CN107714723A - pH响应纳米材料在制备防治骨质疏松抗骨吸收药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种pH响应纳米材料在制备防治骨质疏松抗骨吸收药物中的应用，利用pH响应纳米材料靶向性抑制成熟破骨细胞并同时保留破骨细胞前体，保留破骨前体细胞促进新生骨血管化的功能，从而成为更有效的防治骨质疏松的抗骨吸收药物，效果优于一线抗骨吸收药二磷酸盐，对骨质疏松的治疗具有重要意义。

Description

pH响应纳米材料在制备防治骨质疏松抗骨吸收药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及pH响应纳米材料在制备骨质疏松抗骨吸收药物中的应用。

背景技术

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是由多种原因引起，单位体积内骨组织量减少，骨密度降低为标志的全身性，进行性，代谢性骨病。OP分为原发性和继发性，其中原发性OP又分为I型绝经后OP和II型老年性OP。在所有的OP患者中，均出现单位体积内骨组织量(BV/TV)降低，骨矿密度(BMD)降低，骨微结构破坏。目前全世界OP患者约为2亿人，在50岁以上的女性中，每3名就有一位OP患者。在老龄化不断加剧的社会中，OP已经成为威胁老年人健康和降低生活质量的重要因素。

破骨细胞(Osteoclast，OC)由造血干细胞系髓系单核细胞分化而来，是人体骨骼系统中唯一具有吸收和重塑骨骼形态的生理性多核巨细胞。在OC的分化过程存在几个区别明显的阶段，从单核/巨噬细胞系到TRAP阳性的单核前体破骨细胞最后到成熟的具有骨吸收能力的多核(3核以上)极性巨细胞。每个分化阶段都有其特异性的分子标志物或功能标志。在骨吸收过程中，成熟OC能够酸化其细胞外的微环境至pH 3.0～4.0。OP患者中成熟破骨细胞活性明显提高，噬骨活动增加，破骨细胞与成骨细胞耦连作用下降，最终导致骨吸收大于骨形成，骨生理稳态遭到破坏，骨密度下降。然而，最新的研究成果提示未成熟的破骨细胞前体(POC)不仅不具备骨吸收能力，其能够通过分泌细胞因子促进血管化从而促进新骨形成。因此，在防治骨质疏松中，POC应当被保留而不是抑制。

目前治疗骨质疏松很大程度上依赖抗骨吸收类药物，其中最常用的为二磷酸盐类药物，其药理机制为抑制破骨细胞的功能和活性。然而，其抑制破骨细胞是没有选择性的，POC与成熟OC都被无选择的抑制了。而在骨质疏松的发病机制中，过度的OC介导的骨吸收只是一个方面，骨血管化水平的下降是另一个重要的方面。而二磷酸盐通过全面抑制破骨细胞仅仅解决了第一个问题却没有解决血管化水平的问题。因此，特异性的抑制成熟破骨细胞，保留了POC和其促血管化能力，对骨质疏松的治疗能够更好的效果。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种pH响应纳米材料在制备防治骨质疏松抗骨吸收药物中的应用，pH响应纳米材料靶向性抑制成熟破骨细胞并同时保留破骨细胞前体，保留破骨前体细胞促进新生骨血管化的功能，从而成为更有效的防治骨质疏松的抗骨吸收药物。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、pH响应纳米材料在制备防治骨质疏松抗骨吸收药物中的应用。

进一步，所述pH响应纳米材料为pH响应型氧化石墨烯、壳聚糖或水凝胶。

优选的，pH响应型壳聚糖由以下方法制备：将壳聚糖用质量分数10％的柠檬酸溶液溶解，然后加入经蒸馏水溶胀的明胶，然后加入戊二醇，搅拌反应后冷冻干燥，备用，使用前与抗破骨细胞融合分子交联复合，使用PEG修饰获得较好水溶性与生物相容性，即制备为pH响应纳米材料。更优选的，壳聚糖与明胶重量比为2:1；柠檬酸溶液按加入后壳聚糖终浓度为40g/ml，戊二醇加入量按戊二醇与柠檬酸溶液的体积比为7:50加入。更优选的，所述抗破骨细胞融合分子包括小分子、蛋白质和RNA等，如二磷酸盐、miRNA-7b。

