KR20170139049A - 식물 기원의 다원 행동 생물학적 활성 물질 - Google Patents

식물 기원의 다원 행동 생물학적 활성 물질 Download PDF

Info

Publication number
KR20170139049A
KR20170139049A KR1020177032242A KR20177032242A KR20170139049A KR 20170139049 A KR20170139049 A KR 20170139049A KR 1020177032242 A KR1020177032242 A KR 1020177032242A KR 20177032242 A KR20177032242 A KR 20177032242A KR 20170139049 A KR20170139049 A KR 20170139049A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
flavonoid
biologically active
glycoside
extract
aglycone
Prior art date
Application number
KR1020177032242A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102461853B1 (ko
Inventor
빅토르 아타마니우크
Original Assignee
노비크 아나톨리
빅토르 아타마니우크
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 노비크 아나톨리, 빅토르 아타마니우크 filed Critical 노비크 아나톨리
Publication of KR20170139049A publication Critical patent/KR20170139049A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102461853B1 publication Critical patent/KR102461853B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/899—Poaceae or Gramineae (Grass family), e.g. bamboo, corn or sugar cane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/01—Hydrocarbons
    • A61K31/015—Hydrocarbons carbocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 약리학에 관한 것으로서 헤르페스 바이러스, 인풀루엔자, B형 및 C형 간염 바이러스 등으로 발생하는 바이러스성 질병 치료 및 예방뿐만 아니라 바이러스성 유도면역결핍증용 약제 제조에 사용될 수 있다.
Gramineae, Calamagrostis Adans 속 및/또는 Deshampsia Beauv 속의 녹색 부분 및 작은 이삭으로부터 추출된 약학적 작용의 생물학적 활성 물질은 플라보노이드, 트리신 플라보노이드 아글리콘, 아피제닌, 루테올린, 케르세틴, 라나진 및/ 또는 트리신, 아피제닌, 루테올린, 케르세틴, 라나진, 보조 물질 등의 플라보노이드 배당체를 포함하며 다음과 같은 조성을 갖는다:
0,016 내지 2,062% 트리신 플라보노이드 아글리콘 및/또는 플라보노이드 글리코시드;
0,010 내지 1,393% 아글리콘 플라보노이드 아피제닌 및/또는 그 플라보노이드 글리코시드;
0,01 내지 4,979% 아글리콘 플라보노이드 루테올린 및/ 또는 그 플라보노이드 글리코시드;
0,001 내지 0,771% 케르세틴 플라보노이드 아글리콘 및/ 또는 그 플라보노이드 글리코시드;
0,104 내지 0,203% 아글리콘 플라보노이드 라나나진 및/ 또는 그 플라보노이드 글리코시드;
99,868 내지 90,592% 보조 물질.
따라서 생물학적 활성 물질과 활성 물질의 물리 화학적 특정 조성을 결정하여 생물학적 활성 물질을 향상시키는 것은 바이러스에 대한 바이러스항 활성을 위한 최적 조성물을 생산하고 투여량을 결정하는 것에 이르게 된다 (도 1). 또한 생물학적 활성 물질은 (γ)형의 유도 물질인 것으로 판정하고 세포 자멸 조절 효과가 있으며 항산화성 특성을 가지고 자유 라디칼 스트레스에 대한 세포 내성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 2형 헤르페스, 인플루엔자 바이러스, C형 간염 바이러스 등 특정 바이러스에 대한 항바이러스 작용이 있다.

