳热,尤其是牛或者其它产奶动物。这也包括治疗或预防任何与牛或者其它产奶动物产仔期间出现的血钙减少相关的疾病等。
本发明的另一个实施方式涉及,使用通过上面定义的从粉绿叶茄制备和纯化浓缩的植物提取物的方法获得的或可以由这样的方法获得的创新的浓缩的植物提取物,或者使用本发明创新的(合成的)植物提取物组合物,或者同时使用本发明创新的浓缩的植物提取物或者创新的(合成的)植物提取物组合物中的两种主要成分,也就是同时使用1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,尤其是槲皮苷,作为人体或动物使用的饮食补充剂。可以在没有出现或诊断出前面提到的任何疾病的情况下使用饮食添加剂,尤其是在没有出现或诊断出骨质量减少相关疾病的情况下使用饮食补充剂,例如在没有出现或诊断出骨质量减少或者骨质疏松、胫骨软骨发育异常、产奶动物的产后轻瘫或者产乳热等疾病前使用,也就说上面定义的物质可以用作非治疗目的或者来预防上述疾病。
本发明也涉及试剂盒,特别是该试剂盒含有通过上面定义的从粉绿叶茄制备和纯化浓缩的植物提取物的方法获得的或可以由这样的方法获得的创新的浓缩的植物提取物,或者含有本发明创新的(合成的)植物提取物组合物,或者同时含有本发明创新的浓缩的植物提取物或者创新的(合成的)植物提取物组合物中的两种主要成分,也就是同时含有1,25-二羟基维生素D3糖苷和黄酮醇,尤其是槲皮素,以及/或者本发明创新的药物组合物,可选地,本发明试剂盒还包括技术说明或说明手册,优选用于前面提到的任何用途、疗法或治疗。
本发明的优点
本发明提供了一种从粉绿叶茄制备和纯化浓缩的植物提取物的方法,该方法可以获得高含量的两种活性成分,也就是1,25-二羟基维生素D3糖苷(包括1,25-二羟基维生素D3-1β-吡喃葡萄糖苷)和黄酮醇,尤其是槲皮苷。本发明的粉绿叶茄浓缩的植物提取物具有令人惊奇的活性,该活性已经在科学上可接受的人体绝经后骨质疏松的临床前模型中得到证明。本发明植物提取物可以提供所需浓度的活性维生素D代谢产物,因此其适用于肾功能不全的患者的治疗。本发明创新的植物提取物在提高动物对钙和磷的吸收、提高骨质量和抗断强度、预防家禽胫骨软骨发育异常和预防牛产仔期间出现的血钙浓度下降(也称为产奶动物的产后轻瘫)方面也具有令人惊奇的活性。尤其是,因为含有浓缩浓度的两种活性成分1,25-二羟基维生素D3糖苷(包括1,25-二羟基维生素D3-1β-吡喃葡萄糖苷)和黄酮醇的缘故,尤其是槲皮苷,本发明创新的浓缩的植物组合物具有优越的性能,其中黄酮醇可以令人惊奇地扩大1,25-二羟基维生素D3的治疗窗。这使得本发明创新的浓缩的植物提取物比单独的游离维生素D3 代谢产物具有更好的耐受性。相比于临床上单独小量使用化合物1,25-二羟基维生素D3,本发明植物提取物因为进一步降低了高血钙的风险(如动物模型所示),所以其用在人体中比单独的两种化合物来的更安全。已经发现,同时存在本发明组合物两种活性成分时的生物应答的开始要比单独维生素D来的快,这可能是因为本发明创新的浓缩的植物提取物含有1,25-二羟基维生素D3和1,25-二羟基维生素D3-1β-吡喃葡萄糖苷。最后,本发明浓缩的植物组合物中不含有与植物原材料有关联的可检测到的毒性成分。本发明粉绿叶茄创新的浓缩植物提取物的褪色率也很低,此外因为本发明植物提取物中蛋白含量很低所以其引发过敏的可能性也很低。
附图说明
以下附图仅用于进一步说明本发明。它们不对本发明主题构成任何限制。
图1示出了影响有骨质疏松的男性和女性骨质量的因素。如图所示,营养是整个生命周期中最重要的因素。药物在45岁以上的患者中扮演了重要的角色。
图2示出了通过分析用Sephadex G25柱子对纯化的提取物进行色谱分离所得本发明创新的浓缩植物提取物的表征。分离组分的部分被水解并测定1,25-二羟基维生素D3含量。使用分子量为1400,4300和6800道尔顿的水溶性聚苯乙烯作为质量数标记物。如图2所示,1,25-二羟基维生素D3是本发明创新的浓缩的植物提取物的主要成分。
