WO2016171640A1 - Биологически активное вещество полифармакологического действия растительного происхождения - Google Patents

Биологически активное вещество полифармакологического действия растительного происхождения Download PDF

Info

Publication number
WO2016171640A1
WO2016171640A1 PCT/UA2015/000101 UA2015000101W WO2016171640A1 WO 2016171640 A1 WO2016171640 A1 WO 2016171640A1 UA 2015000101 W UA2015000101 W UA 2015000101W WO 2016171640 A1 WO2016171640 A1 WO 2016171640A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
flavonoid
biologically active
tricin
glycosides
luteolin
Prior art date
Application number
PCT/UA2015/000101
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2016171640A8 (ru
Inventor
Виктор Петрович АТАМАНЮК
Original Assignee
Виктор Петрович АТАМАНЮК
НОВИК, Анатолий Матвеевич
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority to CA2983299A priority Critical patent/CA2983299C/en
Priority to US15/569,076 priority patent/US20180133278A1/en
Priority to EP15890050.6A priority patent/EP3195872A4/en
Priority to MX2017013696A priority patent/MX2017013696A/es
Priority to BR112017021292-7A priority patent/BR112017021292A2/pt
Priority to AU2015391981A priority patent/AU2015391981B2/en
Application filed by Виктор Петрович АТАМАНЮК, НОВИК, Анатолий Матвеевич filed Critical Виктор Петрович АТАМАНЮК
Priority to EA201700340A priority patent/EA033232B1/ru
Priority to KR1020177032242A priority patent/KR102461853B1/ko
Priority to CN201580079170.6A priority patent/CN107530390A/zh
Publication of WO2016171640A1 publication Critical patent/WO2016171640A1/ru
Publication of WO2016171640A8 publication Critical patent/WO2016171640A8/ru
Priority to US16/748,762 priority patent/US20220000962A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/899—Poaceae or Gramineae (Grass family), e.g. bamboo, corn or sugar cane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/01—Hydrocarbons
    • A61K31/015—Hydrocarbons carbocyclic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/185—Acids; Anhydrides, halides or salts thereof, e.g. sulfur acids, imidic, hydrazonic or hydroximic acids
    • A61K31/19—Carboxylic acids, e.g. valproic acid
    • A61K31/195—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group
    • A61K31/197—Carboxylic acids, e.g. valproic acid having an amino group the amino and the carboxyl groups being attached to the same acyclic carbon chain, e.g. gamma-aminobutyric acid [GABA], beta-alanine, epsilon-aminocaproic acid or pantothenic acid
    • A61K31/198—Alpha-amino acids, e.g. alanine or edetic acid [EDTA]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/35—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom
    • A61K31/352—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having six-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings, e.g. methantheline 
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/409—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil having four such rings, e.g. porphine derivatives, bilirubin, biliverdine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/06—Free radical scavengers or antioxidants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to medicine, namely to pharmacology, and for the composition of a biologically active substance (BAS) of polypharmacological action from plant materials containing aglycone compounds of flavonoids, flavonoid glycosides and excipients.
  • BAS biologically active substance
  • BAS can be used to obtain drugs for the treatment and prevention of viral diseases caused by herpes viruses, influenza, hepatitis B and C, as well as virus-induced immunodeficiencies.
  • a well-known molecule that has an antiviral effect in a wide spectrum is a flavonoid compound such as tricin (5,7,4 - trihydroxy-3 ', 5'-dimethoxy flavone).
  • the concentration of tricin derived from Sasa albo-marginata which inhibits the development of cytomegalovirus infection at the cellular level by 50% (antiviral effect), has been found to be more than 0.42 ⁇ M (or 0.139 ⁇ g / ml) (Antiviral Research 91 (2011), 296 - 303), and the antiviral effect of synthetic tricin on group A influenza virus (H1N1) occurs at concentrations equal to and greater than 3.3 ⁇ M (or 1.09 ⁇ g / ml) (Antiviral chemistry and chemotherapy 2011, 22: 1-11; Joi 103851 / MP 1782).
  • Chemically pure tricin aglycones or tricin complex compounds in combination with apigenin and / or luteolin and / or quercetin compounds are obtained from plant materials: bamboo leaves, Sasa, rice leaves. Chemically pure flavonoid compounds are rapidly oxidized and hydrophobic, therefore their use is limited to the field of scientific research at the cellular level. (Microbes and Infection. 2012 p. V.14. Is. 12. p 1086-1092).
  • glycides of aglycones of tricin, apigenin, luteolin, quercetin and their complexes are hydrophilic and complexes of different molecular flavonoid compounds at the level of the whole organism have a synergistic effect and increased bioavailability compared to the action of individual pure substances. (In vivo 201 1, 25 (5), 757-762, Journal of Food. Vol. 13, Xs 1, p. 140-150).
  • the closest chemical composition and origin to the present invention is a biologically active substance (BAS) from plant materials for the treatment and prevention of pathological conditions, obtained by the method described in patent UA N ° 54362 7MPK A61K 35/78 from 02.17.2003 Bull. jNo 2.
  • BAS biologically active substance
  • As a plant raw material a mixture of plants of the genus Calamagrostis Adans and the genus Deschampsia Beauv is used, which are collected in the period after the stems are thrown out and until the flowering of the spikelets.
  • Such a biologically active substance is characterized by a fairly low toxicity, provides a wide range of pharmacological effects on the human body, but there is no definition of the specific composition of active substances and no activity is determined against specific viruses, there are no recommended dosages for creating dosage forms.
  • the task was to improve BAS with the determination of specific compositions of the active components of BAS, their physico-chemical, biological properties, determine its optimal composition for antiviral effect on specific viruses, dosages when creating dosage forms while maintaining low toxicity of BAS.
  • the biologically active substance of polypharmacological action obtained from the green parts and spikelets of cereal plants of the Gramineae family, the genus Calamagrostis Adans and / or the genus Deshampsia Beauv, contains flavonoids, in particular, aglycones of flavonoids tricin (tricin), apigenin, luteolin, quercetin, ramnazine and / or flavonoid glycosides of tricin, apigenin, luteolin, quercetin, ramnazine, excipients and has the following composition, wt%: aglycone of flavonoid tricin and / or its flavonoid glycosides from 0.016 to 2.062% ; apigenin flavonoid aglycone and / or flavonoid glycosides thereof from 0.010 to 1.393%; aglycone of the luteolin fla
  • the biologically active substance as auxiliary substances contains hydrocarbon compounds, amino acids, chlorophylls.
  • the biologically active substance is obtained from terrestrial Veinik (Calamagrostis epigeios L., genus Calamagrostis Adans) and / or Shchuchka sod (Deshampsia caespitosa L., genus Deshampsia Beanu).
  • the content of O-glycosidic forms of flavonoids in the biologically active substance is (53.545 + 86.422)%, and C-glycosidic forms of flavonoids is (43.293 4.910)% of the total number of flavonoid compounds, the rest are flavonoid aglycones.
  • model extracts Five series of model extracts from herbs of different harvesting seasons were made. A series of model extracts consisted of total extracts: a mixture of terrestrial Veinik and Shchuchka herbs taken in a ratio of 1: 1, and from each herb separately with a weight ratio of raw materials: ethyl alcohol in the range from 1: 10 to 3: 1. Five series of extracts are involved in order to obtain the boundaries of the range of fluctuations in the content of the investigated substances and determine their average values. Model extracts were obtained by known extraction methods, namely: maceration, percolation, ultrasonic extraction and a combination of these methods, (Innovative technologies and equipment for pharmaceutical production (edited by N.V. Menshutina) v.2 (p.
  • composition of biologically active substances was determined using instrumental analytical physical chemistry methods, namely: high-performance high-speed liquid chromatography with diode-matrix detection (HPLC, UPLC-PDA); gas chromatographic mass spectrometry with electron impact ionization (GC-MS); high performance liquid chromatography with a mass detector during ionization by electronic spray (UPLC-MC / MS); nuclear magnetic resonance (NMR).
  • HPLC high-performance high-speed liquid chromatography with diode-matrix detection
  • GC-MS gas chromatographic mass spectrometry with electron impact ionization
  • UPLC-MC / MS high performance liquid chromatography with a mass detector during ionization by electronic spray
  • NMR nuclear magnetic resonance
  • Biologically active substances are contained in plants in trace amounts against the background of macrocomponents: chlorophylls, plant fiber, therefore, the first step in isolating biologically active substances is the removal of macrocomponents.
  • a chlorophilic (fat-soluble) fraction that is hydrophobic is removed with an organic solvent, for example hexane or chloroform.
  • Hydrocarbons in plant materials are represented by mono- and polysaccharides both in a free state and in combination with aglycones that have a hydroxyl group. Free hydrocarbons, which are characterized by hydrophilic properties, are removed by extraction, that is, the aglycones are extracted, and the hydrocarbons remain in the aqueous phase. Since flavonoid aglycons in plants are present both in a free state and in the form of glycosidic forms, therefore, after removal of the chlorophyll fraction, for qualitative and quantitative determination it is necessary to convert all aglycones (free and glycosidic) into one analytical form - aglycones without hydrocarbon fragments. This problem is solved by acid hydrolysis: as a result of the action of hydrogen ions on the glycosidic forms of flavonoids, the removal of hydrocarbon fragments occurs.
  • flavonol and flavono glycoside compounds are established by studying the hydrolysis products by spectrophotometric, chromatographic (HPLC, GC with various detectors) methods.
  • Fig.Z HPLC, UPLC-PDA chromatogram of preparatively isolated compounds of the dominant tricin aglycon and its absorption spectra.
  • Figure 4. GC-MS chromatogram of TMS derivatives of the compounds of the dominant tricin aglycone (ion composition spectrum).
  • Fig. 8 Dominant aglycones of biologically active substances and their names.
  • Figure 10 A calibration graph of the peak area of the mass of 271 as a function of concentration.
  • FIG. 13 A calibration graph of the dependence of the peak area of the mass of 465 on the concentration.
  • FIG. 14 The effect of the concentration of hydrogen ions (the number of moles of HC1) on the stability of hyperoside and vitexin when heating solutions for 120 minutes in a boiling water bath.
  • FIG. 16. 2 - total mass chromatogram when scanning by the masses of individual ions; FIG. 16. .UPLC-MC / MS. Where: 3 - scanning by weight 331, determination of the areas of chromatographic peaks;
  • FIG. 4 is a chromatogram of a scan by mass 331.
  • FIG. 17. UPLC-MC / MS.
  • FIG. 19 HPLC, UPLC-PDA chromatograph and absorption spectra of the chromatographic peaks of the ethanol extract of Weinik terrestrial.
  • Fig.20 HPLC, UPLC-PDA chromatograph and absorption spectra of the chromatographic peaks of the ethanol extract of Soddy Schuchka.
  • Fig.21 The effect of biologically active substances on the growth of Jurkat cells.
  • Fig.22 The percentage of hypodiploid cells in Jurkat culture after incubation with biologically active substances.
  • Fig.23 The content of hypodiploid cells in the Jurkat culture after incubation with biologically active substances for 2 days and subsequent induction of apoptosis with vepezid.
  • Fig. The effect of biologically active substances on the rate of generation of superoxide radical by Namalwa cells.
  • Fig. 26 The effect of biologically active substances on the rate of generation of superoxide radical by the homogenate of MT-4 cells.
  • Fig. 27 The effect of biologically active substances on the chemoluminescence of MT-4 cells induced by hydrogen peroxide. Due to the large amount of graphic material, for a better understanding of the meaning, the names of the figures are also affixed next to them.
  • FIG. 1 A typical chromatogram of the total compounds (weight ratio of raw materials: ethyl alcohol is 1: 2) of an extract diluted with ethanol 96% in a 1: 1 ratio obtained by HPLC with a diode-matrix detector is shown in FIG. 1.
  • the analysis was performed using a UPLC Waters chromatograph ACCENCY VENSE column 18, 1.7 ⁇ m, 2, 1 x 150 mm under the following conditions: sample volume 1 ⁇ l, thermostat temperature 30 ° C, mobile phase velocity 0.3 ⁇ l / min ., detection at 350 nm.
  • Figure 1 also provides absorption spectra of chromatographically isolated compounds of the total extract (Spectrum Index Fraction Plot).
  • Acid hydrolysis was carried out as follows: hydrochloric acid was added to the extract to obtain a solution with a pH of about 2 (2 M hydrochloric acid each), the flask with the solution, connected to a reflux condenser, was kept for 2 hours in a boiling water bath , cooled, hydrolyzed aglycones and glycosidic forms are isolated with ethyl acetate, the organic solvent is removed in vacuo, and the residue is dissolved in ethanol (9: 1) and analyzed.
  • the compound from group 2 which is dominant and has a typical flavone spectrum, was isolated using preparative HPLC Waters XBridgeTM prep CI 8 ⁇ OBD TM 19 x 250 mm reverse phase chromatography (Mobile phase: methanol - water (1: 9), flow rate 15 ml / min.) With repeated introduction and purification of chromatographic fractions. As a result, 1 1 mg of aglycon was isolated (HPLC chromatogram in Fig. 3). To determine the gross formula and structure of an aglycon molecule, the GC method with a mass spectrometric detector was used.
  • the detected structure of the dominant aglycone was confirmed by NMR using the tricin standard (Hangzhou Dayangchem Co., LTD. CAS Na: 520-32-1 Purity: 98.5%), as well as comparing the isolated tricin with tricin isolated from leaves bamboo according to the methodology of Chinese researchers (J. Agric. Chem. 2007,55,10086-10092). According to the above methodology, the presence and identification (except for tricin) of the following flavonoid aglycones was determined and identified (except for tricin): flavones — apigenin, luteolin; flavonols - quercetin, ramnazine (Fig. 8).
  • Flavonoid aglycones according to well-known literature data, for example (US Patent N ° US 2008/0171708 dated 06/17/2006), and our studies, in plant materials and extracts obtained from it, are most often found in the form of O and / or C-glycosides, (Fig. 9), as well as individual aglycones, can be in the form of O- and C-glycosides simultaneously.
  • the hydrocarbons present in the extract are first determined and identified using a GC with a mass detector (using TMS derivatization and also using HPLC with a mass spectrophotometric detector for electrospray ionization (this method allows to determine the most intense fragment that corresponds to the molecular ion (m / z).
  • the hydrocarbon compounds in the model extracts that have been identified are given in Table 1.
  • the quantification of aglycones and / or glycosides by the masses of individual ions is carried out using calibration graphs according to the standards: tricin, apigenin, luteolin, quercetin, ramnazine, vitexin, hyperoside.
  • FIG. 10, 11, 12, 13 are examples of calibration plots of agricones of tricin, apigenin, and also hyperoside (O-glycoside) and 1,6-anhydro-p-D-glycoside of vitexin (C-glycoside).
