CN102429927B - 一种制备牛胆结石的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种制备牛胆结石的方法。将菌液接种到牛胆汁中，进行发酵处理，然后利用蒸汽进行灭活处理；发酵牛胆汁中加入饱和氧化钙溶液以及焦亚硫酸钠，搅拌、加热至沸腾，滤取棕红色沉淀物；再向沉淀中加入胆红素、胆酸、去氧胆酸、硫酸锌、硫酸镁后，搅拌混匀，冷冻后低温真空干燥；在15~37℃下，复合胆红素钙中添加发酵牛胆汁、抗氧剂、纯化水，充分搅拌后，静置，制成成石胆汁；对成石胆汁用酸液进行pH调节在6.8以下，然后进行偏轴定向旋转，待其类球形结石形成后，停止旋转；对结石进行整形和冷冻干燥即得到成品。该方法生产周期更短，效率更高，适合更大规模的工业化生产要求。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域，涉及一种中药原料药的制造方法，尤其涉及一种制备牛胆结石的方法。
背景技术
牛胆结石即牛黄，是珍贵的中药材。它具有清心、豁痰、开窍、凉肝、息风、解毒等功效。我国许多名贵中成药，如：安宫牛黄丸、六神丸等均以牛黄为主药配制而成。但是牛体内自然成石率仅为1~2%，因此，药用资源非常稀缺，价格昂贵，依赖进口，不仅花费了大量的外汇，而且也制约了我国传统医药工业的发展。
1956年以来，我国的医药工作者积极从事人工牛黄的研究，1971年人工牛黄应用于中成药组方中，部分缓解了天然牛黄的供需矛盾。但这种人工牛黄主要是胆酸、猪去氧胆酸和极微量的胆红素以及大量淀粉研末过筛而得的粉末，不是牛胆结石，其成份、结构、含量及已知各种微量成份均与天然牛黄相差太远，不具备天然牛黄的性状、结构、成份、含量特征，临床疗效远不及天然牛黄。
上世纪70年代以来，我国云南、广东、内蒙等地的医药工作者，在活牛胆囊内培植牛黄的实验研究获得了成功。但需对牛体进行剖腹手术并且该手术比较复杂，而且2~3年才能剖腹取出尼龙丝网，刮下棕黄色附着物。成石率低，产量小，胆红素含量低，质量不稳定。而且，此产品并不是牛胆结石，而是沉积在尼龙丝网上的棕黄色胆色素钙颗粒及粘液刮下干燥后所形成的粉末。也不可能规模化生产。
上世纪70年代初，武汉同济医科大学附属同济医院肝胆外科蔡红娇医师在对人类胆结石形成的原因和机理进行研究并获得成功的基础上，进一步用此原理进行牛胆囊胆汁内培育牛胆结石的研究，取得了成功并于1989年申报了“一种人工体外制作牛胆结石的方法”的发明专利（申请号89100505.6）。利用该方法制作的牛胆结石，其外观、结构、成份、含量与天然牛黄基本相同。但是限于当时的条件，特别是1985版《中国药典》对牛黄的胆酸、胆红素含量未作规定，因此，其制成的牛胆结石的胆红素、胆酸等含量较低。不仅如此，上述方法除配方的牛胆汁之外，制备胆红素钙，多用猪胆汁代替，胆汁未经细菌发酵即可以成石。因此，其制成的牛胆结石却含有猪去氧胆酸。中国药典1990年版一部明确规定：牛黄是牛胆结石，含胆红素35%以上，胆酸6%以上，并规定了相应的鉴别和检测方法。因此用上述方法制成的牛胆结石不能满足新的《中国药典》对牛胆结石规定的药用要求。
2000年，由武汉大鹏药业有限公司组织科研人员在ZL89100505.6发明专利的基础上，根据1990年版《中国药典》要求，研制了一种新的在牛体外制备牛胆结石（即体外培育牛黄）的方法。该方法既适应规模化生产要求，生产出的产品又能满足新的《中国药典》要求。并于2001年申报了专利（申请号01133550.5）。该方法是在牛胆汁加入一定量的大肠杆菌、肠球菌、变形杆菌的单一菌液或其组合菌液，对牛胆汁进行细菌发酵处理。再利用发酵牛胆汁和澄清饱和钙盐溶液制取有效成份的沉淀物，然后根据药用要求加入适量的胆红素、胆酸、去氧胆酸和无机盐后，制作复合胆红素钙。再利用复合胆红素钙和发酵牛胆汁在体外培育牛胆结石。由于现在生产规模不断扩大，原方法中的有效成份容易分解，自然干燥方式周期太长，已不能适应更大规模的工业化生产要求。
