CN110960564B - 一种鬼针草总黄酮的制备方法、检测方法及在糖尿病防治中的应用 - Google Patents

一种鬼针草总黄酮的制备方法、检测方法及在糖尿病防治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种鬼针草总黄酮的制备方法，包括：S1)将鬼针草与乙醇水溶液混合，加热回流进行提取，得到鬼针草总黄酮提取液；S2)将所述鬼针草总黄酮提取液的pH值调节至弱酸性，然后采用AB‑8大孔吸附树脂进行纯化，得到鬼针草总黄酮提取物。与现有技术相比，本发明将鬼针草用乙醇提取后，通过AB‑8大孔吸附树脂进行纯化，使得到的鬼针草总黄酮提取物的纯度可达50％以上，为鬼针草的充分开发及应用提供了科学的依据，且该方法简单、稳定、可行，制备过程中仅使用乙醇，不引入其他有机溶剂，适于工业化生产，具有很好的应用前景。

Description

一种鬼针草总黄酮的制备方法、检测方法及在糖尿病防治中 的应用
技术领域
本发明属于中药提取技术领域，尤其涉及一种鬼针草总黄酮的制备方法、检测方法及在糖尿病防治中的应用。
背景技术
鬼针草始载于《本草拾遗》，属于菊科(Asteraceae)、鬼针属(Bidens L.)植物，其味苦无毒，具有清热解毒、活血散瘀、消炎消肿的功效，也可用于治疗痢疾、感冒、腹泻、炎症等。鬼针草含有多种具有生物活性的化学成分，主要包括黄酮类、挥发油类、酚酸类、有机酸类及甾体类环合物等。
现代药理作用研究表明，鬼针草提取物具有抗氧化、抗炎、抗菌、肝保护作用及降血糖作用；鬼针草乙醇提取物的乙酸乙酯和正丁醇萃取物能够降低正常小鼠的
Figure BDA0002326258930000011
其中乙酸乙酯提取物具有降低四氧嘧啶高血糖小鼠血糖的作用。有研究也发现，鬼针草总黄酮对糖尿病小鼠具有降血糖作用，其作用机制为通过调控PI3K/AKT/GLUT4信号通路中转录因子的基因和蛋白的表达，从而改善细胞胰岛素抵抗(黄桂红,刘天旭,朱钊铭,等.鬼针草黄酮对HepG2胰岛素抵抗细胞PI3K/AKT1/GLUT4信号通路的调控作用[J].实用医学杂志,2016,32(24):3994-3998)。
也有专利和相关文献对鬼针草总黄酮的纯化方法进行了研究。如中国专利(公开号：CN101185665A)公开了一种鬼针草总黄酮的制备方法，采用乙醇回流，以有机溶剂萃取脱脂后，用与水不互溶的中等极性有机溶剂萃取，最后用树脂进行总黄酮的纯化；有文献研究报道了运用HPD-100型大孔吸附树脂纯化鬼针草叶总黄酮的工艺，结果显示总黄酮纯度较高，达到62.86％(张世明，姜艳玲，周洪雷，等.响应面法优化鬼针草叶总黄酮大孔树脂纯化工艺.辽宁中医药大学学报.2017,19(2):39-43.)；同时还有文献报道分别采用D-101和HPD-100型大孔树脂进行鬼针草总黄酮的分离纯化，结果显示纯化后干浸膏中总黄酮的纯度分别为22.36％和23.54％，但纯化后总黄酮的纯度较低，杂质含量高(邓亚宁，谢蓉蓉，杜瑞杰，等.大孔吸附树脂分离纯化鬼针草总黄酮的研究.中国药物与临床.2008,8(2):143-144.钟明媚,陈飞虎,袁丽萍,等.大孔吸附树脂纯化鬼针草总黄酮的工艺研究.安徽医科大学学报,2007,42(4):424-427.)；还有文献报道采用大孔树脂分离纯化鬼针草总黄酮，在纯化工艺中分别进行石油醚脱脂及不同浓度的乙醇洗脱，虽提高了总黄酮浓度，但不可避免的引入了有机溶剂及提高了洗脱剂的用量(瞿慧,曹园,方祝元,等.大孔吸附树脂纯化鬼针草总黄酮的工艺优选.中国医药指南,2013(34):67-69.魏英勤,马毅,王云云.大孔吸附树脂分离纯化鬼针草总黄酮的研究.时珍国医国药,2006,17(11):2257-2258.)。
并且目前鬼针草总黄酮提取物中的成分并不明确，限制了其充分开发。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种鬼针草总黄酮的制备方法、检测方法及在糖尿病预防和治疗方面的应用，该制备方法得到的鬼针草总黄酮纯度高且并不引入其他有机溶剂。
本发明提供了一种鬼针草总黄酮的制备方法，包括：
S1)将鬼针草与乙醇水溶液混合，加热回流进行提取，得到鬼针草总黄酮提取液；