  • O- and C-glycosides The most optimal conditions for the quantitative determination of O- and C-glycosides is a concentration of hydrogen ions of 0.08 mol by hydrochloric acid (HC1). Under such conditions, O-glycosides are completely destroyed, and C-glycosides remain (by 83%). (The dynamics of the destruction of O- and C-glycosides on the example of vitexin and hyperoside is shown in Fig. 14). So, to obtain information on the quantitative content of aglycones, O- and C-glycosidic forms of aglycones, the results of studies of the extract and product after hydrolysis in an environment of 0.08 mol of HC1 by HPLC, UPLC-MC / MS are analyzed. In FIG.
  • FIG. 15 shows an example of a PDA chromatogram (1) and the total mass chromatograms (2) when scanning for individual ions (the retention time on a UPLC MS / MS device is slightly shorter than the retention time on a Waters UPLS - PDA device with the same column) of the total extract before hydrolysis. Also in FIG. 16. An example of scanning by weight 331 (tricin) with the determination of areas of chromatographic peaks (3) and PDA chromatograms of scanning by weight 331 (4) is given. In FIG. 17 and FIG. Figure 18 shows an example of scanning the total extract and an example of scanning by weight 331 of the total extract after hydrolysis.
  • the results of analysis of the total extract and the results obtained after hydrolysis were compared: the absence or decrease of the peak after hydrolysis indicates the presence of O-glycoside, which can be present both independently (a separate chromatographic peak) and in the complex of compounds (decrease chromatographic peak, which contains several compounds after hydrolysis).
  • the theoretical value of the mass of ions of glycosidic compounds was used taking into account the masses of extracted aglycones, which are shown in Table 3, and identified carbohydrates (Table 1).
  • Vercetin 8-C-glycoside 465 8-C-aporinin glucuronide 447 quercetin 435
  • O - glycosides (mg / l) in terms of hyperoside in the total extract from a mixture of herbs (1: 1) with a weight ratio of raw materials: ethyl alcohol in the range from 1:10 to 3: 1
  • the compounds of group 1 (Fig. 1) on the HPLC chromatogram, with the lowest retention time, as the most hydrophilic, are a mixture of O- and C-glycosides isolated above aglycones, of which tricin, luteolin, apigenin are dominant.
  • the compounds of group 2 (Fig. 1) are a mixture of free aglycones.
  • Group 3 compounds are acylated forms of O-, C-, and bi-glycosides.
  • Comparative composition and boundaries of deviations of the content (mg / l) of free aglycones, O- and C-glycosides in model extracts from a mixture of herbs (1: 1) and from each herb separately with a weight ratio of raw materials: ethyl alcohol in the range from 1:10 to 3: 1.
  • the weight ratio of raw materials ethyl alcohol (dry residue%; density
  • the largest percentage (concentration) of a mixture of flavonoid compounds contains an extract from a mixture of herbs (1: 1) with a weight ratio of raw materials: extractant equal to 3: 1, equal to 9.408% (3223, 9 mg / l) of the dry residue: 30300 mg / l.
  • the smallest amount of flavonoid compounds (0.132% or 9.870 mg / l with a dry residue equal to 6240 mg / l) contains terrestrial Weinik extract with a ratio of raw material: extractant equal to 1: 10.
  • herpes type 2 virus used herpes type 2 virus, strain BH (HSV), infectious titer: 5.0-g 7.0 lg TCD50 / OD ml (TCD50 - tissue cytopathogenic dose of the virus, causes damage to 50% of the cell monolayer).
  • HSV herpes type 2 virus
  • infectious titer 5.0-g 7.0 lg TCD50 / OD ml
  • TCD50 tissue cytopathogenic dose of the virus, causes damage to 50% of the cell monolayer.
  • the cultures were incubated in a thermostat with a supply of COg for 5 days, daily monitoring with a microscope and noting the reproduction of the virus by the cytopathic effect of HSV on Vero cells compared to control cultures where the monolayer was not treated with extracts (virus control).
  • the cytopathic effect of HSV on cells morphologically manifests itself in the formation of symplasts or rounded cells in combination with proliferation and giant multinucleated cells.
  • Table 9 shows the indicators of maximum tolerated concentration (MIC), minimum active concentration (MAA) and chemotherapeutic index (CTI).
  • the studied extracts effectively suppress type 2 herpes virus.
  • the minimum active concentration at which the development of a virus-specific action is suppressed by 2.0 - 3.0 lg TCD50 for the Shchuchka extract of soddy was 0.017 ⁇ g / ml, which is half the value of the minimum active concentration (0.034 ⁇ g / ml) for the total extract and extract of Weinik terrestrial.
  • the HTI of all extracts was approximately 160.
  • Example 2 Determination of the anti-influenza activity of extracts in in vitro experiments.
  • Influenza virus was used, strain A / FM / 1/47 (H1N1), the infectious titer of the allantoic culture was 6.0 lg EID50 / 0.2 ml.
  • a continuous, continuous layer MDC cell culture (dog kidney cells) was used. Cells were grown in plates on RPMI-1640 medium + 10% fetal serum (Nunclon, Surface, Denmark) at a temperature of 37 ° C in a thermostat with a supply of C0 2 . To increase the sensitivity of cells to infection with their influenza virus, trypsin treatment was performed. Trypsin stock solution was prepared by adding up to 3 g of an enzyme sample in 3 ml of DMEM growth medium. Cells were washed three times with this solution at 50 ml per well.
  • the growth medium was poured, model extracts were added to the cells in different concentrations, and the influenza virus was introduced at a dose of 100 TCTs50.
  • Cultures were incubated in an incubator with C0 2 feed for 3 days, daily monitoring using a microscope.
  • the chemotherapeutic index (CTI) of model extracts in relation to the influenza virus was determined by establishing the ratio of the maximum tolerated concentration (MIC) to the minimum active concentration (MAC), at which the development of the virus-specific cytopathic effect is suppressed by 2.0 - 3.0 lg IDso ( Table 11).
  • Bovine viral diarrhea virus which is a test model of hepatitis C virus, was used as a surrogate virus for HCV.
  • Antiviral activity was studied in a culture of MDVC, which was treated with different dilutions of the extracts and VBVD was added at a dose of 100 TCD50. The cultures were incubated in a thermostat until a specific cytopathic effect virus in the control, and then in the culture medium was determined infectious titer of the virus. The results are presented in table 12.
  • model extracts are effective inhibitors of hepatitis C surrogate virus (VBVD) with a high CTI.
  • Interferonogenic activity was studied in an in vivo experiment on outbred white mice to which model extracts were injected intraperitoneally (0.1 ml each) at a concentration of 55.5 ⁇ g / kg. After 24 hours, the mice were withdrawn from the experiment by euthanasia and interferon (IFN) was determined in blood serum according to the generally accepted method for suppressing the cytopathogenic effect (CPD) of vesicular stomatitis virus (VVS) in homologous tissue culture L929. The type of IFNa was determined by the acid sensitivity marker. For this purpose, blood serum was divided into two equal parts. In one of them, the pH of the liquid with 4 N HC1 was adjusted to 2.0, left at 4 ° C for 24 hours, and then the pH of the liquid was restored with 4 N NaOH to 7.2.
  • IFN interferon
  • Poly I Poly C - reference inducer IFN (Calbiocheus, USA)
  • flavonoid substances are quite actively studied in terms of the induction of apoptosis and the effect on cell differentiation, since they have a selective effect on leukemia and normal cells.
  • cytotoxicity For analysis of cytotoxicity, induction of apoptosis, and phase distribution of the cycle, biologically active substances were introduced into the culture medium of suspension cultures at the concentration indicated below. Cell viability was determined by trypan blue staining. At the end of the incubation with the appropriate substances, the cytocentrifuged cell preparations were stained according to Pappenheim.
  • apoptotic index was calculated by the formula: (number of apoptotic cells / total number of cells) x 100).
  • Phase distribution of the cell cycle was studied in cells stained with propidium iodide using flow cytometry.
  • test substance is low toxic. These data coincide with the relative non-toxicity of the extracts on other, both suspension and monolayer cell cultures, used to study the antiviral effect.
  • the data obtained indicate that the biologically active substance causes a pro-apoptotic effect, and with an increase in concentration - an apoptotic effect.
  • vepezid To determine the possible modifying effect of flavonoid substances on the induction of apoptosis of Jurkat cells by vepezid, the cells were first incubated with biologically active substances, and then after 2 or 3 days, vepezid was added to the cells at a dose of 1 ⁇ mol / L for 1 day, i.e., vepezid was used under conditions of sufficient but not excessive, for the induction of apoptosis. The results are shown in Fig.23.
  • the superoxide radical generation rate was determined on an EPR spectrometer using a spin trap of 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-K-oxide (TEMPO), which forms a stable TEMPO radical with a short-lived superoxide.
  • TEMPO 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-K-oxide
  • the reaction of the accumulation of stable TEMPO radicals in the cuvette of the EPR spectrometer after introducing trap cells into the suspension proceeded linearly for 5-6 minutes. Spectra were recorded at minute intervals.
  • the accumulation rate of the TEMPO radical which corresponds to the rate of generation of the superoxide anion radical, was recorded.
  • the working volume of the cuvette was 170 ⁇ l. Studies were carried out at room temperature. Native (whole) cells were introduced into the cuvette or homogenized in an ice bath immediately before the spectrometer was added to the cuvette. Additionally examined cells, either preheated (5 min., 60 ° C), or after exposure at 0-10 C in order to inactivate or inhibit the enzymes that are involved in the electron transfer chain. All solutions were prepared ex tempore from recrystallized reagents of the brand “analytical grade (pure for analysis)” and distilled water.
  • the rate of generation of the superoxide radical anion decreased by 20-30% after 2 hours of incubation, and more than half after 4 hours of incubation. After 24 hours of incubation, the rate of generation of this radical was close to zero.
  • Tests of biologically active substances indicate the presence of antioxidant properties, namely, the dose-dependent kinetics of suppressing the generation of superoxide radical anion, as well as the inhibition of the intensity of free radical processes induced by hydrogen peroxide, are confirmed.
  • the intensity of free radical processes was studied by the chemiluminescent method at room temperature. Hydrogen peroxide was used as an inductor of the generation of radical forms of oxygen, which was introduced into the chemiluminometer cell at the rate of 0.5 ml of 3% H 2 O 2 per 1 ml of cell suspension after preliminary registration of the basic level of cell luminescence with an open PMT curtain (photoelectron multiplier). Cells washed from the culture medium were injected at a concentration of 1 to 8 million / ml. Incubation of MT-4 cells with biologically active substances significantly changed the chemiluminescence intensity of cells attacked by H2O2. Typical chemiluminograms are shown in FIG. 27.
  • biologically active substances are substances of polypharmacological action.
  • the biological spectrum of the action of biologically active substances obtained from a mixture of terrestrial Veinik and Shchuchka soddy herbs (1: 1), and the spectrum of biological activity of biologically active substances obtained from each herb separately, is the same and depends only on the concentration of substances in terms of the total amount of flavonoid compounds.
  • the improvement of biologically active substances with the determination of specific compositions of active substances of biologically active substances, their physico-chemical, biological properties leads to the invention of its optimal composition for antiviral action for specific viruses, dosages when creating dosage forms.
  • BAS is an inducer of endogenous interferon type (y), has an apoptomodulating effect, has antioxidant properties and increases cell resistance to free radical stress.
  • the antiviral effect for specific viruses was defined as the antiviral effect against herpes simplex virus type 2, influenza virus, bovine diarrhea virus (hepatitis C virus).
  • the compounds that make up the biologically active substances have the ability to block the development of both DNA and RNA-containing viruses.
  • the studied extracts effectively suppress type 2 herpes virus.
  • the minimum active concentration at which the development of virus-specific action is suppressed 2.0 - 3.0 lg TCD50, for the Shchuchka soddy extract was 0.017 ⁇ g / ml, which is two times less than the minimum active concentration (0.034 ⁇ g / ml) for the total extract and terrestrial Veinik extract.
  • the HTI of all extracts was approximately 160.
  • model extracts are effective against influenza virus.
  • the infectious titer of the influenza virus decreases the most (by 3.0 lg ID50) at a concentration of biologically active substances equal to 0.0034 ⁇ g / ml under the action of the extract of Shchuchka sod.
  • the results of studies show that model extracts are effective inhibitors of hepatitis C surrogate virus (VBVD) with high HTI.
  • the concentration of biologically active substances to obtain the antiviral effect of 0.017 g 0.068 ⁇ g / ml is significantly less than that for synthetic substances.
  • Terrestrial veinica induces interferon at the level of the reference inducer Poly I: Poly C, and the total extract and extract of Soddy tussock induce interferon at a level of 25% of the level of interferon induction by the reference inducer.
  • Tests of biologically active substances indicate the presence of antioxidant properties, namely, the dose-dependent kinetics of suppressing the generation of superoxide radical anion is confirmed, as well as the inhibition of the intensity of free radical processes induced by hydrogen peroxide.
  • the proposed BAS does not have the drawbacks inherent in synthetic antiviral drugs, provides the ability to create dosage forms with an accurate dosage and targeted pharmaco dynamic action.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Изобретение относится к фармакологии и может использоваться для получения лекарственных средств для лечения и профилактики вирусных заболеваний, вызванных вирусами герпеса, гриппа, гепатитов В и С, а также вирусиндуцированных иммунодефицитов. Биологически активное вещество полифармакологического действия, полученное из зеленых частей и колосков злаковых растений семейства Gramineae, рода Calamagrostis Adans и / или рода Deshampsia Beauv, содержит флавоноиды, в частности, агликоны флавоноидов трицина (tricin), апигенина, лютеолина, кверцетина, рамназина и / или флавоноидные гликозиды трицина, апигенина, лютеолина, кверцетина, рамназина, вспомогательные вещества и имеет следующий состав, мас%: агликон флавоноида трицина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,016 до 2,062%; агликон флавоноида апигенина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,010 до 1,393%; агликон флавоноида лютеолина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,01 до 4,979%; агликон флавоноида кверцетина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,001 до 0,771%; агликон флавоноида рамназина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,104 до 0,203%; вспомогательные вещества от 99,868 до 90,592%. Таким образом усовершенствование БАВ с определением конкретных составов действующих веществ БАВ, их физико-химических, биологических свойств приводит к изобретению его оптимального состава (Фиг.1) для антивирусного действия для конкретных вирусов, дозировок при создании лекарственных форм. Кроме того, определено, что БАВ является индуктором эндогенного интерферона типа (у), имеет апоптозмодулирующее действие, обладает антиоксидантными свойствами и повышает устойчивость клеток к свободнорадикальному стрессу. Антивирусное действие для конкретных вирусов определялось как антивирусное действие по отношению к вирусу простого герпеса типа 2, вирусу гриппа, вирусу бычьей диареи (вирусу гепатита С).