发明内容
本发明是在ZL01133550.5发明专利的基础上，根据更大规模的工业化生产要求和成本控制原则而研发的一种生产周期更短，效率更高的在牛体外制作牛胆结石（即体外培育牛黄）的方法。
本发明的技术方案如下：
1、制备发酵牛胆汁
(1)调节天然牛胆汁中的牛磺酸含量至3~7%（g/ml），使其达到药用要求；
(2)牛胆汁入罐后利用蒸汽进行灭菌处理，然后按每10000ml牛胆汁接种100~500ml菌液的比例，将大肠杆菌、变形杆菌或肠球菌的单一菌液或其组合菌液接种到牛胆汁中，进行发酵处理；
（3）发酵完成后利用蒸汽对发酵液进行灭活处理。
2、利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙
（1）取1000~4000ml纯化水加入20~40g氧化钙，搅拌，即得饱和氧化钙溶液。
（2）取出定量的发酵牛胆汁，每1000ml加入1000~4000ml饱和氧化钙溶液以及5~15g焦亚硫酸钠，对其进行搅拌、加热至沸腾，滤取棕红色沉淀物；
（3）在棕红色沉淀物中，加入适量的水进行搅拌、洗涤，静置后滤去上清液，以除去水溶性杂质，再向沉淀中加入总重量35~55%的胆红素、5~15%的胆酸、2.5~7.5%的去氧胆酸、0.3~0.6%的硫酸锌、0.3~0.6%的硫酸镁后，搅拌混匀；
（4）冷冻后低温真空干燥；
3、在15℃-37℃条件下，利用发酵牛胆汁和复合胆红素钙在牛体外培育牛胆结石
（1）制备成石胆汁
在15~37℃下，每千克干燥的复合胆红素钙中添加500~1500ml发酵牛胆汁、0.4g~1.2g焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠或硫代硫酸钠的单一组份或其混合物作为抗氧剂，再按发酵牛胆汁：纯化水＝（1~3）：1的体积比例加入适量的纯化水，充分搅拌后，静置，制成成石胆汁；
（2）培育牛胆结石
对成石胆汁用酸液进行pH调节，使其pH值在6.8以下，然后对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待其类球形结石形成后，停止旋转，静置培育，取出结石。
（3）牛胆结石的整形
取出结石，放入整形机中，在转速300~500转/分钟，温度18~26℃的条件下整形15~30分钟。
（4）牛胆结石的低温真空干燥
将整形后的牛胆结石放入低温真空干燥箱中，在温度20~40℃，真空度0.015~0.045MPa的条件下干燥18~30小时。
本发明接种发酵前牛胆汁中含有杂菌，对后面发酵菌种的生长繁殖有一定抑制作用。对牛胆汁进行灭菌处理可以有效杀灭牛胆汁和发酵罐中的杂菌，发酵母液得到了纯化，使发酵菌种在其中有足够的营养而旺盛生长，大大提高了生产效率。
本发明发酵完成后菌体会产出废物，经过灭活处理后能防止菌体代谢的后期废物的产出，保证了产品质量。
本发明在加入澄清饱和钙溶液的同时加入适量抗氧剂偏重亚硫酸钠，当升温到沸腾的过程中抗氧剂首先被氧化，对胆红素起到了有效的保护作用，防止了其被氧化。
本发明当在低温、低真空度的条件下干燥时，水在短时间内由晶体状态直接变为气态而挥发，在复合胆红素钙中留下空隙，使其变的疏松而易于处理。其次在低温条件下，有效的保护了蛋白－多糖复合物等生物活性物质的药理活性。