S2)将所述鬼针草总黄酮提取液的pH值调节至弱酸性，然后采用AB-8大孔吸附树脂进行纯化，得到鬼针草总黄酮提取物。
优选的，所述乙醇水溶液中乙醇的体积浓度为75％～85％；所述鬼针草与乙醇水溶液的质量体积比为1g：(10～15)ml；所述加热回流进行提取的次数2～4次；每次提取的时间为1.5～2.5h。
优选的，所述步骤S2)中将所述鬼针草总黄酮提取液的pH值调节至4～6；所述AB-8大孔吸附树脂用乙醇浸泡后，用水洗涤，然后再纯化鬼针草总黄酮提取液。
优选的，所述采用AB-8大孔吸附树脂进行纯化时先用蒸馏水洗脱至无色，然后再用体积浓度为75％～85％的乙醇溶液为洗脱剂进行洗脱。
优选的，所述鬼针草总黄酮提取液采用大孔吸附树脂进行纯化的上样量与洗脱剂的体积为1：3～5；所述洗脱剂的洗脱速度为1～3BV/h。
本发明还提供了一种鬼针草总黄酮的检测方法，包括：
将上述所制备的鬼针草总黄酮提取物利用超高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用仪进行检测，得到鬼针草总黄酮提取物的高效液相色谱图与质谱数据。
优选的，所述高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用仪采用Agilent1200系列超高效液相色谱系统，二级管阵列检测器进行分析。
优选的，所述高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用仪检测中采用SymmetryC18为色谱柱；以0.1％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；采用梯度洗脱的洗脱方式；以体积百分数计，所述梯度洗脱程序为0～25min，15％～40％流动相B；25～35min，20％～50％流动相B；35～50min，55％～80％流动相B；检测波长为254nm。
优选的，所述高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用仪的离子源为电喷雾离子化源，负离子模式，质量扫描范围为100～2000m/z；毛细管电压为4000V；破碎器电压130V；锥孔电压65V；干燥气体流量11L/min；雾化器温度300℃；喷雾压力30psig；MS/MS碰撞能量为10～50V。
本发明还提供了上述鬼针草总黄酮提取物在制备抗糖尿病药物中的应用。
本发明提供了一种鬼针草总黄酮的制备方法，包括：S1)将鬼针草与乙醇水溶液混合，加热回流进行提取，得到鬼针草总黄酮提取液；S2)将所述鬼针草总黄酮提取液的pH值调节至弱酸性，然后采用AB-8大孔吸附树脂进行纯化，得到鬼针草总黄酮提取物。与现有技术相比，本发明将鬼针草用乙醇提取后，通过AB-8大孔吸附树脂进行纯化，使得到的鬼针草总黄酮提取物的纯度可达50％以上，为鬼针草的充分开发及应用提供了科学的依据，且该方法简单、稳定、可行，制备过程中仅使用乙醇，不引入其他有机溶剂，适于工业化生产，具有很好的应用前景。
进一步地，本发明利用超高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用仪对鬼针草总黄酮提取物中的黄酮类成分进行鉴定，能够阐明鬼针草总黄酮的化学成分；结合含量测定方法，说明黄酮类成分是制备所得提取物的主要成分。
进一步地，本发明制备的鬼针草总黄酮提取物对H2O2诱导的胰岛β细胞凋亡具有明显的保护作用，说明鬼针草总黄酮具有抗糖尿病的作用，在糖尿病的预防及治疗方面具有重要意义。
附图说明
图1为本发明实施例1中得到的鬼针草总黄酮提取物的液相色谱图；
图2为混合标准品的液相色谱图；
图3为本发明实施例1中得到的鬼针草总黄酮提取物对H2O2诱导的INS-1细胞活性的影响柱形图；
图4为本发明实施例1中得到的鬼针草总黄酮提取物对H2O2诱导的INS-1细胞ROS生成量的影响柱形图；
图5为本发明实施例1中得到的鬼针草总黄酮提取物对H2O2诱导的INS-1细胞凋亡的保护作用图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了一种鬼针草总黄酮的制备方法，包括：S1)将鬼针草与乙醇水溶液混合，加热回流进行提取，得到鬼针草总黄酮提取液；S2)将所述鬼针草总黄酮提取液的pH值调节至弱酸性，然后采用AB-8大孔吸附树脂进行纯化，得到鬼针草总黄酮提取物。