图3示出了本发明创新的浓缩植物提取物的表征,其采用的方法是在分析用的Superdex-30柱子上对纯化后的提取物进行不同的色谱分离。分离组分的部分被水解并测定1,25-二羟基维生素D3含量。使用分子量为1355道尔顿的维生素b12(Cobalamin)作为质量数标记物。如图3所示,1,25-二羟基维生素D3是本发明创新的浓缩的植物提取物的主要成分。
图4示出了提取效率,其根据下式计算:
yf=VDM(提取物)·[Qu(提取物)/1000]·ef。
作为实验室实验的结果,获得了两个最佳的优良系数(factor of goodness),这两个优良系数同样适用于工业规模的工艺。
图5示出了通过UV,1H-NMR和13C-NMR光谱确定的成分1,25-二羟基维生素D3的结构。
图6示出了本发明产物、对比用的标准品以及银杏和山楂提取物经过高效薄层色谱分离后的特征(参见实施例3(iii))。所用条件如下:
板:硅胶G,带有UV-指示器10x10cm Merck(Camag AG,Muttenz Switzerland)
溶剂:乙酸乙酯/甲酸/醋酸/水(100+11+11+26)。预处理45分钟,跑板45分钟
检测:Naturstoff-Reagent(Camag AG,Muttenz Switzerland)
应用:
道1:槲皮素(rf 0.88;0.56μg);金丝桃甙(rf 0.55;1.25μg);绿原酸(rf 0.42;1.2μg);芸香苷(rf 0.37;0.73μg)
道2:山萘酚(rf0.90;0.25μg);异槲皮素(isoquercitrin)(rf0.57;1.25μg);金丝桃甙(rf0.54;1.25μg);
道3:咖啡酸(rf0.82;0.1μg);异槲皮素(rf0.57;1.25μg)
道4:纯化后的提取物(批次1;41μg;示出了槲皮素和槲皮苷)
道5:纯化后的提取物(批次2;41μg;示出了槲皮素和槲皮苷)
道6:银杏(ginkgo biloba)提取物(商业产品;10μl)
道7:山楂提取物(商业产品;201μg)
道8:与道1相同的标准品
道9:根据现有技术获得的纯化后的对比提取物(在Sephadex G-10上色谱分离)(在Sephadex G10柱子上纯化后的提取物对比样品虽然维生素D活性很高(2000μg/g),但基本上没有黄酮醇)
图7示出了产仔期间的血钙变化(产后轻瘫)。第一个柱子示出本发明创新的纯化后植物提取物(纯化后的提取物),第二个柱子示出了使用丸剂(bolus)形式的钙盐((Bovicalc,Boehringer Ingelheim,Germany,根据厂商说明书使用)进行治疗。如图所示,两种治疗都可以同等的防止血钙下降(使用本发明创新的纯化后的植物提取物(纯化后的提取物)所产生的钙水平比使用钙标准品稍微好一些)。从图7可以看出,不采取治疗手段会不可避免地导致血钙下降。
柱子表示:a.p:产前24小时;
pp:分娩(产仔)时;
plus-12:产仔12小时后;
plus-72:产仔72小时后。
图8示出了未经治疗的母牛产仔前后血钙的变化过程。
图9示出了骨质疏松的大鼠模型经6个月治疗后右胫骨骨质量的变化(参见实验4)。由图可见,使用本发明组合物治疗不仅预防了卵巢摘除引起的骨流失,相比于假手术对照组(sham-operated controls),本发明组合物还可以增加胫骨骨质量。
实施例
以下实施例用于进一步说明本发明。它们不对本发明的主题构成任何限制。
实施例1-提取
根据已经公开的粉绿叶茄提取方法,使用氯仿-甲醇进行提取是最有效的提取方法,但是,这种方法不适用于大规模生产并且该方法还使用了有毒试剂。其它已公开的使用水进行提取的方法获得的维生素D活性又太低,因此也不如本发明的方法。相反,如实施例1记载,本发明提供了一种技术最优化且生态友好型的提取和纯化粉绿叶茄的工艺,优选提取和纯化干燥叶,本发明的方法不使用有毒试剂且具有很高产率。