本发明在制备成石牛胆汁过程中加入抗氧剂，其是一类能够有效阻止或延缓自动氧化的物质，主要用于防止药物的氧化变质。药物的氧化反应是引起药物不稳定的主要因素之一。胆红素的氧化分解是含有自由基的自氧化过程，在这一过程中仅有很少的氧就能引起反应。而空气中的氧气占21%（v/v），在如此多氧的存在下，胆红素不需要其他氧化剂的参与，室温就能自发引起“自氧化反应”。这种反应的过程很复杂，属于游离基诱发的“链反应”，光和热能加速这种反应的进行，微量的金属离子或过氧化物也会催化这种反应。在自氧化过程中，抗氧剂的作用是提供电子或有效氢离子，供给自由基接受，使自氧化链反应中断。胆红素氧化的结果，使有效成份的含量降低，影响了产品疗效。抗氧剂本身是一种还原剂，与有效成份同时存在时，抗氧剂遇氧后首先被氧化，对易氧化的有效成份起到保护作用，从而保证有效成份的稳定性。
本发明使成形后的牛胆结石在整形机中不断地、连续地、重复地做出复杂的多轨迹运动，从而使牛胆结石表面坚固、致密、平整、光滑，有效地改善了产品的均一性，提高了成品率，杜绝了表面物料的脱落，减少了有效成份的损耗，提高了产品质量。
本发明根据2010版《中国药典》的规定，体外培育牛黄的水分应控制在9%以下。牛胆结石中的水分子在负压的环境下，沸点降低，从而能够在较低的温度下迅速从产品的孔隙中变成气态并被抽走，最终能够在较短的周期内达到干燥的目的，符合2010版《中国药典》的要求。而且，始终保持低温环境，也最大程度地避免了胆红素等有效成份的降解。
根据本发明制备的牛胆结石各项指标均符合2010版《中国药典》关于体外培育牛黄的要求，而且生产周期大大缩短，有效减少了能源耗用，成本明显下降。具有较好的社会效益和经济效益。
具体实施方式
实施例1
（1）牛胆汁的获取
取出新鲜牛胆汁，调节牛磺酸含量使其达到3%，低温保存备用。
（2）制备发酵牛胆汁
a.将牛胆汁置于发酵罐中，开启蒸汽使发酵罐内液温升至105℃后灭菌15分钟后关蒸汽。开启冷却水降低温度，待温度降到室温时打开接种口盖，进行无菌处理后，按每10000ml牛胆汁接种100ml菌体溶液的比例，将大肠杆菌和变形杆菌的组合菌液接种至牛胆汁中，盖紧接种口。开启搅拌，调节蒸汽量，使料液温度稳定至42℃发酵。
b.发酵72小时后，开搅拌，调节蒸汽量升温至105℃，温度维持105℃，对发酵液进行灭菌15分钟，开启冷却水降低温度，待温度降到室温后停止降温。
（3）制备复合胆红素钙
a.取发酵牛胆汁10000ml加入11000ml澄清饱和氧化钙溶液及5g焦亚硫酸钠，搅拌、煮沸，冷却后取出棕红色沉淀物。
b. 棕红色沉淀物加纯化水10000 ml，充分搅拌，静置后倾去上清液，每569g沉淀（干重）加入胆红素350g，再加入胆酸50g、去氧胆酸25g、硫酸锌3g、硫酸镁3g，搅拌、混匀。
c.放入低温冷冻箱中，－10℃冷冻16小时，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.085Mpa，40℃干燥48小时，即得复合胆红素钙。
（4）在37℃室温条件下培育药用牛胆结石
a.取500ml的发酵牛胆汁，在37℃下加入到1Kg的复合胆红素钙中（复合胆红素按干燥后的重量计算），再加入0.4g焦亚硫酸钠，再加入500ml纯化水，充分搅拌后，静置，制成成石胆汁。成石胆汁用酸液进行pH调节，使其pH值在6.0以下。然后对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待其形成类球形结石后，停止旋转，静置培育，取出结石。
b.取出结石，放入整形机中，调整转速至300转/分钟，在温度18℃、相对湿度60%的条件下整形15分钟，取出结石。
c.将整形后的结石放入低温真空干燥箱中，在温度20℃，真空度0.015MPa的条件下干燥30小时。即得牛胆结石成品。
上述成品呈均一的球形，直径0.5-3cm，表面光滑，呈黄红色至棕黄色。体轻，质松脆，断面有同心层纹。经紫外分光光度计检测胆红素含量，薄层扫描仪检测胆酸含量，符合《中国药典》2010版P162中体外培育牛黄的标准规定。
实施例2
（1）牛胆汁的获取