进一步，所述骨质疏松为原发性骨质疏松、女性更年期导致的骨质疏松或老年性骨质疏松。

进一步，所述pH响应纳米材料在制备促进破骨细胞分化、融合、凋亡或骨吸收能力的药物中的应用。

进一步，所述pH响应纳米材料在制备改变破骨细胞骨细胞周期趋于静息状态的药物中的应用。

进一步，所述pH响应纳米材料在制备缩短成熟破骨细胞生命周期的药物中的应用。

进一步，所述pH响应纳米材料在制备增加骨密度的药物中的应用。

进一步，所述pH响应纳米材料在制备增加骨量比例的药物中的应用。

进一步，所述pH响应纳米材料在制备酶学活性改变的药物中的应用。

进一步，所述pH响应纳米材料的给药量至少为5mg/kg。

本发明的有益效果在于：本发明提供了pH响应纳米材料在制备防治骨质疏松抗骨吸收药物中的应用，为骨质疏松的治疗提供了新的药物，并且pH响应纳米材料对单核巨噬细胞(BMMS)以及原代骨髓单核细胞(BMMs)无毒性作用；体外实验显示有效剂量内浓度依赖性缩短RANKL诱导的BMMs成破骨细胞的寿命，抑制RANKL诱导的BMMs分化破骨细胞的融合能力，抑制RANKL诱导的BMMs分化成熟的破骨细胞的噬骨能力；有效剂量内浓度依赖性促进RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中趋向静息状态；有效剂量内浓度依赖性促进RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中趋向凋亡。pH响应纳米材料通过快速激活破骨细胞，促使其凋亡，从而缩短了成熟OC的生命周期。同时，pH响应纳米材料对POC无作用从而保留了其分泌PDGF-BB的能力，进而促进体内新骨形成血管化，最终使骨密度，骨量，骨小梁数量增加，起到防治骨质疏松的作用。通过体内外实验显示pH响应纳米材料与目前临床使用的一线抗骨质疏松药阿伦磷酸相比，具有更好的治疗骨质疏松的效果。

因此，pH响应纳米材料可应用于骨质疏松的防治，并且相比目前一线的临床抗骨吸收药具有更好的促血管化和抗骨质疏松效果。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为pH响应纳米材料结构和大体图及pH响应纳米材料对成熟破骨细胞的影响(A为pH响应纳米材料的示意图和大体观；B为24h与72h时不同浓度pH响应纳米材料对BMMS及BMMs细胞增殖的影响；C为流式检测72h时不同浓度pH响应纳米材料对BMMs细胞活细胞数量的影响；D为流式检测活细胞数量统计；E为透射电镜观察pH响应纳米材料在BMMs细胞的亚结构分布)。

图2为pH响应纳米材料对促进RANKL诱导的破骨细胞细胞影响(A为pH响应纳米材料对在有或者无RANKL条件下对BMMs向破骨细胞分化第三天的TRAP染色；B为阴性对照材料对BMMs向破骨细胞分化第三天的TRAP染色；C为pH响应纳米材料对在有或者无RANKL条件下对BMMs向破骨细胞分化第三天的TRAP相对强度量化；D为阴性对照材料对BMMs细胞增殖的影响；E为阴性对照材料对BMMs向破骨细胞分化第三天的TRAP相对强度量化；F为pH响应纳米材料对BMMs向破骨细胞分化第三天的FAK染色；G为破骨细胞数量及其细胞核数量的计数统计)。

图3为pH响应纳米材料浓度促进RANKL诱导的破骨细胞融合(A为不同浓度pH响应纳米材料对RANKL诱导的破骨细胞融合影响的荧光图；B为破骨细胞数量的计数统计；C为破骨细胞融合比例的量化统计；D为CD9，CD47，DC-STAMP的Western blot电泳图；E为CD9，CD47，DC-STAMP的相对表达强度统计)。