实施例1A-实验室规模的提取(工艺L)
在ASE-100仪器(Dionex,USA)中,对1g研磨过的粉绿叶茄干燥叶进行自动化溶剂提取。作为溶剂的醇类溶剂及其用量如下(参见表1):
提取效率根据以下公式计算:
yf=VDM(提取物)*[Qu(提取物)/1000]*ef
其中[VDM]和[Qu]根据每g提取物计算。系数[ef]是表示如成本、生态和提取物质量等因素的经验系数。作为实验室实验的结果,图4以曲线形式给出了获得的优良系数。
根据图4曲线函数获得的两个峰值说明了本发明工艺的优点,其符合本发明标准并优于已知的提取方法。使用其它适当的且广泛使用的溶剂进行提取无法获得最佳的产物组合物。
溶剂混合物乙醇/水比率为25/75时的峰具有特殊意义,因为此时获得的干燥提取物具有出色的水溶性,可以使该提取物适于任何口服使用,例如直接通过饮用水服用而不需要使用乳化剂(通常用于脂溶性维生素)。使用乙醇/水为65/35混合物获得的提取物的水溶性较低,其可以用在例如水不溶的制剂中,例如用在使用乳化剂的制剂中,但是它也可以用在其它不需要乳化剂的制剂中,例如片剂、胶囊等。
作为实验结果,提取效率yf大于3是令人满意的且优于已知的其它提取方法,并且也符合本发明标准。使用其它适当的且广泛使用的溶剂进行提取无法获得最佳的产物组合物。
根据实验室工艺EL获得的提取物的纯化数据如下:
实施例1B-工业规模的提取
(i)工艺EP
用15-30,000升(优选25,000)比率为25-75的乙醇-水(w/w)混合物提取1000kg粉绿叶茄的燥叶(5-15%水含量),该溶剂混合物含有0.1%抗坏血酸作为稳定剂。55℃下在4个循环填充的容器中进行渗滤,每次循环的渗滤都进行24小时,所述渗滤是在现时先进的设备中以1,000升/小时的流速进行。控制回收到的液相的pH,最后加入醋酸将pH调节至5.5-6.5。收集获得的提取物并真空浓缩至不挥发物质含量为35%。根据上面记载的方式进行高温处理。根据工艺EP获得的提取物的纯化数据如下:
(iii)工艺EM
也可以使用浸渍工艺来替代渗滤。将1000kg干燥植物叶装入合适的带有搅拌器和双夹套加热系统的不锈钢反应器。加入9,000升乙醇-水(40-80%w/w,其可以含有0.1%抗坏血栓)。 搅拌下将混合物加热至40-75℃(优选55℃)下6-48小时(优选24小时),然后通过压力过滤器进行固/液分离。使用8.000升溶剂混合物按照相同的方法对分离出来叶子进行第二次提取。过滤提取物,用醋酸将pH调节至5.5-6.5,并在两步真空蒸馏装置中将提取物浓缩至不挥发物质含量为25-50%。根据前面记载的方法进行高温处理。工艺EM获得的数据如下:
(iii)工艺EP+EM
按照前面定义的方法对(i)和(ii)(工艺EP和EM)获得的浓缩提取物进行高温处理,并直接用于下面步骤,或者用于喷雾干燥、带干燥或者冷冻干燥。
实施例2--纯化
实施例2A-实验室规模的纯化(工艺PL)
将约300mg粗提取物溶解在1ml水(或者约30%(w/v)溶液)中,将获得的溶液填充到9ml柱床体积的柱子上,所述柱子填充有测试用的树脂(所述柱子根据其使用说明书进行预处理)。所有溶液使用的流速都为约0.3柱床体积每分钟。用3倍柱床体积的水冲洗柱子。用3倍柱床体积的乙醇/水95/05(v/v)进行洗脱,收集洗脱液用于分析。用3倍柱床体积的丙酮再生柱子。收集所有3种流分:水冲洗液(D105/1A),乙醇洗脱液(D105/1B)以及再生液(D105/1C),将这些溶液蒸发至干燥状态并进行分析。在重新使用前,先后用2倍柱床体积的乙醇、2倍柱床体积的乙醇50%以及4倍柱床体积的水对柱子进行处理。
实验室工艺纯化(PL)。下表记载了4次洗脱获得的所有实验数据:
洗脱1:使用溶剂乙醇/水25/75(v/v)以及柱子Amberlite XAD1180所获得的提取物
洗脱2:使用溶剂乙醇/水25/75(v/v)以及柱子Amberlite XAD7HP所获得的提取物
洗脱3:使用溶剂乙醇/水65/35(v/v)以及柱子Amberlite XAD1180所获得的提取物
洗脱4:使用溶剂乙醇/水65/35(v/v)以及柱子Amberlite XAD7HP所获得的提取物
根据上面记载的方法将所有洗脱液都收集成3种流分:水洗脱液(A),洗脱液(B)以及再生液(C)。
工艺PL获得的数据如下:
讨论:
在Amberlite XAD-1180和Amberlite XAD-7HP上进行纯化所获得的效果要比文献中记载的在硅胶和Sephadex材料上进行纯化的效果好(数据未示出)。
在Amberlite XAD-1180上从粉绿叶茄中色谱分离粗提取物获得的产品具有较高溶解性和较浅的颜色。在Amberlite XAD-7PH上进行色谱分离具有较高的质量和较高的VDM,但是槲皮素产率稍微有些低。两种树脂获得的提取物的纯度相同。
用65/35的乙醇/水提取所获得的VDM/槲皮素的商要比用25/75的乙醇/水提取来的高,但是质量产率要来的低。
根据所用的纯化条件获得的洗脱液只含有1,25-二羟基维生素D3糖苷和槲皮苷(通过HPTLC验证(图6,道4))。
使用乙醇/水96/04(v/v)的洗脱条件,可以获得最佳的VDE产率。
实施例2B-工业规模的纯化
(i)工业纯化工艺(例子PF)
将0.4kg粗提取物(来源于工艺EP(例子1B(i)))装入体积为4L的Amberlite XAD-7HP柱子。得到64g纯化后的产物,该产物含有229ppm维生素D代谢产物(VDM,根据1,25-二羟基维生素D3来确定)以及17.7%黄酮醇(根据水解后的槲皮素来确定)。水解后,该纯化产物只含有一种黄酮醇成分,即槲皮素。
工艺PF获得的数据如下:
(ii)工业纯化工艺(例子PS)
将9升30%粗提取物溶液(来自工艺EM(例子1B(ii)))加到体积为35L的AmberliteXAD-1180柱子中。获得575g纯化后的产物,该产物含有322ppm维生素D代谢产物(VDM,根据1,25-二羟基维生素D3来确定)以及15.9%黄酮醇(根据酸解后的槲皮素来确定)。水解后,该纯化产物只含有一种黄酮醇成分,即槲皮苷。
工艺PS获得的数据如下:
通过上面纯化步骤(i)或(ii)获得的本发明创新的浓缩的植物提取物是一种组合物,该组合物含有标准含量的以糖苷形式存在的维生素D代谢产物1,25-二羟基维生素D3,以及最佳均匀含量的具有骨活性的黄酮醇槲皮素,该槲皮素也以糖苷形式存在。
实施例3-本发明浓缩植物提取物的性能表征
(i)本发明浓缩植物提取物的表征
对获得的提取物进行分析,并按照它的活性成分、非活性成分和无毒成分进行表征,其中产物毒性成分的含量、生产步骤中出现的褐变/褪色已经被优化至最小。具体地,本发明浓缩的植物提取物,也就是根据上面记载的方法制备获得的产物(实施例1和2)可以通过以下特性来表征:
(ii)根据维生素D活性成分的表征
本发明组合物,也就是根据上面方法制备的本发明创新的浓缩的植物提取物的另一个特征在于,该提取物含有摩尔质量分布在596.8(416.6+180.2)至4500道尔顿之间的维生素D活性成分1,25-二羟基维生素D3糖苷(图2示出了在分析用的Sephadex G25柱子上色谱分离纯化后的提取物。水解等分流分并测定1,25-二羟基维生素D3。使用分子量为1400、4300和6800道尔顿的水溶性聚苯乙烯作为质量标记物。图3示出了在分析用的Superdex-30柱子上色谱分离纯化后的提取物。水解等分流分并测定1,25-二羟基维生素D3。使用分子量为1355道尔顿的维生素b12作为质量标记物)。此外,通过LC-MS-、UV-、1H-NMR和13C-NMR光谱确定,本发明组合物还存在1,25-二羟基维生素D3-1β-吡喃葡萄糖苷(参见图5)。
