CN107530390A - 多药性作用植物生物活性物质 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药理学，并可以用于制作治疗和预防由疱疹、流行性感冒、乙型和丙型肝炎病毒引起的病毒性疾病以及病毒感染免疫缺陷的药物。禾本科植物Gramineae科Calamagrostis Adans属和/或Deshampsia Beauv属绿色部分和小穗中提取的生物活性物质含黄酮类化合物，即小麦黄素(tricin)、芹菜素、木犀草素、槲皮素、鼠李金黄酮类苷元和/或小麦黄素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、鼠李金黄酮苷，辅助物质，成分(质量％)如下：小麦黄素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.016至2.062％；芹菜素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.010至1.393％；木犀草素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.01至4.979％；槲皮素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.001至0.771％；鼠李金黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.104至0.203％；辅助物质99.868至90.592％；至0.203％；辅助物质99.868至90.592％。因此，测定生物活性物的具体活性物质成分，其物理化学、生物学性能允许改善并选择其对特定病毒、剂型计量发挥抗病毒作用的最佳成分。此外，已确定本生物活性物质作为(γ)型内源干扰素的诱导剂，并具有凋亡调节作用和抗氧化性能，提高细胞对自由基压力的稳定性。特定病毒抗病毒作用针对2型单纯疱疹病毒、流感病毒、牛腹泻病毒(丙型肝炎病毒)。

Description

多药性作用植物生物活性物质
技术领域
本发明归于医学，即药理学，涉及到多药性作用植物生物活性物质成分，含黄酮类苷元、黄酮苷和辅助物质。生物活性物质能用于制作治疗和预防由疱疹、流行性感冒、乙型和丙型肝炎病毒引起的病毒性疾病以及病毒感染免疫缺陷的药物。
背景技术
近年来，植物材料的抗病毒药物受更多关注，其中检测到直接作用于病毒剂的物质。一种已知的具有广泛范围内抗病毒活性作用的分子为小麦黄素(tricin)(5,7,4'-三羟基-3'，5'-二甲氧基黄酮)。
已知，小麦黄素抗流感病毒、巨细胞病毒和单纯疱疹病毒性能有效(日本专利Р2010-254649 А,2010年11月11日版本；日本专利Р 2006-265248 А,2006年10月05日版本)。已测定，从在细胞层次50％抑制巨细胞病毒感染发展(抗病毒作用)的Sasa albo-marginata中提取的小麦黄素浓度超过0.42微米(或0.139微克/毫升)(AntiviralResearch 91(2011),296-303)，而合成小麦黄素对甲型流感病毒(H1N1)的抗病毒作用仅在等于或高于3.3微米(或1.09微克/毫升)的浓度生效(抗病毒化学与化疗2011,22:1-11；Joi103851/MP 1782)。
化学纯小麦黄素苷元或小麦黄素与芹菜素和/或木犀草素和/或槲皮素的复合化合物源自植物材料：竹叶(Bamboo leaves)，Sasa，稻叶。化学纯黄酮类化合物快速氧化并且是疏水性的，因此其使用仅限于细胞层次科学研究领域(Microbes andInfection.2012p.V.14.Is.12.p 1086-1092)。络合物：小麦黄素苷元、芹菜素、木犀草素、槲皮素的糖苷与其复合物是疏水性的，在整个生物体的水平，不同分子量黄酮类化合物的配合物具有协同作用，以及与某些纯物质的作用相比，生物利用度较高(In vivo 2011,25(5),757-762,Journal of Food.Vol.13,№1,p.140-150)。
本发明化学成分和来源最接近的物质用于治疗和预防病理状况，是以2003年2月17日UA № 54362 7МПК A61K 35/78公报2号专利方法提取的植物生物活性物质。植物材料为Calamagrostis Adans和Deschampsia Beauv属混合物，收集期间是茎发育到小穗开花结束为止。
如此的生物活性物质毒性较低，为人体提供广泛药理作用，但未确定活性物质具体成分，以及对特定病毒作用未知，无创建药剂推荐剂量的信息。