Description

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЕ ВЕЩЕСТВО ПОЛИФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к медицине, а именно к фармакологии, и касается состава биологически активного вещества (БАВ) полифармакологического действия из растительного сырья, содержащего соединения агликонов флавоноидов, флавоноидные гликозиды и вспомогательные вещества. БАВ может использоваться для получения лекарственных средств для лечения и профилактики вирусных заболеваний, вызванных вирусами герпеса, гриппа, гепатитов В и С, а также вирусиндуцированных иммунодефицитов.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
В последние годы все больше внимания уделяется противовирусным средствам из растительного сырья, в которых идентифицированы вещества, действующие непосредственно на вирусный агент. Известной молекулой, которая оказывает антивирусное, в широком спектре, действие есть такое флавоноидное соединение как трицин (tricin) (5,7,4 - тригидрокси-3 ', 5'-диметоксифлавон).
Известно, что трицин эффективен против вируса гриппа, цитомегаловируса и вируса простого герпеса (Пат. Японии Р 2010 - 254649 А, Публ. И Л 1.2010 г; Пат. Японии Р 2006 - 265248 А, Публ. 05.10.2006 г.). Установлено, что концентрация трицина, полученного из Sasa albo-marginata, которая ингибирует на 50% развитие цитомегаловирусной инфекции на клеточном уровне (антивирусное действие) составляет более 0,42 мкМ (или 0,139 мкг / мл) (Antiviral Research 91 (2011), 296- 303), а антивирусное действие синтетического трицина на вирус гриппа группы A (H1N1) наступает при концентрациях, равных и больших 3,3 мкМ (или 1,09 мкг / мл) (Противовирусная химия и химиотерапия 2011 , 22: 1-11; Joi 103851 / MP 1782).
Химически чистые агликоны трицина или комплексные соединения трицина в сочетании с соединениями апигенина и / или лютеолина и / или кверцетина получают из растительного сырья: листьев бамбука (Bamboo leaves), Sasa, листьев риса. Химически чистые флавоноидные соединения быстро окисляются и являются гидрофобными, поэтому их использование ограничено сферой научных исследований на клеточном уровне. (Microbes and Infection. 2012 p. V.14. Is. 12. p 1086-1092). Комплексные соединения: гликозиды агликонов трицина, апигенина, лютеолина, кверцетина и их комплексы являются гидрофильными и на уровне целостного организма комплексам разномолекулярних флавоноидных соединений свойственно синергическое действие и повышение биодоступности по сравнению с действием отдельных чистых веществ. (In vivo 201 1, 25 (5), 757-762, Journal of Food. Vol. 13, Xs 1, p. 140-150).
Наиболее близким по химическому составу и происхождению к предлагаемому изобретению является биологически активное вещество (БАВ) из растительного сырья для лечения и профилактики патологических состояний, полученое способом, приведеным в патенте UA N° 54362 7МПК А61К 35/78 от 17.02.2003 г. Бюл. jNo 2. В качестве растительного сырья используют смесь растений рода Calamagrostis Adans и рода Deschampsia Beauv, которые собраны в период после выбрасывания стеблей и до окончания цветения колосков.
Такое БАВ характеризуется достаточно низкой токсичностью, обеспечивает широкий спектр фармакологического воздействия на организм человека, но отсутствует определение конкретного состава действующих веществ и не определена активность в отношении конкретных вирусов, отсутствуют рекомендованные дозировки для создании лекарственных форм.
Была поставлена задача усовершенствования БАВ с определением конкретных составов действующих компонентов БАВ, их физико-химических, биологических свойств, определение его оптимального состава для антивирусного действия на конкретные вирусы, дозировок при создании лекарственных форм при сохранении низкой токсичности БАВ.
РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ Поставленная задача решается тем, что биологически активное вещество полифармакологического действия, полученное из зеленых частей и колосков злаковых растений семейства Gramineae, рода Calamagrostis Adans и / или рода Deshampsia Beauv, содержит флавоноиды, в частности, агликоны флавоноидов трицина (tricin), апигенина, лютеолина, кверцетина, рамназина и / или флавоноидные гликозиды трицина, апигенина, лютеолина, кверцетина, рамназина, вспомогательные вещества и имеет следующий состав, мас%: агликон флавоноида трицина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,016 до 2,062%; агликон флавоноида апигенина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,010 до 1,393%; агликон флавоноида лютеолина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,01 до 4,979%; агликон флавоноида кверцетина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,001 до 0,771%; агликон флавоноида рамназина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,104 до 0,203%; вспомогательные вещества от 99,868 до 90,592%.
Предпочтительнее, когда биологически активное вещество в качестве вспомогательных веществ содержит углеводородные соединения, аминокислоты, хлорофиллы.
Предпочтительнее, когда биологически активное вещество получено из Вейника наземного (Calamagrostis epigeios L. рода Calamagrostis Adans) и / или Щучки дернистой (Deshampsia caespitosa L. рода Deshampsia Beanu).
Предпочтительнее, когда в биологически активном веществе содержание О- гликозидных форм флавоноидов составляет (53,545 + 86,422)%, а С-гликозидных форм флавоноидов составляет (43,293 4,910)% от общего количества флавоноидных соединений, остальное - агликоны флавоноидов.
Для установления причинно-следственной связи между конкретными действующими компонентами и свойствами БАВ, его оптимального состава были проведены исследования с помощью стандартных методик (В. А. Миронов, С. Янковский. Спектроскопия в органической химии. Москва «Химия» 1985 г . - 230 с. .С. Сенчев «Практическое руководство по жидкостной хроматографии. Москва.« Техносфера », 2010 г. - 272 с). Когда агликоны флавоноидов находятся в форме О- и / или С-гликозидов, то при этом увеличивается растворимость БАВ в водных средах а также обеспечивается синергизм действия и биодоступность смеси флавоноидных гликозидов на уровне целостного организма.
Было изготовлено пять серий модельных экстрактов из трав разных сезонов сбора. Серия модельных экстрактов состояла из суммарных экстрактов: смеси трав Вейника наземного и Щучки дернистой, взятых в соотношении 1 : 1 , и из каждой травы отдельно при весовом соотношении сырье: спирт этиловый в диапазоне от 1 :10 до 3: 1. Пять серий экстрактов задействованы с целью получения границ диапазона колебаний содержания исследуемых веществ и определения их средних значений. Модельные экстракты получали известными способами извлечения, а именно: мацерации, перколяции, ультразвуковой экстракции и сочетанием указанных методов, (Инновационные технологии и оборудование фармацевтического производства (под редакцией Н.В.Меншутиной) т.2 (стр. 33-88) Москва: « Бином »2013 г. - 480 с), причем в процессе экстрагирования проводили периодический контроль показателя сухого остатка. В экстрактах с весовым соотношением сырья к спирту 1 :10 процесс экстракции завершали при достижении показателем сухого остатка значения 0,5% (среднее значение плотности 0,8010 г / мл), при весовом соотношении сырья к спирту 1: 2 экстракцию завершали при достижении показателем сухого остатка значения 1,2% (среднее значение плотности 0,8100 г / мл), а при весовом соотношении сырья к спирту 3: 1 экстракцию завершали при достижении показателем сухого остатка значения 2,5% (среднее значение плотности 0,8250 г / мл).
Сначала определяли состав агликонов флавоноидов, флавоноидных гликозидов в суммарном экстракте, который производили при соотношении сырья к спирту 1 : 2.
Определение состава БАВ проводили методами инструментальной аналитической физической химии, а именно: высокоэффективной скоростной жидкостной хроматографии с диодноматричным детектированием (ВЭЖХ, UPLC-PDA); газовой хроматомасс - спектрометрии с ионизацией электронным ударом (ГХ-МС); жидкостной высокоэффективной хроматографии с масс -детектором при ионизации электронным спреем (UPLC-MC / МС); методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР). После идентификации и определения веществ в суммарном экстракте определяли качественное и количественное содержание БАВ в модельных экстрактах, полученных из каждой травы отдельно.
Для определения специфического действия проводили сравнительное изучение БАВ суммарного экстракта и экстрактов из каждой травы отдельно.
БАВ содержится в растениях в следовых количествах на фоне макрокомпонентов: хлорофиллов, растительной клетчатки, поэтому первым этапом, при выделении БАВ является удаление макрокомпонентов. Хлорофильную (жирорастворимую) фракцию, которая является гидрофобной, удаляют органическим растворителем, например гексаном или хлороформом.
Углеводороды в растительном сырье представлены моно- и полисахарами как в свободном состоянии, так и в сочетании с агликонами, которые имеют гидроксильную группу. Свободные углеводороды, которым свойственны гидрофильные свойства, удаляют экстракционным методом, то есть агликоны экстрагируют, а углеводороды остаются в водной фазе. Поскольку агликоны флавоноидов в растениях присутствуют как в свободном состоянии, так и в виде гликозидных форм, поэтому, после удаления хлорофильных фракции, для проведения качественного и количественного определения необходимо все агликоны (свободные и гликозидные) перевести в одну аналитическую форму - агликоны без углеводородных фрагментов. Эта задача решается путем кислотного гидролиза: в результате действия водородных ионов на гликозидные формы флавоноидов происходит отщепление углеводородных фрагментов.
Химическая структура флавоноловых и флавоновых гликозидных соединений устанавливается путем изучения продуктов гидролиза спектрофотометрическими, хроматографическими, (ВЭЖХ, ГХ с различными детекторами) методами. КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
Суть изобретения иллюстрируют фигуры, на которых изображено:
Фиг.1. ВЭЖХ, UPLC-PDA хроматограмма суммарного экстракта и спектры поглощения выделенных соединений. б
Фиг.2. ВЭЖХ, UPLC-PDA хроматограмма суммарного экстракта после гидролиза и спектры поглощения выделенных соединений.
Фиг.З. ВЭЖХ, UPLC-PDA хроматограмма препаративно выделенных соединений доминирующего агликона трицина и его спектры поглощения. Фиг.4. ГХ-МС хроматограмма TMS дериватов соединений доминирующего агликона трицина (спектр ионного состава).
Фиг.5. ГХ-МС хроматограмма TMS дериватов соединений доминирующего агликона трицина (время удержания иона с массой 531,00).
Фиг.6. Ή-ЯМР спектр трицина, полученного из суммарного экстракта. Фиг.7. 13С-ЯМР спектр трицина, полученного из суммарного экстракта.
Фиг.8. Доминирующие агликоны БАВ и их названия.
Фиг.9. Схема образования О-гликозидов и С-гликозидов.
Фиг.10. Калибровочный график зависимости площади пика массы 271 от концентрации.
Фиг.11. Калибровочный график зависимости площади пика массы 331 от концентрации. Фиг.12. Калибровочный график зависимости площади пика массы 415 416 от
концентрации.
Фиг. 13. Калибровочный график зависимости площади пика массы 465 от концентрации.
Фиг. 14. Влияние концентрации водородных ионов (количество молей НС1) на устойчивость гиперозида и витексина при нагревании растворов в течение 120 мин на кипящей водяной бане.
Фиг. 15.UPLC-MC / МС. Где:
1 - PDA хроматограмма суммарного экстракта;
2 - суммарная масс-хроматограмма при сканировании по массам отдельных ионов; Фиг. 16. .UPLC-MC / МС. Где: 3 - сканирование по массе 331, определение площадей хроматографических пиков;
4 - хроматограмма сканирования по массе 331. Фиг. 17. UPLC-MC / МС. Где:
1 - PDA хроматограмма суммарного экстракта после гидролиза; 2 - суммарная масс-хроматограмма при сканировании по массам отдельных ионов; Фиг. 18. UPLC-MC / МС. Где:
3 - сканирование по массе 331, определение площадей хроматографических пиков;
4 - хроматограмма сканирования по массе 331.
.Фиг.19. ВЭЖХ, UPLC-PDA хроматографа и спектры поглощения хроматографических пиков этанольного экстракта Вейника наземного.
Фиг.20. ВЭЖХ, UPLC-PDA хроматографа и спектры поглощения хроматографических пиков этанольного экстракта Щучки дернистой.
Фиг.21. Влияние БАВ на рост клеток Jurkat.
Фиг.22. Содержание гиподиплоидных клеток (в процентах) в культуре Jurkat после инкубации с БАВ.
Фиг.23. Содержание гиподиплоидних клеток в культуре Jurkat после инкубации с БАВ в течение 2 суток и последующей индукцей апоптоза вепезидом.
Фиг.24.Влияние БАВ на скорость генерирования супероксидрадикала клетками МТ-4.
Фиг.25.Влияние БАВ на скорость генерирования супероксидрадикала клетками Namalwa. Фиг.26.Влияние БАВ на скорость генерирования супероксидрадикала гомогенатом клеток МТ-4.
Фиг.27.Влияние БАВ на хемиолюминисценцию клеток МТ-4, индуцированную пероксидом водорода. Из-за большого количества графического материала, для лучшего понимания смысла, названия фигур проставлены также и рядом с ними.
Типичная хроматограмма соединений суммарного (весовое соотношение сырье: спирт этиловый равно 1 : 2) экстракта разбавленного этанолом 96% в соотношении 1 : 1, полученная с помощью ВЭЖХ с диодно -матричным детектором предоставлена на Фиг. 1. Анализ выполнен с помощью хроматографа UPLC Waters колонка ACQUITY ВЕНС 18, 1,7 мкм, 2, 1 х 150 мм при следующих условиях: объем введенной пробы 1 мкл, температура термостата 30°С, скорость подвижной фазы 0,3 мкл / мин., детектирование при 350 нм. Подвижная фаза, это (вода: ацетонитрил) = (60: 40) в градиентном режиме, вода при рН 2,2 (ортофосфорная кислота). На Фиг.1 предоставлены также спектры поглощения хроматографически выделенных соединений суммарного экстракта (Spectrum Index Fraction Plot).
Спектры поглощения хроматографически выделенных соединений (Фиг.1) со временем удержания в интервале от 5,0 минут (мин.) до 10 мин. указывают на наличие в растворе набора соединений одного класса соединений - флавоноидов, которые имеют одинаковый «скелет» молекулы. Разница в спектрах обусловлена природой заместителей в составе молекулы. Для идентификации молекул используют кислотный гидролиз, который в случае О-гликозидов позволяет выделить (высвободить) агликоны. Кислотный гидролиз проводился следующим образом: к экстракту добавляют соляную кислоту до получения раствора с рН - около 2 (по 2 Молярной хлористо-водородной кислоте), колбу с раствором, подсоединенную к обратному холодильнику, выдерживают в течение 2-х часов в водяной бане при кипении, охлаждают, выделяют прогидролизованые агликоны и гликозидные формы этилацетатом, удаляют органический растворитель под вакуумом, а остаток растворяют в этаноле (9: 1) и анализируют.