本发明创新的浓缩的植物提取物的另一个特征在于,其不含有游离的1,25-二羟基维生素D3和25-羟基维生素D3。
主要成分1,25-二羟基维生素D3-1β-吡喃葡萄糖苷的分析数据如下:
LC-MS-光谱(POS,TIME=7.787:8.041):
m/z=543[M+H-2H2O]+,399[M+H-Glu]+,381[M+H-H2O-Glu]+,363[M+H-2H2O-Glu]+,
(参见;CTL:m/z=399[M+H-H2O]+,381[M+H-2H2O]+,363[M+H-3H2O]+,(CTL=骨化三醇);
分子量(ESI-TOF):
C33H54O8m/z[M+Na+]:
理论值:601.3736
实测值:601.3711 相差:4.2ppm
C66H108O16m/z[M+Na+]:
理论值:1179.7530
实测值:1179.7520 相差:-0.8ppm
UV-光谱:
UV-光谱示出了两个最大吸收峰,这两个峰只有在带有C1-O位置基团的CTL-化合物中才能观察到。
UV[MeOH/H2O(9∶1)]:λmax=244,71.
1
H-NMR-光谱(400MHz,CDCl
3
,40℃):
δ[ppm]=0.55(s,3H,18),0.94(d,3J(21,20)=6.4Hz,3H,21),1.22(s,6H,26/27),3,30(dd, 3J(2’,3’)=9.2Hz,3J(2’,1’)=7.6Hz,1H,2’),3.38(m,1H,5’),3.48(dd,3J(4’,3’)=9.2Hz, 3J(4’,5’)=8.8Hz,1H,4’or 3’),3.59(dd,3J(3’,2’)=9.2Hz;3J(3’,4’)=9.2Hz;1H,3’or 4’),3.83(dd,2J(6b’,6a’)=12.0Hz,3J(6b’,5’)=4.8Hz,1H,6b’),3.93(dd,2J(6a’,6b’)=11.6Hz,3J(6a’,5’)=3.6Hz,1H,6a’),4.17(m,3J(3α,4β)=5.6Hz,3J(3α,4α)=3.6Hz,1H,3α), 4.36(d,3J(1’,2’)=7.6Hz,1H,1’),4.45(t,3J(1β,2)=4.0Hz,1H,1β),5.15(d,2J(19E,19Z)=2.0Hz,1H,19E),5.30(d,2J(19Z,19E)=1.6Hz,1H,19Z),5.98(d,3J(7,6)=11.6Hz,1H,7),6.40(d,3J(6,7)=11.2Hz,1H,6).
13
C-NMR光谱(CDCl
3
):
δ[ppm]=12.1(18),18.8(21),29.2(26/27),62.5(6’),99.1(1β),117.1(19E),117.1(19Z).因此,可以明确地确定本发明提取物中存在1,25-二羟基维生素D3-1β-吡喃葡萄糖苷。
(iii)根据植物黄酮醇的表征
本发明组合物,也就是根据上面方法制备的本发明创新的浓缩的植物提取物的另一个特征在于其只含有一种生物活性的黄酮类化合物,也就是糖苷形式的黄酮醇槲皮素。表2列出了槲皮苷组分,如图6所示在进行高效薄层色谱分离后用指纹图谱对其进行表征。通过使用本发明获得的产物、以及将其与标准品以及银杏和山楂的提取物进行对比的方式来进行高效薄层色谱分离表征(参见实施例3(iii))。所用条件如下:
板:硅胶G,带有UV-指示器10x10cm Merck(Camag AG,Muttenz Switzerland)
溶剂:乙酸乙酯/甲酸/醋酸/水(100+11+11+26)。预处理45分钟,洗脱45分钟
检测:Naturstoff-Reagent(Camag AG,Muttenz Switzerland)
应用:
道1:槲皮素(rf 0.88;0.56μg);金丝桃甙(rf 0.55;1.25μg);绿原酸(rf 0.42;1.2μg);芸香苷(rf 0.37;0.73μg)(道中含有Fluka AG,Buchs Switzerland提供的参照用标准品);
道2:山萘酚(rf0.90;0.25μg);异槲皮素(rf0.57;1.25μg);金丝桃甙(rf0.54;1.25μg)(道中含有Fluka AG,Buchs Switzerland提供的参照用标准品);道3:咖啡酸(rf0.82;0.1μg);异槲皮素(rf0.57;1.25μg)(道中含有FlukaAG,Buchs Switzerland提供的参照用标准品)
道4:纯化后的提取物(批次1;41μg)
使用了41μg本发明纯化后的浓缩的的植物提取物。可以将槲皮素、槲皮苷以及普遍存在的非主要植物提取物(包括咖啡酸和绿原酸)分离开(参见图6)
道5:纯化后的提取物(批次2;41μg素)
类似地,使用了41μg本发明纯化后的浓缩植物提取物。可以将槲皮素、槲皮苷以及普遍存在的非主要植物提取物(包括咖啡酸和绿原酸)分离 开(参见图6);道4和道5显示出了不同批次样品之间所存在的轻微差别;
道6:银杏(ginkgo biloba)提取物(商业产品;10μl)(商业银杏提取物(CeresAG,Switzerland))
道7:山楂提取物(商业产品;201μg)(商业山楂提取物(Zeller AG,Romanshorn,Switzerland);道6和道7两种提取物是明显不同的组合物;
道8:与道1相同的标准品(FlukaAG,Buchs Switzerland);
道9:根据现有技术获得的纯化后的对比提取物(在Sephadex G-10上色谱分离)(在Sephadex G10柱子上纯化后的提取物对比样品虽然维生素D
活性很高(2000μg/g),但基本上没有黄酮醇)。
高效薄层色谱分离的分析结果如下(参见表2):
槲皮苷 | mg/g |
芹菜糖基芸香苷(Apiosyl rutin) | 50-100 |
芸香苷 | 120-200 |
其它槲皮素低聚糖 | 5-50 |
金丝桃苷 | 5-20 |
其它槲皮素单糖苷 | 10-50 |
槲皮素 | 2-50 |
山奈酚 | <20 |
表2:本发明创新的浓缩植物提取物中黄酮醇的含量
通过在Sephadex树脂上进行色谱分离纯化后可以获得具有高含量1,25-二羟基维生素D3的产物,但就像图5道9所示,该产物基本上不含有黄酮醇。
实施例3-测试本发明创新的浓缩植物提取物生物学活性的实验
(i)在日本鹌鹑(Japanese quails)中进行生物测定进而评估维生素D活性(实验1)
从Rambeck等人发表的文献(参见Rambeck等人,Ann.Nutr.Metab.30,9-14,(1986))可以知道,可以通过简单的生物测定方法即鹌鹑蛋蛋壳测定来评估维生素D活性。根据该方法,可以使用缺乏维生素D的饲料来喂养日本鹌鹑(Coturnix japonica),其中该饲料足量含有除维生素D外的所有其它营养物,所选的日本鹌鹑处于产卵年龄并且其产卵能力>80%。喂养近8天后,作为维生素D缺乏最敏感反应,这些日本鹌鹑的产卵能力下降了10%。然后将实验动物10只一组进行随机分组并用相同的饲料喂养,同时使用实验用物质进行补充喂养。监测产卵能力21天,同时也对与维生素D代谢有关的其它指标进行监测,例如血浆中的碱性磷酸酶和钙。
实验1中,3组鹌鹑用100,200和400国际单位的维生素D3/kg饲料进行喂养,5组鹌鹑用2,8,32,128和514mg/kg纯化后的植物提取物喂养,另有1组动物用合成的1,25-二羟基维生素D3(1μg/kg饲料)喂养,另有一组动物用研磨过的干燥粉绿叶茄叶子(1000mg/kg饲料)进行喂养。
表3:以每个动物每天蛋壳重量(ESW)(g)作为指标来反映维生素D在日本鹌鹑中的活性