目的为改进生物活性物质，并确定其活性成分、物理化学、生物学特性，确定其针对特定病毒抗病毒作用最佳成分、创建药剂同时保持低毒性的剂量。
发明内容
上述任务解决方案为：禾本科植物Gramineae科Calamagrostis Adans属和/或Deshampsia Beauv属绿色部分和小穗中提取的生物活性物质含黄酮类化合物，即小麦黄素(tricin)、芹菜素、木犀草素、槲皮素、鼠李金黄酮类苷元和/或小麦黄素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、鼠李金黄酮苷，辅助物质，成分(质量％)如下：
小麦黄素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.016至2.062％；
芹菜素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.010至1.393％；
木犀草素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.01至4.979％；
槲皮素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.001至0.771％；
鼠李金黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.104至0.203％；
辅助物质99.868至90.592％。
最好生物活性物质的辅助物质含碳氢化合物、氨基酸、叶绿素。
最好生物活性物质从拂子茅(Calamagrostis epigeios L.，CalamagrostisAdans属)和/或发草(Deshampsia caespitosa L.，Deshampsia Beanu属)提取。
最好生物活性物质黄酮类化合物总数中O-糖苷形式的黄酮类含量达(53.545÷86.422)％，C-糖苷形式的黄酮类含量达(43.293÷4.910)％，其余为黄酮类苷元。
为了测定生物活性物质特定活性成和特性分之间的因果关系，其最佳成分，使用了标准技术进行试验(米罗诺夫，扬科夫斯基。有机化学中的光谱学。莫斯科“化学”1985年——230页。先切夫。液相色谱实用指南。莫斯科“捷赫诺斯费拉”，2010年——272页)。
当黄酮类苷元处于O-和/或С-糖苷形式时，提高了生物活性物质在水性介质中的溶解度，同时保证了黄酮类糖苷混合物在整个生物体中协同作用和生物利用度。
配置了5个系列不同季节植物的模型提取物。模型提取物系列组成于总提取物：拂子茅和发草混合，比例为1:1，个别植物原料：乙醇重量比1:10到3:1。
5个系列提取物用于测定被研究物质含量范围的边界，并确定其平均值。用已知提取方法配置模型提取物，即：浸渍、渗滤、超声提取与其方法的组合(制药生产创新技术和设备；缅舒季纳版本；2册33-88页莫斯科市“比诺姆”2013年——480页)。在提取过程中，定期监测干渣。
至于原料和乙醇重量比1:10的提取物，在干渣达0.5％(平均密度0.8010克/毫升)完成提取过程；原料和乙醇重量比1:2的提取物，在干渣达1.2％(平均密度0.8100克/毫升)完成提取过程；原料和乙醇重量比3:1的提取物，在干渣达2.5％(平均密度0.8250克/毫升)完成提取过程。
首先测定总提取物中黄酮类苷元、黄酮类糖苷的含量，原料和乙醇重量比1:2。
生物活性物质成分测定用了仪器分析物理化学方法，即：具有二极管矩阵检测的高效液相色谱(UPLC-PDA)；电子碰撞电离气相色谱/质谱；电喷雾电离质量检测器液体高效色谱(UPLC-MC/MC)；核磁共振法。
鉴定和确定总提取物中的物质后，在模型提取物测定了个别植物生物活性物质定性和定量的含量。
为了确定特定作用，进行了总提取物和个别植物生物活性物质的比较。
生物活性物质在植物的含量跟宏成分，即叶绿素、植物纤维，相比为痕量的，因此生物活性物质提取第一步为宏成分的排除。疏水的叶绿素(脂溶性)级分，用有机溶剂除去，即己烷或氯仿。
植物原料中的碳氢化合物处于游离状态并与具有羟基糖苷组合的单糖和多糖。亲水性质游离碳氢化合物用提取方法去除，即提取苷元，而碳氢化合物留在水相中。由于植物黄酮类苷元处于游离状态和糖苷形式，因此，去除叶绿素部分后，进行定性和定量测定需要使全部苷元(游离状态和糖苷形式)成一个分析形式——无碳氢化合物片块的苷元。通过酸解可以解决这个问题：通过氢离子对苷类形式的黄酮类的作用分裂出碳氢化合物片块。
黄酮醇和黄酮糖苷化合物的化学结构通过分光光度法、色谱法(高效液相色谱法、各种检测器气相色谱)等水解产物分析而测定。
附图说明
附图中示出了本发明的实质：
图1.高效液相色谱法,UPLC-PDA，总提取物色谱图和分离化合物的吸收光谱图。