Description

식물 기원의 다원 행동 생물학적 활성 물질
본 발명은 약리학에 관한 것이며 생물학적 활성 물질의 조성, 플로바노이드 아글리콘, 플로바노이드 글리코시드, 보조 물질 등을 함유하는 식물성 약학적 작용에 관한 것이다. 생물학적 활성 물질은 헤르페스 바이러스, 인플루엔자, B형 및 C형 간염 바이러스 등에 의한 바이러스성 질병의 치료 및 예방을 위한 약물뿐만 아니라 면역 결핍증 치료제 생산에도 사용될 수 있다.
최근에는 바이러스 물질에 직접적으로 작용하는 식물성 항바이러스제에 많은 주의를 기울이고 있다. 항바이러스 작용을 갖는 알려진 분자는 트리신(tricin) (5,7,4'-트리하이드록시-3 ', 5'-디메톡시플라본)과 같은 플라보노이드 화합물이다.
트리신은 인플루엔자 바이러스, 사아토메갈로바이러스 및 단순 포진바이러스에 효과적이라는 것이 알려져 있다 (일본 특허 P 2010 - 254649 A, 출판일 2010년11월11일; 일본 특허 P 2006 - 265248 A, 출판일 2006년10월5일). 세포 수준에서 (항바이러스 작용) 감염 발병을 50%까지 억제하는 Sasa albo-marginata에서 얻어진 트리신 농도는 0,42 mkM이상인 것으로 밝혀졌다 (또는 0,139 mkg/ ml) (Antiviral Research 91 (2011), 296- 303). A형 인플루엔자 (H1N1) 바이러스에 대한 합성 트리신의 항 바이러스 효과는 3,3 mkM 이상(또는1,09 mkg/ ml)농도 시 발생하다. (항바이러스 화학 및 화학 요법 2011, 22: 1-11; Joi 103851 / MP 1782).
화학적으로 순수한 트리신 아글루콘 및 아피제닌 및/또는 루테올린 및/또는 케르세틴의 화합물과 조합하여 트리신 복합 화합물은 식물성 원료로부터 추출된다: 대나무 잎(Bamboo leaves), Sasa, 벼 잎. 화학적으로 순수한 플라보노이드 화합물은 빠르게 산화되어 소수성되어서 그 사용이 세포 수준에서 과학 연구로만 제한되어 있다. (Microbes and Infection. 2012 p. V.14. Is. 12. p 1086-1092). 복잡 화합물: 트리신, 아피제닌, 리유테린 및 아글라이콘 등의 배당체는 친수성이며 전체 유기물의 수준에서 상이한 분자 플라보노이드 화합물의 복합체는 개별 순수한 물질의 작용과 비교하여 상승 효과 및 생체 이용률의 증가를 나타낸다. (In vivo 2011, 25 (5), 757-762, Journal of Food. Vol. 13, No 1, p. 140-150).
본 발명에 가장 가까운 화학 조성물 및 근원은 2003년2월17일자 UA No 54362 7MIIK A61K 35/78 특허에 주어진 방법으로 얻은 병리학적 상태의 치료 및 예방을 위한 식물성 물질로부터의 생물학적 활성 물질이다 (증명서2). 식물 원료로서 줄기가 나타나고 소우의 개화가 끝날 때까지 수집된 Calamagrostis Adans 식물 및 Deschampsia Beauv 식물 혼합물을 사용한다.
이런 생물학적 활성 물질은 낮은 독성을 특징으로 하며 인체에 광범위한 약리학적 효과를 제공하지만 활성 물질의 특정 구성에 대한 설명이 없으며 특정 바이러스에 대한 활성이 결정되지 않으며 복용량 권장이 없다.
특정 구성(물리 화학적 및 생물학적 성질, 특정 바이러스에 대한 항바이러스 작용에 대한 최적 구성을 결정함, 낮은 독성을 유지해 최적 복용량을 결정함)을 결정해서 생물학적 활성 물질의 활성 구성 성분을 향상시킬 목적이 있다.
Gramineae, Calamagrostis Adans 속 및/또는 Deshampsia Beauv속의 녹색 부분, 작은 이삭으로부터 유도된 약학적 작용의 생물학적 활성 물질은 플라보노이드, 트리신 플라보노이드 아글리콘, 아피제닌, 루테올린, 케르세틴, 라나진 및/ 또는 트리신, 아피제닌, 루테올린, 케르세틴, 라나진, 보조 물질 등의 플라보노이드 배당체를 포함하며 다음과 같은 조성을 갖는다:
0,016 내지 2,062% 트리신 플라보노이드 아글리콘 및/또는 플라보노이드 글리코시드;
0,010 내지 1,393% 아글리콘 플라보노이드 아피제닌 및/또는 그 플라보노이드 글리코시드;
0,01 내지 4,979% 아글리콘 플라보노이드 루테올린 및/ 또는 그 플라보노이드 글리코시드;
0,001 내지 0,771% 케르세틴 플라보노이드 아글리콘 및/ 또는 그 플라보노이드 글리코시드;
0,104 내지 0,203% 아글리콘 플라보노이드 라나나진 및/ 또는 그 플라보노이드 글리코시드;
99,868 내지 90,592% .보조 물질.
생물학적 활성 물질은 보조 물질로서 탄화수소 화합물, 아미노산, 클로로필 등을 함유한다.
생물학적 활성 물질은 베에니 (Calamagrostis epigeios L. poдa Calamagrostis Adans) 및/ 또는 (Deshampsia caespitosa L. ) Deshampsia Beanu속) 데시시시아 카에스피토사 등의 유래이라는 것이 바람직하다.
생물학적 활성 물질은 플라보노이드 화합물의 총수에서의 O-글리코시드형 플라보노이드 (53,545 - 86,422)%, C-글리코시드형 플라보노이드(43,293 - 4,910)%를 함유하고 나머지는 플라보노이드 아글리콘을 함유하는 것이 바람직하다.
특정 활성 성분과 생물학적 활성 물질 사이의 인과 관계와 최적 조성을 확립하기 위해 표준 기술을 사용하여 연구가 수행되었다 (미로노브, 얀코브스크. 유기 화학 분광학. 모스크바 <<화학>> 1985년 - 230 장. 센체브 <<액체형 크로마토그래피 살용 가이드. 모스크바. <<기술 영역>>, 2010년 - 272장).
플라보노이드 아글리콘이 O- 및/ 또는 C-글리코시드형에 있을 때 생물학적 활성 물질의 용해도가 수성 매질에서 증가되고 전체 인체의 수준에서 플라보노이드 글리코시드 혼합물의 상승 작용 및 생체 이용률이 보장된다.
다양한 수확 계절의 허브에서 5가지 추출물 모델이 생산되었다. 모델 추출물 세트는 다음 추출물로 구성되었다: 1:1 비율로 육상 지상 목초 혼합물 및 Deschampsia cespitosa 허브 혼합물, 1:10내지 3:1 에틸 알코올. 5가지 추출물을 사용하여 연구 대상 물질의 함량 변동 범위를 측정하고 평균값을 결정한다. 모델 추출물은 다음과 같은 알려진 추출법에 의해 얻어졌다: 침식, 퍼콜레이션, 초음파 추출 등 그 방법의 조합. 또한 추출 공정 중에 건식 잔류를 주기적으로 모니터링하였다. (혁신적인 기술 및 제약 생산 장비 (멘수티나 개정) 2권 (33-88장) 모스크바: <<비놈>> 2013년 - 480장). 추출물에서 원료 대 알콜 1:10 비율. 건식 잔류 지수 0.5%에 도달할 때 추출 과정을 종료한다 (1:10 원료와 알코올 비율) (평균 밀도가 0,8010 g/ml임). 알코올과 원료가 1:2 비율인 경우 건식 잔류 지수가 1,2%에 도달할 때 추출 과정을 종료한다 (평균 밀도가 0,8100 g/ml임), 알코올과 원료가 3:1 비율인 경우 건식 잔류 지수가 2,5%에 도달할 때 추출 과정을 종료한다 (평균 밀도가 0,8250 g/ml임).
먼저 원료와 알코올 1:2 비율로 생산된 총 추출물에서 플라보노이드 글리코시드, 플라보노이드 배당체 등의 조성물을 결정하였다.
생물학적 활성 물질의 구성은 도구 분석 물리 화학 방법으로 결정된다: 다이오드 매트릭스 검출 기능을 갖춘 고성능 액체형 크로마토그래피 (UPLC-PDA); 전자 충격 이온화를 이용한 가스 크로마토그래피; 전자 빔으로 이온화하여 질량 검출기를 이용한 액체형 고성능 크로마토그래피 (UPLC-MC / MC); 핵 자기 공명법.
총 추출물 중 물질을 식별하고 결정한 후 각 허브에서 개별적으로 얻은 모델 추출물에서 생물학적 활성 물질의 정성 및 정량 함량을 결정하였다.
특정 효과를 결정하기 위해 총 추출물의 생물학적 활성 물질과 각 허브 추출물에 대한 비교 연구를 별도로 수행하였다.
생물학적 활성 물질은 매크로 성분인 엽록소 (chlorophylls), 식물 섬유 (plant fiber)에 미량으로 식물에서 미량으로 발견된다. 따라서 BAS를 추출하는 첫째 단계는 매크로 구성 요소를 제거하는 것이다. 소수성 (지용성) 요소는 헥산, 클로로포름 등과 같은 유기 용매로 제거된다.
식물 원료에서의 탄화수소는 자유 상태 및 수산기를 갖는 아글리콘과 함께 모노 및 폴리사카라이드로 대표된다. 친수성을 특징으로 하는 유리 탄화수소는 추출법에 의해 제거된다. 즉, 아글리콘이 추출되고 탄화수소가 수성상에 잔존한다. 플라보노이드 아글리콘이 식물에 자유 상태와 글리코시드 형태로도 있기 때문에 클로로필 분획을 제거한 후 질적 및 양적 측정을 위해 모든 아글리콘 (자유 및 글리코시드)이 탄화수소 분획이 없는 아글리콘으로 변환되어야 한다. 이 문제는 산가수 분해로 해결된다: 플라보노이드의 글리코시드 형태에 수소 이온이 작용하여 탄화수소 분획이 제거된다.
플라보놀 및 플라본 글리코시드 화합물의 화학 구조는 분광 광도법, 크로마토그래피 (HPLC, 다양한 검출기를 갖는 GC) 방법에 의한 가수 분해 생성물을 연구함으로써 확립된다.
본 발명의 핵심은 다음과 같은 도면으로 표시된다:
도 1. HPLC, UPLC-PDA 분리된 화합물 흡수 스펙트럼 및 총 추출물의 크로마토그램.
도 2. HPLC, UPLC-PDA 가수 분해 후 총 추출물 크로마토그램 및 분리된 화합물 흡수 스펙트럼
도 3. HPLC, UPLC-PDA 트리센 아글리콘의 분리된 화합물의 크로마토그램
도 4. CG-MS 크로마토그램 TMS 트리신의 우세한 아글리콘 화합물 유도체 (이온 조성 스펙트럼)
도 5. 트리신의 우세한 아글리콘 화합물의 TMS 유도체의 GC-MS (531,00 질량을 갖는 이온의 체류 기간).
도 6. 1H-ЯMP (H-NMR) 총 추출물에서 얻어진 트리신 스펙트럼.
도 7. 13C-ЯMP (H-NMR) 총 추출물에서 얻어진 트리신 스펙트럼.
도 8. 우세한 생물학적 아글리콘 및 그 명칭.
도 9. O-배당체와 C-배당체의 형성 도면.
도 10. 농도의 피크 질량 271 영역에 따라 교정 도면.
도 11. 농도의 피크 질량 331 영역에 따라 교정 도면.
도 12. 농도의 피크 질량 415 - 416 영역에 따라 교정 도면.
도 13. 농도의 피크 질량 465 영역에 따라 교정 도면
도 14. 끓는 물에서 120분간 혼합물을 가열할 때 하이페로사이드 및 비텍신의 안정성에 영향을 미치는 수소 이온의 농도 (HCl 몰수).
도 15. UPLC-MC / MC:
1 - PDA 총 추출물의 크로마토그램;
2 - 별도 이온의 질량에 의한 스캐닝을 위한 총 질량 크로마토그램;
도 16. UPLC-MC / MC:
3 - 331 질량 스캐닝, 크로마토그래피 피크의 영역을 결정함;
4 - 331 질량 시 크로마토그램 스캐닝.
도 17. UPLC-MC / MC:
1 - PDA 가수 분해 후 총 추출물 PDA 크로마토그램;
2 - 별도 이온의 질량에 의한 스캐닝 시 총 질량 크로마토그램;
도 18. UPLC-MC / MC:
3 - 331 질량 스캐닝, 크로마토그래피 피크의 영역을 결정함;
4 - 331질량 시 크로마토그램 스캐닝.
도 19. Calamagrostis epigejos 모델 추출물의 크로마토그래피 피크 흡수 스펙트럼 및 HPLC, UPLC-PDA 그로마토그래프.
도 20. Deschampsia cespitosa모델 추출물의 크로마토그래피 피크 흡수 스펙트럼 및 HPLC, UPLC-PDA 그로마토그래프.
도 21. 생물학적 활성 물질에 Jurkat세포 성장에 영향을 미침.
도 22. 생물학적 활성 물질과 배양 후 Jurkat 배양에서 저두배수체의 함량 (%).
도 23. 생물학적 활성 물질과 배양 후 2 일간 및 세포 사멸 바페지드 유도 후 Jurkat 배양에서 저두배수체의 함량 (%).
도 24. 생물학적 활성 물질이 MT-4세포에 의해 슈퍼옥사이드 라디칼을 생성하는 속도에 영향을 미침.
도 25. 생물학적 활성 물질이 Namalwa세포에 의해 슈퍼옥사이드 라디칼을 생성하는 속도에 영향을 미침.
도 26. 생물학적 활성 물질이 MT-4세포에 의해 슈퍼옥사이드 라디칼 균질액을 생성하는 속도에 영향을 미침.
도 27. 생물학적 활성 물질이 과산화수소에 의해 유도된 MT-4 세포의 화학 발광에 영향을 미침
그래픽 자료가 많아서 의미를 더 잘 이해하기 위해 그래픽 옆에 명칭도 표시된다.