На хроматограмме (Фиг. 1) (ВЭЖХ с PDA детектором), полученной до гидролиза, наблюдаются три раздельные группы соединений со временем удержания: 5 - 7 мин (соединения группы 1), 8-9,0 мин (соединения группы 2) и соединения после девятой мин (соединения группы 3). Хроматограмма, полученная после гидролиза (Фиг. 2), показывает, что соединения группы 1 остались, соединения группы 2 выросли и увеличилось количество соединений группы 3. Соединение из группы 2, которое является доминирующим и имеет типичный спектр флавона, было выделено с помощью препаративной ВЭЖХ «Waters» XBridgeTM prep CI 8 ΙΟμηι OBD™ 19 x 250 mm в режиме обратно фазной хроматографии (Подвижная фаза: метанол - вода (1 : 9), скорость потока 15 мл / мин.) при многократном введении и очищении хроматографических фракций. В результате выделено 1 1 мг агликона (ВЭЖХ хроматограмма на Фиг. 3). Для определения брутто - формулы и структуры молекулы агликона был использован метод ГХ с масс-спектрометрическим детектором. Поскольку флавоноидные соединения в своей структуре содержат гидроксильные группы, которые противодействуют их летучести, поэтому для введения образца в ГХ необходимо проводить их дериватизацию. В качестве реагента использовали N, Ν-триметилсилил- трифторацетамид (TMS дериватизация). Хроматограмма деривата агликона (Фиг.4,Фиг.5.) указывает на то, что масса агликона при исключении массы фрагментов составляет 330 . По библиотеке масс-спектров это трицин или рамназин. Для уточнения структуры молекулы использован метод ЯМР на протонных и углеродных ядрах. Получены следующие характеристики спектров ЯМР (Фиг. 6, Фиг. 7): 13С (ДМСО- б, 100 МГц): δ = 56.33 (СНЗ х 2), 94.13 (С-8), 98.78 (С-6), 103.49 (С-3) , 103.59 (С-10), 104.28 (С-2 '+ С-6 "), 120.27 (С-Г), 139.75 (С-4 '), 148.06 (С-3' + С-5 '), 157.20 (С-5), 161.25 (С-Г), 163.48 (С-9), 164.14 (С-2), 181.60 (С-4) м.д. (магнитной девиации).
1Н (ДМСО- 16, 400 МГц): δ = 3.88 (6Н, с, СНЗ х 2), 6.20 (Ш, д, J = 2.0 Гц, Н-6), 6.56 (1Н, д, J = 2.0 Гц, Н-8), 7.00 (Ш, с, Н-3), 7.33 (2Н, с, Н-2 '+ Н-6 "), 12.98 (Ш, с, ОН-5) м. д.
Сигнал при 12.98 м.д. обусловлен наличием водородной связи между атомом водорода гидроксильной группы и атомом кислорода карбонильной группы. Все другие гидроксильные группы (ОН-7 и ОН-4 ') в спектре ЯМР не проявляются из-за их обмена с водой.
Анализ полученных данных спектров ЯМР окончательно подтверждает подлинность трицина как основной составляющей соединения 2. (Tricin / Трицин или 5,7-Dihydroxy-2- (4- hydroxy-3,5 dimethoxyphenyl) -4H-chromen-4-one или 5,7-Дигидрокси-2-(4-гидрокси-3,5- диметоксифенил)-4Н-хромен-4-он).
Обнаруженная структура доминирующего агликона (молекулы трицина) подтверждена методами ЯМР с использованием стандарта трицина (Hangzhou Dayangchem Co., LTD. CAS Na: 520-32-1 Purity: 98,5%), а также сравнением выделенного трицина с трицином, выделенным из листьев бамбука по методике китайских исследователей (J. Agric. Chem. 2007,55,10086-10092). По вышеуказанной методике, в составе суммарного экстракта определено наличие и проведена идентификация (кроме трицина) следующих агликонов флавоноидов: флавоны - апигенин, лютеолин; флавонолы - кверцетин, рамназин (Фиг. 8). Агликоны флавоноидов, по известным литературным данным, например (Патент США N° US 2008/0171708 от 17.06.2006 г.), и нашим исследованиям, в растительном сырье и экстрактах, полученных из него, содержатся чаще всего в виде О-и / или С-гликозидов, (Фиг. 9), а также отдельные агликоны могут быть в виде О- и С-гликозидов одновременно.
Для раздельного определения качественного и количественного состава О- и С- гликозидов сначала определяют и идентифицируют имеющиеся в экстракте углеводороды с помощью ГХ с масс-детектором (используя TMS дериватизацию а также с помощью ВЭЖХ с масс - спектрофотометрическим детектором при ионизации электроспреем (этот метод позволяет определить наиболее интенсивный фрагмент, который соответствует молекулярному иону (m / z). Соединения углеводородов в модельных экстрактах, которые были идентифицированы (название; молекулярный вес) приведены в Таблице 1.
Таблица 1.
Идентифицированные соединения углеводородов в модельных екстрактах Вейника наземного и Щучки дернистой.
JV. Название Мол. вес. п/п
1 2 3
1 Глюкоза (маноза) 180
2 1 ,6-ангидро- - -глюкоза 162
3 Арабиноза 150
4 Ксилоза 150
5 Рибоза 150
6 Рамноза 164
7 Глюкофуноза 180
8 Глюкуроновая кислота 196
9 D- сахарная кислота 210
10 Сорбоза 180
11 З-Оксипропионовая кислота 90 12 4-Оксипентановая кислота 118
13 1 -Пропен- 1 ,2, 3 -трикарбоновая кислота 174
14 З-Гидрокси-бутановая кислота 104
15 2-Бутанен 72
16 Сукциновая кислота 118
17 Фумаровая кислота 116
18 Азелаиновая кислота 188
19 3-Метокси^4-гидроксибензойная кислота 168
20 3,4-Диметоксибензойная кислота 182
21 Бензойная кислота 122
22 4- Гидроксибензойная кислота 138
23 3,4-Дигидроксибензойная кислота 154
24 2-Карбокси^1-гидроксибензойная кислота 182
25 Сиреневая кислота 198
26 Коричная кислота 118
27 Кофейная кислота 180
28 Феруловая кислота (4-гидроксил-З-метоксил-коричная кислота) 194
29 Синаловая 224
30 Диметоксилкоричная 208
31 Альфа конидендрин 356
32 Аконитиновая кислота 174
33 3-(4-гидрокси-3-метоксифенил) метиловый эфир 2-пропановой 208
кислоты
После определения состава углеводородов необходимо определить условия, при которых можно различить О- и С-гликозиды, брутто-формулы которых одинаковы, в результате чего их оптические и хроматографические характеристики мало отличаются. Наиболее классическим является определение динамики высвобождения агликонов из гликозидных форм при их деструкции под действием различных концентраций водородных ионов. Кислотный гидролиз проводят описанным выше методом при различных концентрациях соляной кислоты. Осадок после удаления этилацетата растворяют в этиловом спирте (9: 1) и анализируют. Гидролизаты, полученные при различных концентрациях водородных ионов анализируют методом масс - спектрометрии UPLS - МС / МС. Количественное определение агликонов и / или гликозидов по массам отдельных ионов проводят с использованием калибровочных графиков по стандартам: трицина, апигенина, лютеолина, кверцетина, рамназина, витексина, гиперозида. На Фиг. 10, 11, 12, 13 приведены примеры калибровочных графиков агликонов трицина, апигенина а также гиперозида (О-гликозида) и 1,6-Ангидро-р- D- гликозида витексина (С-гликозид).
Содержание агликонов в экстракте и динамика высвобождения агликонов из гликозидных форм в зависимости от концентрации водородных ионов приведена в Таблице 2.
Таблица 2
Влияние концентрации водородных ионов на выход агликонов
Figure imgf000014_0001
1 -при отсутствии бутилгидроксианизола (ВНА).
2 - в присутствии ВНА.
Наиболее оптимальными условиями для количественного определения О-и С- гликозидов является концентрация водородных ионов 0,08 Моль по соляной кислоте (НС1). При таких условиях полностью разрушаются О-гликозиды, а С-гликозиды остаются (на 83%). (Динамика разрушения О- и С-гликозидов на примере витексина и гиперозида показана на Фиг. 14). Так что для получения информации о количественном содержании агликонов, О- и С-гликозидных форм агликонов анализируют результаты исследований экстракта и продукта после гидролиза в среде 0,08 Моль НС1 методом ВЭЖХ, UPLC-MC / МС . На Фиг. 15 приведен пример PDA хроматограммы (1) и суммарной масс- хроматограммы (2) при сканировании по отдельным ионам (время удержания на приборе UPLC МС / МС немного меньше по сравнению с временем удержания на приборе Waters UPLS - PDA при одной и той же колонке) суммарного экстракта до гидролиза. Также на Фиг.16. приведен пример сканирования по массе 331 (трицин) с определением площадей хроматографических пиков (3) и PDA хроматограммы сканирования по массе 331 (4). На Фиг. 17и Фиг. 18 приведен пример сканирования суммарного экстракта и пример сканирования по массе 331 суммарного экстракта после гидролиза.
Для вычисления количества О-гликозидов сравнивали результаты анализа суммарного экстракта и результаты, полученные после гидролиза: отсутствие или уменьшение пика после гидролиза указывает на присутствие О-гликозида, который может присутствовать как самостоятельно (отдельный хроматографический пик), так и в составе комплекса соединений (уменьшение хроматографического пика, который содержит несколько соединений после гидролиза). Для расчетов использовали теоретическое значение массы ионов гликозидных соединений с учетом масс экстрагированных агликонов, которые приведены в Таблице 3, и идентифицированных углеводов (Таблица 1).
Таблица 3
Теоретически расчитанные гликозиды исследуемых агликонов
Мол. Ксилоза 1,6-
Время Глюкурон
масса М Глюкоза (рибоза, Ангидро- Рамн
Агликон удержани овая
+1 (сорбоза) арабиноза β-D- оза я (мин.) кислота
(М) ) глюкоза
Апигенин 7,56 270 271 433 403 415 447 417
Лютеоли
6,9 286 287 449 419 431 463 433 н
Кверцети
7,15 302 303 465 435 447 479 449 н
Трицин
7,82
(Рамнази 330 331 493 463 475 507 477
(9,02)
н) При этом учитывались те обстоятельства, что в случае О-гликозида (например, гиперозид) в результате действия электроспрея при масс-спектрометрии происходит отрыв молекулы агликона от углеводорода и соотношение между агликоном и исходным гликозидом составляет 100 : 1. В случае С-гликозида (например, витексин) происходит отрыв от молекулы исходного гликозида фрагмента ОН + 1 , то есть массы 18, и соотношение площадей пиков исходного гликозида и продукта его деструкции (тоже гликозида) равно 3,23. По результатам исследований выявлены возможные соединения, которые появляются в исследуемых масс-спектрах и образуются в результате деструкции С-гликозидов (Таблица 4)·
Таблица 4
Продукты преобразования С-гликозидов флавоноидов при проведении мас- спектрометрического анализа
Агликон Исходный гликозид М + 1 Продукт преобразования М + 1
Трицин 8-С-гликозид трицина 493 Ангидро С-гликозид 475
С-гликозид с рамнозой 477 Ангидро С-гликозид 459
Рамназин 8-С-ксилозид 463 Ангидро С-гликозид 448 рамназина
Апигенин 8-С-гликозид 433 8-С-(1,6-ангидро)-Р-Д-гликозид 415 апигенина 403 апигенина 385
8-С-ксилозид 417 Ангидро С-гликозид 399 апигенина Ангидро С-гликозид
С-гликозид с рамнозой
Лютеолин 8-С-гликозид 449 8-С-(1,6-ангидро)-Р-Д-гликозид 431 лютеолина 419 лютеолина 401
С-гликозид с ксилозой 433 Ангидро С-гликозид 415
8-С-гликозид Ангидро С-гликозид
лютеолина
верцетин 8-С-гликозид 465 8-С-глюкоронид апигенина 447 кверцетина 435 Ангидро С-гликозид 417
С-гликозид с ксилозой 449 Ангидро С-гликозид 431
С-гликозид с рамнозой Таблица 5.
Содержание О - гликозидов (мг/л) в пересчете на гиперозид в суммарном екстракте из смеси трав (1:1) при весовом соотношении сырье: спирт этиловый в диапазоне от 1:10 до 3:1
Время Весовое соотношение сырье: спирт
m/z Соединения удержания,мин (сухой остаток %, плотность г/мл)
1:10 1:2 3:1
1 2 4
(0,5;0,8010) (1,2;0,8100) (2,5;0,8250)
7-О-гликозид
4,9 11,23 84,20 140,50
лютеолина
449
З-О-рамнозид 7,86 0,58 4,35 10,80
кверцетина
5,02 2,98 14,90 37,25 7-О-ксилозид
463
5,86 1,52 7,80 19,50 рамназина
7-О-ксилозид
403 9,0 0,91 6,80 17,60
апигенина
5,44 1,28 9,60 24,20 7-О-глюкозид
493
5,74 5,19 38,90 97,25 трицина
7-0-(1,6-ангидро)-|3-
431 4,9 17,70 125,00 210,20
Д-гликозид лютеолина
7-0-( 1 ,5 -ангидро)-Р~
5,50 6,18 46,30 115,75
Д-ксилозид трицина
445 7-0-
5,03 18,00 135,00 247,50 ангидроглюкоронид лютеолина
7-О-ксилозид
419 5,5 3,76 28,20 70,50
лютеолина
7,9 3,44 25,80 46,40 З-О-гликоронид
479
8,13 4,35 32,60 65,20 кверцетина
З-О-глюкозид
465 4,94 1,66 12,40 31,00 кверцетина З-О-ксилозид
5,41 3,93 15,70 37,70
кверцетина
8,92 0,07 0,30 0,75 7-О-рамнозид кверцетина
З-О-глюкозид, 7-О-
582 4,91 15,24 114,30 244,30
рамнозид лютеолина
З-О-глюкозид, 7-О-
639 5,74 7,24 54,30 119,45
рамнозид трицина
5,92 1,23 4,90 12,25
3-0-(4- 6,26 8,16 40,80 102,00
689 гидроксибензоил)
6,45 5,27 26,10 65,25
ксилозид кверцетина
7,03 2,85 11,40 28,50
Всего, О
гликозидов 122,75 842,95 1726,25
(мг/л)
Таблица 6
Содержание С - гликозидов (мг/л) в пересчете на гиперозид в суммарном экстракте из смеси трав (1:1) при весовом соотношении сырье: спирт этиловый в диапазоне от 1:10 до 3:1
Время Весовое соотношение сырье : спирт
m/z Соединения удержания,мин. (сухой остаток %, плотность г/мл)
1:10 1:2 3:1
1 2 4
(0,5;0,8010) (1,2;0,8100) (2,5;0,8250)
4,94 0,36 2,02 4,95
5,29 0,28 2,23 5,58
5,51 0,12 1,00 2,48 8-С-глюкозид
465
5,51 0,11 1,06 2,43 кверцетина
9,12 1,24 8,60 19,78
9,12 1,89 11,30 27,69 Время Весовое соотношение сырье : спирт
m/z Соединения удержания, мин. (сухой остаток %, плотность г/мл)
1:10 1:2 3:1
1 2 4
(0,5;0,8010) (1,2;0,8100) (2,5;0,8250)
9,0 10,26 66,75 166,87 8-С-гликозид
403
9,0 0,32 1,83 4,09 апигенина
5,02 1,15 6,90 17,25
8-С-ксилозид
5,35 1,20 9,00 24,30
трицина
5,47 1,80 11,70 28,08
463
5,47 0,02 0,09 0,22
8-С-глюкуронид
5,57 0,98 6,86 16,81
лютеолина
9,15 1,65 10,00 23,70
5,75 1,08 7,00 17,50
8-С-глюкозид
5,97 2,12 15,90 36,57
трицина
493 5,97 1,54 10,00 23,17
9,16 0,68 4,15 10,17 8-С-глюкозид
9,11 4,94 34,60 89,96 рамназина
8,95 0,11 0,65 1,69 8-С-глюкуронид
507
9,08 1,44 10,0 24,51 трицина
8-С-(1,6 ангидро)-Р~
415 9,16 1,78 10,50 25,73 Д-глюкозид апигенина
5,47 0,38 2,30 5,64
8-С-глюкуронид
447 5,65 2,02 13,10 31,40
апигенина
7,89 0,64 3,20 7,36
4,86 0,31 1,85 4,45
4,86 0,24 1,08 2,82
5,33 1,98 12,70 31,12 8-С-глюкозид
433
5,33 3,04 18,40 44,20 апигенина
9,06 3,85 27,20 62,56
9,06 1,56 8,40 17,82 Время Весовое соотношение сырье : спирт
m/z Соединения
удер ания,мин. (сухой остаток , плотность г/мл)
1:10 1:2 3:1
1 2 4
(0,5;0,8010) (1,2;0,8100) (2,5;0,8250)
7,22 0,12 0,70 1,75
7,89 0,97 6,80 15,23
8-С-глюкуронид
479 8,09 0,85 6,15 15,98
кверцетина 9,0 0,72 4,40 9,94
9,14 0,73 4,60 8,75
4,9 3,12 20,30 56,35
5,02 4,95 37,10 89,04
5,02 3,12 20,30 49,74
8-С-глюкозид
449 7,86 1,54 10,70 23,84
лютеолина 8,01 не визнач. 0,041 0,09
8,06 2,46 16,05 40,43
9,12 2,60 14,50 35,67
4,9 8,04 56,30 129,50 7-0-(1,6-ангидро)-р-
431 5,33 4,27 25,60 62,72 Д глюкозид
9,06 4,5 27,80 63,94 лютеолина
5,62 0,24 1,60 4,00 8-С-(синапоил)-
671
9,08 0,63 4,10 9,27 глюкозид кверцетина
Всего, С-гликозидов
87,6 5 577,36 1395,71
(мг/л)
Таким образом, на примере анализа суммарного экстракта выполнено качественное и количественное определение содержания свободных агликонов (Таблица 2), а также гликозидных форм агликонов: О-гликозидов (Таблица 5); С-гликозидов (Таблица 6).