图4为pH响应纳米材料对破骨细胞骨吸收能力影响(A为不同浓度pH响应纳米材料对破骨细胞Acting Ring形成能力的影响；B为骨片吸收陷窝实验；C为胶原板吸收陷窝实验；D为正在融合的破骨细胞计数统计；E为骨片表面吸收分数统计；F为胶原板表面吸收分数统计)。

图5为pH响应纳米材料对破骨细胞静息状态与细胞凋亡的影响(A为不同浓度pH响应纳米材料无RANKL刺激下对BMMs细胞周期的影响；B为不同浓度pH响应纳米材料在RANKL刺激下对BMMs细胞周期的影响；C为pH响应纳米材料对各个细胞周期影响的量化统计；D为pH响应纳米材料对sub-G1期细胞数量改变的影响；E为pH响应纳米材料对RANKL24h或72h刺激下对BMMs细胞凋亡的影响；F为pH响应纳米材料对BMMs细胞早期和晚期凋亡影响的量化统计)。

图6为pH响应纳米材对骨质疏松小鼠骨密度和新骨形成的影响(A为不同给药浓度的pH响应纳米材料下小鼠股骨microCT结果，远端股骨骨小梁重建及组织切片H&E,Masson,TRAP染色结果；B为pH响应纳米材料对小鼠骨密度的影响；C为pH响应纳米材料对小鼠骨量的影响；D为pH响应纳米材料对小鼠骨小梁数量的影响；E为pH响应纳米材料对小鼠骨小梁分离度的影响)。

图7为pH响应纳米材料对成熟破骨细胞寿命的影响(A为时间依赖性检测pH响应纳米材料对RANKL诱导的BMMs成破骨细胞分化过程中ROS产生的情况；B为pH响应纳米材料对RANKL诱导的BMMs成破骨细胞分化过程中ATP6v0d2的表达改变情况；C为不同pH下pH响应纳米材料的氧化酶活性曲线；D为pH响应纳米材料对RANKL诱导的BMMs成破骨细胞分化过程中钙离子震荡的影响；E为pH响应纳米材料对RANKL诱导的BMMs成破骨细胞分化过程中CaMKKβ和Pyk2蛋白表达的影响；F为pH响应纳米材料对RANKL诱导的BMMs成破骨细胞分化过程中CaMKKβ和Pyk2的mRNA表达的影响)。

图8为pH响应纳米材料与阿伦磷酸钠比较(A为pH响应型纳米材料与阿仑磷酸在缓解骨质疏松，提高骨密度、骨量、骨小梁数量上的比较，提示pH响应型纳米材料更优于阿仑磷酸；B为pH响应型纳米材料与阿仑磷酸治疗的小鼠股骨切片中TRAP和PDGF-BB的表达情况；C为对上图的统计分析，提示pH响应型纳米材料对二者的促进明显优于阿仑磷酸)。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

原代BMMs由小鼠长骨骨髓细胞分离而来，在RANKL(核因子κB受体活化因子配体)以及MCSF(巨噬细胞集落刺激因子)的刺激诱导下可以向破骨细胞分化，是研究破骨细胞分化，融合，成熟，噬骨等生物学行为的常用的原代细胞模型。同时破骨细胞与成骨细胞，骨细胞，基质细胞等都有密切的关联和耦合作用，是体内骨稳态及电解质稳态以及促进骨形成的重要调控元素。骨质疏松往往由过多的骨吸收导致，是破骨细胞过度活化的结果。故选择BMMs作为细胞模型研究pH响应纳米材料对RANKL诱导的破骨细胞生成的影响。体内、外实验观察pH响应纳米材料对骨密度、量的影响，对破骨细胞数量，特异相关基因的表达及细胞周期与凋亡的影响，体外解释pH响应纳米材料pH依赖的酶学活性改变是导致其药用价值的关键机制。