蛋壳重量概率分析后表明,纯化后的提取物维生素D3活性为约10,000IUD/g,而粉绿叶茄叶子中维生素D3活性为约200IUD/g(1国际单位(IU)维生素D(IUD)与0.025μg维生素D3/麦角钙化甾醇的生物活性相同)。因此,本发明获得的组合物维生素D活性要比未经处理的原材料高50倍。
除了测定维生素D活性外,本实验还表明本发明纯化后的提取物在大剂量使用时也能被生物体很好的接受。而对于合成的1,25-二羟基维生素D3,其在小鸡中的治疗窗为2至5(参见Rambeck等人,supra),而纯化后的提取物剂量在32mg/kg饲料(开始产生药理效果)至512mg/kg饲料时生物体还具有很好的耐受性,而不会造成动物产卵能力下降(ESW,表3)。
此外,用纯化后的粉绿叶茄提取物进行治疗对动物产卵能力发生效果的速度要比用维生素D3进行治疗来的快,这可以通过产卵能力提高50%所需的时间来估算。用纯化后的提取物治疗所需时间是24-48小时,而用维生素D3治疗所需时间则为48-72小时。
如下表4所示,相比于用400IUD/kg饲料喂养的对照组,用纯化后提取物喂养的动物组中蛋质量有明显提高。
表4:生物测定期间收集到的日本鹌鹑第1天至21天蛋质量平均值。
(ii)腿异常雏鸡(Broiler)实验(实验2)
实验2中,用含有1,000IUD维生素D3/kg饲料的商业饲料喂养出生只有1天的雄性雏鸡。对照组用没有添加纯化提取物的饲料喂养,另两个组分别用补充添加有32mg纯化提取物/kg饲料和128mg纯化提取物/kg饲料的饲料进行喂养,分别相当于4.3μg和76.8μg 1,25-二羟基维生素D3(提取物体外水解后来确定)。表5显示,使用本发明创新的纯化后的浓缩粉绿叶茄植物提取物治疗可以减少了雏鸡胫骨软骨发育异常(TD)以及其它腿异常的出现。
表5:治疗第14天后雏鸡胫骨软骨发育异常(TD)和其它腿异常的治疗效果
(iii)预防产仔期间血钙下降的活性(实验3)
产乳热是产奶动物分娩前后出现的代谢疾病,因为恢复产奶会耗尽母体血液中的循环钙。内源性的钙体内平衡无法通过饮食摄取或者骨代谢来产生足够的钙以预防血钙浓度下降。在某些情况下,钙浓度偏低还会引发肌肉轻瘫。目前的治疗方法是在产仔前后给予大剂量的钙(参见:The Merck Veterinary Manual,Parturient Paresis in Cows)。
实验中,将怀孕母牛随机分成2个治疗组。一个组使用每丸含有42g钙盐的钙丸剂商业产品进行治疗。根据生产厂家的建议,在产仔前后给治疗动物服用4丸。分娩前72至24小时之间单剂量服用5g本发明产品。出于伦理上的考虑有1组没有采取治疗;记录临产前血钙下降情况(参见Figure 7,Goff JP,Horst RL.J Dairy Sci.1997 Jan;80(1):176-86.Effects of theaddition of potassium or sodium,but not calcium,to prepartum ratios on milk fever in dairy cows)。
如图7所示,结果表明服用单剂量的本发明组合物可以预防血钙下降,其与在产仔前后服用4丸含有43g钙盐的钙剂具有相同的作用。
(iv)人体骨质疏松动物模型中表现出的活性(实验4)
在卵巢摘除诱导的人绝经后骨质疏松大鼠模型(骨质疏松大鼠临床前模型)中验证含有两种活性成分也就是1,25-二羟基维生素D3(以1,25-二羟基维生素D3-1β-吡喃葡萄糖苷形式存在)与黄酮醇槲皮素的本发明创新的浓缩植物提取物的活性。
从Charles River Labs(L′Arbresle,France)处获得120g重的卵巢切除雌性大鼠和假手术用的同窝出生大鼠,并进行分组。驯养后使用对照用品饲料(假手术组和ovx组)进行喂养,或者使用含有实验用物质(溶胶和阿仑膦酸盐(alendronate))的相同饲料进行喂养。阿仑膦酸盐用作阳性对照以验证实验有效性。阿仑膦酸盐可以在人体中产生抗骨质疏松的治疗效果。实验中收集血液和尿液,并测定骨转换指标和骨形成指标。6个月后终止实验,测定骨粉(boneash)并对胫骨进行X射线断层摄像。
