CN102429926A - 一种利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙的方法。取定量的发酵牛胆汁，每1000ml加入1000~4000ml饱和氧化钙溶液以及5~15g焦亚硫酸钠，对其进行搅拌、加热至沸腾，滤取棕红色沉淀物；在棕红色沉淀物中，加入适量的水进行搅拌、洗涤，静置后滤去上清液，以除去水溶性杂质，再向沉淀中加入总重量35~55%的胆红素、5~15%的胆酸、2.5~7.5%的去氧胆酸、0.3~0.6%的硫酸锌、0.3~0.6%的硫酸镁后，搅拌混匀；冷冻后低温真空干燥除水。使用该方法，可以提高复合胆红素钙盐的收率及干燥效率，从而降低生产成本，提高生产效率。

Description

一种利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙的方法

技术领域

    本发明属于制药技术领域，涉及一种中药原料药的中间体的制造方法，尤其涉及一种利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙的方法。

背景技术

牛黄即牛胆结石，天然牛胆结石的形成是多种因素共同作用的结果，首先要有形成牛黄的适宜条件，其次要有形成牛黄的物质基础。当胆汁受到细菌感染时一方面使胆汁PH下降，酸性环境引起胆汁中蛋白质的沉降，另一方面它利用胆汁中的蛋白质、碳水化合物等大分子物质，结果导致胆汁的粘度下降。若胆汁粘度高，新形成的牛黄小颗粒在胆汁中悬浮，不易沉降和粘附。低粘度的胆汁，牛黄小颗粒易发生沉淀、附着和聚集，并形成大的牛黄块，大的牛黄块不易因胆汁的流动而丢失。细菌还能降解胆酸，胆酸对游离胆红素有助溶作用，其本身还能与钙等金属离子结合，抑制胆红素钙盐的形成。细菌产生的粘液也参与了牛黄的形成。其次细菌产生的β－葡萄糖醛酸苷酶能将胆汁中的结合胆红素转变为游离胆红素，后者能与钙等金属离子形成胆红素钙盐，其进一步与蛋白－多糖复合物形成牛黄小颗粒。牛黄小颗粒在蛋白质沉降形成的核心上沉集，并逐层增大。

通过对具有药用价值的牛结石上的沉集层进行分析，通过生物、化学的方法可以得到与天然结石沉集层上成份一致的物质即复合胆红素钙盐（牛黄小颗粒），

复合胆红素钙为体外培育牛黄的主要组成成份，复合胆红素钙的收率和生产效率直接影响体外培育牛黄的生产成本。

武汉同济医科大学附属同济医院肝胆外科蔡红娇医师1989年申报了“一种人工体外制作牛胆结石的方法”的发明专利（ZL89100505.6），2000年，由武汉大鹏药业有限公司组织科研人员在ZL89100505.6发明专利的基础上，根据1990年版《中国药典》要求，研制了一种新的在牛体外制备牛胆结石（即体外培育牛黄）的方法（ZL01133550.5）。该方法既适应规模化生产要求，生产出的产品又能满足新的《中国药典》要求。该专利中复合胆红素钙的生产方法是：取出定量的发酵胆汁，加入1~4倍量澄清饱和钙溶液，对其进行搅拌、加热至沸腾，滤取棕红色沉淀物；在棕红色沉淀物中，加入适量的水进行搅拌、洗涤，静置后滤去上清液，再依据药用要求加入适量的胆红素、胆酸、去氧胆酸和无机盐后，搅拌混匀，干燥备用。

在生产实践中发现，按上述技术，加热至沸腾的过程部分游离的胆红素被氧化，导致与钙及蛋白质等生物活物质结合的胆红素减少，影响复合胆红素钙的收率。并且干燥时间过长，干燥时易结块，导致受热不均匀，对后续粉碎带来不利影响。随着生产规模的不断扩大，提高复合胆红素钙盐的收率及干燥效率将会为企业带来可观的经济效益。

发明内容

本发明是在ZL01133550.5发明专利的基础上，而研发的一种新的利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙的方法。使用该方法，可以提高复合胆红素钙盐的收率及干燥效率，从而降低生产成本，提高生产效率。

本发明所提供的利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙的方法，具体方案是：

（1）取1000~4000ml纯化水加入20~40g氧化钙，搅拌，即得饱和氧化钙溶液；

（2）取出定量的发酵牛胆汁，每1000ml加入1000~4000ml饱和氧化钙溶液以及5~15g焦亚硫酸钠，对其进行搅拌、加热至沸腾，滤取棕红色沉淀物；

（3）在棕红色沉淀物中，加入适量的水进行搅拌、洗涤，静置后滤去上清液，以除去水溶性杂质，再向沉淀中加入总重量35~55%的胆红素、5~15%的胆酸、2.5~7.5%的去氧胆酸、0.3~0.6%的硫酸锌、0.3~0.6%的硫酸镁后，搅拌混匀；