本发明中pH响应纳米材料(简称CNPs)由以下方法制备，具体步骤如下：将2g壳聚糖在研钵中，称取1g明胶使用蒸馏水溶胀，加入50ml 10％柠檬酸溶液溶解壳聚糖，将溶胀后的明胶加入其中，接着加入7ml戊二醇，50℃搅拌反应后冷冻干燥，使用前将制备好的材料与抗破骨细胞融合分子包括二磷酸盐、miRNA-7b，使用PEG修饰获得较好水溶性与生物相容性，即制备为pH响应纳米材料，制得的pH响应纳米材料图1中A所示。

本发明还可以使用其他现有的pH响应纳米材料，如：pH响应型氧化石墨烯、水凝胶等均可获得相同的技术效果。

实施例1、高浓度pH响应纳米材料抑制成熟破骨细胞的活性

将BMMs细胞以1×10³个/well接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗(1％青霉素和1％链霉素)，以终浓度为0(空白对照组)、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL将pH响应纳米材料加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(100ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)诱导BMMS细胞向破骨细胞分化。分别培养24h和72h，观察pH响应纳米材料RNAKL诱导下BMMS细胞增殖作用的影响。在观察点，利用CCK-8法对细胞活性进行检测，利用流式细胞计数仪对活细胞数量进行检测，利用透射电镜对细胞-纳米颗粒作用进行了观察。结果如图1中B、C、D和E所示，横坐标为不同浓度的pH响应纳米材料给药剂量，纵坐标为以各组的吸光度OD值同空白对照组的OD值比较百分数表述的细胞活力值。由图可见，在24h组或是72h组中，较高浓度的pH响应纳米材料(小于100μg/mL)对破骨细胞分化过程中的细胞增殖无毒性影响，高浓度的pH响应纳米材料(大于200μg/mL)对破骨细胞分化过程中的细胞增殖具有明显的毒性，*P＜0.05，#P＜0.05，*为CNPs组比较，#为CNPs+RANKL比较。图1中E显示CNPs浓度为100μg/mL时大量存在于细胞内，RANKL存在下则更广泛的分布于囊泡中。

实施例2、pH响应纳米材料早期(72h内)促进RANKL诱导的破骨细胞细胞产生

分组情况：组1，无RANKL诱导，有pH响应纳米材料组；组2，RANKL(100ng/mL)诱导，1μg/mL，10μg/mL，100μg/ml pH响应纳米材料实验组；组3，RANKL(100ng/mL)诱导，1μg/mL，10μg/mL，100μg/mL三价离子实验组。

将BMMS细胞以1×10³个/well接种于96孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗(1％青霉素和1％链霉素)，将pH响应纳米材料加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(100ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)诱导BMMs细胞向破骨细胞分化。诱导培养72h后进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色。弃置培养基后用PBS清洗3次，一次3min。4％多聚甲醛固定20min，PBS清洗3次，一次3min。抗酒石酸酸性磷酸酶染液染色(0.1mg/ml of naphthol AS-MX phosphate,0.3mg/ml ofFast Red Violet LB复染)。避光染色1h，弃置染液。PBS漂洗3次后每孔加入100μL PBS待观察。光镜下可见TRAP阳性细胞被染成紫红色(图2中A、B)。根据细胞核数量统计TRAP阳性细胞个数，分别统计TRAP相对强度(图2中C、E)，图2中D为阴性对照材料对BMMs细胞增殖的影响，结果提示TRAP相对强度在毒性浓度范围内随着pH响应纳米材料给药剂量的增加而增加。证明pH响应纳米材料浓度依赖性增加破骨细胞的生成。当pH响应纳米材料给药剂量浓度为临界毒性浓度100μg/mL时，促进效果最明显(**P＜0.01)。