图2.高效液相色谱法,UPLC-PDA，水解后总提取物色谱图和分离化合物的吸收光谱图。
图3.高效液相色谱法,UPLC-PDA，主要小麦黄素苷元制备型分离化合物的色谱，与其吸收光谱图。
图4.气相色谱/质谱，主要小麦黄素苷元化合物TMS衍生物的色谱图(离子组成谱)。
图5.气相色谱/质谱，主要小麦黄素苷元化合物TMS衍生物的色谱图(离子质量为531.00的保持时间)。
图6.1H核磁共振波谱法，总提取物小麦黄素光谱。
图7.13C核磁共振波谱法，总提取物小麦黄素光谱。
图8.生物活性物质主要苷元与其名称。
图9.O-和С-糖苷形成图。
图10.质量峰面积271对浓度的依赖性校准图。
图11.质量峰面积331对浓度的依赖性校准图。
图12.质量峰面积415÷416对浓度的依赖性校准图。
图13.质量峰面积465对浓度的依赖性校准图。
图14.氢离子浓度(HCl摩尔数)对溶液在沸水浴中加热120分钟时金丝桃甙和牡荆黄素稳定性的影响。
图15.UPLC-MC/MC.其中:
1-总提取物PDA色谱图；
2-单个离子质量扫描总质量色谱图。
图16.UPLC-MC/MC.其中:
3-331质量扫描，测定色谱峰面积；
4-331质量扫描色谱图。
图17.UPLC-MC/MC.其中:
1-水解后总提取物PDA色谱图
2-单个离子质量扫描总质量色谱图。
图18.UPLC-MC/MC.其中:
3-331质量扫描，测定色谱峰面积；
4-331质量扫描色谱图。
图19.高效液相色谱法,UPLC-PDA拂子茅乙醇提取物色谱峰的色谱和吸收光谱图。
图20.高效液相色谱法,UPLC-PDA发草乙醇提取物色谱峰的色谱和吸收光谱图。
图21.生物活性物质对Jurkat细胞生长的影响。
图22.跟生物活性物质培育后Jurkat培养物中亚二倍体细胞(百分比)的含量。
图23.跟生物活性物质2天培育以及凋亡细胞用凡毕士(Vepeside)诱导后Jurkat培养物中亚二倍体细胞的含量。
图24.生物活性物质对MT-4细胞产生超氧自由基速率的影响。
图25.生物活性物质对Namalwa细胞产生超氧自由基速率的影响。
图26.生物活性物质对МТ-4细胞匀浆产生超氧自由基速率的影响。
图27.生物活性物质对МТ-4细胞以过氧化氢诱导的化学发光的影响。
由于附图比较多，为了更好理解，附图旁边也显示了其名称。
用96％乙醇稀释(比例1:1)的总提取物(比例原料：乙醇1:2)化合物典型色谱图，用二极管矩阵检测的典型高效液相色谱图，见图1。使用UPLC Waters色谱仪进行分析，色谱柱ACQUITY BEHC18,1.7微米,2.1×150毫米，条件为：进样体积1微升，恒温温度30℃，流动相速度0.3微升/分钟，在350纳米检测。流动相为梯度模式(水：乙腈)＝(60:40)，pH为2.2的水(正磷酸)。图1页显示了总提取物的色谱分离化合物的吸收光谱(Spectrum IndexFraction Plot)。
保持时间为5.0分钟至10分钟的色谱分离的化合物吸收光谱(图1)指出溶液中存在一类化合物——具有相同分子“骨架”的黄酮类化合物。光谱中的差异是由分子中取代基性质引起的。酸水解用于分子鉴定，至于O-糖苷允许分离(释放)苷元。酸水解操作程序如下：将盐酸加入到提取物直到pH为约2的溶液(2摩尔盐酸)，将连接到回流冷凝器的溶液烧瓶在水浴中保持2小时，放冷，以乙酸乙酯分离水解后的苷元和糖苷形式，真空除去有机溶剂，将残余物溶于乙醇(9:1)并分析。
在水解前色谱图(二极管矩阵检测的高效液相色谱)上(图1)可见三组分离的化合物，保持时间：5-7分钟(1组化合物)，8-9.0分钟(2组化合物)和9分钟后的化合物(3组化合物)。在水解后色谱图上(图2)可见1组化合物保留了，2组化合物生长，3组化合物数量提高。
2组化合物作为主要的，具有典型的黄酮谱，用制备型高效液相色谱《Waters》XBridgeTM prep C18 10微米OBDTM 19×250毫米在反相色谱法模式下(流动相：甲醇-水(1:9)，流速15毫升/分钟)色谱级分重复引入和纯化。结果分离11毫克苷元(高效液相色谱图见图3)。为了测定苷元分子的总公式和结构使用了气相色谱-质谱联用仪。由于黄酮类化合物含抵制其挥发性的羟基，因此气相色谱仪进样前必须进行其衍生化。
用N，N-三甲基甲硅烷基-三氟乙酰胺作为试剂(TMS衍生化)。苷元衍生物的色谱图(图4、5)指出在减除片块质量后苷元质量等于330。据质谱图库此为小麦黄素或鼠李金。为了确定分子结构使用了质子和碳核的核磁共振波谱法。以核磁共振波谱法获得了以下光谱(图6、7)：13C(二甲基亚砜-d6,100兆赫):δ＝56.33(CH3×2),94.13(C-8),98.78(C-6),103.49(C-3),103.59(C-10),104.28(C-2'+C-6"),120.27(C-1'),139.75(C-4'),148.06(C-3'+C-5'),157.20(C-5),161.25(C-7),163.48(C-9),164.14(C-2),181.60(C-4)磁偏差。