（4）冷冻后低温真空干燥除水。

发酵牛胆汁按照本领域通常方法制备，一般包括如下步骤： 

（1）调节天然牛胆汁中的牛磺酸含量，使其达到药用要求3%~7%，

（2）将大肠杆菌、变形杆菌或肠球菌的单一菌液或其组合菌液接种到牛胆汁中，进行发酵处理。

在向发酵牛胆汁中，加入澄清饱和氧化钙溶液的同时加入焦亚硫酸钠，当升温到沸腾的过程中抗氧剂首先被氧化，对胆红素起到了有效的保护作用，防止了其被氧化。

在低温条件下，水以晶体形式存在于复合胆红素钙中，当在低温、低真空度的条件下干燥时，水在短时间内由晶体状态直接变为气态而挥发，在复合胆红素钙中留下空隙，使其变的疏松而易于处理。其次在低温条件下，有效的保护了蛋白－多糖复合物等生物活性物质的药理活性。

附图说明

图1 利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙的操作流程图。

具体实施方式

实施例1

（1）取出新鲜牛胆汁，按优质牛黄的要求，调节牛磺酸含量使其达到7%(g/ml)，置于消毒罐内，低温保存备用。

（2）将牛胆汁置于发酵罐，按每10000ml牛胆汁接种100ml菌体溶液的比例，将大肠杆菌和变形杆菌的组合菌液接种至牛胆汁中，发酵80小时，即得发酵牛胆汁。

（3）取发酵牛胆汁10000ml加入11000ml澄清饱和氧化钙溶液及5g焦亚硫酸钠，搅拌、煮沸，冷却后取出棕红色沉淀物。

（4）棕红色沉淀物加纯化水10000 ml，充分搅拌，静置后倾去上清液，每569g沉淀（干重）加入胆红素350g，再加入胆酸50g、去氧胆酸25g、硫酸锌3g、硫酸镁3g，搅拌、混匀。

（5）放入低温冷冻箱中，－10℃冷冻16小时，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.085Mpa，40℃干燥48小时，即得复合胆红素钙。

实施例2

（1）杀牛时，在无菌操作重要条件下，摘取胆囊，先用无杂质、未受污染、金黄色者，倾出胆汁于消毒罐内，按优质牛黄的要求，调节牛磺酸含量使其达到6%(g/ml)，低温保存备用。

（2）将牛胆汁置于发酵罐，按每10000ml牛胆汁接种200ml菌体溶液的比例，将大肠杆菌接种至牛胆汁中，发酵96小时，即得发酵牛胆汁。

（3）取发酵牛胆汁10000ml加入30000ml澄清饱和氧化钙溶液及10g焦亚硫酸钠，搅拌、煮沸，冷却后取出棕红色沉淀物。

    （4）棕红色沉淀物加纯化水10000 ml，充分搅拌，静置后倾去上清液，每390g沉淀（干重）加入胆红素450g，再加入胆酸100g、去氧胆酸50g、硫酸锌5g、硫酸镁5g，搅拌、混匀，备用。

（5）放入低温冷冻箱中，－8℃冷冻20小时，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.085Mpa，50℃干燥36小时，即得复合胆红素钙。

实施例3

（1）取出新鲜牛胆汁，置于消毒罐内，低温保存备用。

（2）将牛胆汁置于发酵罐，按每10000ml牛胆汁接种300ml菌体溶液的比例，将肠球菌接种至牛胆汁中，发酵92小时，即得发酵牛胆汁。

（3）取发酵牛胆汁10000ml加入40000ml澄清饱和氧化钙溶液及15g焦亚硫酸钠，搅拌、煮沸，冷却后取出棕红色沉淀物。

     （4）棕红色沉淀物加纯化水10000 ml，充分搅拌，静置后倾去上清液，每213g沉淀（干重）加入胆红素550g，再加入胆酸150g、去氧胆酸75g、硫酸锌6g、硫酸镁6g，搅拌、混匀，备用。

（5）放入低温冷冻箱中，－5℃冷冻24小时，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.085Mpa，60℃干燥24小时，即得复合胆红素钙。

Claims (3)

1.一种利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙的方法，其特征是：

（1）取1000~4000ml纯化水加入20~40g氧化钙，搅拌，即得饱和氧化钙溶液；

（2）取出定量的发酵牛胆汁，每1000ml加入1000~4000ml饱和氧化钙溶液以及5~15g焦亚硫酸钠，对其进行搅拌、加热至沸腾，滤取棕红色沉淀物；

（3）在棕红色沉淀物中，加入适量的水进行搅拌、洗涤，静置后滤去上清液，以除去水溶性杂质，再向沉淀中加入总重量35~55%的胆红素、5~15%的胆酸、2.5~7.5%的去氧胆酸、0.3~0.6%的硫酸锌、0.3~0.6%的硫酸镁后，搅拌混匀；

（4）冷冻后低温真空干燥除水。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述冰冻后低温干燥过程为：

将配好的复合胆红素钙放入低温冷冻箱中，－5℃至－10℃冷冻20分钟，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.085Mpa，干燥24小时。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征是，所述发酵牛胆汁的制备包括如下步骤： 

（1）调节天然牛胆汁中的牛磺酸含量，使其达到药用要求，

（2）将大肠杆菌、变形杆菌或肠球菌的单一菌液或其组合菌液接种到牛胆汁中，进行发酵处理。

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