Соединения группы 1 (Фиг. 1) на хроматограмме ВЭЖХ, с наименьшим временем удержания, как наиболее гидрофильные, являются смесью О- и С-гликозидов, выделенных выше агликонов, из которых доминирующими являются трицин, лютеолин, апигенин. Соединения группы 2 ( Фиг. 1) представляют собой смесь свободных агликонов. Соединения группы 3 это ацилированные формы О-, С-, и би-гликозидов.
Изложенные выше результаты определения качественного и количественного состава агликонов и их гликозидов в экстракте из смеси трав, для которого изучена биологическая активность, дают возможность сравнить состав и биологическую активность экстрактов из каждой травы отдельно. Модельные экстракты из каждой травы отдельно, с целью определения различий в составе и для проведения сравнительных исследований специфического биологического действия, изготавливали с калиброванным содержанием суммы флавоноидов и их гликозидов, равным 0,22 мг / мл, при весовом соотношении сырья к спирту 1 : 4, 5 и при достижении показателем сухого остатка значения, равного 0,7% (среднее значение плотности 0,8080 г / мл). Типичные ВЭЖХ хроматограммы (детектирование при 350 нм) в условиях хроматографирования, приведенных выше по тексту, и спектры поглощения соединений этанольных экстрактов из трав Вейника наземного и Щучки дернистой представлены на Фиг. 19 и Фиг. 20 соответственно.
Из приведенных хроматограмм видно, что качественный состав экстрактов подобный. Различия в составе этанольных экстрактов заключаются в разном количественном содержании отдельных молекул флавоноидов и их О- и С-гликозидов.
Таблица 7
Сравнительный состав и границы отклонений содержания (мг/л) свободных агликонов, О- и С- гликозидов в модельных экстрактах из смеси трав (1:1) и из каждой травы отдельно при весовом соотношении сырье: спирт этиловый в диапазоне от 1:10 до 3:1.
Экстракт из смеси Экстракт Вейника Экстракт Щучки трав (1:1) наземного дернистой
Весовое соотношение сырье: спирт этиловый (сухой остаток %;плотность
Соедин
п/ (г/мл))
ения
п 1:10 1:2 3:1 1:10 1:2 3:1 1:10 1:2 3:1
0,5;0, 1,2;0, 2,5;0,8 ,5;0, 1,2;0, 2,5;0,8 0,5;0,8 1,2;0,8 2,5;0, 8010 8100 250 8010 8100 250 010 100 8250
1 Трицин 4,000 37,260 95,000 0,900 9,450 24,00 0,600 6,800 14,000
Лютеол
2 0,100 1,500 3,600 0,004 0,040 0,010 0,100 1,250 3,200 ин Апиген
0,080 0,840 1,800 0,020 0,200 0,600 0,010 0,150 0,500 ин
Кверцет
0,060 0,600 1,400 0,030 0,300 0,800 0,010 0,100 0,500 ин
Рамнази
0,010 0,070 0,140 0,010 0,020 0,080 0,010 0,020 0,080 н
Всего,
свободн
101,94
ых 4,250 40,270 0,964 10,010 25,490 0,730 8,320 18,280
0
агликон
ов
О
гликози
19,92 149,10 356,65 1,00 10,0 21,00 1,00 10,5 21,00 ды
трицина
С
гликози
10,44 71,15 173,07 0,20 6,2 11,00 1,00 10,0 22,00 ДИ
трицина
О
гликози
ДИ 0,91 6,80 17,60 0,60 8,9 22,00 1,00 11,35 24,00 апигени
на
С
гликози
ды 26,38 167,30 402,63 0,05 0,53 1,20 0,04 3,70 9,00 апигени
на
О
гликози 65,93 486,70 913,00 0,01 2,36 6,80 4,00 41,6 120,0 ды лютеол
ина
С
гликози
ДЫ 36,95 245,60 592,05 0,02 0,22 0,06 0,50 6,95 21,00 лютеол
ина
О
гликози
ДЫ 31,49 177,65 399,85 0,01 0,16 0,04 0,02 0,18 0,40 кверцет
ина
С
гликози
ДЫ 8,26 54,56 127,83 0,02 0,22 0,70 0,02 0,18 0,70 кверцет
ина
О
гликози
ДЫ 4,50 22,70 56,75 6,50 67,5 180,00 10,00 108,0 260,00 рамнази
на
С
гликози
ДЫ 5,62 38,75 100,13 0,01 0,08 0,12 0,01 0,12 0,36 рамнази
на
Всего,
0- 1726,2
122,75 842,95 8,31 70,02 227,84 16,02 171,63 454,40 гликози 5
ДОВ
Всего, 87,65 577,36 1395,7 0,60 7,25 13,08 2,57 20,95 53,06 8 C- 1
гликози
ДОВ
Пользуясь методиками, которые были задействованы для определения суммарного экстракта с использованием ВЭЖХ-МС / МС, определяют качественный и количественный состав экстрактов из каждой травы отдельно.
Как видно из Таблицы 7 содержание свободных агликонов в экстрактах Вейника наземного составляет от 9,5% до 11,5%, а в экстрактах Щучки дернистой составляет от 3,8% до 4,2% от суммарного количества флавоноидных соединений и практически не зависит от соотношения сырье: экстрагент в указанном диапазоне. Приведенные данные свидетельствуют о постоянстве состава экстрагируемых веществ в модельных экстрактах.
Наибольший процент (концентрацию) смеси флавоноидных соединений (агликонов и их О-и / или С-гликозидов) содержит экстракт из смеси трав (1 : 1) при весовом соотношении сырье: экстрагент равном 3: 1, равный 9,408% (3223, 9 мг / л) от величины сухого остатка: 30300 мг / л. Наименьшее количество флавоноидных соединений (0,132% или 9,870 мг / л при сухом остатке, равном 6240 мг / л) содержит экстракт Вейника наземного при соотношении сырье: экстрагент, равном 1 : 10.
При соотношении сырья к экстрагенту, которое меньше 1 :10, флавоноидные соединения лютеолина, апигенина и кверцетина не экстрагируются и вещество теряет свою антивирусную активность. При увеличении соотношения сырье: экстрагент величины 3: 1 количество экстрагируемых О- и / или С-гликозидов не увеличивается, экстракты теряют антивирусное действие, поскольку нестабильны во времени из-за выпадения коагуляционного осадка.
Сравнительные испытания биологической активности проводились параллельно и одновременно для суммарного экстракта из смеси трав (1 : 1) и отдельных экстрактов, полученных из Вейника наземного и из Щучки дернистой с калиброванным содержанием суммы флавоноидов, равной 0,22 мг / мл. Приведенные примеры иллюстрируют свойства БАВ, но не ограничивают действие патента. Обнаруженные свойства отражены в таблицах JVoNs 1-16 и на Фиг. Фиг. 1-27.
Термины, используемые в заявке и их сокращенные версии, методики исследований являются официально принятыми (Доклинические исследования лекарственных средств (методические рекомендации). Под редакцией член-корреспондента АМН Украины О.В.Стефанова -К.: Авиценна, 2001 г., - 528с .).
ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Пример 1.
Изучение антигерпетической активности модельных экстрактов в опытах in vitro. Для изучения антивирусной активности экстрактов использовали перевиваемую культуру клеток Vero (клетки почки обезьяны). Клетки выращивали в плашках на среде RPMI-1640 + 10% фетальной сыворотки (Nunclon, Surface, Denmark) при температуре 37°С в термостате с подачей С02.
Использовали вирус герпеса 2-го типа, штамм ВН (ВПГ), инфекционный титр: 5,0 -г 7,0 lg ТЦД50 / ОД мл (ТЦД50 - тканевая цитопатогеная доза вируса, вызывает поражение 50% монослоя клеток). Для изучения антивирусной активности использовали суточные культуры клеток Vero со сплошным монослоем клеток. Среду роста удаляли и на монослой клеток наносили экстракты в разных концентрациях. Спустя один час после контактирования добавляли вирус герпеса в дозе 100 ТЦД50 и в лунки вносили поддерживающую среду (питательная среда без сыворотки).
Культуры инкубировали в термостате с подачей СОг в течение 5 суток, ежедневно контролируя с помощью микроскопа и отмечая репродукцию вируса по цитопатическому действию ВПГ на клетки Vero по сравнению с контрольными культурами, где монослой не подвергали обработке экстрактами (контроль вируса).
Цитопатическое действие ВПГ на клетки морфологически проявляется в образовании симпластов или округлых клеток в сочетании с пролиферацией и гигантскими многоядерными клетками.
Через 3 дня собирали культуральную среду из лунок плашек и определяли инфекционный титр в каждой пробе при введении различных доз модельных экстрактов. Результаты репродукции ВПГ-2 представлены в Таблице 8.
Таблица 8 Результаты влияния экспериментальных экстрактов на репродукцию ВПГ-2 в культуре клеток Vero и определение минимально активной концентрации (МАК)
Figure imgf000026_0001
В Таблице 9 приведены показатели максимально переносимой концентрации (МПК), минимально активной концентрации (МАК) и химиотерапевтического индекса (ХТИ).
Таблица 9.
Результаты определения МПК, МАК, ХТИ модельных экстрактов при их действии на вирус герпеса второго типа в культуре клеток Vero.
Figure imgf000026_0002
Исследуемые экстракты эффективно подавляют вирус герпеса 2-го типа. Минимально активная концентрация, при которой подавляется развитие вирус-специфического действия на 2,0 - 3,0 lg ТЦД50, для экстракта Щучки дернистой составила 0,017 мкг / мл, что в два раза меньше значения минимально активной концентрации (0,034 мкг / мл) для суммарного экстракта и экстракта Вейником наземного. ХТИ всех экстрактов составлял приблизительно 160.
Пример 2 Определение антигриппозной активности экстрактов в опытах in vitro.
Использовали вирус гриппа, штамм А / FM / 1/47 (H1N1), инфекционный титр алантоисной культуры - 6,0 lg EID50 / 0,2 мл.
Для определения антивирусной активности экстрактов в условиях in vitro использовали суточную перевиваемую культуру клеток MDC (клетки почки собаки) со сплошным слоем. Клетки выращивали в плашках на среде RPMI-1640 + 10% фетальной сыворотки (Nunclon, Surface, Denmark) при температуре 37° С в термостате с подачей С02. Для повышения чувствительности клеток к заражению их вирусом гриппа проводили обработку трипсином. Маточный раствор трипсина готовили добавляя до 3 г навески фермента в 3 мл питательной среды DMEM. Клетки трижды промывали этим раствором по 50 мл на лунку.
Среду роста сливали, к клеткам добавляли модельные экстракты в разных концентрациях и вносили вирус гриппа в дозе 100 ТЦЦ50.
Культуры инкубировали в термостате с подачей С02 в течение 3 суток, ежедневно контролируя с помощью микроскопа.
Через 72 часа инкубации клеток культуральную жидкость собирали и в ней определяли инфекционный титр вируса гриппа титрованием в культуре клеток. В Таблице 10 представлены результаты изучения влияния модельных экстрактов на вирус гриппа. Согласно полученным данным модельные экстракты в различных концентрациях подавляют репродукцию вируса гриппа
на 2,0 - 3,0 lg ID50, что свидетельствует об антигриппозном действии веществ как суммарного экстракта, так и экстрактов из каждой травы отдельно.
Таблица 10
Результаты влияния экспериментальных экстрактов на репродукцию вируса гриппа в культуре клеток MDCK и определение минимальной активной концентрации (МАК)
Названия экстрактов и их влияние на инфекционные титры
Концентрация суммы
вируса гриппа в lg ID50
флавоноидов в разведенных
Суммарный Экстракт Экстракт экстрактах мкг/мл
экстракт (1 :1) Вейника наземного Щучки дернистой
0,055 3,0 4,0 3,0
0,0275 2,0 4,0 3,0
0,0137 3,0 7,0 3,0 0,0068 3,0 6,0 2,0
0,0034 5,0 6,0 3,0
0,0017 5,0 6,0 7,0
Контроль вируса. 6,0 6,0 6,0
Химиотерапевтический индекс (ХТИ) модельных экстрактов по отношению к вирусу гриппа определяли путем установления соотношения максимально переносимой концентрации (МПК) в минимальной активной концентрации (МАК), при которой подавляется развитие вирус-специфического цитопатического действия на 2,0 - 3,0 lg IDso (Таблица 11).
Таблица 1 1
Результаты определения МПК, МАК и ХТИ модельных экстрактов при их действии на вирус гриппа в культуре клеток MDCK.
Figure imgf000028_0001
Все модельные экстракты являются эффективными против вируса гриппа. Инфекционной титр вируса гриппа понижается больше всего (на 3,0 lg ID50) при концентрации БАВ, равной 0,0034 мкг / мл, под действием экстракта Щучки дернистой. Наибольшая селективность действия на вирус гриппа присуща сумарному экстракту, для которого ХТИ = 808.
Пример 3.
Изучение активности экстрактов против вируса гепатита С (ВГС).
В качестве суррогатного вируса ВГС использовали вирус бычей вирусной диареи (ВБВД), который является тест-моделью вируса гепатита С.
Антивирусную активность изучали в культуре МДВК, которую обрабатывали разными разведениями экстрактов и добавляли ВБВД в дозе 100 ТЦД50. Культуры инкубировали в термостате до возникновения специфического цитопатического действия вируса в контроле, а затем в культуральной среде определяли инфекционный титр вируса. Результаты представлены в таблице 12.
Таблица 12
Результаты влияния экспериментальных экстрактов на репродукцию вируса бычей вирусной диареи и определение минимально-активной концентрации (МАК) на культуре клеток МДВК.
Figure imgf000029_0001
Анализируя полученные результаты, следует отметить, что экстракты угнетают репродукцию суррогатного вируса гепатита С на 3-2 lg ID50.
Результаты определения МПК, МАК, ХТИ при действии суммарного экстракта, экстрактов Щучки дернистой, Вейника наземного по отношению к вирусу ВБВД в культуре клеток МДВК, представлены в таблице 13.
Таблица 13
Результаты определения МПК, МАК и ХТИ экстрактов по отношению к ВБВД в культуре клеток МДВК.
Показатели МПК, МАК и ХТИ для модельных экстрактов
Показатели Суммарный экстракт Экстракт Щучки Экстракт Вейника
(1:1) дернистой наземного
МПК 5,5 2,7 5,5
МАК 0,034 0,034 0,034
ХТИ 161,7 79,4 161,7 По результатам исследований устанавливлено, что модельные экстракты являются эффективными ингибиторами суррогатного вируса гепатита С (ВБВД) с высоким показателем ХТИ.
Все экстракты подавляют вирус бычей диареи (тест-модель вируса гепатита С) на 4,0 - 5,0 lg ID50 при концентрациях, которые равны 0,0034 мкг / мл.
Пример 4.
Интерфероногенная активность модельных экстрактов in vivo.
Интерфероногенная активность была изучена в эксперименте in vivo на белых беспородных мышах, которым модельные экстракты вводили внутрибрюшинно (по 0,1 мл) в концентрации 55,5 мкг / кг. Через 24 часа мышей выводили из эксперимента путем эвтаназии и определяли интерферон (ИФН) в сыворотках крови по общепринятой методике подавления цитопатогенного действия (ЦПД) вируса везикулярного стоматита (ВВС) в гомологической культуре тканей L929. По маркеру кислоточувствительности определяли тип ИФНа. Для этой цели сыворотку крови делили на две равные части. В одной из них рН жидкости при помощи 4 N НС1 доводили до 2,0, оставляли при 4 ° С на 24 часа, а затем восстанавливали рН жидкости при помощи 4 N NaOH до 7,2.
Результаты проведенного эксперимента представлены в таблице 14.
Таблица 14
Уровни интерферона в сыроватках крови мышей, которым вводили модельные экстракты.
Figure imgf000030_0001
Poly I:Poly С - эталонный индуктор ИФН (Calbiocheus, USA)
По Маркеру чувствительности к рН было определено, что все три экстракта индуцируют γ-интерферон. Все экстракты обладают свойством индуцировать иммунный γ-интерферон. Экстракт Вейника наземного индуцирует интерферон на уровне эталонного индуктора Poly I: Poly С, а суммарный экстракт и экстракт Щучки дернистой индуцируют интерферон на уровне 25% от уровня индукции интерферона эталонным индуктором.
Пример 5
Определение апоптогенной и апоптоз-модулирующей активности БАВ.