1Н(二甲基亚砜-d6,400兆赫):δ＝3.88(6H,c,CH3×2),6.20(1Н,д,J＝2.0Гц,Н-6),6.56(1Н,д,J＝2.0Гц,Н-8),7.00(1Н,с,Н-3),7.33(2Н,с,Н-2'+H-6"),12.98(1H,c,OH-5)磁偏差。
12.98磁偏差信号证明在羟基氢原子和羰基氧原子之间氢键的存在。核磁共振波谱法光谱中其余羟基(ОН-7和ОН-4')因跟水交换不显出。
核磁共振波谱法光谱分析后最终证实了小麦黄素作为化合物2主要成分。(Tricin/小麦黄素或5,7-Dihydroxy-2-(4-hydroxy-3,5dimethoxyphenyl)-4H-chromen-4-one)
发现的主要苷元的结构(小麦黄素分子)由使用小麦黄素标准(HangzhouDayangchem Co.,LTD.CAS Na:520-32-1Purity:98.5％)核磁共振波谱法，以及分离小麦黄素跟中国研究人员(J.Agric.Chem.2007,55,10086-10092)的方法从竹叶中分离出来小麦黄素比较而证实的。
据上述方法，在总提取物(除了小麦黄素)检测到并识别以下黄酮类苷元：黄酮类——芹菜素、木犀草素，黄酮醇——槲皮素、鼠李金(图8)。相关文献，如(2006年6月17日美国专利№ US 2008/0171708)以及我们的研究证明，植物原料和提取物中的黄酮类苷元通常是O-和/或C-糖苷形式的(图9)，同时个别苷元会是O-和C-糖苷形式的。
为了进行单独O-和C-糖苷定性和定量的测定，首先识别和鉴定提取物中存在的碳氢化合物，以气相色谱/质谱(用ТМS衍生化，和电喷雾电离质量检测器液体高效色谱仪(此方法允许测定最浓重片块，对应于分子离子( )。模型提取物中已鉴定的碳氢化合物(名称；分子量)见表1。
表 1
确定碳氢化合物成分后，要确定可以分别O-和C-糖苷的条件，其总公式一致，因此光学和色谱特性差异很小。最经典的方法为在各种浓度氢离子的作用下，测定苷元从糖苷形式分解后释放的动态。如上所述，以各种浓度盐酸进行酸水解。去除乙酸乙酯后，将沉淀物溶于乙醇(9:1)中并分析。
不同氢离子浓度下产生的水解物，用质谱分析UPLS-MC/MC。用标准化的校准图进行个体离子质量对苷元和/或糖苷的定量测定：小麦黄素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、鼠李金、金丝桃甙、牡荆黄素。图10、11、12、13显示小麦黄素苷元、芹菜素、金丝桃甙(O-糖苷)以及1,6-脱水-β-D-糖苷牡荆黄素(C-糖苷)校准图。
提取物中苷元含量，以及在各种浓度氢离子的作用下，苷元从糖苷形式释放的动态如表2。
表2
1–无丁基羟基茴香醚(ВНА)。
2–有丁基羟基茴香醚ВНА。
O-和C-糖苷定量测定最佳条件为盐酸(HCl)氢离子浓度0.08摩尔。在这种条件下，O-糖苷完全分裂，而C-糖苷仍然保留(约83％)。(牡荆黄素和金丝桃甙O-和C-糖苷分裂动态见图14)。因此，为了获得苷元、苷元的O-和C-糖苷定量的信息，应用高效液相色谱法UPLC-MC/MC在0.08摩尔HCl条件下分析提取物和水解后产物的结果。
图15显示水解前总提取物PDA色谱图(1)以及单独离子扫描(UPLC MC/MC设备上保持时间稍微低于Waters UPLS–PDA设备，色谱柱一致)总质谱图(2)。图16显示331质量扫描(小麦黄素)，并测定色谱峰面积(3)，以及331质量扫描PDA色谱图(4)。图17、18显示水解后总提取物和331质量扫描结果。
为了测定O-糖苷的含量，比较了总提取物分析结果和水解后得到的结果：水解后无峰或峰降低证明O-糖苷的存在，可能是单独存在(单独色谱峰)或作为化合物复合物的一部分(水解后含若干化合物的色谱峰降低)。计算使用了含被提取苷元质量的糖苷化合物离子质量的理论值，如表3，以及被碳水化合物理论值(表1)。
表3
被研究苷元理论计算的糖苷
此外，考虑到O-糖苷(如，金丝桃甙)在用电喷雾电离质量检测器液体高效色谱的情况下，碳氢化合物分子与苷元分离，苷元和原糖苷比例为100:1。至于C-糖苷(如，牡荆黄素)从原糖苷分子分离ОН+1片块，即18质量，原糖苷峰面积与其分离产物(同糖苷)的比例为3.23。经试验发现了C-糖苷分裂后在被研究质谱中所出现的化合物(表4)。