在骨细胞培养物中用游离槲皮素和游离1,25-二羟基维生素D3作为阳性对照进行体外实验,来验证本发明组合物中槲皮素成分的活性。
结果发现,本发明创新的浓缩的植物组合物具有预料不到的强大效果,这种效果或许可以解释为两种活性成分即1,25-二羟基维生素D3和槲皮素的协同作用。因此,如图9所示,用本发明组合物进行治疗不仅可以预防卵巢切除诱导的骨流失,并且相比于假手术对照组,本发明组合物还可以增加胫骨骨质量。
Claims (16)
1.一种从粉绿叶茄中制备和纯化富含1,25-二羟基维生素D3糖苷和槲皮苷的浓缩植物提取物的方法,其中所述方法包含以下步骤:
a)使用乙醇/水的混合溶剂提取粉绿叶茄种的植物或植物的部分,该混合溶剂中乙醇/水(v/v)的比率为25/75至80/20;和
b)使用下列步骤纯化根据步骤a)获得的植物提取物:
b1)将步骤a)获得的植物提取物填充到含有非离子型聚合物树脂的柱子中,该非离子型聚合物树脂选自聚苯乙烯、苯乙烯二乙烯苯共聚物、丙烯酸酯聚合物以及多酚树脂;
b2)用水冲洗柱子;
b3)使用体积比为100/0至70/30的醇/水混合物从柱子中洗脱出浓缩的植物提取物;以及
b4)浓缩和/或干燥所述浓缩的植物提取物。
2.根据权利要求1所述的方法,其中步骤a)包括对粉绿叶茄种的植物或植物的部分进行研磨、渗滤和/或浸渍的步骤,其中对于渗滤类型的提取所述乙醇/水的混合物中乙醇/水(v/v)的比率为25/75或75/25,或者对于浸渍类型的提取所述乙醇/水(v/v)的比率为65/35。
3.根据权利要求2所述的方法,其中对于渗滤类型的提取溶剂/药材的比率为9(v/w),对于浸渍类型的提取溶剂/药材的比率为5(v/w)。
4.根据权利要求1所述的方法,其中步骤a)在40℃至60℃下进行,其中步骤a)中溶剂的pH值被调节到5.5至6.5之间的一特定值。
5.根据权利要求1所述的方法,将步骤a)和/或b)获得的植物提取物浓缩或干燥至含有25-35%不挥发物质。
6.根据权利要求1所述的方法,对步骤a)获得的提取物进行热处理。
7.根据权利要求1所述的方法,其中非离子型聚合物树脂选自树脂Amberlite XAD-7、XAD-7HP、XAD-8或XAD-1180。
8.根据权利要求1所述的方法,其中对所述步骤a)和/或b)获得的提取物进行喷雾干燥、带式干燥或者冷冻干燥。
9.根据权利要求1-8中任一项获得的粉绿叶茄的浓缩植物提取物。
10.根据权利要求9所述的浓缩植物提取物,其含有以下成分:
(a)维生素D3代谢产物,其浓度为至少300μg/g的活性维生素D3,该浓度以1,25-二羟基维生素D3糖苷的总量来计算,以及
(b)至少100mg/g的槲皮苷,该浓度根据酸解后的槲皮素来计算。
11.根据权利要求10所述的浓缩植物提取物,其另一个特征在于生物碱含量低于检测限10μg/g。
12.用于预防和治疗骨质量减少相关疾病或胫骨软骨发育异常或产后轻瘫或产乳热或用作饮食补充剂的药物组合物,所述药物组合物由以下成分组成:
a)根据权利要求9所述的粉绿叶茄浓缩植物提取物;以及
b)药学上可接受的载体和/或赋形剂。
13.根据权利要求9所述的粉绿叶茄浓缩植物提取物用于制备预防或治疗骨质量减少相关的疾病的药物组合物的用途,所述疾病包括人体或动物体的骨质减少或骨质疏松。
14.根据权利要求9所述的粉绿叶茄浓缩植物提取物用于制备预防或治疗胫骨软骨发育异常的药物组合物的用途。
15.根据权利要求9所述的粉绿叶茄浓缩植物提取物用于制备预防或治疗产奶动物的产后轻瘫或产乳热的药物组合物的用途。
16.根据权利要求9所述的粉绿叶茄浓缩植物提取物用作人体或兽医用的饮食补充剂的用途。
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