取出新鲜牛胆汁，调节牛磺酸含量使其达到5%，低温保存备用。
（2）制备发酵牛胆汁
a.将牛胆汁置于发酵罐中，开启蒸汽使发酵罐内液温升至108℃后灭菌15分钟后关蒸汽。开启冷却水降低温度，待温度降到室温时打开接种口盖，进行无菌处理后，按每10000ml牛胆汁接种300ml菌体溶液的比例，将大肠杆菌接种至牛胆汁中，盖紧接种口。开启搅拌，调节蒸汽量，使料液温度稳定至40℃发酵。
b.发酵60小时后，开搅拌，调节蒸汽量升温至108℃，温度维持108℃，对发酵液进行灭菌15分钟，开启冷却水降低温度，待温度降到室温后停止降温。
（3）制备复合胆红素钙
a.取发酵牛胆汁10000ml加入30000ml澄清饱和氧化钙溶液及10g焦亚硫酸钠，搅拌、煮沸，冷却后取出棕红色沉淀物。
b. 棕红色沉淀物加纯化水10000 ml，充分搅拌，静置后倾去上清液，每390g沉淀（干重）加入胆红素450g，再加入胆酸100g、去氧胆酸50g、硫酸锌5g、硫酸镁5g，搅拌、混匀，备用。
c.放入低温冷冻箱中，－8℃冷冻20小时，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.085Mpa，50℃干燥36小时，即得复合胆红素钙。
（4）在26℃室温条件下培育药用牛胆结石
a.取1000ml的发酵牛胆汁，在26℃下加入到1Kg的复合胆红素钙中（复合胆红素按干燥后的重量计算），再加入0.8g亚硫酸氢钠，再加入500ml纯化水，充分搅拌后，静置，制成成石胆汁。成石胆汁用酸液进行PH调节，使其PH值在6.4以下。然后对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待其形成类球形结石后，停止旋转，静置培育，取出结石。
b.取出结石，放入整形机中，调整转速至400转/分钟，在温度22℃、相对湿度65%的条件下整形15分钟，取出结石。
c.将整形后的结石放入低温真空干燥箱中，在温度30℃，真空度0.03MPa的条件下干燥24小时。即得牛胆结石成品。
上述成品呈均一的球形，直径0.5-3cm，表面光滑，呈黄红色至棕黄色。体轻，质松脆，断面有同心层纹。经紫外分光光度计检测胆红素含量，薄层扫描仪检测胆酸含量，符合《中国药典》2010版P162中体外培育牛黄的标准规定。
实施例3
（1）牛胆汁的获取
取出新鲜牛胆汁，调节牛磺酸含量使其达到7%，低温保存备用。
（2）制备发酵牛胆汁
a. 将牛胆汁置于发酵罐，开启蒸汽使发酵罐内液温升至110℃后灭菌15分钟后关蒸汽。开启冷却水降低温度，待温度降到室温时打开接种口盖，进行无菌处理后，按每10000ml牛胆汁接种500ml菌体溶液的比例，将肠球菌接种至牛胆汁中，盖紧接种口。开启搅拌，调节蒸汽量，使料液温度稳定至37℃发酵。
b. 发酵48小时后，开搅拌，调节蒸汽量升温至110℃，温度维持110℃，对发酵液进行灭菌15分钟，开启冷却水降低温度，待温度降到室温后停止降温。
（3）制备复合胆红素钙
a.取发酵牛胆汁10000ml加入40000ml澄清饱和氧化钙溶液及15g焦亚硫酸钠，搅拌、煮沸，冷却后取出棕红色沉淀物。
b. 棕红色沉淀物加纯化水10000 ml，充分搅拌，静置后倾去上清液，每213g沉淀（干重）加入胆红素550g，再加入胆酸150g、去氧胆酸75g、硫酸锌6g、硫酸镁6g，搅拌、混匀，备用。
c.放入低温冷冻箱中，－5℃冷冻24小时，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.085Mpa，60℃干燥24小时，即得复合胆红素钙。
（4）在15℃室温条件下培育药用牛胆结石
a.取1500ml的发酵牛胆汁，在15℃下加入到1Kg的复合胆红素钙中（复合胆红素按干燥后的重量计算），再加入1.2g硫代硫酸钠，再加入500ml纯化水，充分搅拌后，静置，制成成石胆汁。成石胆汁用酸液进行pH调节，使其pH值在6.8以下。然后对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待其形成类球形结石后，停止旋转，静置培育，取出结石。
b.取出结石，放入整形机中，调整转速至500转/分钟，在温度26℃、相对湿度70%的条件下整形15分钟，取出结石。
c.将整形后的结石放入低温真空干燥箱中，在温度40℃，真空度0.045MPa的条件下干燥18小时。即得牛胆结石成品。
上述成品呈均一的球形，直径0.5-3cm，表面光滑，呈黄红色至棕黄色。体轻，质松脆，断面有同心层纹。经紫外分光光度计检测胆红素含量，薄层扫描仪检测胆酸含量，符合《中国药典》2010版P162中体外培育牛黄的标准规定。
Claims (4)
1.一种牛胆结石的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
一、制备发酵牛胆汁
(1)调节天然牛胆汁中的牛磺酸含量至3～7%；
(2)牛胆汁入罐后利用蒸汽进行灭菌处理，然后按每10000ml牛胆汁接种100～500ml菌液的比例，将大肠杆菌、变形杆菌或肠球菌的单一菌液或其组合菌液接种到牛胆汁中，进行发酵处理；
（3）发酵完成后利用蒸汽对发酵液进行灭活处理；
二、利用发酵牛胆汁制备复合胆红素钙
（1）取1000～4000ml纯化水加入20～40g氧化钙，搅拌，即得饱和氧化钙溶液；
（2）取出定量的发酵牛胆汁，每1000ml加入1000～4000ml饱和氧化钙溶液以及5～15g焦亚硫酸钠，对其进行搅拌、加热至沸腾，滤取棕红色沉淀物；
（3）在棕红色沉淀物中，加入适量的水进行搅拌、洗涤，静置后滤去上清液，以除去水溶性杂质，再向沉淀中加入总重量35～55%的胆红素、5～15%的胆酸、2.5～7.5%的去氧胆酸、0.3～0.6%的硫酸锌、0.3～0.6%的硫酸镁后，搅拌混匀；
（4）冷冻后低温真空干燥；
三、在15℃-37℃条件下，利用发酵牛胆汁和复合胆红素钙在牛体外培育牛胆结石
（1）制备成石胆汁
在15～37℃下，每千克干燥的复合胆红素钙中添加500～1500ml发酵牛胆汁、0.4g～1.2g焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠或硫代硫酸钠的单一组份或其混合物作为抗氧剂，再按发酵牛胆汁：纯化水＝（1～3）：1的体积比例加入适量的纯化水，充分搅拌后，静置，制成成石胆汁；
（2）培育牛胆结石
对成石胆汁用酸液进行pH调节，使其pH值在6.8以下，然后对成石胆汁进行偏轴定向旋转，待其类球形结石形成后，停止旋转，静置培育，取出结石；
（3）牛胆结石的整形；
（4）牛胆结石的低温真空干燥。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤二中，将配好的复合胆红素钙放入低温冷冻箱中，－5℃至－10℃冷冻20分钟，之后转入真空干燥箱中，抽真空到0.085MPa，干燥24小时。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，牛胆结石的整形具体为：放入整形机中，在转速300~500转/分钟，温度18～26℃的条件下整形15~30分钟。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤三中，牛胆结石的低温真空干燥具体为：将整形后的牛胆结石放入低温真空干燥箱中，在温度20~40℃，真空度0.015～0.045MPa的条件下干燥18~30小时。
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