诱导培养72h后行FAK(Actin Cytoskeleton and Focal Adhesion Staining)免疫荧光染色。细胞取出后弃置培养基，1×PBS洗两遍，4％多聚甲醛室温下固定20min，1×PBS洗两遍。0.1％Triton X-100穿透细胞5min，1×PBS洗两遍。Blocking buffer(1％BSAin 1×PBS)固定30min。一抗(Anti-Vinculin)于Blocking buffer稀释至工作浓度(1：300)，室温孵育细胞1h。1×wash buffer(0.05％Tween-20in 1×PBS)洗三遍，每次5-10min。二抗(Alexa Fluor 488Goat Anti-Mouse IgG(H+L)Antibody,Invitrogen)稀释至工作浓度(1：500)，同时加入TRITCconjugated Phalloidin(1:500)。室温下共同孵育1h。1×wash buffer洗三遍，每次5-10min。室温下DAPI(1:1000)复染核5min，1×wash buffer洗三遍，每次5-10min。荧光显微镜观察细胞(图2中F)。统计视野下破骨细胞数量，以及破骨细胞平均核数(图2中G)。结果提示当pH响应纳米材料剂量浓度超过1μg/mL时，破骨细胞的形成收到了明显的增加，**P＜0.01。实施例3、pH响应纳米材料浓度早期(72h内)促进RANKL诱导的破骨细胞融合

分组情况：组1，RANKL(100ng/mL)诱导，无pH响应纳米材料对照组；组2，RANKL(100ng/mL)诱导，1μg/mLpH响应纳米材料实验组；组3，RANKL(100ng/mL)诱导，10μg/mLpH响应纳米材料实验组；组4，RANKL(100ng/mL)诱导，100μg/mL pH响应纳米材料实验组。

将BMMS细胞以1×10⁵个/well接种于6孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗(1％青霉素和1％链霉素)，以终浓度为0、1μg/mL、10μg/mL、100μg/mL将pH响应纳米材料加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(100ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)诱导BMMS细胞向破骨细胞分化。诱导培养72h后进行membranedye DiI和cell content marker Cell tracker green免疫荧光染色。室温孵育30分钟后，弃置培养基，1×PBS洗两遍，将一孔的细胞刮下加入另一染色孔。细胞培养箱孵育2h后取出在荧光显微镜下观察细胞(图3中A)。另外通过Western Blot检测融合相关分子CD9，CD47，DC-STAMP的表达情况(图3中D)。统计视野下破骨细胞数量，以及破骨细胞融合比例。结果提示当pH响应纳米材料剂量浓度超过1μg/mL时，破骨细胞的形成即收到了明显的促进，**P＜0.01(图3中B)。同时可见当pH响应纳米材料剂量浓度超过10μg/mL时，破骨细胞的融合比例显著增加，**P＜0.01(图3中C)。另外RANKL依赖的融合分子CD9，DC-STAMP表达都随着CNPs的添加而增加**P＜0.01(图3中E)。

实施例4、pH响应纳米材料早期(72h内)促进破骨细胞骨吸收能力

分组情况：组1，RANKL(100ng/mL)诱导，无pH响应纳米材料对照组；组2，RANKL(100ng/mL)诱导，1μg/mL pH响应纳米材料实验组；组3，RANKL(100ng/mL)诱导，10μg/mLpH响应纳米材料实验组；组4，RANKL(100ng/mL)诱导，100μg/mL pH响应纳米材料实验组。

将BMMS细胞以4×10³个/well接种于铺200μm小牛骨片的48孔板或胶原板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗(1％青霉素和1％链霉素)，将pH响应纳米材料加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(100ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)诱导BMMS细胞向破骨细胞分化(除外空白对照组)。96小时后取出含小牛骨片的48孔板，弃置培养基。10％漂白剂(HClO)室温漂白5min。双蒸水清洗3遍，每次5min。室温下放置至干燥(3-5小时)。甲苯胺蓝染液染色5min。双蒸水漂洗3-5遍，每次5min。每孔加入200μl双蒸水或1×PBS，光镜下观察。另外通过FAK染色观察破骨细胞actin ring形成情况。结果图4所示，结果显示，正在融合的破骨细胞数量增加，提示破骨细胞功能增强。骨表面经破骨细胞吸收后可被甲苯胺蓝染成蓝色，根据蓝色噬骨面积的大小和占总骨面的百分比评价破骨细胞的噬骨能力。结果可见未加入RANKL诱导的空白对照组无骨吸收。加入RANKL(100ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)诱导，100μg/mLpH响应纳米材料对照组骨吸收表面比例与实验组相比最大(**P<0.01)。各实验组随着pH响应纳米材料给药剂量浓度的提高，破骨细胞骨吸收能力显著提高，毒性剂量内最明显的pH响应纳米材料剂量浓度为100μg/mL(**P<0.01)。