다이오드어레이 검출기를 갖는 HPLC에 의해 얻어진 1:1비율로 희석된 96% 에탄올 총 추출물 (중량비: 에틸 알코올 1:2)의 전형적인 크로마토그램이 도 1에 표시된다. 분석은 PLC Waters 컬럼ACQUITY BEHC18, 1,7 mkm, 2,1 x 150 mm를 사용하여 다음 조건에서 수행되었다: 투입한 샘플 볼륨 1 mkl, 온도 조절기의 온도 30℃, 이동상 속도 0,3 мкл /분, 350 nm시 검출. 이동상은 구배 모드에서 (물: 아세토니트릴) = (60: 40)이며 물은 pH 2,2 (오르토인산)이다. 총 추출물 (Spectrum Index Fraction Plot)의 크로마토그래피 분리된 화합물의 흡수 스펙트럼은 도 1에 표시된다.
크로마토그래피 분리된 화합물 흡수 스펙트럼은 (도 1) 5.0분 범위 유지 시간 시 (분) 10분까지 같은 분자 조성을 가진 플라보노이드 클래스가 용액에 있음을 나타낸다. 스펙트럼 차이는 분자의 치환기로 나타난다. 분자를 식별하기 위해 산 가수 분해를 사용한다. 산 가수 분해는 O-글리코시드의 경우 아글리콘을 방출할 수 있다. 산 가수 분해는 다음과 같이 수행된다: 추출말에 염산을 첨가하여 pH-약 2 (2물 염산) 용약을 얻는다. 환류 응축기에 연결된 용액을 갖는 플라스크를 환류 온도 수조에서 2시간 동안 유지하고 냉각시킨다. 그 다음에 가수 분해된 아글리콘 및 글리코시드 형태를 에틸 아세테이트로 단리하고 진공에서 유기 용매를 제거하고 잔류물을 에탄올 (9:1)에 용해시킨다. 그 다음에 결과가 분석된다.
가수 분해 전에 얻어진 크로마토그램 (도 1) (PDA 검출기와 HPLC)에 다음 유지 시간과 세 가지 분리된 화합물 군이 관찰된다: 5 - 7 분 (1 화합물 군), 8-9,0 분 (2 화합물 군) 및 9분 후 화합물 (3 화합물 군). 가수 분해 후에 얻어진 크로마토그램 (도 2)은 1군의 화합물이 남아 있고 2군의 화합물이 증가되고 3군의 화합물의 개수를 증가함을 나타낸다. 우세하고 플라본의 전형적인 범위를 갖는 2군의 화합물은 HPLC <<Waters>> XBridgeTM prep C18 10㎛ OBDTM 19 x 250 mm로 역상 크로마토그래피 모드에서 (이동상: 메탄올- 물 (1: 9), 유속 15 ml/ 분) 크로마토그래피 분획의 반복 투입 및 정제 시 추출되었다. 결과적으로 아글리콘의 11mg이 분리되었다 (도 3 HPLC 크로마토그햄). 아글리콘의 분자 총식, 구조 등을 결정하기 위해 질량 분석 검출기를 사용하는 GC 방법이 사용되었다. 플라보노이드 화합물은 휘발성방해하는 수산기를 함유하기 때문에 CG에 샘플을 투입하기 위해 유도체화를 수행하여야 한다. N, N-트리메틸실릴-트리플루오로아세트아미드 (TMS 유도체화)를 시약으로 사용하였다. 아글리콘 유도체의 크로마토그램 (도 4, 도 5)은 아글리콘 질량이 분획의 질량 제거 시 330임을 나타낸다. 질량 스펙트럼의 라이브러리에 따라 이것은 트리신 또는 람나시드이다. 분자의 구조를 정제하기 위해 양성자와 탄소핵에 관한 MMR 방법을 사용하였다. 얻어진 NMR 스펙트럼의 특성은 다음과 같다 (도 6, 도 7): 13C (ДMCO-d6, 100 MГц): δ = 56.33 (CH3 x 2), 94.13 (C-8), 98.78 (C-6), 103.49 (C-3) , 103.59 (C-10), 104.28 (C-2 '+ C-6 "), 120.27 (C-1'), 139.75 (C-4 '), 148.06 (C-3' + C-5 '), 157.20 (C-5), 161.25 (C-7), 163.48 (C-9), 164.14 (C-2), 181.60 (C-4) м.д. (자기 편차).
1H (ДMCO-d6, 400 MГц): δ = 3.88 (6H, c, CH3 x 2), 6.20 (1H, д, J = 2.0 Гц, H-6), 6.56 (1H, д, J = 2.0 Гц, H-8), 7.00 (1H, c, H-3), 7.33 (2H, c, H-2 '+ H-6 "), 12.98 (1H, c, OH-5) м.д.
12.98 ppm 신호는 수산기의 수소 원자와 카르보닐기 산소 원자 사이에 수소 결합이 있기 때문이다. NMR 스펙트럼에서 다른 모든 히드록실기(OH-7 및 OH-4 ') 물과의 교환으로 인해 나타나지 않는다.
얻어진 NMR 스펙트럼의 분석은 최종적으로 화합물의 주성분인 트리신의 진정성을 확인한다2. (Tricin / 트리신 또는 5,7-Dihydroxy-2- (4-hydroxy-3,5 dimethoxyphenyl) -4H-chromen-4-one 또는 5,7-디히드록시-2-(4-히드록시-3,5-디메톡시페닐)-4H-ㅡ크로멘-4-온).
우세한 아글리콘 (트리신 분자)의 발견된 구조는 트리신 표준을 사용하여 NMR 방법 (Hangzhou Dayangchem Co., LTD. CAS Na: 520-32-1 Purity: 98,5%) 및 중국 연구자의 방법에 따라 분리된 트리신과 대나무 잎에서 분리된 트리신과 비교함으로 인해 확인되어 있다 (J. Agric. Chem. 2007,55,10086-10092).
상기 방법에 따라 총 추출물에서 다음 플라보노이드 아글리콘이 함유되어 있는지 여부 확인하고 식발한다 (트리신 제외): 플라본 - 아피제닌, 루테올린; 플라보놀- 케르세틴, 라나진 (도 8). 아글리콘 플라보노이드는 알려진 자료 (예를 들어, 2006년6월17일자 미국 특허 No US 2008/0171708) 및 우리 연구에 따라 식물성 재료 및 식물성 추출물에 O- 및/또는 C-글리코시드 형태로 존재할 수 있다 (도 9). 또한 해당 아글리콘이 동시에 O- 및 C-글리코시드 형태로 존재할 수 있다.
O- 및 C- 글리코시드의 양적 및 질적 조성을 결정하기 위해 질량 검출기를 사용하여 추출물에 존재하는 탄화수소를 식별한다 (전자 스프레이로 이온화 시 질량 분광 광도계 검출기로 TMS 유도체화 및 HPLC를 사용한다 (이 방법은(m / z)에 해당하는 가장 강렬한 단편을 결정할 수 있다). 확인된 모델 추출물의 탄화수소 화합물(명칭: 분자량)은 표 1에 표시된다.
표 1.
Veinic terrestrial 및 Deschampsia cespitosa의 모델 추출물에서 식별된 탄화수소 화합물.
No 항목 분자량
1 2 3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33		 글루코오스 (마노자)
1,6-무수-β-α-글루코오스
아라비노스
자일로스
리보스
람노스
글루코노오즈
글루쿠론산
D- 젖산
소르보스
3-히드록시프로피온산
4-옥시펜탄산
1-프로펜-1,2,3-트리카르복실산
3-하이드록시-부탄산
2-부타넨
숙신산
푸마르산
아젤라인산
3-메톡시-4-하이드록시 벤조산
3,4-디메톡시벤조산
벤조산
4- 하이드록시벤조산
3,4-디히드록시벤조산
2-카르복시-4-히드록시벤조산
라일락산
계피산
카페산
페룰린산 (4-히드록시-3-메톡실-신남산)
시날
디메톡실계피산
알마코이덴드린
아코니틴산
3-(4-히드록시-3-메톡시페닐) 메틸 에스테르2-프로판산		 180
162
150
150
150
164
180
196
210
180
90
118
174
104
72
118
116
188
168
182
122
138
154
182
198
118
180
194
224
208
356
174
208
탄화수소의 조성을 결정한 후 총식을 동일한 O- 및 C-배당체를 구별할 수 있는 조건을 결정할 필요가 있다. 결과적으로 광학적 및 크로마토그래피 특성도 거의 다르지 않는다. 가장 고전적인 방법은 다양한 농도의 수소 이온에 의해 분해될 때 글리코사이드 형태로부터 아글리콘 방출의 동력을 결정하는 것이다. 산 가수 분해는 다양한 농도 염산 시 위에 전술한 바와 같이 수행된다. 에틸아세테이트를 제거한 후 침전물을 에틸 알코올에 (9:0) 용해시키고 분석한다.
다른 농도의 수소 이온에서 얻은 가수 분해물을 UPLS - MC / MC 질량 분석기로 분석한다. 별도 이온 질량에 대한 아글리콘 및/또는 글리코시드의 질량 측정은 다음 표준에 따른 보정 스케줄을 사용하여 수행된다: 트리신, 아피제닌, 루테올린, 케르세틴, 라나진. 비텍스, 하이프로지드. 도 10, 11, 12, 13에는 트리신, 아피제닌 및 하이프로지드 아글리콘 및 1,6-무수-β-D- 비텍스 글리코시드 (C-글리코시드) 보정 스케줄의 예를 볼 수 있다.
추출물에 아글리콘의 함량 및 글리코사이트 형태의 아글리콘이 수소 이온의 농도에 따라 방출되는 동력은 표 2에 표시된다.
표 2
수소 이온 농도가 아글리콘의 수율에 영향을 미침
아글리콘 아글리콘 함량 mg/l
허브 화합물
(1:1) 		0, 08 mol
HCl 		1, 2 mol
HCl 		1, 6 mol
HCl
1 2 1 2 1 2
루테올린 1,5 2,0 2,0 2,1 1,9 2,0 2,0
트리신 37,26 50,3 52,3 52,8 54,9 55,2 58,8
케르세틴 0,60 3,2 2,7 1,4 1,7 1,2 1,1
람나진 0,072 0,45 0,32 0,50 0,53 0,66 0,83
아피제닌 0,835 0,88 0,97 1,40 1,40 1,16 1,25
1 -부틸하이드록시아니솔 (BHA)이 없는 경우.
2 - BHA가 있는 경우.
O-및 C-배당체의 정량 분석을 위한 최적 조건은 염산에 의해 수소 이온 (HCI) 농도가 0.08몰이다. 이런 조건의 경우 O-글리코시드가 완전히 파괴하고 C-글리코시드가 남아 있다 (83%정도) (O-및 C- 글리코시드를 파괴하는 동력은 비텍스 및 하이프로지드에 도시된 실시 예에서 표 14에 나타난다). 따라서 아글리콘 및 아글리콘 형태의 O- 및 C- 글리코시드 형태 등의 정략적 정보를 얻기 위해 추출물 및 HPLC, UPLC-MC / MC 방법으로 0,08 Mолъ HCl 배지에서 가수 분해 후 생성물에 대한 연구 결과를 분석한다. 도 15는 PDA 크로마토그램 (1) 및 총 질량 크로마토그램 (2)의 예를 나타낸다. 가수 분해 전 총 추출물의 개별 이온을 스캐닝한다 (같은 컬럼의 경우 UPLC MC / MC 기기에 유지 시간이 Waters UPLS - PDA기기의 유지 시간보다 약간 적다). 또한 도 16에는 크로마토그래피 피크 (3)를 결정하고 331 (4) 질량 시 PDA 크로마토그램을 스캐닝하여 331 (트리신) 질량으로 스캐닝하는 예가 나타난다. 도 17 및 도 18에는 가수 분해 후 총 추출물을 질량 (331)으로 스캐닝하는 예를 도시한다.
O-글리코시드의 수량을 결정하기 위해 총 추출물의 결과 및 가수 분해 후 얻어진 추출물의 결과를 비교한다: 가수 분해 후 피크의 부재 또는 감소는 (가수 분해 후 여러 가지 화합물을 함유하는 크로마토그래피 피크를 감소함) 단독적으로 또는 화합물의 복찹체의 일부로서 존재할 수 있는 O-글리코시의 존재를 나타낸다 (단독 크로마토그래피 피크). 계산할 때 표 3에 주어진 추출된 아글리콘의 질량과 식별된 탄수화물을 고려하여 배당체 이온의 이론적인 질량을 사용하였다 (표 1).
표 3
연구된 아글리콘의 이론적으로 계산된 배당체
아글리콘 유지 시간 (분) 질량.
(M)		 M +1 글루코스 (소르보스) 자일로스(리보스, 아라비노스) 1,6-무수-β-D-글루코스 글루쿠론산 람노시드
아피제닌 7,56 270 271 433 403 415 447 417
루테올린 6,9 286 287 449 419 431 463 433
케르세틴 7,15 302 303 465 435 447 479 449
크리신
(람나진)		 7,82
(9,02)		 330 331 493 463 475 507 477
O-글리코시드의 경우 (예, 과오사이드) 질량 분광법에서 전기 분무기를 사용한 결과로서 아글리콘 분자는 탄화수소에서 분리되고 아글리콘과 초기 글리코시드 간의 비율은 100:1이 된다. C-글리코시드의 경우 (예, 바이텍스) 초기 글리코스드 분자OH + 1에서 분리되고 (즉 18 질량) 초기 글리코시드와 그 파생품(글리코시드도)의 피크 면적의 비율은 3,23이 된다. 연구 결과를 바탕으로 연구된 질량 스펙트럼에 나타나고 C-글리코시드 분해 결과로 형성된 화합물이 발견되었다 (표 4).
표 4
질량 분광 분석 시 C-글리코시드 플로바노이드를 전환하는 파생품
아글리콘 초기 글리코시드 M + 1 파생품 M + 1
트리신 8-C-트리신 글리코시드
C-람나진 글리코시드		 493
477		 무수C-글리코시드
무수C-글리코시드 		475
459
람나진 8-C-람나진 크실로시드 463 무수 C-글리코시드 448
아피제닌 8-C-아피제닌 글리코시드
8-C-아피제닌 크실로시드
C-람나진 글리코시드		 433
403
417		 8-C-(1,6-무수)-β-Д-아피제닌 글리코시드
무수C-글리코시드
무수C-글리코시드 		415