Известно, что флавоноидные вещества достаточно активно исследуются в плане индукции апоптоза и влияния на дифференцирование клетки, поскольку они обладают избирательным действием на лейкозные и нормальные клетки.
Нами было проведено изучение цитотоксичности БАВ, способности его к индукции апоптоза и взаимодействия БАВ с цитотоксическим апоптоз-индуцирующим препаратом вепезид в системе злокачественных лимфоидных клеток человека Jurkat.
Исследования проводили на перевиваемой линии клеток Т-клеточного лимфобластного лейкоза человека Jurkat. Клетки культивировали общепринятым методом. Для исследований БАВ вносили в культуры в начале логарифмической фазы их роста.
Для анализа цитотоксичности, индукции апоптоза и распределения по фазам цикла БАВ вносили в культуральную среду суспензионных культур в указанной ниже по тексту концентрации. Жизнеспособность клеток определяли по окраске трипановым синим. По окончании инкубации с соответствующими веществами цитоцентрифугированные препараты клеток окрашивали по Паппенгейму.
Перед проведением цитометрического анализа клетки инкубировали в растворе пропидия йодида (50 мкг / мл) с 0,1% цитрата натрия и 0,1% тритона Х- 100. Флуоресценцию клеток оценивали, используя проточный цитофлуориметр FACScan фирмы "Becton Dickinson" (США). Апоптотический индекс (АИ) рассчитывали по формуле: (количество апоптичних клеток / общее количество клеток) х 100).
Распределение по фазам клеточного цикла изучали в клетках, окрашенных пропидия йодидом, с помощью проточной цитометрии.
После проведения проточной цитометрии результаты анализировали с помощью компьютерных программ ModFit LT 2.0 ("Verity Software House", Topsham, ME, США) и CELLQuest ("BD Biosciences Pharmingen»). Влияние флавоноидных веществ суммарного экстракта на рост клеток Jurkat исследовали в концентрациях 5,5 и 55 мкг / мл. Результаты приведены на Фиг. 21.
Как видно из данных кинетики роста, исследуемое вещество является малотоксичным. Эти данные совпадают с относительной нетоксичностью экстрактов на других, как суспензионных, так и монослойных культурах клеток, использованных при изучении антивирусного действия.
Следует отметить, что значительное торможение роста клеток при воздействии флавоноидных веществ экстракта в концентрации 55 мкг / мл практически не сопровождалось массовой гибелью клеток, даже при полной задержке дальнейшего роста.
Представляло интерес определить вклад апоптогенных компонентов в эффекты торможения роста клеток. Как видно из данных, приведенных на Фиг. 22 длительное (3 суток) культивирование с флавоноидными веществами экстракта, даже в дозе 5,5 мкг / мл, сопровождается небольшим увеличением процента гииодиплоидных клеток в популяции, по данным проточной цитометрии (в дополнение к спонтанному апоптозу, заметному в контрольных культурах на поздних этапах культивирования). Содержание гиподиплоидних клеток значительно увеличивается при увеличении в 10 раз концентрации флавоноидных веществ. Уже на второй день количество апоптотических клеток по сравнению со спонтанным апоптозом увеличивается на 20%.
Полученные данные свидетельствуют, что БАВ вызывает проапоптическое, а при увеличении концентрации - апоптическое действие.
Для определения возможного модифицирующего действия флавоноидных веществ на индукцию апоптоза клеток Jurkat вепезидом клетки сначала инкубировали с БАВ, а затем через 2 или 3 суток в клетки вносили вепезид в дозе 1 мкмоль / л на 1 сутки, то есть вепезид использовали в условиях достаточных, но не чрезмерных, для индукции апоптоза. Результаты приведены на Фиг.23.
Как видим, инкубация с БАВ в нетоксичных дозах приводит к значительному повышению чувствительности клеток Jurkat к действию типичного индуктора апоптоза вепезида. Практически в таких условиях достигается аддитивный эффект в отношении выхода гиподиплоидних клеток при последовательном воздействии БАВ и вепезида.
Приведенные результаты исследований указывают на то, что БАВ имеет апоптозмодулирующее воздействие. Пример 6.
Определение действия БАВ на антиоксидантный статус клеток.
Результаты известных исследований, касающихся биологических и фармакологических эффектов флавоноидов в различных экспериментальных моделях, указывают на то, что одним из механизмов биологического действия может быть их влияние на антиоксидантную систему клеток и организма, в частности, интенсивность образования и элиминации радикальных форм кислорода.
В качестве объекта исследования использовали культуры перевиваемых линий злокачественных лимфоидных клеток человека Namalwa и МТ-4, инкубированные с препаратом в течение 2, 4 или 24 часов до взятия образца. Концентрация БАВ была подобрана при антивирусных исследованиях и составляла в большинстве экспериментов 2,75 мкг / мл по гликозиду кверцетина. По окончании инкубации с БАВ, контролировали жизнеспособность клеток окрашиванием препаратов трипановым синим. Для дальнейших экспериментов по анализу антиоксидантных свойств БАВ использовали только те образцы, в которых жизнеспособность клеток по окончании инкубации составляла не менее 90%. Для изучения влияния препарата на про-антиоксидантный статус исследуемых клеток использовали методы ЭПР-спектрометрии (электронно-парамагнитной резонансной спектрометрии) и хемилюминесценции.
Скорость генерации супероксидного радикала определяли на ЭПР-спектрометре с использованием спиновой ловушки 2,2,6, 6-тетраметилпиперидина-К-оксида (TEMPO), образующей с короткоживущим супероксидом стабильный ТЕМРО-радикал. Реакция накопления стабильных ТЕМРО-радикалов в кювете спектрометра ЭПР после введения в суспензию клеток ловушки протекала линейно в течение 5-6 мин. Спектры регистрировали с минутными интервалами. По величине амплитуд второй компоненты спектра ЭПР TEMPO - радикала регистрировали скорость накопления ТЕМРО-радикала, которая соответствует скорости генерирования супероксидного радикала аниона.
Рабочий объем кюветы составлял 170 мкл. Исследования проводились при комнатной температуре. В кювету вводили или нативные (целые) клетки, или гомогенизированные на ледяной бане непосредственно перед внесением в кювету спектрометра. Дополнительно исследовали клетки, или предварительно прогретые (5 мин., 60°С), или после экспозиции при 0-10 С с целью инактивации или ингибирования ферментов, которые участвуют в цепи переноса электронов. Все растворы готовились ex tempore из перекристаллизированных реактивов марки "ч.д.а. (чистые для анализов)" и дистиллированной воды.
Нативные клетки контрольной культуры МТ-4 при комнатной температуре генерировали супероксидрадикал-анион со скоростью в среднем 0.53 нмоль / 100 тыс. клеток в 1 мин. (Фиг.. 24). После температурной обработки (60°С и 0°С) ЭПР сигнал образования ТЕМРО-комплекса отсутствовал, что свидетельствует об участии термолабильных компонентов в процессах генерации активного кислорода и об отсутствии влияния неучитываемых субстанций на результаты опыта.
При инкубации клеток МТ-4 в присутствии БАВ скорость генерации супероксидрадикала-аниона снижалась на 20-30% после 2-х часов инкубации, и больше чем на половину после 4-х часовой инкубации. Через 24 часа инкубации скорость генерирования этого радикала была близка к нулю.
Активность генерации этого радикала клетками линии Namalwa была несколько ниже чем клетками МТ-4 (в среднем 0.33 нмоль / 100 тыс. клеток в 1 мин). При этом в этих клетках отмечалось практически полное гашение генерации радикала после инкубации с БАВ во все сроки наблюдения (Фиг. 25).
Проведенные испытания БАВ свидетельствуют о наличии антиоксидантных свойств, а именно, подтверждена дозозависимая кинетика подавления генерации супероксидрадикала -аниона, а также угнетение интенсивности свободнорадикальных процессов индуцированных пероксидом водорода.
Проведено исследование влияния БАВ на интенсивность свободнорадикальных процессов, индуцированных пероксидом водорода (Н2О2).
Интенсивность свободнорадикальных процессов изучали хемилюминесцентным методом при комнатной температуре. В качестве индуктора генерации радикальных форм кислорода использовали пероксид водорода, который вводили в ячейку хемилюминометра из расчета 0,5 мл 3% Н2О2 на 1 мл суспензии клеток после предварительной регистрации базового уровня свечения клеток при открытой шторке ФЭУ (фотоэлектронного умножителя). Клетки, отмытые от культуральной среды, вводили в концентрации от 1 до 8 млн. / мл. Инкубация клеток МТ-4 с БАВ значительно меняла интенсивность хемилюминесценции клеток, атакованных Н2О2. Типичные хемилюминограммы приведены на Фиг. 27. Для образцов клеток, инкубированных в присутствии БАВ, оказалось характерным снижение хемилюминесценции в первые секунды после атаки Н202, в 2.2 раза по сравнению со свечением клеток контрольной культуры. Максимум свечения контрольных клеток регистрировался на 90-180 секундах, после чего реакция переходила в стационарную фазу с амплитудой свечения 62-75 у.е. (условные единицы). В образцах клеток, инкубированных с БАВ, развитие свободнорадикальных реакций носило вялотекущий характер - максимум свечения наступал на 270-300 секундах, а стационарный уровень - на 560-600 секундах (Фиг. 26).
Выявлено, что исследуемая БАВ проявляет антирадикальные свойства, то есть повышает устойчивость клеток к свободно-радикальному стрессу, вызванному воздействием Н202.
Приведенные примеры специфического действия БАВ свидетельствуют, что БАВ является веществом полифармакологического действия. Биологический спектр действия БАВ, полученного из смеси трав Вейника наземного и Щучки дернистой (1: 1), и спектр действия БАВ, полученных из каждой травы отдельно, одинаков и зависит только от концентрации веществ в пересчете на суммарное количество флавоноидных соединений.
Таким образом усовершенствование БАВ с определением конкретных составов действующих веществ БАВ, их физико-химических, биологических свойств приводит к изобретению его оптимального состава для антивирусного действия для конкретных вирусов, дозировок при создании лекарственных форм. Кроме того, определено, что БАВ является индуктором эндогенного интерферона типа (у), имеет апоптозмодулирующее действие, обладает антиоксидантными свойствами и повышает устойчивость клеток к свободнорадикальному стрессу. Антивирусное действие для конкретных вирусов определялось как антивирусное действие по отношению к вирусу простого герпеса типа 2, вирусу гриппа, вирусу бычьей диареи (вирусу гепатита С).
Соединения, которые входят в состав БАВ, обладают способностью блокировать развитие как ДНК, так и РНК-содержащих вирусов.
Исследуемые экстракты эффективно подавляют вирус герпеса 2-го типа. Минимально активная концентрация, при которой подавляется развитие вирус-специфического действия на 2,0 - 3,0 lg ТЦД50, для экстракта Щучки дернистой составила 0,017 мкг / мл, что в два раза меньше значения минимально активной концентрации (0,034 мкг / мл) для суммарного экстракта и экстракта Вейника наземного. ХТИ всех экстрактов составлял приблизительно 160.
Все модельные экстракты эффективны против вируса гриппа. Инфекционный титр вируса гриппа снижается больше всего (на 3,0 lg ID50) при концентрации БАВ, равной 0,0034 мкг / мл под действием экстракта Щучки дернистой. Наибольшая селективность воздействия на вирус гриппа присуща суммарному экстракту, для которого ХТИ = 808. Результаты исследований показывают, что модельные экстракты являются эффективными ингибиторами суррогатного вируса гепатита С (ВБВД) с высокими показателями ХТИ.
Все экстракты подавляют вирус бычьей диареи (тест-модель вируса гепатита С) на 4,0 - 5,0 lg ID50 при концентрациях БАВ, которые равны 0,0034 мкг / мл.
Концентрация БАВ для получения антивирусного действия 0,017 -г 0,068 мкг / мл значительно меньше таковой для синтетических веществ.
Все экстракты имеют свойство индуцировать иммунный γ-интерферон. Экстракт
Вейника наземного индуцирует интерферон на уровне эталонного индуктора Poly I: Poly С, а суммарный экстракт и экстракт Щучки дернистой индуцируют интерферон на уровне 25% от уровня индукции интерферона эталонным индуктором.
Приведенные результаты исследований указывают на то, что БАВ оказывает апоптозмодулирующее действие.
Проведенные испытания БАВ свидетельствуют о наличии антиоксидантньгх свойств, а именно подтверждена дозозависимая кинетика подавления генерации супероксидрадикала аниона, а также угнетение интенсивности свободнорадикальных процессов, индуцированных пероксидом водорода.
К тому же, предложенный БАВ не имеет недостатков, присущих синтетическим антивирусным препаратам, предоставляет возможность создания лекарственных форм с точной дозировкой и целенаправленным фармако динамическим действием.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Биологически активное вещество полифармакологического действия, полученное из зеленых частей и колосьев злаковых растений семейства Gramineae, рода Calamagrostis Adans и / или рода Deshampsia Beauv, содержащее флавоноиды, которое отличается тем, что содержит агликоны флавоноидов трицина (tricin), апигенина, лютеолина, кверцетина, рамназина и / или флавоноидные гликозиды трицина, апигенина, лютеолина, кверцетина, рамназина, вспомогательные вещества и имеет следующий состав%:
Агликон флавоноида трицина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,016 до 2,062%;
Агликон флавоноида апигенина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,010 до 1,393%;
Агликон флавоноида лютеолина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,01 до 4,979%;
Агликон флавоноида кверцетина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,001 до 0,771%;
Агликон флавоноида рамназина и / или его флавоноидные гликозиды от 0,104 до 0,203%; вспомогательные вещества от 99,868 до 90,592%.
2. Биологически активное вещество по п.1, отличающееся тем, что в качестве вспомогательных веществ содержит углеводороды соединения, аминокислоты, хлорофиллы.
3. Биологически активное вещество по п.1 или п.2, отличающееся тем, что получено из Вейника наземного (Calamagrostis epigeios L. рода Calamagrostis Adans) и / или Щучки дернистой (Deshampsia caespitosa L. рода Deshampsia Beanu).
4. Биологически активное вещество по любому из п.1-3, отличающееся тем, что содержание О-гликозидных форм флавоноидов составляет (53,545 -г 86,422)%, а С-гликозидных форм флавоноидов составляет (43,293 - 4,910)% от общего количества флавоноидных соединений, остальные агликоны флавоноидов
PCT/UA2015/000101 2015-04-24 2015-10-28 Биологически активное вещество полифармакологического действия растительного происхождения WO2016171640A1 (ru)