其中，本发明对所有原料的来源并没有特殊的限制，为市售即可。
将鬼针草与乙醇水溶液混合；所述鬼针草优选进行干燥后切成小段，然后再与乙醇水溶液混合；所述干燥的温度优选为45℃～60℃，更优选为50℃～55℃；干燥后优选切成0.1～1厘米，更优选为0.5厘米的小段；所述乙醇水溶液中乙醇的体积浓度优选为75％～85％，更优选为80％；所述鬼针草与乙醇水溶液的质量比优选为1：(10～15)，更优选为1：(11～14)，再优选为1：(12～13)，最优选为1：12。
混合后，加热回流进行提取；所述加热回流进行提取的次数优选为2～4次，更优选为3次；每次提取的时间优选为1.5～2.5h，更优选为1.8～2.2h，再优选为2h；提取后，优选过滤，合并滤液，减压浓缩后定容，得到鬼针草总黄酮提取液；所述定容优选为定容后的体积与原料的质量比为(2～5)ml：1g，更优选为(3～4)ml：1g，再优选为(3～3.5)ml：1g。
将所述鬼针草总黄酮提取液的pH值调节至弱酸性，优选调节至4～6，更优选调节至4.5～5.5，再优选调节至5；在本发明中优选采用稀盐酸调节鬼针草总黄酮提取液的pH值。
然后采用AB-8大孔吸附树脂进行纯化；所述AB-8大孔吸附树脂优选乙醇浸泡后，用水洗涤，然后再纯化鬼针草总黄酮提取液；所述乙醇优选为95％乙醇；所述浸泡的时间优选为20～30h，更优选为22～28h，再优选为24～26h；通过浸泡可除去树脂中的杂质；浸泡后在使用前优选还用乙醇清洗树脂，然后用水洗涤；所述水优选为蒸馏水；洗涤优选至无醇味后，装柱；将调节pH值后的鬼针草总黄酮提取液上样至AB-8大孔吸附树脂后，优选用蒸馏水洗脱至无色，然后再用洗脱剂进行洗脱；所述上样量优选为每克AB-8大孔吸附树脂20ml鬼针草总黄酮提取液；所述洗脱剂优选为体积浓度为75％～85％的乙醇溶液；在本发明提供的一些实施例中，所述洗脱剂优选为体积浓度为75％的乙醇溶液；在本发明提供的另一些实施例中，所述洗脱剂优选为体积浓度为85％的乙醇溶液；所述上样量与洗脱剂的体积比优选为1：(3～5)，更优选为1：(4～5)；所述洗脱剂的洗脱速度优选为1～3BV/h，更优选为2～3BV/h。
纯化后，收集乙醇洗脱液，优选回收乙醇，浓缩，干燥后，得到鬼针草总黄酮提取物。
本发明将鬼针草用乙醇提取后，通过AB-8大孔吸附树脂进行纯化，使得到的鬼针草总黄酮提取物的纯度可达50％以上，为鬼针草的充分开发及应用提供了科学的依据，且该方法简单、稳定、可行，制备过程中仅使用乙醇，不引入其他有机溶剂，适于工业化生产，具有很好的应用前景。
本发明通过紫外分光光度法测定鬼针草总黄酮提取物中总黄酮的含量，优选以芦丁为标准对照品绘制标准曲线。
所述标准曲线的绘制优选具体为：取不同体积的芦丁标准品置于10ml容量瓶中，然后加入5％亚硝酸亚溶液0.8ml，摇匀，优选放置5～6min后，加入10％硝酸铝溶液0.8ml，摇匀，优选放置5～6min后，加入4％氢氧化钠溶液0.8ml，摇匀，再用80％乙醇定容，优选放置15min，得到标准测量样品；以80％乙醇为空白对照，将标准测量样品采用紫外分光光度法测定其吸光度A，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；所述芦丁标准品的浓度优选为0.16g/ml；不同体积优选0～3ml，步长值优选为0.3～0.6ml，更优选为0.4～0.6ml，再优选为0.5ml；在本发明中最优选分别为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0ml；所述紫外分光光度法的测量波长优选为512nm。
将鬼针草总黄酮提取物按照标准曲线的绘制中同样的方法进行测量，得到其吸光度，对照标准曲线，得到鬼针草总黄酮提取物中总黄酮的含量。
本发明还提供了一种鬼针草总黄酮的检测方法，包括：将上述方法制备的鬼针草总黄酮提取物利用超高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用进行检测，得到鬼针草总黄酮提取物的高效液相色谱图与质谱数据。
所述超高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用优选采用Agilent1200系列超高效液相色谱系统，二级管阵列检测器进行分析。