385
399
루테올린 8-C-루테올린 글리코시드
C-크실로오스 글리코시드
8-C-루테올린 글리코시드		 449
419
433		 8-C-(1,6-무수)-β-Д-루테올린 글리코시드
무수C-글리코시드
무수C-글리코시드		 431

401
415
케르세틴 8-C-케르세틴 글리코시드
C-크실로오스 글리코시드
C-람노시드 글리코시드		 465
435
449		 8-C-아피제닌 글루코시드
무수C-글리코시드
무수C-글리코시드		 447
417
431
표 5.
O-글리코시드 (mg/l) 함유량이 총 허브 추출물(1:1)에서 다음 비율로 ( 에틸 알콜 1:10에서 3:1까지) 과오사이드로 계산하는 값은 다음과 같다
m/z 시간, 분 원료의 중량비: 알코올 (건식 잔류물 % , 밀도 g/ml) 연결
1 2 1:10
(0, 5;0,8010 ) 		1:2
(1, 2;0,8100 ) 		3:1
(2, 5;0,8250 ) 		4
449 4,9

7,86		 11,23

0,58		 84,20

4,35		 140,50

10,80		 7-O-루테올린 배당체
3-O-람노지드 퀘르세틴
463 5,02
5,86		 2,98
1,52		 14,90
7,80		 37,25
19,50		 7-O-람나진 크실로시드
403 9,0 0,91 6,80 17,60 7-O-아피제닌 크실로시드
493 5,44
5,74		 1,28
5,19		 9,60
38,90		 24,20
97,25		 7-O-트리신 크실로시드
431 4,9 17,70 125,00 210,20 7-O-(1,6-무수)-β-Д-루테올린 글리코시드
445 5,50 6,18 46,30 115,75 7-O-(1,5-무수)-β-Д-트리신 크실로시드
5,03 18,00 135,00 247,50 7-O-루테올린 아하이드로글루코로니드
419 5,5 3,76 28,20 70,50 7-O-루테올린 크실로시드
479 7,9
8,13		 3,44
4,35		 25,80
32,60		 46,40
65,20		 3-O-케르세틴 글리코로니드
465 4,94 1,66 12,40 31,00 3-O-케르세틴 글루코시드
5,41 3,93 15,70 37,70 3-O-케르세틴 크실로시드
8,92 0,07 0,30 0,75 7-O-람노시드 케르세틴
582 4,91 15,24 114,30 244,30 3-O-글루코시드, 7-O-람노시드 루테올린
639 5,74 7,24 54,30 119,45 3-O-글루코시드, 7-O-람노시드 트리신
689 5,92
6,26
6,45
7,03		 1,23
8,16
5,27
2,85		 4,90
40,80
26,10
11,40		 12,25
102,00
65,25
28,50		 3-O-(4-하이드록시벤조일) 케르세틴 크실로시드
O-글리코시드의 총개 (mg/l) 122,75 842,95 1726,25
표 6
1:10 내지 3:1 범위에서 에틸 알코올 원료 중량비 시 총 추출물에 허브 화합물 (1:1)에서 글리코시드로 계산하는 경우 C - 글리코시드 (mg/l) 함량
m/z 시간, 분 원료의 중량비: 알코올 (건식 잔류물 % , 밀도 g/ml) 연결
1 2 1:10
(0, 5;0,8010 ) 		1:2
(1, 2;0,8100 ) 		3:1
(2, 5;0,8250 ) 		4
465 4,94
5,29
5,51
5,51
9,12
9,12		 0,36
0,28
0,12
0,11
1,24
1,89		 2,02
2,23
1,00
1,06
8,60
11,30		 4,95
5,58
2,48
2,43
19,78
27,69		 8-C-케르세틴 글루코시드
403 9,0
9,0		 10,26
0,32		 66,75
1,83		 166,87
4,09		 8-C-아피제닌 글리코시드
463 5,02
5,35
5,47		 1,15
1,20
1,80		 6,90
9,00
11,70		 17,25
24,30
28,08		 8-C-트리신 크실로시드
5,47
5,57
9,15		 0,02
0,98
1,65		 0,09
6,86
10,00		 0,22
16,81
23,70		 8-C-루테올린 글루쿠로니드
493 5,75
5,97
5,97		 1,08
2,12
1,54		 7,00
15,90
10,00		 17,50
36,57
23,17		 8-C-트리신 글루코시드
9,16
9,11		 0,68
4,94		 4,15
34,60		 10,17
89,96		 8-C-람노시드 글루코시드
507 8,95
9,08		 0,11
1,44		 0,65
10,0		 1,69
24,51		 8-C-트리신 글루쿠로니드
415 9,16 1,78 10,50 25,73 8-C-(1,6 무수)-β-Д-아피제닌 글루코시드
447 5,47
5,65
7,89		 0,38
2,02
0,64		 2,30
13,10
3,20		 5,64
31,40
7,36		 8-C-아피제닌 글루쿠로니드
433 4,86
4,86
5,33
5,33
9,06
9,06		 0,31
0,24
1,98
3,04
3,85
1,56		 1,85
1,08
12,70
18,40
27,20
8,40		 4,45
2,82
31,12
44,20
62,56
17,82		 8-C-아피제닌 글루코시드
479 7,22
7,89
8,09
9,0
9,14		 0,12
0,97
0,85
0,72
0,73		 0,70
6,80
6,15
4,40
4,60		 1,75
15,23
15,98
9,94
8,75		 8-C-케르세틴 글루쿠로니드
449 4,9
5,02
5,02
7,86
8,01
8,06
9,12		 3,12
4,95
3,12
1,54
검출되지 않음
2,46
2,60		 20,30
37,10
20,30
10,70
0,041
16,05
14,50		 56,35
89,04
49,74
23,84
0,09
40,43
35,67		 8-C-루테올린 글루코시드
431 4,9
5,33
9,06		 8,04
4,27
4,5		 56,30
25,60
27,80		 129,50
62,72
63,94		 7-O-(1,6-무수)-β-Д 루테올린 글루코시드
671 5,62
9,08		 0,24
0,63		 1,60
4,10		 4,00
9,27		 8-C-(시나폴)-케르세틴 글루코시드
C-글로코시드 총개 (mg/l) 87,6 5 577,36 1395,71
따라서 총 추출물 분석의 예에서 유리 아글리콘 (표 2) 및 글리코시드 형태의 아글리콘의 함량을 정성 및 정량적으로 측정하였다: O-글리코시드 (표 5); C-글리코시드 (표 6).
1군의 화합물은 (도 1) HPLC 크로마토그램에서 최소 유지 시간과 가장 친수성이 낮은 그룹으로서 아글리콘에서 분리된 O- 및C-글리코시드의 혼합물이다. 그 중 트리신, 루테올린 및 아피제닌 등은 우세하다. 2군의 화합물은 (도 1) 유리 아글리콘의 혼합물이다. 3군의 화합물은 아실화된 O-, C- 및 비글리코시드이다.
허브 추출물에서의 아글리콘과 그 글리코시의 정략적 조성을 결정하는 상기 결과는 (생물학적 활성을 연구함) 각 허브에서 별도로 얻은 추출물의 구성과 생물학적 활성을 비교할 수 있다. 각 허브에서의 모델 추출물은 조성 차이를 결정하고 특정 생물학적 효과를 비교할 목적으로 플라보노이도와 그 글리시드의 0,22 mg / ml 합계 및 원료와 알코올 비율로1: 4, 5 생산되었다 (건식 잔류물은 0,7% 이다 (0,8080 g / ml 평균 밀도)). 크로마토그래피 조건 하에서 전형적인 HPLC 크로마토그램 (350nm 시 검출) 및 Deschampsi cespitosa와 Calamagrostis epigeios에서 얻어진 에탄올 추출물의 흡수 스펙트럼은 도 19 및 도 20에 표시된다.
크로마토그램은 추출물의 질적 구조가 유사하다는 것을 보여준다. 에탄올 추출물 조성 사이의 차이는 플라보노이드 및 O- 및 C- 글리코시드의 개별 분자의 상이한 정량적 함량으로 구성된다.
표 7
모델 허브 추출물에서 (1:1) 그리고 에틸 알코올 비율 (1:10부터 3:1까지)로 유리 아글리콘, O- 및 C- 글리코시드 등의 비교 조성과 중량비를 분석함.
No 연결 허브 혼합물 ( 1:1) Calamagrostis epigeios 추출물 Deschampsia cespitosa 추출물
원료재료의 중량비: 에틸 알코올 (건식 잔류물 % ; 밀도 (g/ml))
1:10 1:2 3:1 1:10 1:2 3:1 1:10 1:2 3:1
0, 5;0,8010 1, 2;0,8100 2, 5;0,8250 0, 5;0,8010 1, 2;0,8100 2, 5;0,8250 0, 5;0,8010 1, 2;0,8100 2, 5;0,8250
1 트리신 4,000 37,260 95,000 0,900 9,450 24,00 0,600 6,800 14,000
2 루테올린 0,100 1,500 3,600 0,004 0,040 0,010 0,100 1,250 3,200
3 아피제닌 0,080 0,840 1,800 0,020 0,200 0,600 0,010 0,150 0,500
4 케르세틴 0,060 0,600 1,400 0,030 0,300 0,800 0,010 0,100 0,500