Priority Applications (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US15/569,076 US20180133278A1 (en) 2015-04-24 2015-10-28 Plant-based biologically active substance having a polypharmacological effect
EP15890050.6A EP3195872A4 (en) 2015-04-24 2015-10-28 Plant-based biologically active substance having a polypharmacological effect
MX2017013696A MX2017013696A (es) 2015-04-24 2015-10-28 Sustancia biologicamente activa proveniente de una planta que tiene un efecto polifarmacologico.
BR112017021292-7A BR112017021292A2 (pt) 2015-04-24 2015-10-28 substância biologicamente ativa à base de plantas com efeito polifarmacológico
AU2015391981A AU2015391981B2 (en) 2015-04-24 2015-10-28 Plant-based biologically active substance having a polypharmacological effect
CA2983299A CA2983299C (en) 2015-04-24 2015-10-28 Plant-based biologically active substance having a polypharmacological effect
EA201700340A EA033232B1 (ru) 2015-04-24 2015-10-28 Биологически активное вещество полифармакологического действия растительного происхождения
KR1020177032242A KR102461853B1 (ko) 2015-04-24 2015-10-28 식물 기원의 다원 행동 생물학적 활성 물질
CN201580079170.6A CN107530390A (zh) 2015-04-24 2015-10-28 多药性作用植物生物活性物质
US16/748,762 US20220000962A1 (en) 2015-04-24 2020-01-21 Plant-based biologically active substance having a polypharmacological effect