表4
质谱中发现的黄酮类C-糖苷变型产品
表5
О-糖苷含量换算为原料:乙醇(干残渣％，密度克/毫升)重比例从1:10至3:1植物混合物总提取物(1:1)中的金丝桃甙含量
表6
С-糖苷含量换算为原料:乙醇重比例从1:10至3:1植物混合物总提取物(1:1)中的金丝桃甙含量
因此，据总提取物进行了游离苷元含(表2)、苷元的糖苷：O-糖苷(表5)；С-糖苷(表6)量定性和定量测定。
保持时间最小的高效液相色谱图上的1组化合物(图1)作为最亲水的以上分离苷元的O-和C-糖苷混合物，其中主要的是小麦黄素、木犀草素、芹菜素。2组化合物(图1)为游离苷元混合物。2组化合物为O-、C-和双糖苷的酰化形式。
有生物活性植物混合物提取物中苷元和糖苷成分量定性和定量测定的结果允许分别比较各各植物提取物的成分和生物活性。
以确定成分差别和进行具体生物效应的比较研究，用校正的黄酮类化合物及其糖苷总量的含量制备单独植物模型提取物，原料和乙醇比例为1:4.5的含量为0.22毫克/毫升，干渣值达0.7％(平均密度0.8080克/毫升)。据上述色谱条件下的典型高效液相色谱图(350纳米检测)以及拂子茅和发草乙醇提取物化合物吸收光谱见图19和20。
据上述色谱图可见，提取物定性成分有所相同。乙醇提取物成分的区别在于黄酮类单分子及其O-和C-糖苷的定量含量的所不同。
表7
植物混合物模型提取物(1:1)中以及单独植物中，在原料:乙醇重比例从1:10至3:1下，游离苷元、O-和C-糖苷比较成分和偏差范围(毫克/升)
用测定总提取物的高效液相色谱/质谱法，测定单独植物提取物的定性和定量成分。
如表7显示，拂子茅提取物中游离苷元含量为总黄酮类化合物的9.5％至11.5％，发草提取物中游离苷元含量为3.8％至4.2％，而实际上不依赖于在规定范围内原料：提取剂的比例。数据证明了模型提取物中可萃取物质的稳定性。
黄酮类化合物(苷元与其O-和/或C-糖苷)最高百分比(浓度)在于原料：萃取剂3:1重比例的植物混合物，等于30300毫克/升干残渣的9.408％(3223.9毫克/升)。原料：萃取剂1:10重比例的拂子茅提取物含最少黄酮类化合物(6240毫克/升干残渣的0.132％或9.870毫克/升)。
在原料：萃取剂重比例少于1:10的情况下，木犀草素、芹菜素、槲皮素黄酮类化合物不被提取，物质失去其抗病毒活性。在原料：萃取剂重比例高于3:1的情况下，O-和/或C-糖苷提取量不提高，提取物失去其抗病毒作用，由于其随着凝结沉淀物沉淀而随时间不稳定。
生物活性比较试验是并行和同时进行的，用拂子茅和发草总提取物(1:1)和单独提取物，黄酮类化合物校正的总量等于0.22毫克/毫升。
上述数据显示了生物活性物质的性能，但不限制专利的有效性。发现的性能显示于№ 1-16表和1-27图。
申请中使用的术语及其缩写、研究方法是正式通行的(药用产品临床前研究(方法建议)乌克兰医学科学院通讯院士编辑——斯特凡诺——基辅：阿维森纳，2001年——528页)。
具体实施方式
例子1
研究模型提取物体外反疱疹作用。
用可移植细胞培养物Vero(猴肾细胞)研究提取物抗病毒作用。在微孔板RPMI-1640+10％胎儿血清(Nunclon,Surface,Denmark)在供二氧化碳的恒温器37оС温度下培养了细胞。
用了2型疱疹病毒，ВН(单纯疱疹病毒)株，感染性滴度：5.0÷7.0lg组织细胞病变剂量50/0.1毫升(组织细胞病变剂量50-造成50％单层细胞病变)。用Vero单层每日细胞培养物研究抗病毒活性。除去生长培养基，并将各种浓度提取物涂在单层细胞。一个小时后添加疱疹病毒，组织细胞病变剂量50为100，在孔里添加支持培养基(无血清培养基)。
5天内在供二氧化碳的恒温器中进行培养。每日以显微镜监控，并据单纯疱疹病毒对Vero细胞病变作用记录病毒繁殖，以及与单层未经提取物处理(病毒控制)的对照培养物比较。形态上，单纯疱疹病毒对Vero细胞病变作用表现为共质体或圆形细胞带增生和巨型多核细胞的形成。
3天后从微孔板孔吸取培养基，并在每个不同模型提取物量的样品量测定感染性滴度。2型单纯疱疹病毒繁殖结果见表8。
表8
Vero细胞培养物中实验提取对2型单纯疱疹病毒繁殖的影响，并最低活性浓度测定
表9显示最大耐受浓度、最低活性浓度和化疗指数。
表9
Vero细胞培养物中模型提取物最大耐受浓度、最低活性浓度和化疗指数对2型单纯疱疹病毒作用的测定结果
被研究的提取物有效地抑制2型单纯疱疹病毒。2.0-3.0lg组织细胞病变剂量50抑制特定动作病毒发展最小活性浓度为：发草提取物0.017微克/毫升，比总提取物和拂子茅提取物最小活性浓度值(0.034微克/毫升)低一半。各个提取物的化疗指数大约为160。
例子2
体外试验中确定提取物反流性感冒活性。
用F/FM// 1/47(H1N1)流感病毒，尿囊培养物感染性滴度——6.0lgEID50/0.2毫升。
在体外条件下，用连续层可移植细胞培养物MDCK(狗肾细胞)。细胞培养于微孔板在RPMI-1640+10％胎儿血清(Nunclon,Surface,Denmark)中在供二氧化碳的恒温器37оС温度下。用胰蛋白酶处理提高细胞对流感病毒感染的敏感性。胰蛋白酶母液制备：将3克酶试料注入3毫升DMEM培养基。用该溶液三次洗细胞，每孔以50毫升溶液。
倒出生长培养基，于细胞添加各种浓度模型提取物，并注入100组织细胞病变剂量50的流感病毒。
3天内在供二氧化碳的恒温器中培养。每日以显微镜监控。
72小时培养后，吸取培养液，并在细胞培养物通过滴定测定了流感感染性病毒滴度。表10显示模型提取物对流病毒影响的研究结果。据收到的数据，不同浓度模型提取物2.0-3.0lg ID50抑制流感病毒的繁殖，因此证明了总提取物以及分别植物提取物的抗流感作用。
表10
在MDCK细胞培养物中实验提取物对流感病毒繁殖的作用，并最低活性浓度测定
通过抑制特定动作病毒发展的最低活性浓度中最大耐受浓度比例的确定，而测定对流感病毒模型提取物的化疗指数(表11)。
表11
MDCK细胞培养物中模型提取物对流感病毒作用下最大耐受浓度、最低活性浓度和化疗指数测定结果。
各个模型提取物对抗流感病毒作用有效。在发草提取物作用下，活性物质浓度为0.0034微克/毫升的情况下，流感病毒感染滴定降低率最大(降低3.0lg ID50)。总提取物对抗流感病毒具有最大选择性作用，化疗指数为808。
例子3
提取物对丙型肝炎病毒活性的研究。
用牛病毒性腹泻病毒作为丙型肝炎病毒的替代病毒，即丙型肝炎病毒的试验模型。
在小牛肾细胞培养物中，用不同浓度提取物添加100组织细胞病变剂量50牛病毒性腹泻病毒研究了抗病毒活性。将培养物在恒温器中培养，直到出现病毒受控特异性细胞病变效应，此后在培养基中确定感染性病毒滴度。结果见表12。
表12
小牛肾细胞中，实验提取物对牛病毒性腹泻病毒繁殖的作用，以及最低活性浓度测定
分析结果后，要指出的是，各个提取物3-2lg ID50抑制丙型肝炎病毒代替病毒的繁殖。
在总提取物、拂子茅提取物、发草提取物对在小牛肾细胞中牛病毒性腹泻病毒的作用下最大耐受浓度、最低活性浓度和化疗指数测定结果见表13。
表13
小牛肾细胞中，提取物对牛病毒性腹泻病毒的作用下最大耐受浓度、最低活性浓度和化疗指数测定结果
结果证明，模型提取物作为丙型肝炎病毒代替病毒的有效抑制剂，化疗指数较高。
在0.0034微克/毫升浓度各个提取物4.0-5.0lg ID50抑制牛腹泻病毒(丙型肝炎病毒试验模型)。
例子4
模型提取体内干扰素活性。
用非良种白鼠在体内试验中研究干扰素活性。用55.5微克/公斤浓度模型提取物腹腔注射(每只0.1毫升)。24小时后，以安乐死药死白鼠，并在同源组织培养L9297中按水泡性口炎病毒通用抑制细胞病变作用的方法在血清中测定干扰素。按酸敏感性指点标测定干扰素类型。为此目的，将血清分成等量部分。其中一个用4N HCl使液体pH达2.0，24小时在4℃温度下静放。此后用4N NaOH使液体pH达7.2。
试验结果见表14。
表14
注射模型提取物白鼠血清中干扰素水平
PolyI:Poly C-标准诱导剂(Calbiocheus,USA)
按对pH敏感性指点标确定了三个提取物都诱导γ-干扰素。
各个提取物具有诱导免疫γ干扰素的性能。拂子茅提取物在标准Poly I:Poly C诱导剂水平上诱导干扰素。总提取物和发草提取物诱导标准干扰素诱导剂水平的25％。
例子5
生物活性物质凋亡和凋亡调节活性测定。
已知，黄酮类物质在对凋亡诱导和细胞分化的作用被积极研究。其对白血病和正常细胞具有选择性作用。
我们研究了生物活性物质的细胞毒性，即其对凋亡诱导能力，以及生物活性物质与在Jurkat人体恶性淋巴细胞中的诱导凋亡具有细胞毒性凡毕士(Vepeside)药物的相互作用。
在Jurkat人体T细胞性淋巴细胞白血病可移植细胞系进行了研究。以通用方法培养细胞。在其对数生长期初将生物活性物质注入培养物。
为了分析细胞毒性、凋亡诱导和生长期阶段分配，将生物活性物质注入到悬浮培养基，浓度见下文。用台盼蓝测定细胞活力。用相关物质培养后，以帕彭海姆染色方法染细胞离心细胞制剂。
在进行细胞分析前，将细胞在碘化丙啶(50微克/毫升)、0.1％柠檬酸钠和0.1％X-100溶液中培养。用“Becton Dickinson”公司(美国)流式细胞仪FACScan测定细胞荧光。凋亡指数按(凋亡细胞数量/细胞总数х100)公式计算。