5 람나자인 0,010 0,070 0,140 0,010 0,020 0,080 0,010 0,020 0,080
6 자유 아글리콘 총개 4,250 40,270 101,940 0,964 10,010 25,490 0,730 8,320 18,280
7 O-트리신 배당체 19,92 149,10 356,65 1,00 10,0 21,00 1,00 10,5 21,00
8 C-트리신 글리코시드 10,44 71,15 173,07 0,20 6,2 11,00 1,00 10,0 22,00
9 O-아피제닌 글리코시드 0,91 6,80 17,60 0,60 8,9 22,00 1,00 11,35 24,00
10 C-아피제닌 글리코시드 26,38 167,30 402,63 0,05 0,53 1,20 0,04 3,70 9,00
11 O-루테올린 글리코시드 65,93 486,70 913,00 0,01 2,36 6,80 4,00 41,6 120,0
12 C-루테올린 글리코시드 36,95 245,60 592,05 0,02 0,22 0,06 0,50 6,95 21,00
13 O-케르세틴 글리코시드 31,49 177,65 399,85 0,01 0,16 0,04 0,02 0,18 0,40
14 C-케르세틴 글리코시드 8,26 54,56 127,83 0,02 0,22 0,70 0,02 0,18 0,70
15 O-람나진 글리코시드 4,50 22,70 56,75 6,50 67,5 180,00 10,00 108,0 260,00
16 C-람나진 글리코시드, 총개 5,62 38,75 100,13 0,01 0,08 0,12 0,01 0,12 0,36
17 O-글리코시드 총개 122,75 842,95 1726,25 8,31 70,02 227,84 16,02 171,63 454,40
18 C-글리코시드 87,65 577,36 1395,71 0,60 7,25 13,08 2,57 20,95 53,06
HPLC-MC/MC를 사용하여 총 추출물을 결정하는데 사용된 기술을 활용하여 각 허브 추출물의 질적 및 양적 조성을 별도로 결정한다.
표 7에서 볼 수 있듯이 Calamagrostis epigeios추출물에서 유리 아글리콘 함유량은 9,5% 내지 11,5%이며 Deschampsi cespitosa 추출물에서 유리 아글리콘 함유량은 플라보노이드 화합물의 총량에서의 3,8% 내지 4,2%이다. 그 함유량은 원료 비율과 거의 다르지 않는다: 추출제가 특정 범위에 있다. 제시된 데이터는 모델 추출물에서 추출되는 물질의 일관성을 나타낸다.
플라보노이드 화합물의 혼합물(아글리콘 및 O- 및/또는 C-글리코시드)의 최대 비율은 허브 혼합물(1:1)이 함유한다: 추출제 3: 1, 건식 잔류물에서의 9,408% (3223, 9 mg/ l) 이다: 30300 mg / l. Calamagrostis epigeios 추출물은 플라보노이드 화합물의 최소 수량을 함유한다 (0,132% 또는 9,870 mg/ l, 건식 잔류물이 6240 mg/ l이다) 원료 비율: 추출제 1:10.
추출 물질에 대한 원료의 비울이 1:10미만이면 루테올린, 아피제닌, 케르세틴 등의 플라보노이드 화합물은 추출되지 않고 항바이러스 활성을 상실한다. 원료 비율을 증가시키는 경우: 3: 1 추출물의 경우 추출되는 O- 및/또는 C-글리코시드 수량은 증가하지 않으며 추출물은 응고 퇴적물의 침전으로 인해 시간이 지나가서 항바이러스 효과를 잃는다.
생물학적 활성에 대한 비교 시험은 플라보노이드의 보정된 합계가 0,22 mg/ml인 경우 Calamagrostis epigeios와 Deschampsi cespitosa로 추출된 총 허브 추출물 (1:1)을 위해 동시에 수행된다.
위의 예는 생물학적 활성 물의 특성을 설명하지만 특허의 효과를 제한하지 않는다. 검출된 특성은 NoNo 표 1-16 및 표 1-27에 반영된다.
신청서에 사용된 용어 및 약어, 연구 방법은 공식적으로 인정되어 있다 (의약품의 전임상 연구 (체계적인 권고). 우크라이나 의료 과학 아카데미 스테파노바 위원의 편집-K.: 아비첸나, 2001년 - 528장).
발명을 실시하는 옵션
1예.
관내 실험에서 모델 추출물의 헤르페스 억제 효과에 대한 연구를 실시함.
추출물의 항바이러스 활성을 연구하기 위해 Vero 세포(원숭이의 신장 세포) 배양물을 사용하였다. 세포는 태아 혈청(Nunclon, Surface, Denmark)의 RPMI-1640 + 10% 배지에서 37℃ 온도시 CO2 공급과 배양되었다.
2형 헤르페스 바이러스 (HH (HSV)균주), 감염성 역가: 5,0 - 7,0 lg TCD50 / 0,1 ml (TCD50 - 조직 세포증 병원성 바이러스의 투여량은 세포 단층 50%를 손상해준다)를 사용하였다. 항바이러스 활성을 연구하기 위해 단일 층을 가진 하루 Vero 세포의 배양액을 사용하였다. 배양물을 제거하고 세포 단층에 추출물을 다양한 농도로 투입하였다. 접촉한 1시간 후 헤르페스 바이러스를 100 TCD50 용량으로 첨가하고 지지 배지 (무혈청 배양 배지)를 웰에 첨가하였다.
매일 현미경으로 모니터링하고 Vero 세포에 대한 HSV 세포 변성 효과에 의한 바이러스 번식을 기록하여 5일 동안 CO2 공급과 배양기에서 배양물을 배양한다. 단일 층은 추출물로 처리되지 않는다 (바이러스 관리).
세포에 대한 HSV의 세포 병리학적 효과는 형질 전환 및 거대 다핵 세포와 조합하여 심플렉스 또는 둥근 세포의 형성에 형태학적으로 나타난다.
3 일 후 플레이트의 웰에서 배양 배지를 수집하고 모델 추출물의 다양한 투여량을 투여할 때 각 샘플에서 감염성 약가를 측정한다. HSV-2 번식 결과는 표 8에 표시된다.
표 8
Vero 세포 배양물에서 HSV - 2 번식 및 최소 활성 농도 결정에 실험 추출물이 영향을 미치는 결과
희석한 추출물에 있는 플라보노이드 농도, mkg/ml lg ID50 에서 전염성 역가에 영향을 미치는 추출물 명칭
총 추출물
(1:1)		 Calamagrostis 추출물 Deschampsia cespitosa 추출물
0,272
0,136
0,068
0,034
0,017		 3,0
4,0
5,0
5,0
6,0		 3,0
5,0
4,0
5,0
6,0		 3,0
4,0
4,0
3,0
4,0
바이러스 관리 7,0 7,0 7,0
도 9에 최대 허용 농도, 최소 활성 농도 및 화학 요법 지수 등이 표시된다.
표 9.
모델 추출물의 최대 허용 농도, 최소 활성 농도 및 화학 요법 지수 등을 결정하는 결과 및 Vero 세포 배양에서 2형 헤르페스 바이러스에 영향을 미침.
지수 최대 허용 농도, 최소 활성 농도 및 화학 요법 지수
총 추출물
(1:1)		 Calamagrostis 추출물 Deschampsia cespitosa 추출물
최대 허용 농도 (mkg/ml)
최소 활성 농도 (mkg/ml)
화학 요법 지수		 5,5
0,034
161,7		 5,5
0,034
161,7		 2,7
0,017
158,8
연구된 추출물은 2형 헤르페스 바이러스를 효과적으로 억제한다. Deschampsia cespitosa 추출물의 경우 바이러스의 특이적 작용 발당을 억제하는 최소 활성 농도는 2,0 - 3,0 lg TЦД50이다. 이 값은 전체 추출물 및 Calamagrostis epigejos 추출물에 대한 최소 활성 농도(0,034 mkg /ml)의 절반 값이다. 총 추출물은 160이다.
2예
In vitro 실험에서 추출물의 항지균 활성 수준을 결정함.
A / FM / 1/47 (H1N1)균주, 유산균 배양액의 감염 역가 - 6,0 lg EID50 / 0,2 ml 등을 사용한다.
In vitro 실험에서 추출물의 항바이러스 활성을 측정하기 위해 연속 층을 갖는 MDCK 세포 (개 신장 세포)의 하루 일과성 배양물을 사용하였다. CO2 공급과 태아 혈청 (Nunclon, Surface, Denmark)의 RPMI-1640 + 10% 배양기에서 37℃ 온도 시 세포를 성장시켰다. 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 세포의 감수성을 증가시키기 위해 트립신에 의해 치러되었다. 트립신의 모액은 DMEM 3배양 배지에 그랙까지 효소를 첨가하여 생산되었다. 세포는 웰당 용액 50ml으로 3회 세척되었다.
성장 배지를 배수시키고 세포에 모델 추출물을 다양한 농도로 첨가하고 인플루엔자 바이러스를100 TCD50 투여량으로 투여하였다.
CO2 공급과 배양기에서 3일간 배양물을 배양하고 매일 현미경으로 관리하였다.
세포 배양 72 시간 후 배양액을 수집하고 세포 배양에서 적정에 의해 인플루엔자 바이러스의 감염성 역가를 결정하였다. 표 10에는 모델 추출물이 인플루엔자 바이러스에 미치는 영향을 연구한 결과가 표시된다. 얻어진 자료에 따르면 다양한 농도로 모델 추출물은 인풀루엔자 바이러스의 생식을 2,0 - 3,0 lg ID50 로 억제해서 총 추출물뿐만 아니라 각 허브의 항 인플루엔자 작용을 보여준다.
표 10
실험 추출물이 MDCK 세포 배양에서 인풀루엔자 바이러스 생식에 영향을 미치고 최소 활성 농도를 결정하는 결과