所述高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用优选采用Symmetry C18色谱柱；所述色谱柱的尺寸优选为250×4.6nm，5μm；所述高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用检测中优选以0.1％甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；采用梯度洗脱的洗脱方式；以体积百分数计，所述梯度洗脱程序为0～25min，15％～40％流动相B；25～35min，20％～50％流动相B；35～50min，55％～80％流动相B；所述高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用的检测波长优选为254nm。
所述高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用检测中的质谱条件：离子源优选为电喷雾离子化源；负离子模式，质量扫描范围优选为100～2000m/z；毛细管电压优选为4000V；破碎器电压优选为130V；锥孔电压优选为65V；干燥气体流量优选为11L/min；雾化器温度优选为300℃；喷雾压力优选为30psig；MS/MS碰撞能量优选为为10～50V。
根据上述检测条件，得到鬼针草总黄酮提取物的高效液相色谱图与质谱数据；在本发明中采集的数据优选由安捷伦MassHunter工作站软件(B.04.00版)记录和处理。
根据采集的数据可鉴定出鬼针草总黄酮提取物中的黄酮类化合物。
本发明利用超高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用法对鬼针草总黄酮提取物中的黄酮类进行鉴定，能够阐明鬼针草总黄酮的化学成分；结合含量测定方法，说明黄酮类成分是制备所得提取物的主要成分。
本发明还提供了上述方法制备的鬼针草总黄酮提取物在制备抗糖尿病药物中的应用；所述鬼针草总黄酮提取物通过保护H2O2诱导的INS-1胰岛β细胞氧化损伤从而具有抗糖尿病作用，更优选通过抑制细胞内活性氧的产生并抑制细胞凋亡从而对H2O2诱导的INS-1胰岛β细胞氧化损伤具有保护作用。
本发明制备的鬼针草总黄酮提取物对H2O2诱导的胰岛β细胞凋亡具有明显的保护作用，说明鬼针草总黄酮具有抗糖尿病的作用，在糖尿病的预防及治疗方面具有重要意义
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种鬼针草总黄酮的制备方法、检测方法及在糖尿病防治中的应用进行详细描述。
以下实施例中所用的试剂均为市售。
实施例1
1.1取鬼针草药材于50℃干燥后，切制成0.5cm小段，称取80g药材，加入12倍体积浓度为80％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩后定容至250mL，得鬼针草总黄酮提取液。
1.2采用AB-8大孔吸附树脂进行鬼针草总黄酮的纯化：用95％乙醇浸泡大孔树脂24小时，去除杂质。使用前，先用乙醇清洗树脂，然后用蒸馏水冲洗，至无醇味，装柱。取20mL1.1中得到的鬼针草总黄酮提取液用稀盐酸调节pH为5.0，上样，用蒸馏水洗脱至无色，然后用75％乙醇进行洗脱，洗脱剂用量为100mL，洗脱速度为3BV/h。收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得鬼针草总黄酮提取物。
1.3实施例1中得到的鬼针草总黄酮提取的含量测定方法：
仪器与试剂
仪器：紫外-可见分光光度仪
试剂：芦丁对照品，甲醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠
溶液制备
1.3.1对照品溶液的制备：取芦丁对照品适量，精密称定，加甲醇制备成每1mL含0.16mg的标准品溶液；
1.3.2测试样品溶液的制备：精密称取实施例1中得到的鬼针草总黄酮提取物2.0mg，加甲醇溶解，定容至5mL。制备得鬼针草总黄酮样品溶液。
