CN1717246A - 一种提取生物活性物质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从植物原料中提取用于预防和治疗病状的生物活性的且特效物质的方法。在形成植物原料中使用野生禾本的(graminyceous)禾本科(Graminea family)和拂子茅属(Calamagrostis Adans)和发草属植物的绿色部分。所述禾本植物是在从开穗至穗开花结束期间采集的，把它们分别干燥到含水量为8～20％，并以如下的组成比例混合。拂子茅80～20质量％；发草20～80质量％。然后，用乙醇萃取，从植物原料中分离出液态水溶性级分，原料与乙醇的质量比为1∶1～1∶10，同时定期监视干残渣质量指标。当所述指标达到0.5～1.5％时停止萃取，用大孔过滤器经过滤除去稀级分中的固体杂质而获得最终产品。使用90～99.8％乙醇采用浸渍和/或反复浸渍的方法，在温度18～47℃下从植物原料中萃取所述液态水溶性级分。
Description
本发明涉及提取一种生物活性物质的方法，本发明是属于医学，特别是药物学领域。这种生物活性物质是从植物原料中分离出来的，保持了其中所含的多种黄酮类化合物和氨基酸的混合物，生物活性物质可用来制备针对治疗和预防病状主要是治疗胞疹病毒引起的传染病，综合治疗乙肝和丙肝以及治疗免疫缺陷病人的特效药品。
已知的一种提取抗肿瘤活性的生物活性物质的方法，在该方法中作为植物原料使用了海桐花科主要是海桐花属植物嫩芽，该方法在于通过把嫩芽浸渍在有机溶剂中，把所得的溶液与其它溶剂摇混，再用一有机溶液处理每一个相，分离和收集分离出来的组分，而且，在此过程的每一阶段前把它们干燥和纯化，用乙醇作为有机溶剂。在提取过程中植物原料与萃取剂的比例为1∶10～10∶1。处理的时间为5分钟到3个月，处理温度为5至100℃(参阅乌克兰专利No.26321кл.MПK A61 K 35/78，1999)。
与其它药品相比，用上述方法所得的源于植物的生物活性物质，具有相当高的活性和低的毒性，但是，上述的方法由于有多道操作工序且需使用专门的试剂，所以很复杂，耗材且费力。
已知一种提取预防和治疗病状的生物活性物质的方法(参阅国际申请报告WO 91/11191，кл.MПK A61 K 35/78，1991)，在该方法中以禾本科禾本植物嫩芽作为植物原料，它们是在生长阶段采集的。该方法包括从原料中分离出浆汁形式的水溶和油溶的液体部分，通过离心除去其中的固体杂质，然后经高质量的精细过滤分离掉离心留下的小颗粒。从植物原料中提取浆汁主要是采取压榨、碾压或破碎植物的方法实现的。经喷雾(升华)干燥浓缩或采用专门的防腐稳定剂来稳定所得的生物活性物质，而且，建议生物活性物质的稳定要在把它们萃取出后2小时内进行。
该方法的缺点也是工艺过程的复杂性，由于采用了诸如离心、破碎、压榨等耗能设备，使用了专门的试剂以及实施2个阶段——离心和精细过滤纯化萃取物操作工序，所以该工艺过程包括了几个费力、耗材料和耗能的操作。此外，工艺过程持续时间长也是该方法的缺点。
除此之外，为了提取生物活性物质，植物原料要使用宝贵的谷类作物，其中包括小麦，黑麦、燕麦、稻米和其它类似的禾本植物，这在经济方面是不合算的。在乌克兰有334种(98属)禾本植物，而上述方法中均未具体提到利用野生禾本科草本植物的可能性。
用上述方法所得的生物活性物质不可以单独作为治疗病状的药品使用，要求与药理上合适的液体载体混合使用。此外，该生物活性物质抗肿瘤的特效活性不够强，抗病毒的活性不很高。
就整个情况看，与本发明最接近是一种为预防和治疗病状提取生物活性物质的方法(乌克兰专利No.22549A，кл.MПK A61 K 35/78，1997)，按照此方法，作为植物原料使用拂子茅属(Calamagrostis Adans)和发草属植物混合物形式的禾木科(Graminea family)禾本植物绿色部分，它们是在抽穗后开花前采集的，该方法包括分别干燥这些植物到含水量为8～20％，按质量比：拂子茅40～60％和发草60～40％，把它们混合，在温度18～47℃时采用浸渍方法，用92～99.8％的乙醇，在原料与乙醇的质量比为1∶3～1∶8时从原料中经萃取提取出水溶性的液体部分，并同时定期检测萃取液折光率，在折光率达到1.362～1.364时，用大孔过滤器过滤去水溶性液体部分中的固体杂质，达到纯化目的，获得最终产品。
与前面所述的现有技术相比，这个提取生物活性物质的方法比较简单，因为不采用从植物原料中压榨出浆汁，经离心和高效过滤进行纯化以及稳定萃取液等一系列费力和耗能的操作工序。
但是，该方法规定所取拂子茅属和发草属野生禾本植物的混合物组成的比例范围非常狭小，这样就不能得到广谱特效作用的生物活性物质。所以，以这种生物活性物质为基础制备的药品，只具有有限的治疗性能。此外，采集以上的植物也是在它们成长的狭小的阶段：抽穗后和穗开花前，这就会减少原料中萃取物的数量。所有这一切降低了一个季节中上述原料来源的使用程度。
在萃取出水溶性部分的过程中还必须测定萃取物的折光率，也是该已知方法的缺点，因为这使工艺过程更复杂，耗能更多，此外，还必须要有分析仪器——折光仪。
本发明的目的是提出一个提取有高特效活性和低毒性的稳定的生物活性物质的简易和有效的方法，其途径是：为了分离出生物活性物质，扩大拂子茅属和发草属禾本科野生禾本的(graminyceous)植物混合物中组成的比例范围；延长它们的采集期限；通过取消复杂的测定折光率的操作工序而采用测定干的萃取物残渣的简单工序来简化提取生物活性物质的工艺过程。
本发明不仅可以扩大生物活性物质的已知植物原料来源的使用范围，而且产生其组分保证对人机体有广谱选择性特效药理作用的生物活性物质，从而相应地保证其在低毒性时有高的治疗效果。
本发明通过如下方法实施：在从植物原料中提取对预防和治疗病状有特效作用的生物活性物质方法中，原料使用为拂子茅属和发草属禾本科野生禾本植物的绿色部分，它们是在其成长阶段采集的。该方法包括分别干燥这些植物到含水量为8～20％，把它们混合得到原料，用乙醇萃取从该原料中分离出水溶性的液体部分，经过滤除去其中的固体杂质而纯化，得到最终产品。按照本发明，野生禾本植物是在抽穗后和穗开花结束前收集。在原料与乙醇的质量比为1∶1～1∶10时从原料中分离出水溶性液体部分，并同时定期监控干燥残渣的质量指标，在其达到0.5～1.5％值时进行纯化，而且，以如下的组成比例(质量，％)混合野生植物：
拂子茅 80～20
发草 20～80
在温度为18～47℃时采用浸渍和/或重复浸渍的方法用乙醇从植物原料中萃取出液体部分。而且，为了提高从禾本科草本植物混合物中分离萃取物的效率，使用90～99.8％的乙醇。
本发明的实质在于使用了上面组成比例的拂子茅属和发草属禾木科禾木植物混合物后，提高了所得萃取物的含量，同时扩大了对人机体有选择性特效药理作用的范围。
此外，拂子茅属和发草属植物采集期，对本发明中所提取的生物活性物质成分的质量和数量有重要的影响。因为在本发明中所指的具体生长期间——抽穗后和穗开花结束前，这些植物的绿色部分含有最大数量的、具有最大选择性特效活性的黄酮类化合物。此外，植物混合物的组成比例也直接影响萃取液中萃取物的含量，进而表现在生物活性物质作用的特效性上。而且混合物中禾木科草本植物的含量与它们采集时的气候条件和季节有直接的关系。
本发明除了选择混合物中具体的植物组成比例的参数外，研究制定实施工艺过程、工序条件也很重要。
按照本发明如下提取生物活性物质：
在上述禾本科植物具体的生长期间，采集它们的地上部分，分别干燥采集的植物到它们的含水量为8～20％，以如下的组成比例(质量，％)取经干燥的禾本植物的混合物：
拂子茅 80～20
发草 20～80
之后，把所得的植物混合物放入一容器中，在原料与乙醇的质量比1∶1～1∶10范围内，加入90～99.8％的乙醇。在原料被乙醇浸湿后，密封好容器以防止空气进入。在一个暗色的容器内在温度18～47℃下用浸渍和/或重复浸渍的方法进行萃取，并同时定期监控萃取液干残渣的质量指标。如果它等于0.5～1.5％，停止水溶性部分的萃取。分离出的萃取液经大孔玻璃过滤器倒入容器保存。所得到生物活性物质是高稳定的材料，适合于用作药品或是制备药品的元素。
以上指出的干燥原料所达到的植物含水量范围是最佳的，因为把植物干燥到含水量低于8％，会损失掉结合水，从而破坏了有效的萃取物，而将植物原料干燥到含水量高于20％，则导致萃取液中游离水含量超过稀释植物中萃取物所需的游离水的数量，这样会减少萃取液中活性物的含量。
原料与萃取剂的质量比1∶1～1∶10也是最佳的，因为所指组分的比例超过1∶1时，即在按质量萃取剂含量小于原料时，萃取液中萃取物的数量将会大于1.5％，这表示萃取剂发生凝结，药品对治病无效。如果原料与萃取剂的质量比例小于1∶10，即萃取剂质量超过原料质量10倍，干残渣将小于0.5％，这也会降低药效
测定萃取液干残渣质量指标是为了确定用有机溶剂萃取植物原料过程的终点。选定的这个指标的范围0.5～1.5％能及时使萃取过程停止，以得到高效的最终产品。而且，在干残渣质量指标低于0.5％时，在抑止剂作用下慢化下来的生物活性物质的活性将低于世界上对淘汰药品通用的推荐值，即低于2个传染剂量对数，因此药品将没有效。如果萃取液干残渣质量指标大于1.5％，则在所得的生物活性物质内产生沉淀，这表示生物活性物质作为药品也是无效的。
因此，只有原料与乙醇的质量比在1∶1～1∶10范围及干残渣质量指标在0.5～1.5％范围时，所得到生物活性物质是高效且有特效作用的药品。
上面指出的乙醇萃取液的浸渍和/或重复浸渍的温度范围能使生物活性物质从植物中萃取出来的过程进行得最完全，因为在温度低于18℃时，降低了目标产物产率百分数，而在温度高于47℃时，萃取物经植物氨基酸凝结而分解。
为了保证最大限度地从拂子茅属和发草属的干燥植物中提取出萃取物，十分重要的是用90～99.8％乙醇进行萃取，因为在乙醇浓度低于90％时，从植物中提取活性物的完全程序大大降低，而在乙醇浓度高于99.8％时，目标产物的产率不见提高，因此消耗掉过量乙醇。
在本发明中，制备了5个组分的植物混合物，组分之间的差别在于组成的含量(最小，最佳，最大和2个超限值)，示于表1。
表1
| 成分实例 | 拂子茅属植物，质量％ | 发草属植物，质量％ |
| 1 | 80 | 20 |
| 2 | 50 | 50 |
| 3 | 20 | 80 |
| 4 | 90 | 10 |
| 5 | 10 | 90 |
下面给出提取生物活性物质的具体实施例。
实施例1
以如下的数量取干燥到含水量达14％的未粉碎的植物原料：生草层的发草800克(80％)和地面上的拂子茅200克(20％)，把它们放入一个浸渍罐中，注入加热到萃取温度30℃的96％的精确乙醇，数量1282±2ml，而且原料与萃取剂(乙醇)的质量比在该实施例中为1∶1。在原料被完全润湿后，密封住浸渍罐，保持在温度30℃以下。通过浸渍和/或反复浸渍进行萃取，同时定期监视干残渣质量指标。当干残渣质量指标达到0.5～1.5％值时，停止浸渍过程。把这样制好的萃取液经大孔玻璃过滤器倒入暗色的玻璃器皿中，在温度15～40℃下保存。
生物活性物质目标产物的产率为原料质量的85％。实施例2，3，4，5也按照实施例1所述的方法制得生物活性物质，但植物组成含量和工艺规范在另外的参数下进行，这些参数列于表2。
表2
| 工艺规范参数 | 植物混合物组分实例 | ||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| 原料与萃取剂比例 | 1∶1 | 1∶5 | 1∶10 | 1∶0.7 | 1∶12 |
| 原料的含水量，％ | 14 | 20 | 8 | 25 | 6 |
| 乙醇的含量，％体积 | 96 | 99.8 | 90 | 87 | 99.8 |
| 浸渍温度，℃ | 30 | 18 | 47 | 10 | 56 |
| 干残渣质量，％ | 0.5～1.5 | 0.5～1.5 | 0.5～1.5 | 0.5～1.5 | 0.5～1.5 |
在实验室条件下，对按实施例1～5在以上提取方法工艺规范下从植物原料混合物中分离出的生物活性物质进行了研究。而且，对所得的生物活性物质在临床试验前范围内作为药品进行了研究。
用疱疹病毒脑膜炎脑炎模型在非良种白鼠体内研究了抗疱疹活性。传染前和3昼夜内的每天(预防式)及在被疱疹病毒传染后24小时(治疗式)口服0.25生物活性物质。生物活性物质加入剂量为0.068mg/kg。通过在研究组和对比组内比较生物活性物质致死指标，评价生物活性物质的活性。同时，考虑了白鼠致死百分数，防护倍数(КЗ)和效率指数(ИЭ)
防护倍数(КЗ)-与对比组相比在研究组内死亡白鼠减少的倍数。
研究结果列于表3。
表3
| 植物混合物组分实例 | 生物活性物质加入式 | |||||
| 预防 | 治疗 | |||||
| 致死％ | КЗ | ИЭ | 致死％ | КЗ | ИЭ | |
| 1 | 40 | 2.5 | 60.0 | 30 | 1.43 | 30.0 |
| 2 | 50 | 2.0 | 50.0 | 30 | 1.43 | 30.0 |
| 3 | 42 | 2.0 | 50.0 | 34 | 2.20 | 54.5 |
| 4 | 90 | 1.12 | 10.7 | 87 | 1.15 | 13.0 |
| 5 | 80 | 1.25 | 20.0 | 92 | 1.09 | 8.3 |
从表3可见，按照实施例1～3，依本发明从组分植物混合物中提取出的生物活性物质具有明显的预防作用和有效的治疗作用，因为等于30.0及更高的效率指数在脑膜炎脑炎模型上是体内抗疱疹活性的指标。按照实施例4～5，依本发明从植物混合物中提取出的生物活性物质萃取物有差的预防作用和弱的治疗作用。
除了适合于治疗疱疹外，生物活性物质也可用来综合治疗乙肝和丙肝，治疗有免疫缺陷的病人，即它具有有效的抗病毒的作用。此外，生物活性物质可以用来制备抗肿瘤作用的药品。
根据本发明提取出的生物活性物质——是有苦味和特性气体的绿色液体，在与相同体积的水混合时，沉降绿色絮状沉淀。按照药典方法(2001年2月14日No.P.02.01/02777注册证书的药典条款CPC)测定了生物活性物质的组分。用光谱方法测定了黄酮类化合物的数量，生物活性物质与氯化铝络化物溶液吸收光谱示于图1。
按照本发明提取的生物活性物质使用安全性的评价是按俄国标ΓOCT12.1.007-76要求进行的。
上面生物活性物质毒性研究结果表明，小鼠LD50(致死剂量50)值为9453.3～10315.8，大鼠的LD50为8107.0～8865.9mg/kg。根据现有技术中给出的数据，可作出如下的结论：用这方法所得的活性物质毒性指标LD50等于350mg/kg(小鼠)和300mg/kg(大鼠)。由此可得出，对小鼠和大鼠而言，按照本发明所得到的生物活性物质毒性指标几乎是超过按现有技术所得的生物活性物质毒性指标的30倍。
因此，所进行的药理研究证实，与现有技术相比，本发明中获得生物活性物质的方法能在不高的毒性指标下达到对人机体有高效选择性的特效药理作用。
按照乌克兰国家药典方法(第1版，哈尔科夫，2001年)采用物理—化学分析方法：与注册证书2001年2月14日P02.01/02777的药典条款一致的光谱和薄层色谱方法，测定了表征生物活性物质效能的特征。
根据本发明所得的生物活性物质的液体萃取物的可见和紫外吸收光谱示于图2，3。
在氯仿-丙酮溶剂系统中(20∶1)生物活性物质溶液的薄层色谱，在所得色谱图上产生3个斑点。
同时，在同样的条件下色谱分离了试样物溶液-叶绿酸溶液标准样(图4)。
按照以上的药典条款，在测定生物活性物质效能的同时，研究了生物活性物质时间稳定性。为此，在36个月过程中每6个月时间间隔试验了5批产品。通过说明生物活性物质的目测性质和用上面提到的物理-化学分析方法研究其物理-化学参数，评价了生物活性物质的效能和稳定性。
研究结果证实了本发明所得的生物活性物质随时间的效能和稳定性，由于在36个月过程中所有5批产品的生物活性物质的说明性和主要的物理-化学性质符合药典条款方法中的说明的，即在36个月过程中生物活性物质未失去自己的特效活性。
本发明中提取生物活性物质的方法可以无任何限制地用在工业中制备药品，它已批准用在顿涅茨区阿尔条莫夫斯克城OAO(股份公司)“Фитофарм”设备上。
在实施所有的工艺操作工序下，本发明中提取生物活性物质的新方法保证可获得如下肯定的结果：
—通过把使用折光仪测量折光率复杂工序更换成称重干残渣测量质量指标的简单工序简化工艺过程；
—扩大具体属禾木科野生草本植物采集期范围，从而提高了提取生物活性物质用的一个季节植物原料的使用程度。
—扩大现有技术中原料与乙醇比例范围1∶3～1∶8到本发明中的1∶1～1∶10，由于提高了萃取物的数量(达1.5％)，从而保证获得高效的生物活性物质；
—由于取消了使用昂贵分析仪-折光仪测量萃取液折光率，保证了得到生物活性物质过程能耗降低，因而降低了成本。
本发明有如下的积极结果：
·提出为获得生物活性物质使用广大组成比范围内的具体属的禾木科野生禾本植物混合物，从而扩大了获取生物活性物质的原料来源，而且这些禾本型草本植物的原料来源足以保证工业化生产生物活性物质以及以它为基础的药品；
·保证获得具有高选择性抗病毒活性、与该用途其它生物活性物质相比具有更加低毒性的特效生物活性物质；
·扩大了适合于制备治疗病状首先是治疗普通疱疹病毒、1型和2型疱疹病毒引起的病毒性传染病以及综合治疗乙肝和丙肝和治疗有免疫缺陷病人的新药品的生物活性物质的品种。
Claims (3)
1.一种从植物原料中提取预防和治疗病状用的特效生物活性物质的方法，在该方法中作为植物原料使用拂子茅属和发草属植物混合物形式的禾本科野生禾本植物的绿色部分，这些绿色部分是在其成长阶段采集的，该方法包括分别干燥这些植物到含水量为8～20％，随后把它们混合得到原料，通过用乙醇萃取从该原料中分离出水溶性的液体部分，经过滤除去其中的固体杂质，得到最终产品，其特征在于，野生禾本植物是在抽穗后和穗开花结束前期间采集的，用乙醇从植物原料中萃取出液体部分是在原料与乙醇的质量比为1∶1～1∶10时进行的，并同时定期监视干残渣的质量指标，当它达到0.5～1.5％值时，纯化萃取液，而且植物是以如下的组成比(质量，％)混合的：
拂子茅 80～20
发草 20～80
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在温度18～47℃时用浸渍和/或重复浸渍方法从植物原料中萃取出水溶性液体部分。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用90～99.8％乙醇从植物原料中萃取出水溶性液体部分。
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