희석된 추출물에서 플라보노이드의 합계 농도 mg/ml 추출물이 lg ID50인플루엔자 바이러스의 전염성 역가에 미치는 영향 및 추출물 명칭
총 추출물
(1:1)		 Calamagrostis 추출물 Deschampsia cespitosa 추출물
0,055
0,0275
0,0137
0,0068
0,0034
0,0017		 3,0
2,0
3,0
3,0
5,0
5,0		 4,0
4,0
7,0
6,0
6,0
6,0		 3,0
3,0
3,0
2,0
3,0
7,0
바이러스 관리. 6,0 6,0 6,0
인플루엔자 바이러스에 대한 모델 추출물의 화학 요법 지수는2,0 - 3,0 lg ID50 으로 특정 바이러스 세포 변성 작용을 억제하는 최소 활성 농도에서 최대 허용 농도 비율을 측정하여 결정된다 (표 11).
표 11
MDCK 세포 배양에서 인플루엔자 바이러스에 작용할 때 모델 추출물의 최대 허용 농도, 최소 활성 농도 및 화학 요법 지수 등을 결정하는 결과
지수 최대 허용 농도, 최소 활성 농도 및 화학 요법 지수
총 추출물 (1:1) Deschampsia cespitosa 추출물 Calamagrostis epigejos 추출물
최대 허용 농도 (mkg/ml)
최소 활성 농도 (mkg/ml)
화학 요법 지수		 5,5
0,0068
808,8		 5,5
0,0275
200,0		 1,8
0,0034
52,9
모든 모델 추출물은 인플루엔자 바이러스에 효과적이다. 인풀루엔자 바이러스 감염 역가는 생물학적 활성 물질의 농도가 0,0034 mkg / ml인 경우 Deschampsia cespitosa 작용 시 크게 감소한다 (3,0 lg ID50 정도). 인플루엔자 바이러스에 영향을 주는 가장 큰 선택성은 HTI=808인 총 추출물에 내재되어 있다.
3예
C형 간염 바이러스에 대한 추출물의 활성을 연구함.
HCV 대리 바이러스로서 C형 간염 바이러스의 시험 모델인 C형 간염 바이러스를 사용한다.
희석 추출물로 가공되고 100 TЦД50 투여량으로 첨가된 MDPC 배양물에서 항바이러스 활성을 연구하였다. 배양물을 대조군에서 바이러스의 특유 세포 변성 작용이 나타날 때까지 항온 배양기에서 배양한 후 배양 배지에서 감염성 바이러스 역가를 측정한다. 결과를 도 12에 볼 수 있다.
표 12
소 설사 바이러스 생식에 영향을 미치는 결과 및 MDVK 세포 배양에 대한 최소 활성 농도를 결정함.
희석 추출물에서 플라보노이드 농도, Mkg/ml 추출물 명칭 및 HCV가 lg ID50에 전염성 역가에 양향을 미침
총 추출물 Deschampsia cespitosa 추출물 Calamagrostis epigejos 추출물
0,275 4,0 4,0 4,0
0,137 4,0 4,0 4,0
0,068 3,0 4,0 4,0
0,034 4,0 3,0 4,0
바이러스 관리 8,0 8,0 8,0
얻은 결과를 분석하여 추출물이 C형 간염 바이러스의 생식을 3-2 lg ID50으로 억제한다는 것을 주목하여야 한다.
총 추출물, Deschampsia cespitosa 추출물, Calamagrostis epigejos 추출물 등이 MDVK 세포 배양에서 IHVD 바이러스에 작용할 때 최대 허용 농도, 최소 활성 농도 및 화학 요법 지수 등을 결정하는 결과는 표 13에 표시된다.
표 13
MDVK 세포 배양에서 IHVD에 대해 최대 허용 농도, 최소 활성 농도 및 화학 요법 지수 등을 결정하는 결과.
지수 최대 허용 농도, 최소 활성 농도 및 화학 요법 지수
총 추출물 (1:1) Deschampsia cespitosa 추출물 Calamagrostis epigejos 추출물
최대 허용 농도 5,5 2,7 5,5
최소 활성 농도 0,034 0,034 0,034
화학 요법 지수 161,7 79,4 161,7
연구 결과에 따르면 모델 추출물은 HTI 지수가 높은 C형 간염 바이러스를 효과적으로 억제한다.
모든 추출물은0,0034 mkg /ml 시 C형 간염 바이러스를 4,0 - 5,0 lg ID50 로 억제한다.
4예.
In vivo 에서 모델 추출물의 인터페론 활성.
인터페론 활성은 모델 추출물을 복강 내 (0,1ml씩) 55,5 mkg/kg 농도로 투입한 in vivo에서 흰색 이계 마우스에 대한 실험에서 연구되었다. 24 시간 후 안락사에 의해 실험에서 마우스를 제거하였으며 L929상 동성 조직 배양에서 수막 구염 바이러스의 세포 변성 작용을 억제하는 통상적인 방법에 의해 혈청에서 인터페론을 결정하였다. IFN의 유형은 산 감수성 마커에 의해 결정되었다. 이 목적으로 혈청을 2등분으로 나누었다. 그 부분 중 하나에서 4 N HCI에 의해 pH 액체를 2.0값까지 증가시키고 24시간 동안 4℃ 온도로 남았다. 그 다음에 4 N NaOH에 의해 7.2까지 액체의 pH을 회복시켰다.
수행된 실험 결과는 표 14에 나타난다.
표 14
모델 추출물을 주사한 마우스의 혈청 내 인터페론 수준.
모델 추출물 및 기준 인덕터 단위당 인터페론 활동
- pH + pH
총 추출물 320 0
Deschampsia cespitosa 추출물 320 0
Calamagrostis epigejos 추출물 1280 0
Poly I:Poly C 1280 1280
Poly I:Poly C - IFN 기준 인덕터 (Calbiocheus, USA)
pH 감수성 마커에 따르면 3가지 추출물 모두가 γ-인터페론을 유도한다는 것이 판명되었다.
모든 추출물에는 면역 γ-인터페론을 유도하는 특성이 있다. Calamagrostis epigejos 추출물은 Poly I: Poly C 기준 인덕터의 수준에서 인터페론을 유도하고 총 추출물 및 Deschampsia cespitosa 추출물은 기준 인덕터를 유도하는 수준에서의 25%수준에 인터페론을 유도한다.
5 청구
생물학적 활성 물질의 아포프토제닉 및 변조 아폽토시스 특성을 결정한다.
플라보노이드 물질이 백혈병 세포 및 정상 세포에 선택적 효과가 있기 때문에 아폽토시스 유도 및 세포 분화에 대한 연구에서 활발히 연구되고 있는 것으로 알려져 있다.
우리는 생물학적 활성 물질의 세포 독성, 세포 사멸을 유도하는 능력, 생물학적 활성 물질이 Jurkat 악성 인간 림프구 세포 시스템에서 세포 자멸 유발 약물 vapezid (바페지드)과의 상호 작용에 대해 연구하였다.
본 연구는 Jurkat 인간 T세포 림프 모구 백혈병 세포의 이식 가능한 세포주에서 수행되었다. 연구를 실시하기 위해 생물학적 활성 물질은 성장의 대수 단계 시작에 도입된다.
세포 독성을 분석하고 세포 자멸사를 유도하고 사이클 주기를 분포하기 위해 현탁 배양액에 생물학적 활성 물질을 아래 농도로 넣었다. 세포의 생존력은 트리판 블루색에 의해 결정된다. 적절한 물질과 항몬 처리가 끝나면 바벤체임에 따라 세포 원심 분리 준비물을 염색하였다.
혈구 계산을 분석하기 전에 세포는 구연산 나트륨 0.1% 및 0,1% 트리톤 X-100과 프로피디움 요오드화물 (50 mkg/ ml)에서 배양되었다. "Becton Dickinson" (미국) 제조사의 FACScan유동 세포 계측기를 사용하여 세포 형광을 평가하였다. 세포 자멸 지수는 다음 공식에 의해 계산된다: (세포 사포 수/ 세포 총수) x 100).
유동 세포 계측법에 의해 프로피디움 요오드화물로 염색된 세포에서 세포주기 위상 분포를 연구하였다.
유세포 분석 후 결과가 ModFit LT 2.0 ("Verity Software House", Topsham, ME, 미국) 및 CELLQuest ("BD Biosciences Pharmingen>>) 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분석되었다.
총 추출물의 플라보노이드 물질이 Jurkat 세포의 성장에 5,5 и 55 mkg /ml농도로 영향을 미친다는 효과를 조사하였다. 그 결과는 도 21에 나타난다.
성장 동역학 자료를 알 수 있듯이 시험 물질은 저독성이다. 본 데이터는 항바이러스 효과를 연구하는 것에 사용된 서스펜션 및 배양 단층 세포에 대한 추출물의 상대적인 무독성과 일치한다.
추출물의 플로바노이드 물질이 55 mkg/ml 농도로 작용할 때 세포 성장을 억제하는 것은 성장의 완전한 지연의 경우에도 세포의 대량 사멸을 동반하지 않는다.
아포프토제닉 인자가 세포 성장의 억제에 기여하는 것을 결정하는데 관심이 있었다. 도 22에 도시된 데이터에 따르면 추출물의 플로바노이드 물질과 5,5mkg/ml 용량으로 장기 기간 (3일) 배양하는 것은 유동 세포 계측법에 따라 저차원 배반 세포의 비율이 약간 증가하는 것을 동반한다 (배양의 후기 단계에서 대조군 배양물에서 자발적으로 아폽토시스가 일어난다). 플라보노이드 물질의 농도가 10배로 증가하면 저복상성 세포의 함량이 크게 증가한다. 둘째 날에는 자멸사 세포의 수가 자발적 세포 사멸과 비교하여 20%로 증가한다.
얻은 데이터는 생물학적 활성 물질이 프로아폽토틱이고 농도가 증가하면 증가할수록 세포 사멸 효과가 있음을 나타낸다.