实施例5、pH响应纳米材料晚期(72h后)使破骨细胞趋于静息状态与细胞凋亡

分组情况：组1，RANKL(100ng/mL)诱导，无pH响应纳米材料对照组；组2，RANKL(100ng/mL)诱导，1μg/mLpH响应纳米材料实验组；组3，RANKL(100ng/mL)诱导，10μg/mLpH响应纳米材料实验组；组4，RANKL(100ng/mL)诱导，100μg/mL pH响应纳米材料实验组。

将BMMS细胞以1×10⁴个/well接种于6孔板，待细胞长满后弃掉培养基，培养基成分为：DMEM高糖培养液+10％胎牛血清+1％双抗(1％青霉素和1％链霉素)，将pH响应纳米材料加入各个含新鲜培养基的孔板中，同时以RANKL(50ng/mL)、M-CSF(50ng/mL)诱导BMMS细胞向破骨细胞分化。诱导培养72h后取出，弃置培养基。将细胞刮下，行PI染色，使用流式细胞仪检测细胞周期情况。行Annexin/PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，结果如图5所示。

结果可见CNPs能够显著将细胞趋于静息状态无论有无RANKL(**P<0.01)。在RANKL的刺激下，CNPs能够显著提升处于sub-G1状态下的细胞数量(**P<0.01)。细胞凋亡检测结果提示，随着pH响应纳米材料给药浓度剂量的增加，破骨细胞的早期凋亡率梯度增加，体现出pH响应纳米材料具有促进破骨细胞早期凋亡的能力。

实施例6、pH响应纳米材治疗骨质疏松小鼠，提高骨密度，增加新骨形成

取15只0周龄OVX C57BL/6J雌性小鼠。分组情况：组1，无pH响应纳米材料对照组组(n＝5)；组2，5mg/kg pH响应纳米材料实验组(n＝5)；组3，5mg/kg pH响应纳米材料实验组(n＝5)。给药持续4周，每周给药一次。通过小动物microCT检测骨微结构进行分析。管电压为50kV，管电流为0.1mA，分辨率为8mm。股骨扫描区域限定为远端干垢端，向近端的初级松质近末端区域延伸2mm。选定的感兴趣区(ROI)的3D参数用于数据分析，包括：骨矿物质密度、连接密度、结构模型指数、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度和相对骨体积分数。将小鼠的股骨分离，使用EDTA脱钙3周。脱钙后的股骨制作石蜡切片，行H&E染色，Masson染色和TRAP染色，结果如图6所示。结果显示pH响应纳米材料浓度依赖性提高小鼠骨密度，单位体积内骨组织量，骨小梁数量以及降低了骨小梁分离度(图6，B-E)。组织学分析提示骨量增加，同时破骨细胞体内数量也同样增加(图6，A)。