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
UAA201503915 2015-04-24
UAA201503915 2015-04-24

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/569,076 A-371-Of-International US20180133278A1 (en) 2015-04-24 2015-10-28 Plant-based biologically active substance having a polypharmacological effect
US16/748,762 Division US20220000962A1 (en) 2015-04-24 2020-01-21 Plant-based biologically active substance having a polypharmacological effect

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2016171640A1 true WO2016171640A1 (ru) 2016-10-27
WO2016171640A8 WO2016171640A8 (ru) 2018-03-08

Family

ID=67998792

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/UA2015/000101 WO2016171640A1 (ru) 2015-04-24 2015-10-28 Биологически активное вещество полифармакологического действия растительного происхождения

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20180133278A1 (ru)
EP (1) EP3195872A4 (ru)
KR (1) KR102461853B1 (ru)
CN (1) CN107530390A (ru)
AU (1) AU2015391981B2 (ru)
BR (1) BR112017021292A2 (ru)
CA (1) CA2983299C (ru)
EA (1) EA033232B1 (ru)
MX (1) MX2017013696A (ru)
WO (1) WO2016171640A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114796016A (zh) * 2022-05-31 2022-07-29 浙江伊瑟奇医药科技有限公司 一种私密修护精华液及其制备方法

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8933078B2 (en) 2011-07-14 2015-01-13 Research Cancer Institute Of America Method of treating cancer with combinations of histone deacetylase inhibitors (HDAC1) substances
WO2018157081A1 (en) 2017-02-27 2018-08-30 Research Cancer Institute Of America Compositions, methods, systems and/or kits for preventing and/or treating neoplasms
WO2018170457A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Research Cancer Institute Of America Compositions, methods, systems and/or kits for preventing and/or treating neoplasms
WO2021262749A1 (en) * 2020-06-26 2021-12-30 Research Cancer Institute Of America Compositions and methods for preventing and/or treating viral infection
CN113880898B (zh) * 2020-10-30 2023-07-25 杭州拉林智能科技有限公司 黄酮苷-有机胺类抗微生物剂复盐化合物及其制备方法和应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058285A1 (fr) * 2002-12-26 2004-07-15 Anatoliy Matveyevich Novyk Procede permettant d'obtenir une substance biologiquement active

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102007054985A1 (de) * 2007-11-17 2009-05-20 Gerhard Dr. Sauermann Topische Produkte zur Reduzierung der Häufigkeit von Rezidiven bei Lippenherpes
WO2009129818A1 (en) * 2008-04-21 2009-10-29 Herbonis Ag Preparation and use of a plant extract from solanum glaucophyllum with an enriched content of 1,25-dihydroxyvitamin d3 glycosides and quercetin glycosides

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058285A1 (fr) * 2002-12-26 2004-07-15 Anatoliy Matveyevich Novyk Procede permettant d'obtenir une substance biologiquement active

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURLAKA I. C. ET AL.: "«Oderzhannia ta shchentifshashchia nastoiki travi kunichnika zvichainogo ta travi shchuchnika dernistogo»", MATERIALY I MKNARODNO1 NAUKOVO-PRAKTICHPOL 1 NTERNET-KONFERENTSL «TEKHNOLOGICHNI TA BIOFARMATSEVTICHNI ASPEKTI STVORENNIA LIKARSKIKH PREPARATIB RIZNOI NAPRAVLENOSTI DII», 2014, pages 34, XP009502615 *
BURLAKA I. S.: "«Farmakognostichne vivchennia Calamagrostis epigeios (L.) roth. I Deshampsia caespitosa (L.) beauv.»", AVTOREFERAT, DIP. KAND. FARM., 2013, nauk, KHarkiv, pages 1 - 23, XP009502647 *
JEFFREY B. HARBORNE ET AL.: "«Flavonoid patterns in leaves of the Gramineae»", BIOCHEMICAL SYSTEMATICS AND ECOLOGY», vol. 4, no. 4, 1976, pages 267 - 280, XP025577076 *
KISLICHENKO V. S. ET AL.: "«Flavonoids from the aerial part of Calamagrostis epigeios»", CHEMISTRY OF NATURAL COMPOUNDS, vol. 49, no. 1, 2013, pages 133 - 134, XP018507695 *
See also references of EP3195872A4 *
STAROSILA D. B.: "«Flavonoidy-geterotsiklicheskie kislorodsoderzhaschie soedineniia, obladauschie shirokim spektrom antivirusnoi aktivnosti», tezisy dokladov nauchno-prakticheskoi konferentsii «Biologicheski aktivnye veshchestva: fundamentalnye i prikladnye voprosy polucheniia i primeneniia»", NOVY SVET, 23 May 2011 (2011-05-23), Krym, Ukraina, pages 607, XP009502619 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114796016A (zh) * 2022-05-31 2022-07-29 浙江伊瑟奇医药科技有限公司 一种私密修护精华液及其制备方法
CN114796016B (zh) * 2022-05-31 2023-03-24 浙江伊瑟奇医药科技有限公司 一种私密修护精华液及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
AU2015391981A1 (en) 2017-11-30
MX2017013696A (es) 2019-07-29
KR20170139049A (ko) 2017-12-18
AU2015391981B2 (en) 2021-08-19
EP3195872A1 (en) 2017-07-26
BR112017021292A2 (pt) 2018-12-04
WO2016171640A8 (ru) 2018-03-08
CN107530390A (zh) 2018-01-02
KR102461853B1 (ko) 2022-10-31
EP3195872A4 (en) 2018-04-11
US20180133278A1 (en) 2018-05-17
CA2983299C (en) 2022-12-06
EA033232B1 (ru) 2019-09-30
EA201700340A1 (ru) 2017-10-31
US20220000962A1 (en) 2022-01-06
CA2983299A1 (en) 2016-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220000962A1 (en) Plant-based biologically active substance having a polypharmacological effect
Jun et al. Cytotoxic activity of [beta]-Caryophyllene oxide isolated from jeju guava (Psidium cattleianum sabine) leaf
Mohammed et al. Flavonoid constituents, cytotoxic and antioxidant activities of Gleditsia triacanthos L. leaves
Nguyen et al. New prenylated isoflavonoids as protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) inhibitors from Erythrina addisoniae
Yadav et al. Antioxidant furofuran lignans from Premna integrifolia
Dang et al. α-Glucosidase inhibitors from the leaves of Embelia ribes
Jiang et al. Flavonoids from Curcuma longa leaves and their NMR assignments
Na et al. Antioxidant compounds from the stem bark of Sorbus commixta
Farid et al. Comprehensive phytochemical characterization of Raphanus raphanistrum L.: in vitro antioxidant and antihyperglycemic evaluation
Liu et al. Structural features guided “fishing” strategy to identification of flavonoids from lotus plumule in a self-built data “pool” by ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole-orbitrap high resolution mass spectrometry
Messi et al. Phenolic compounds from the roots of Ochna schweinfurthiana and their antioxidant and antiplasmodial activities
Cui et al. Analysis of bioactive constituents from the leaves of Amorpha fruticosa L.
Shimoda et al. Glycosylation of hesperetin by plant cell cultures
Besbas et al. Chemical composition, antioxidant, antihemolytic and anti-inflammatory activities of Ononis mitissima L.
CN108129295A (zh) 一类松香烷型二萜衍生物与其药物组合物和用途
Farid et al. Comparative study of Posidonia oceanica L.: LC/ESI/MS analysis, cytotoxic activity and chemosystematic significance
Noté et al. Pro-apoptotic activity of acylated triterpenoid saponins from the stem bark of Albizia chevalieri Harms
Gadetskaya et al. Phytochemical characterization and biological activity of secondary metabolites from three Limonium species
Sugimoto et al. Structure elucidation of secondary metabolites isolated from the leaves of Ixora undulate and their inhibitory activity toward advanced glycation end-products formation
Kolodziej Studies on Bignoniaceae: newbouldiosides D–F, minor phenylethanoid glycosides from Newbouldia laevis, and new flavonoids from Markhamia zanzibarica and Spathodea campanulata
Burton et al. Elucidation of a new oleanane glycoside from Barringtonia asiatica
Farid et al. Phytochemical constituents of the butanol fraction of Arum palaestinum Boiss.: cytotoxic and antiviral screening
KR101306875B1 (ko) 풍년화 추출물을 유효성분으로 포함하는 종양의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
Wang et al. On-line identification of the chemical constituents of Polygoni Multiflori Radix by UHPLC-Q-ToF MS/MS
Hamdan et al. Secondary metabolites isolated from dichloromethane fraction of rough lemon stem and hepatoprotective effect of limonianin

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15890050

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2015890050

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201700340

Country of ref document: EA

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01A

Ref document number: 112017021292

Country of ref document: BR

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2983299

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15569076

Country of ref document: US

Ref document number: MX/A/2017/013696

Country of ref document: MX

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20177032242

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015391981

Country of ref document: AU

Date of ref document: 20151028

Kind code of ref document: A

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112017021292

Country of ref document: BR

REG Reference to national code

Ref country code: BR

Ref legal event code: B01E

Ref document number: 112017021292

Country of ref document: BR

Free format text: EM ADITAMENTO A EXIGENCIA PUBLICADA NA RPI 2477, SOLICITA-SE QUE A EXIGENCIA SEJA RESPONDIDA CORRETAMENTE, NUM PRAZO DE 60 DIAS, POR MEIO DA GRU DE CODIGO 207, ESPECIFICO PARA ESSE TIPO DE SERVICO. DEVE SER FEITO O PAGAMENTO DE DUAS GRUS 207, UMA REFERENTE A PUBLICACAO RPI 2477 E OUTRA REFERENTE A ESTE ADITAMENTO.

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 112017021292

Country of ref document: BR

Kind code of ref document: A2

Effective date: 20171004