바페지드로 Jurkat 세포 사멸 유도에 대한 플라보노이드 물질의 가능한 변형 효과를 결정하기 위해 생물학적 활성 물질과 세포를 배양한다. 그 다음에 2 또는 3일 후에 세포에 하루당 1mkmol/l 용량으로 베페지드를 첨가하였다. 즉 베페지드는 세포 자멸 유도하기애 충분하다. 연구 결과는 도 23에 표시된다.
우리가 보는 바와 같이 생물학적 활성 물질이 비독성 용량에서 배양하는 것은 베페지드의 전형적인 세포 사멸 유도제의 작용에 대한 Jurkat 세포의 감수성을 현저히 증가시킨다. 이런 조건에서 생물학적 활성 물질와 베페지드의 순차적 작용으로 하이포디플로이드 세포의 수율에 대한 추가적인 효과가 얻어진다.
연구 결과에 따르면 생물학적 활성 물질이 세포 사멸 조절 효과를 가지고 있다.
6예.
세포 항산화 상태에 생물학적 활성 물질의 효과를 결정함.
다양한 실험 모델에서 플라보노이드의 생물학적 및 약리학적 효과에 관한 잘 알려진 연구 결과에 따르면 생물학적 작용 메커니즘 중 하나는 세포와 인체의 항산화 시스템 (특히 라디칼 형태의 산소 형성 및 제거 강도)에 영향을 주는 것이다.
샘플을 채취하기 전에 2, 4 또는 24 시간 동안 약물과 함께 배양하는 악성 인간 림프구 세포인 Namalwa 및 MT-4의 수혈된 배양 균을 연구 대상으로 사용하였다. 생물학적 활성 물질의 농도는 항바이러스 연구 때 결정되었으며 대부분의 실험에서 케르세틴 글리코시드의 경우 2,75mg/ml이었다. 생물학적 활성 물질과의 배양 종료 시 세포의 생존력은 트리판블루에 의해 염색함으로써 모니터링되었다. 생물학적 활성 물질의 항산화 특성 분석에 대한 추가 실험을 실시하기 위해 90%이상 생존력을 보여준 샘플만 사용하였다. 연구된 세포의 항산화제 상태에 대한 약물의 영향을 연구하기 위해 ERP분광법 (전자 - 상자성 공명 분광계) 및 화학 발광 방법이 사용되었다.
슈퍼옥사이드 라디칼의 생성 속도는 단시간 슈퍼옥사이드로 안정한 TEMPO 라디칼을 형성해서 스핀 트랩2,2,6,6-테트라메틸피페리딘-N-옥사이드 (TEMPO)를 사용하여 EPR 분광계에서 측정되었다. 현탄액에 트랩 셀을 투입한 후 EPR 분광계의 큐벳에서 안정한 TEMPO-라디칼을 축적하는 과정은 5-6분 동안 선형적으로 진행되었다. 스펙트럼은 분 간격으로 기록되었다. TEMPO 라디칼 EPR 스펙트럼의 두째 성분의 진폭에 의해 슈퍼옥사이드 라디칼 생성 속도에 해당하는 TEMPO 라디칼의 축적 속도를 기록하였다.
큐벳의 작동 볼륨은 170mkl였다. 조사는 실온에서 수행되었다. 큐벳에서 네이티브 (완전) 셀 그리고 큐벳에 분광계를 넣기 전에 얼음 욕조에서 균질화된 셀을 주사한다. 또한 비활성화하고 전자 전달 체인에 참여하는 효소를 억제하기 위해 0-100℃에 예열되거나 가열된 (60℃ 5분) 세포를 조사했다. 모든 용액은 재결정된 시약 (분석을 위해 순수함) 및 증류수로 ex tempore에서 생산되었다.
MT-4 대조군 배양 배지의 천연 세포는 실온에서 평균 1분당 0.53nmol/십만 세포의 속도로 슈퍼옥사이드 라디칼 -음이온을 생성하였다 (도 24). 온도 처리 후 (60℃ 및 0℃) TEMPO 복합체 형성의 EPR 신호가 없는 사실은 활성 산소를 발생하는 과정에서 열 분해성 성분이 참여하고 실험 결과에 고려할 수 없는 물질의 영향이 부재함을 증명한다.
MT-4 세포가 생물학적 활성 물질의 존재 하에서 배양되었을 때 슈퍼옥사이드 라디칼-음이온을 생성하는 속도는 배양 2 시간 후 20-30%로 감소되고 배양 4 시간 후 절반 이상 감소된다. 배양 24 시간 후 라디칼을 생성하는 속도는 거의 0이다.
Namalwa 세포에 의해 이 라디칼 생성 활성은 MT-4 (평균 0.33 nmol/ 100　000 분당) MT-4 세포보다 약간 낮았다. 동시에 생물학적 활성 물질과의 배양 후 라디칼 밸상의 거의 완전한 소멸이 관찰되었다 (도 25).
생물학적 활성 물질에 관한 시험을 수행한 결과에 따르면 항산화 특성이 있으며 슈퍼옥사이드 라디칼-음이온 발생 억제에 대한 용량 의존 동력뿐만 아니라 과산화수소에 의해 유도된 자유 라디칼 과정 강도를 억제한다.
생물학적 활성 물질이 과산화수소 (H2O2)에 의해 유도된 자유 라디칼 과정의 강도에 미치는 영향을 연구한다.
유리 라디칼 공정의 강도는 실온에서 화학 발광 방법으로 연구되었다. 산소 라디칼 형태의 산소 발생 유도제로 광전자 곱셈기의 열린 커튼으로 세포의 빛 기본 수준을 예비 등록을 한 후 화학 발광 측정기의 셀에 투입한 과산화수소(현탁액의 1ml당 0,5ml 3% H2O2씩)를 사용하였다. 배양액에서의 세포는 1-8백만/ml 농도로 투여되었다.
생물학적 활성 물질과의 MT-4 세포의 부화는 H202에 의해 공격받는 세포의 화학 발광의 강도를 현저하게 변화시켰다. 전형적인 화학 발광 그램은 도 27에 표시된다. 생물학적 활성 물질과 배양된 세포 샘플의 경우 H202 공격 후 1초 이내에 화학 발광 감소가 대조군 배양 세포의 화학 발광과 비교하여 2.2배로 특이성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 대조군 세포의 최대 발광은 90-180초에 기록되었으며 그 후 반응은 발광 진폭이 62-75 cu인 고정상으로 이동한다. 생물학적 활성 물질과 배양한 세포 샘플에서 자유 라디칼 발달은 부진한 특성을 가진다. 최대 광선은 270-300초에 나타나며 고정 수준은 560-600초에 나타난다 (도 26).
연구된 생물학적 활성 물질은 반감기 특성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 즉, H202에 의해 여기되는 자유 라디칼 스트레스에 대한 세포의 저항성을 증가시킨다.
생물학적 활성 물질의 특수 예는 생물학적 활성 물질이 폴리약리학적 작용을 가진 물질임을 나타낸다. Calamagrostis epigeios 및 Deschampsia (1:1) 허브 혼합물에서 추출된 생물학적 활성 물질의 범위 작용 그리고 각 허브에서 별도로 추출된 생물학적 활성 물질의 작용 스펙트럼은 동일하며 플라보노이드 화합물의 총수에 대한 물질 농도에 따라 다르다.
따라서 생물학적 활성 물질과 활성 물질의 물리 화학적 특정 조성을 결정하여 생물학적 활성 물질을 향상시키는 것은 바이러스에 대한 바이러스항 활성을 위한 최적 조성물을 생산하고 투여량을 결정하는 것에 이르게 된다 (도 1). 또한 생물학적 활성 물질은 (γ)형의 유도 물질인 것으로 판정하고 세포 자멸 조절 효과가 있으며 항산화성 특성을 가지고 자유 라디칼 스트레스에 대한 세포 내성을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 2형 헤르페스, 인플루엔자 바이러스, C형 간염 바이러스 등 특정 바이러스에 대한 항바이러스 작용이 있다
생물학적 활성 물질을 구성하는 화합물은 바이러스를 함유한 DNA와 RNA의 발달을 차단할 수 있다.
연구된 추출물은 2형 바이러스를 효과적으로 억제한다. Deschampsia cespitosa 추출물의 경우 바이러스의 특이적 작용 발당을 억제하는 최소 활성 농도는 2,0 - 3,0 lg TЦД50이다. 이 값은 전체 추출물 및 Calamagrostis epigejos 추출물에 대한 최소 활성 농도(0,034 mkg /ml)의 절반 값이다. 총 추출물은 160이다.
모든 모델 추출물은 인플루엔자 바이러스에 효과적이다. 인풀루엔자 바이러스 감염 역가는 생물학적 활성 물질의 농도가 0,0034 mkg / ml인 경우 Deschampsia cespitosa 작용 시 크게 감소한다 (3,0 lg ID50 정도). 인플루엔자 바이러스에 영향을 주는 가장 큰 선택성은 HTI=808인 총 추출물에 내재되어 있다. 연구 결과는 모델 추출물이 높은 HTI를 갖는 C형 간염 바이러스에 대한 효과적인 저해제임을 보여준다.
모든 추출물은 생물학적 활성 물질의 농도가 0,0034 mkg/ ml인 경우 4,0 - 5,0 lg ID50으로 C형 간염 바이러스를 억제한다 (C형 간염 바이러스의 시험 모델).
0,017 - 0,068 mkg / ml 항바이러스 작용을 얻기 위한 생물학적 활성 물질의 농도는 합성 물질보다 훨씬 더 낮다.
모든 추출물에는 면역 γ-인터페론을 유도하는 특성이 있다. Calamagrostis epigejos 추출물은 Poly I: Poly C 기준 인덕터의 수준에서 인터페론을 유도하고 총 추출물 및 Deschampsia cespitosa 추출물은 기준 인덕터를 유도하는 수준에서의 25%수준에 인터페론을 유도한다.
연구 결과는 생물학적 활성 물질이 세포 자멸 조절 작용을 가지고 있음을 나타낸다.
생물학적 활성 물질에 대해 실시된 시험은 과산화수소에 의해 유도된 자유 라디칼 과정의 강도를 억제하고 음이온의 슈퍼옥사이드 라디칼 생성을 억제하는 것을 확인한다.
또한 제안된 생물학적 활성 물질은 합성 항바이러스 약물에 내재된 단점이 없으므로 정확한 투여량과 대상 약물역학 작용을 갖는 의약품을 생산할 가능성을 제공한다.