实施例7、pH响应纳米材料pH依赖酶学活性改变使ROS，钙振荡增加缩短成熟破骨细胞寿命

分组情况：组1，无RANKL诱导，无pH响应纳米材料对照组；组2，RANKL(100ng/mL)诱导，100μg/mLpH响应纳米材料实验组；组3，无RANKL诱导，100μg/mLpH响应纳米材料实验组；组4，RANKL(100ng/mL)诱导，100μg/mLpH响应纳米材料实验组。ROS检测分别于24h，36h，48h，和72h时间点检测。同时氢离子泵ATP6v0d2的表达也在相应时间点检测。通过氧化活性检测CNPs在不同pH下氧化酶活性随时间的变化。钙振荡的分组情况如下：组1，无RANKL诱导，无pH响应纳米材料对照组；组2，RANKL(100ng/mL)诱导，无pH响应纳米材料实验组；组3，RANKL(100ng/mL)诱导，100μg/mLpH响应纳米材料实验组。另外通过Western Blot检测CaMKKbeta及PYK2的表达情况，结果如图7所示。结果显示，CNPs在48h之前能够抑制ROS阳性细胞的数量，在48h和72h能够极大的增加ROS阳性细胞的强度(图7，A)。另外CNPs能够在RANKL的作用下，随时间显著增加氢离子泵ATP6v0d2的表达(图7，B)。氧化活性实验提示CNPs在pH为4.0时氧化性显著增加(图7，C)。钙振荡实验提示CNPs能够显著增加RANKL诱导钙振荡的幅度和频率(图7，D)。另外CaMKKbeta与PYK2的蛋白与mRNA表达都显著增加(图7，E)。这说明pH依赖的酶活性改变是CNPs快速激活破骨细胞并使其凋亡的原因。机制则是通过ROS的堆积和钙振荡的激活。

实施例8、pH响应纳米材料优于一线抗骨吸收药阿伦磷酸钠并能通过保留PDGF-BB的分泌促进新骨血管化

取20只0周龄OVX C57BL/6J雌性小鼠。分组情况：组1，假手术无pH响应纳米材料阴性对照组(n＝5)；组2，OVX阳性对照组(n＝5)；组3，OVX阿仑膦酸钠治疗组(n＝5)；组4，OVXpH响应纳米材料治疗组(n＝5)。给药持续4周，每周给药一次。通过小动物microCT检测骨微结构进行分析。管电压为50kV，管电流为0.1mA，分辨率为8mm。股骨扫描区域限定为远端干垢端，向近端的初级松质近末端区域延伸2mm。选定的感兴趣区(ROI)的3D参数用于数据分析，包括：骨矿物质密度、连接密度、结构模型指数、骨小梁数量、骨小梁厚度、骨小梁分离度和相对骨体积分数。将小鼠的股骨分离，使用EDTA脱钙3周。脱钙后的股骨制作冰冻切片，行免疫荧光染色检测TRAP和PDGF-BB。

结果显示，pH响应纳米材料在提高小鼠骨密度，单位体积内骨组织量，骨小梁数量以及降低了骨小梁分离度方面均优于一线抗骨吸收药阿仑膦酸钠(图8中A)。组织学分析提示PDGF-BB的表达在pH响应纳米材料组中明显高于阿仑膦酸钠，并保留了部分前体破骨细胞(图8中B,C)。

综上所述，pH响应纳米材料通过对破骨过度激活导致其最终凋亡。因此大大缩短了成熟破骨细胞的细胞寿命，与此同时保留下来的破骨细胞前体继续分泌PDGF-BB促进血管化与成骨，增加骨密度，骨量。pH响应纳米材料可应用于骨质疏松的防治，尤其是破骨细胞活跃相关的骨质疏松症中，并对骨形成中的血管发生有明显的促进作用。疗效优于目前一线抗骨吸收药物阿仑膦酸钠。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.pH响应纳米材料在制备防治骨质疏松抗骨吸收药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述pH响应纳米材料为pH响应型氧化石墨烯、壳聚糖或水凝胶。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述骨质疏松为原发性骨质疏松、女性更年期导致的骨质疏松或老年性骨质疏松。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述pH响应纳米材料在制备促进破骨细胞分化、融合、凋亡或骨吸收能力的药物中的应用。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述pH响应纳米材料在制备改变破骨细胞骨细胞周期趋于静息状态的药物中的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述pH响应纳米材料在制备缩短成熟破骨细胞生命周期的药物中的应用。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述pH响应纳米材料在制备增加骨密度的药物中的应用。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述pH响应纳米材料在制备增加骨量比例的药物中的应用。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述pH响应纳米材料在制备pH依赖酶学活性改变的药物中的应用。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述pH响应纳米材料的给药量至少为5mg/kg。