以流式细胞仪观察用碘化丙啶染的细胞中细胞生长期阶段分配。
完成流式细胞分析后，以ModFit LT 2.0软件("Verity Software House",Topsham,ME,美国)和CELLQuest("BD Biosciences Pharmingen》)分析结果。
用5.5和55微克/毫升浓度的总提取物研究了黄酮类物质对Jurkat细胞生长的影响。结果见图21。
如生长动力学数据显示，被研究的物质毒性低。这些数据跟提取物对其他抗病毒研究中用的悬浮和单层细胞培养物的低毒性作用的数据相符。
要指出的是，在提取物55微克/毫升浓度黄酮类影响下，即使是进一步生长完全迟缓的情况下，细胞生长显著抑制实际上未导致细胞大量死亡。
凋亡成分对抑制细胞生长的作用引起了很大的兴趣。如图22，据流式细胞仪分析，连在5.5微克/毫升含黄酮类物质提取物长期(3天)培养导致在种群中亚二倍体细胞百分率轻微提高(跟在对照培养物晚期显著自发凋亡的同时)。在10倍提高黄酮类物质浓度后，亚二倍体细胞的数量也显着提高。就第二天，与自发凋亡比较，亚二倍体细胞的数量提高20％。
数据证明，生物活性物质引起促进凋亡作用，浓度增加后引起凋亡作用。
为了确定黄酮类物质对用凡毕士(Vepeside)诱导Jurkat细胞凋亡可能的修饰作用，先将细胞跟生物活性物质培养，两三天后将一天1微摩尔/升凡毕士(Vepeside)注入到细胞，即使用凡毕士(Vepeside)条件足以诱导凋亡，也不过分。结果见图23。
我们能看到，与无毒剂量生物活性物质的培育导致Jurkat细胞对凡毕士(Vepeside)典型凋亡诱导剂的作用敏感性显著提高。实际上在这种条件，在生物活性物质和凡毕士(Vepeside)连续影响下，引起释放亚二倍体细胞的加性效应。
上述研究结果指出，生物活性物质具有凋亡调节作用。
例子6
确定生物活性物质对细胞抗氧化状态的作用。
各种实验模型中黄酮类生物和药理作用的已知研究结果指出，对身体和细胞抗氧化性能的作用也是其中生物作用机制之一。即自由基形式氧气形成速率和排除。
抽样前，2、4或24个小时内用制剂培育Namalwa和МТ-4人体恶性淋巴细胞可移植培养物系作为研究对象。在抗病毒研究中选择生物活性物质浓度，在大部分试验中为槲皮素糖苷2.75微克/毫升。跟生物活性物质培育完成后，以台盼蓝染制剂方式控制细胞活性。生物活性物质抗氧化性能分析后续试验，仅用培育完成后活性不低于90％的细胞。为了研究制剂对细胞促氧化状态的作用，用电子自旋共振光谱测定法和化学发光。
以电子自旋共振光谱分析仪2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧化物(TEMPO)自旋陷阱，确定超氧化物基产生速率。2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧化物(TEMPO)与短暂的超氧化物形成稳定的TEMPO基。陷阱细胞注入到悬浮液后，在电子自旋共振光谱分析仪比色皿中5-6分钟内有稳定TEMPO基积累线性反应。以分钟间隔记录光谱图。按TEMPO基电子自旋共振光谱图第二个分量振幅大小而记录TEMPO基积累速率，此与阴离子超氧自由基产生速率相符。
比色皿工作量为170微升。在室温下进行了试验。将天然(整个)细胞，或比色皿放入光谱分析仪前在冰浴均质化的细胞注入比色皿。另外，研究了预热(5分，600С)或在0-100С温度下暴露后的细胞，以失活或抑制参与电子转移链的酶。以“分析纯”重结晶试剂和蒸馏水制备了所有溶液。
在室温下，将МТ-4对照培养物天然细胞以0.53纳摩尔/10万细胞1分钟平均速率产生阴离子超氧化物基(图24)。温度处理后(600С和00С)，无TEMPO综合体电子自旋共振形成信号。此证明了，感热成分参与活性氧生成，也无未考虑的物质对试验结果的影响。
在МТ-4细胞跟生物活性物质培育时，两个小时培育后阴离子超氧化物基产生速率下降20-30％，而四个小时培育后——下降一半以上。24个小时培育后该自由基产生速率几乎等于零。
Namalwa系细胞该自由基产生活性比МТ-4细胞较低(平均0.33纳摩尔/10万细胞1分钟)。在观察期间内，跟生物活性物质培育后，几乎完全抑制自由基产生(图25)。
生物活性物质试验证明其拥有抗氧化性能。即证明了抑制阴离子超氧自由基产生剂量的依赖性动力学，以及过氧化氢诱导的自由基过程强度的抑制。
进行了生物活性物质对过氧化氢(Н2О2)诱导的自由基过程强度的研究。
在室温下，以化学发光法研究了自由基过程的强度。用过氧化氢(Н2О2)为自由基形式氧气产生的诱导剂。在光电倍增器快门开启状态下初步记录细胞基本发光率后的每1毫升细胞悬浮将0.5毫升3％Н2О2注入化学发光分析仪。将注入以从100到800万/毫升浓度洗去培养基的细胞。
МТ-4细胞跟生物活性物质培育显著改变由Н2О2侵袭细胞的化学发光强度。图27显示典型的化学发光图。跟生物活性物质培育的细胞试样在Н2О2.侵袭后第一秒就降低化学发光，跟对照培养物细胞比发光降低2.2倍。在90-180秒记录对照细胞的最大发光率，随后反应进入稳定状态，发光幅度为62-75标准单位。跟生物活性物质培育的细胞试样中，自由基反应发展进展较缓慢，即在270-300秒有最大发光率，而560-600秒有稳态发光(图26)。
发现被研究的生物活性物质表现出抗自由基性能，即提高细胞对Н2О2影响引起的自由基压力的稳定性。
生物活性物质特殊作用的例子证明本生物活性物质为多药性作用的物质。拂子茅和发草提取物混合物(1:1)中生物活性物质的生物作用范围，单独植物提取物的生物活性物质作用范围一致。不过取决于以黄酮类化合物总数计的物质浓度。
因此，测定生物活性物的具体活性物质成分，其物理化学、生物学性能允许改善并选择其对特定病毒、剂型计量发挥抗病毒作用的最佳成分。此外，已确定本生物活性物质作为(γ)型内源干扰素的诱导剂，并具有凋亡调节作用和抗氧化性能，提高细胞对自由基压力的稳定性。特定病毒抗病毒作用针对2型单纯疱疹病毒、流感病毒、牛腹泻病毒(丙型肝炎病毒)。
生物活性物质成分化合物具有抑制含DNA和RNA病毒发展的性能。
被研究的提取物有效地抑制2型单纯疱疹病毒。2.0-3.0lg组织细胞病变剂量50抑制特定动作病毒发展最小活性浓度为：发草提取物0.017微克/毫升，比总提取物和拂子茅提取物最小活性浓度值(0.034微克/毫升)低一半。各个提取物的化疗指数大约为160。
各个模型提取物对抗流感病毒作用有效。在发草提取物作用下，活性物质浓度为0.0034微克/毫升的情况下，流感病毒感染滴定降低率最大(降低3.0lg ID50)。总提取物对抗流感病毒具有最大选择性作用，化疗指数为808。研究结果表明，模型提取物作为丙型肝炎病毒替代病毒(牛病毒性腹泻病毒)化疗指数高的有效抑制剂。
在0.0034微克/毫升浓度各个提取物4.0-5.0lg ID50抑制牛腹泻病毒(丙型肝炎病毒试验模型)。
引起抗病毒作用的生物活性物质浓度为0.017÷0.068微克/毫升，比合成物质少得多。
各个提取物具有诱导免疫γ干扰素的性能。拂子茅提取物在标准Poly I:Poly C诱导剂水平上诱导干扰素。总提取物和发草提取物诱导标准干扰素诱导剂水平的25％。
研究结果指出，生物活性物质具有凋亡调节作用。
生物活性物质试验证明其拥有抗氧化性能。即证明了抑制阴离子超氧自由基产生剂量的依赖性动力学，以及过氧化氢诱导的自由基过程强度的抑制。
加之，本生物活性物质无合成抗病毒药物的缺陷，并允许创造有具体剂量和针对性药效作用的剂型。

Claims (4)

1.禾本科植物Gramineae科Calamagrostis Adans属和/或Deshampsia Beauv属绿色部分和小穗中提取的生物活性物质含黄酮类化合物，即小麦黄素(tricin)、芹菜素、木犀草素、槲皮素、鼠李金黄酮类苷元和/或小麦黄素、芹菜素、木犀草素、槲皮素、鼠李金黄酮苷，辅助物质，成分(质量％)如下：
小麦黄素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.016至2.062％；
芹菜素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.010至1.393％；
木犀草素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.01至4.979％；
槲皮素黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.001至0.771％；
鼠李金黄酮类苷元和/或其黄酮苷0.104至0.203％
辅助物质99.868至90.592％。
2.第一条中生物活性物质的特点为：辅助物质含碳氢化合物、氨基酸、叶绿素。
3.第一条或第二条中生物活性物质以拂子茅(Calamagrostis epigeios L.родаCalamagrostis Adans)和/或发草(Deshampsia caespitosa L.родаDeshampsia Beanu)提取的。
4.任何1-3条中生物活性物质的特点为：其O-糖苷形式的黄酮类含量达(53.545÷86.422)％，C-糖苷形式的黄酮类含量达总黄酮类化合物的(43.293÷4.910)％，其余为黄酮类苷元。
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