1.3.3标准曲线的绘制：精密吸取芦丁标准品0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，置于10mL容量瓶中，加入5％亚硝酸钠溶液0.8mL，摇匀，放置6分钟，加入10％硝酸铝溶液0.8mL，摇匀，放置6分钟，加入4％氢氧化钠溶液0.8mL，摇匀，用80％乙醇定容，放置15分钟。平行三组，以80％乙醇为空白对照，按照紫外分光光度法于512nm波长处测量样品溶液的吸光度A。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为：A＝7.5313C+0.0035，R2＝0.9998，其中：A代表吸光度，c为黄酮质量浓度(mg/mL)。
1.3.4样品测定法：精密吸取1.3.2中制备的样品溶液1mL，照标准曲线的绘制项下的方法，自“加入5％亚硝酸钠溶液0.8mL”起，依法测定吸光度，代入回归方程，计算总黄酮浓度，即得。
经测定，计算实施例1提取物中总黄酮含量，鬼针草总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算总黄酮含量为50.20％。
1.4采用超高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用(UHPLC-Q-TOF-MS)技术对实施例1中得到的鬼针草总黄酮提取物中化学成分进行鉴定
分析条件：采用Agilent 1200系列超高效液相色谱(UHPLC)系统，二极管阵列检测器(DAD)进行分析。色谱柱：Symmetry C18(250×4.6nm，5μm)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)，乙腈(B)，梯度洗脱：0～25min,15～40％B；25～35min,40～50％B；35～50min,55～80％B,流速0.8mL/min，柱温25℃，进样量10μL，检测波长254nm。
质谱条件：离子源为电喷雾离子化源(ESI)，负离子模式；质量扫描范围m/z 100～2000；毛细管电压：4000V，破碎器电压130V，锥孔电压65V，干燥气体流量11L/min,雾化器温度300℃，喷雾压力30psig,MS/MS碰撞能量为10～50V，数据由安捷伦MassHunter工作站软件(B.04.00版)记录和处理。
黄酮类化合物鉴定结果：
采用UHPLC-ESI-Q/TOF MS/MS法对实施例1中得到的鬼针草总黄酮提取物中的黄酮类化合物进行鉴定。实施例1中得到的鬼针草总黄酮提取物的HPLC色谱图如图1所示。保留时间、计算质量、检测质量、分子式、质量误差、MS/MS片段见表1。通过与标准品的保留时间和碎片离子的比较，并对碎片离子进行分析，共检测到18个主峰，成功鉴定出14个化合物，其中黄酮类化合物12个，如表1所示。
表1 UHPLC-Q/TOF-MS鉴定鬼针草总黄酮中黄酮类化合物
Figure BDA0002326258930000091
Figure BDA0002326258930000101
通过与相应对照品的保留时间、分子离子峰，峰1、2、3、6、10峰分别鉴定为芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮苷、木犀草素(图2所示，图2为混合标准品的液相色谱图)。其中化合物1、2、3、6在m/z 300的碎片离子为糖基的丢失，与槲皮素苷元的离子。
峰5的分子离子峰[M-H]-为m/z 477.0648。在301.0360处的碎片离子[M-H-C6H9O6]-表示失去葡萄糖醛酸基和槲皮素苷元的存在。因此，该化合物被鉴定为槲皮素3-O-β-D-葡萄糖醛酸苷。峰8(tR＝16.571)，分子离子峰[M-H]-为m/z 637.1745。在m/z329的碎片离子[M-H-C12H21O9]-为失去芸香糖基团的碎片离子。两个碎片离子m/z 314和299(-15Da)是失去CH3的碎片离子，以及槲皮素苷元的存在。此外，与从鬼针草中分离得到的化合物信息进行比较，化合物8初步鉴定为槲皮素3,4＇-二甲基醚-7-O-芸香糖苷。峰18的分子离子峰[M-H]-为m/z 329.0648，由于失去-CH3，在m/z 313和299处产生了碎片离子，该化合物初步鉴定为槲皮素3,4＇-二甲基氧基醚。
峰14和峰16在m/z 575.1362有相同的分子离子峰，在m/z 285.0361处的片段离子表示三个乙酰基团和葡萄糖的丢失。根据文献报道m/z 285.0361、151.0004和135.0445的片段离子表明了异奥卡宁和奥卡宁碎片的存在。通过综合分析，化合物14和16初步确认为异奥卡宁7-O-D-(2″,4″,6″-三乙酰)吡喃葡萄糖苷和奥卡宁4′-O-D-(2″,4″,6″-三乙酰)吡喃葡萄糖苷。
峰7的分子离子峰[M-H]-为m/z515.1170，在m/z353处的碎片离子[M-H-caffeoyl]-，在m/z191存在[quinic acid-H]-和在m/z179存在[caffeic acid-H]-说明该化合物是二咖啡酰基奎宁酸，由于二咖啡酰基奎宁酸有很多同分异构体，结合鬼针草化学成分的研究，化合物7初步鉴定为4,5-二咖啡酰奎宁酸。峰13在m/z 327.2157处产生一个分子离子[M-H]-，碎片离子m/z 229说明C12-C13键的裂解而导致的C6H13O基团的丢失，碎片离子m/z 171和151的证明C12-C13键的裂解，因此，结合文献报道，峰13鉴定9,12,13-trihydroxy-octadecadienoic acid。
1.5鬼针草总黄酮对H2O2诱导的INS-1胰岛β细胞氧化损伤的保护作用
细胞培养：INS-1细胞在含有10％胎牛血清(FBS)，100U/mL青霉素,100μg/mL链霉素的RPMI1640的培养液中进行培养。培养条件为：37℃，5％CO2。
细胞存活率实验：采用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)法测定细胞存活率，取对数生长期的INS-1细胞，浓度为5×105个/孔的细胞接种于96孔板中。在培养基中培养48小时后，加入不同浓度的实施例1中得到的鬼针草总黄酮样品溶液(50μL)培养4小时，再加入10μL的H2O2(100μM)继续培养24h。加入100μL MTT溶液(0.5mg/mL)继续培养4h，吸去上清液，加入100μL DMSO(二甲基亚砜)溶解，在波长为570nm处测定吸光度。
活性氧簇(ROS)生成量实验：对数生长的INS-1细胞，接种于24孔板，加入不同浓度的鬼针草总黄酮样品溶液(50μL)培养4小时，加入100μM的H2O2干预，24小时后加入20μL 2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)溶液(10μM)。测定荧光强度，激发波长488nm，发射波长525nm。
Hoechst 33342染色实验：取对数生长的INS-1细胞，调整浓度为5×105细胞/孔，接种于24孔板，培养4小时后，加入不同浓度的鬼针草总黄酮样品溶液培养4小时，加入10μL的H2O2(100μM)干预，加入Hoechst 33342染色20分钟。与荧光显微镜下观察。
结果：
鬼针草总黄酮对H2O2诱导的INS-1细胞活力的影响：如图3所示，与对照组比较，H2O2诱导的氧化损伤模型组INS-1细胞活力显著下降(p<0.05)。而与25、50和100μg/mL鬼针草总黄酮共同培养4小时后，再加入H2O2进行诱导，与模型组比较，INS-1细胞活性显著升高(p<0.05)。说明，鬼针草总黄酮对H2O2诱导INS-1胰岛β细胞损伤具有明显的保护作用。
鬼针草总黄酮对H2O2诱导的INS-1细胞内ROS生成量的影响：如图4所示，与空白组比较，H2O2诱导能够显著增加INS-1细胞ROS的生成量(p<0.05)。而不同浓度鬼针草总黄酮预处理后，细胞内ROS的生成量显著下降(与模型组比较，p<0.05)，且呈现浓度依赖关系。
鬼针草总黄酮对H2O2诱导的INS-1细胞氧化损伤的影响：Hoechst 33342染色结果如图5显示，空白组中，细胞呈现均匀的微弱蓝色荧光。而经H2O2干预后，细胞呈现致密浓染或碎块状浓染，荧光强度明显高于空白组。与模型组相比，不同浓度鬼针草总黄酮干预组中，正常细胞数比例明显升高，蓝色荧光强度也有所降低。
结论：以上结果说明鬼针草总黄酮对H2O2诱导的INS-1细胞氧化损伤具有明显的保护作用，其作用与抑制细胞内活性氧的产生并抑制细胞凋亡有关。
实施例2
2.1取鬼针草药材于50℃干燥后，切制成0.5cm小段，称取80g药材，加入12倍体积浓度为80％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩后定容至250mL，得鬼针草总黄酮提取液。
2.2采用AB-8大孔吸附树脂进行鬼针草总黄酮的纯化：用95％乙醇浸泡大孔树脂24小时，去除杂质。使用前，先用乙醇清洗树脂，然后用蒸馏水冲洗，至无醇味，装柱。取20mL2.1中得到的鬼针草总黄酮提取液用稀盐酸调节pH为5.0，上样，用蒸馏水洗脱至无色，然后用85％乙醇进行洗脱，洗脱剂用量为80mL，洗脱速度为2BV/h。收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得鬼针草总黄酮提取物。
按照实施例1中的方法进行测定，计算提取物中总黄酮含量，鬼针草总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算总黄酮含量为51.17％。
实施例3
3.1取鬼针草药材于50℃干燥后，切制成0.5cm小段，称取80g药材，加入12倍体积浓度为80％乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩后定容至250mL，得鬼针草总黄酮提取液。
3.2采用AB-8大孔吸附树脂进行鬼针草总黄酮的纯化：用95％乙醇浸泡大孔树脂24小时，去除杂质。使用前，先用乙醇清洗树脂，然后用蒸馏水冲洗，至无醇味，装柱。取20mL3.1中得到的鬼针草总黄酮提取液用稀盐酸调节pH为5.0，上样，用蒸馏水洗脱至无色，然后用75％乙醇进行洗脱，洗脱剂用量为80mL，洗脱速度为2BV/h。收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得鬼针草总黄酮提取物。
按照实施例1中的方法进行测定，计算提取物中总黄酮含量，鬼针草总黄酮提取物中总黄酮含量以芦丁计算总黄酮含量为55.86％。

Claims (1)

1.一种鬼针草总黄酮的检测方法，其特征在于，包括：
取鬼针草药材于50℃干燥后，切制成0.5 cm小段，称取80 g药材，加入12倍体积浓度为80%乙醇，加热回流提取3次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩后定容至250 mL，得鬼针草总黄酮提取液；
采用AB-8大孔吸附树脂进行鬼针草总黄酮的纯化：用95%乙醇浸泡大孔树脂24小时，去除杂质；使用前，先用乙醇清洗树脂，然后用蒸馏水冲洗，至无醇味，装柱；取20 mL 1.1中得到的鬼针草总黄酮提取液用稀盐酸调节pH为5.0，上样，用蒸馏水洗脱至无色，然后用75%乙醇进行洗脱，洗脱剂用量为100 mL，洗脱速度为3 BV/h；收集乙醇洗脱液，回收乙醇，浓缩，干燥，得鬼针草总黄酮提取物；
将鬼针草总黄酮提取物利用超高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用仪进行检测，得到鬼针草总黄酮提取物的高效液相色谱图与质谱数据；
所述高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用仪采用Agilent1200系列超高效液相色谱系统，二级管阵列检测器进行分析；
所述高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用仪检测中采用Symmetry C18为色谱柱；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B；采用梯度洗脱的洗脱方式；以体积百分数计，所述梯度洗脱程序为0~25 min，15%~40%流动相B；25~35 min，20%~50%流动相B；35~50min，55%~80%流动相B；检测波长为254 nm；
所述高效液相色谱-电喷雾-飞行时间质谱联用仪的离子源为电喷雾离子化源，负离子模式，质量扫描范围为100~2000 m/z；毛细管电压为4000 V；破碎器电压130 V；锥孔电压65V；干燥气体流量11 L/min；雾化器温度300℃；喷雾压力30 psig；MS/MS碰撞能量为10~50V。
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