Claims (4)

  1. Gramineae, Calamagrostis Adans 속 및/또는 Deshampsia Beauv 속의 녹색 부분 및 작은 이삭으로부터 추출된 약학적 작용의 생물학적 활성 물질은 플라보노이드, 트리신 플라보노이드 아글리콘, 아피제닌, 루테올린, 케르세틴, 라나진 및/ 또는 트리신, 아피제닌, 루테올린, 케르세틴, 라나진, 보조 물질 등의 플라보노이드 배당체를 포함하며 다음과 같은 조성을 갖는다:
    0,016 내지 2,062% 트리신 플라보노이드 아글리콘 및/또는 플라보노이드 글리코시드;
    0,010 내지 1,393% 아글리콘 플라보노이드 아피제닌 및/또는 그 플라보노이드 글리코시드;
    0,01 내지 4,979% 아글리콘 플라보노이드 루테올린 및/ 또는 그 플라보노이드 글리코시드;
    0,001 내지 0,771% 케르세틴 플라보노이드 아글리콘 및/ 또는 그 플라보노이드 글리코시드;
    0,104 내지 0,203% 아글리콘 플라보노이드 라나나진 및/ 또는 그 플라보노이드 글리코시드;
    99,868 내지 90,592% 보조 물질.
  2. 제1항에 있어서 생물학적 활성 물질은 탄화수소 화합물, 아미노산, 클로로필 등이 보조 물질로서 있음을 특징으로 한다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서 생물학적 활성 물질은 Calamagrostis epigeios (Calamagrostis epigeios L. Calamagrostis Adans 속) 및/또는 Deshampsia caespitosa (Deshampsia caespitosa L. Deshampsia Beanu 속)등에서 유래된다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서 생물학적 활성 물질은 플라보노이드 O-글리코시드형태의 함량(53,545 - 86,422)%이고 플라보노이드 C-글리코시그 향태의 함량(43,293 - 4,910)%이다 나머지 플라보노이드 아글리콘이다.
KR1020177032242A 2015-04-24 2015-10-28 식물 기원의 다원 행동 생물학적 활성 물질 KR102461853B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
UAA201503915 2015-04-24
UAA201503915 2015-04-24
PCT/UA2015/000101 WO2016171640A1 (ru) 2015-04-24 2015-10-28 Биологически активное вещество полифармакологического действия растительного происхождения

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170139049A true KR20170139049A (ko) 2017-12-18
KR102461853B1 KR102461853B1 (ko) 2022-10-31

Family

ID=67998792

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177032242A KR102461853B1 (ko) 2015-04-24 2015-10-28 식물 기원의 다원 행동 생물학적 활성 물질

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20180133278A1 (ko)
EP (1) EP3195872A4 (ko)
KR (1) KR102461853B1 (ko)
CN (1) CN107530390A (ko)
AU (1) AU2015391981B2 (ko)
BR (1) BR112017021292A2 (ko)
CA (1) CA2983299C (ko)
EA (1) EA033232B1 (ko)
MX (1) MX2017013696A (ko)
WO (1) WO2016171640A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8933078B2 (en) 2011-07-14 2015-01-13 Research Cancer Institute Of America Method of treating cancer with combinations of histone deacetylase inhibitors (HDAC1) substances
WO2018157081A1 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Research Cancer Institute Of America Compositions, methods, systems and/or kits for preventing and/or treating neoplasms
WO2018170457A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Research Cancer Institute Of America Compositions, methods, systems and/or kits for preventing and/or treating neoplasms
WO2021262749A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Research Cancer Institute Of America Compositions and methods for preventing and/or treating viral infection
WO2022089600A1 (zh) * 2020-10-30 2022-05-05 杭州拉林智能科技有限公司 黄酮苷-有机胺类抗微生物剂复盐化合物及其制备方法和应用
CN114796016B (zh) * 2022-05-31 2023-03-24 浙江伊瑟奇医药科技有限公司 一种私密修护精华液及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1717246A (zh) * 2002-12-26 2006-01-04 阿纳托利·马特维耶维奇·诺维克 一种提取生物活性物质的方法
JP2011518201A (ja) * 2008-04-21 2011-06-23 ヘルボニス アクチェンゲゼルシャフト 高濃度の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びケルセチングリコシドを含むソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の植物抽出物の調製及び使用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102007054985A1 (de) * 2007-11-17 2009-05-20 Gerhard Dr. Sauermann Topische Produkte zur Reduzierung der Häufigkeit von Rezidiven bei Lippenherpes

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1717246A (zh) * 2002-12-26 2006-01-04 阿纳托利·马特维耶维奇·诺维克 一种提取生物活性物质的方法
JP2011518201A (ja) * 2008-04-21 2011-06-23 ヘルボニス アクチェンゲゼルシャフト 高濃度の１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３グリコシド及びケルセチングリコシドを含むソラヌム・グラウコフィルム（Ｓｏｌａｎｕｍｇｌａｕｃｏｐｈｙｌｌｕｍ）の植物抽出物の調製及び使用

Also Published As

Publication number Publication date
CN107530390A (zh) 2018-01-02
EA033232B1 (ru) 2019-09-30
MX2017013696A (es) 2019-07-29
US20180133278A1 (en) 2018-05-17
AU2015391981A1 (en) 2017-11-30
WO2016171640A8 (ru) 2018-03-08
CA2983299A1 (en) 2016-10-27
EA201700340A1 (ru) 2017-10-31
CA2983299C (en) 2022-12-06
EP3195872A4 (en) 2018-04-11
WO2016171640A1 (ru) 2016-10-27
KR102461853B1 (ko) 2022-10-31
US20220000962A1 (en) 2022-01-06
EP3195872A1 (en) 2017-07-26
AU2015391981B2 (en) 2021-08-19
BR112017021292A2 (pt) 2018-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102461853B1 (ko) 식물 기원의 다원 행동 생물학적 활성 물질
Jolad et al. Fresh organically grown ginger (Zingiber officinale): composition and effects on LPS-induced PGE2 production
EP1299406B1 (de) Curcumin-derivate mit gegenüber curcumin verbesserter wasserlöslichkeit und diese enthaltende arzneimittel
Gobbo-Neto et al. Online identification of chlorogenic acids, sesquiterpene lactones, and flavonoids in the Brazilian arnica Lychnophora ericoides Mart.(Asteraceae) leaves by HPLC-DAD-MS and HPLC-DAD-MS/MS and a validated HPLC-DAD method for their simultaneous analysis
Zhou et al. A new dicoumarin and anticoagulant activity from Viola yedoensis Makino
Lanzotti Bioactive saponins from Allium and Aster plants
Picerno et al. Phenolic constituents and antioxidant properties of Xanthosoma violaceum leaves
Cuong et al. Anti-inflammatory activity of phenolic compounds from the whole plant of Scutellaria indica
Ak et al. Tanacetum vulgare L.(Tansy) as an effective bioresource with promising pharmacological effects from natural arsenal
Xiang et al. Four new bi-phenylethylchromones from artificial agarwood
Khatun et al. Isolation of phytochemical constituents from Stevia rebaudiana (Bert.) and evaluation of their anticancer, antimicrobial and antioxidant properties via in vitro and in silico approaches
Pacifico et al. Influence of harvest season on chemical composition and bioactivity of wild rue plant hydroalcoholic extracts
Ma et al. Flavonoids with inhibitory effects on NLRP3 inflammasome activation from Millettia velutina
Farid et al. Comprehensive phytochemical characterization of Raphanus raphanistrum L.: in vitro antioxidant and antihyperglycemic evaluation
Tai et al. A new iridoid and effect on the rat aortic vascular smooth muscle cell proliferation of isolated compounds from Buddleja officinalis
Castañeda-Gómez et al. Acylsugar diversity in the resin glycosides from Ipomoea tricolor seeds as chemosensitizers in breast cancer cells
Shimoda et al. Glycosylation of hesperetin by plant cell cultures
Molčanová et al. Antiproliferative and cytotoxic activities of C-Geranylated flavonoids from Paulownia tomentosa Steud. Fruit
Gadetskaya et al. Phytochemical characterization and biological activity of secondary metabolites from three Limonium species
Nair et al. Identification of Amaryllidaceae alkaloids in larvae of the ‘lily borer’moth Brithys crini
Burton et al. Elucidation of a new oleanane glycoside from Barringtonia asiatica
CN110960564B (zh) 一种鬼针草总黄酮的制备方法、检测方法及在糖尿病防治中的应用
Deiva et al. 2-furyl (phenyl) methanol isolated from Atractilis gummifera rhizome exhibits anti-leishmanial activity
Lee et al. Glycosylated constituents isolated from the trunk of Abies holophylla and their anti-inflammatory and neurotrophic activity
Varvouni et al. Chemical profile and biological properties of the endemic Turkish species Phyllocara aucheri

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant