CN110302422B - 一种硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶及其制备方法与应用。本发明首先制备硅酸钙镁纳米空心球,然后将其分散于羧甲基壳聚糖和β‑甘油磷酸钠的配合物溶液中经30‑70℃处理制得。本发明制备方法简单,反应条件易于实现;所用原料廉价易得,成本低。所得温敏水凝胶安全、细胞毒性低,生物相容性好,低温流动性好,37℃时迅速变为凝胶,且变为凝胶后表面疏松多孔,具有较大的比表面积,利于神经干细胞的吸附;其中的硅酸钙镁纳米空心球均匀的分散于温敏水凝胶中,其材料本身能够对神经细胞分化产生促进作用;应用于修复脑组织损伤,能够有效促进神经干细胞的吸附并向神经元及神经胶质分化,具有较强的临床应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶及其制备方法与应用,属于生物材料技术领域。
背景技术
脑损伤是一种极其严重的神经系统损伤类型,以高死亡率、高致残率、高治疗费用、长恢复时间为显著特点,严重威胁人类生命健康及生活水平,给社会和家庭都带来沉重的负担。目前对脑组织损伤并没有简单有效的治疗方法,大多数情况下只能依赖患者的细胞生长能力自行修复,较为新颖的异体神经干细胞修复技术也存在注射入患处的神经干细胞无法稳定存在于患处并定向分化的问题。
近年来,生物医学、材料科学、组织工程学的快速发展及相互交叉交流给许多亟待解决的生物医学问题带来了许多解决办法,也给传统的材料科学研究带来了新的生机;以生物材料、种子细胞和生长因子为基本要素的神经系统组织修复工程,有望克服传统神经系统组织修复的问题,实现真正意义上的神经系统组织修复。
水凝胶因其柔软、不定型等特殊的机械性能,可与人体软组织较好的结合兼容,在生物医学领域逐渐得到重视。目前,水凝胶应用于神经系统组织修复已有报道。如,中国专利文献CN 107778496A公开了一种掺杂有聚苯胺的高强导电水凝胶及其制备方法和应用,以2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和乙烯基咪唑为主体的水凝胶,并在凝胶上包覆一层掺杂态聚苯胺,赋予凝胶导电性,通过微弱电流的刺激,促进神经干细胞向神经元方向分化。但该发明中的水凝胶是经过自由基聚合制备,制备过程需要进行充分清洗,废水产生量大,并且最终所得水凝胶中不可避免的含有有机溶剂、未反应单体等有害物质,细胞毒性大;所得水凝胶生物相容性欠佳,而生物相容性是评判某种材料能否用于生物医学的重要判据;并且其不具备温敏性,比表面积低,吸附能力欠佳,不利于后续应用。
此外,现有的水凝胶多作为支架材料,能够赋予的功能有限。如在促进神经修复的方面多是基于水凝胶材料对生长因子的吸附和释放功能,从而对神经分化产生影响;鲜有利用无机-有机复合材料制备的能够促进神经分化的支架材料。而且,传统水凝胶的应用前后不发生形态变化,这就要求在手术修复中,提前制备特定形状进行填充,并且会造成较大的创伤面积,不利于组织修复以及水凝胶的充分紧密填充。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明提供一种硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶及其制备方法。本发明首先制备硅酸钙镁纳米空心球,然后将其分散于羧甲基壳聚糖和β-甘油磷酸钠的配合物溶液中制得硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶。本发明制备方法简单,反应条件易于实现;所用原料廉价易得,成本低。所得水凝胶安全、细胞毒性低,生物相容性好,具有较大的比表面积;其为温敏水凝胶,具有低温流动性好,37℃时迅速变为凝胶的特性,且变为凝胶后表面疏松多孔;其中的硅酸钙镁纳米空心球均匀的分散于水凝胶中,其材料本身能够对神经细胞分化产生促进作用。
本发明还提供上述硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的应用,应用于修复脑组织损伤,能够有效促进神经干细胞的吸附并向神经元及神经胶质分化,具有较强的临床应用前景。
本发明的技术方案如下:
一种硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶,所述温敏水凝胶是水凝胶中均匀分散有硅酸钙镁纳米空心微球,所述硅酸钙镁纳米空心微球的粒径为100-300nm。
根据本发明优选的,所述温敏水凝胶具有在4℃-25℃下流动性好,37℃时迅速变为凝胶的特性;且变为凝胶后疏松多孔,孔隙分布均匀且相互连通。
上述硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的制备方法,包括步骤:
(1)将可溶性镁盐、可溶性钙盐、铵盐和氨水溶于水中,加入单分散纳米二氧化硅微球,超声分散20-40min;然后于150-190℃下水热反应10-15h,经过滤、洗涤、干燥得硅酸钙镁纳米空心微球;
(2)将羧甲基壳聚糖盐酸水溶液和β-甘油磷酸钠水溶液混合均匀,得配合物溶液;加入步骤(1)制备的硅酸钙镁纳米空心微球,分散混合均匀后,于30-70℃处理4-8h,得到硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶。
根据本发明优选的,步骤(1)中,所述可溶性镁盐为氯化镁,可溶性钙盐为氯化钙,铵盐为氯化铵,氨水的质量浓度为20-30%;优选的,氨水的质量浓度为25%。
根据本发明优选的,步骤(1)中,所述可溶性镁盐、可溶性钙盐和铵盐的摩尔比为0.4-0.7:1:4-7,所述铵盐的质量和氨水的体积比为200-300mg/mL,所述可溶性钙盐和水的质量比为0.004-0.007:1;优选的,所述可溶性镁盐、可溶性钙盐和铵盐的摩尔比为0.5-0.6:1:5-6,所述铵盐的质量和氨水的体积比为270-280mg/mL,所述可溶性钙盐和水的质量比为0.005-0.006:1。
根据本发明优选的,步骤(1)中,所述单分散纳米二氧化硅微球和可溶性钙盐的质量比为1:1-4;优选的,所述单分散纳米二氧化硅微球和可溶性钙盐的质量比为1:2-3。
根据本发明优选的,步骤(1)中,所述水热反应温度为170℃,水热反应时间为12h。
根据本发明优选的,步骤(1)中,所述洗涤是用去离子水和乙醇交替洗涤;所述干燥是进行冷冻干燥。
根据本发明,步骤(1)中,所述单分散纳米二氧化硅微球可按现有技术采用Stber法制备得到。优选按下述方法制备得到:将无水乙醇、水和质量浓度为25%的氨水混合均匀得A液;将正硅酸乙酯(TEOS)充分溶于无水乙醇中得B液;在15-25℃下,将B液缓慢倒入A液中,反应8-10h至体系呈浑浊状态后,经过滤、洗涤、干燥,即得单分散纳米二氧化硅微球。
优选的,所述A液中,无水乙醇、水和质量浓度为25%的氨水的体积比为37-38:1:3;所述B液中,正硅酸乙酯和无水乙醇的体积比为1:10-15;所述B液和A液的体积比为1:3-5。
根据本发明优选的,步骤(2)中,所述羧甲基壳聚糖的脱乙酰度≥95%。
根据本发明优选的,步骤(2)中,所述羧甲基壳聚糖盐酸水溶液是将羧甲基壳聚糖溶于浓度为0.05-0.15mol/L的盐酸水溶液中制得,所述羧甲基壳聚糖的质量与盐酸水溶液的体积比为1:3-5g/mL;β-甘油磷酸钠水溶液是将β-甘油磷酸钠溶于水中制得,所述β-甘油磷酸钠的质量和水的体积比为0.005-0.15g/mL。
根据本发明优选的,步骤(2)中,所述羧甲基壳聚糖、β-甘油磷酸钠和硅酸钙镁纳米空心微球的质量比为8-12:1:1;优选的,所述羧甲基壳聚糖、β-甘油磷酸钠和硅酸钙镁纳米空心微球的质量比为10:1:1。
上述硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的应用,应用于促进神经干细胞向神经元及神经胶质分化,进而修复脑组织损伤。
本发明的技术特点及有益效果如下:
1、本发明首先采用Stber法制备单分散纳米二氧化硅实心微球。然后利用所得二氧化硅微球进一步与可溶性镁盐、可溶性钙盐、铵盐和氨水混合进行水热反应制备硅酸钙镁纳米空心球。将所得硅酸钙镁纳米空心球分散于羧甲基壳聚糖和β-甘油磷酸钠的配合物溶液中制得硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶。本发明制备方法相对简单,反应条件易于实现;制备过程不使用有机溶剂等有害物质,废液产生量少,绿色环保;所用原料廉价易得,成本低。
2、由于本发明制备过程中不使用有机溶剂等有害物质,使所得温敏水凝胶安全、细胞毒性低;且其具有低温(4℃-25℃)流动性好,37℃时迅速变为凝胶的特性,且变为凝胶后疏松多孔,孔隙分布均匀可控(合成水凝胶时处理温度越高,孔隙越大)且相互连通;其中的硅酸钙镁纳米空心球均匀的分散于水凝胶中,硅酸钙镁纳米球的空心结构以及水凝胶的多孔结构使得本发明所得水凝胶具有较大的比表面积。
3、本发明制备的温敏水凝胶生物相容性好,且安全、方便、可操作性强,可用于修复脑组织损伤,具有较强的临床应用前景。本发明温敏水凝胶中水凝胶的多孔结构以及硅酸钙镁球的空心结构使其具有较大的比表面积,能够有效促进神经干细胞的吸附,利于细胞生长贴附。本发明温敏水凝胶中的水凝胶主要是起快速成型的载体作用,担当了组织修复的支架;其具有温敏性,允许在实际应用中实现微创注射治疗,避免大范围开放性手术创口,注入体内时在体温作用下迅速凝固成型,实现体内的紧密填充并防止硅酸钙镁纳米空心球被体液带走。本发明温敏水凝胶中的硅酸钙镁纳米空心球作用于水凝胶孔隙中的神经干细胞,促进神经干细胞向神经元及神经胶质分化,进而修复脑组织损伤。随着神经干细胞的分化及生命体的自我修复,水凝胶会慢慢降解,从而慢慢释放硅酸钙镁纳米空心球,硅酸钙镁纳米空心球进一步被神经干细胞胞吞,随神经干细胞进行新陈代谢,从而进一步促进神经干细胞的分化。另外,本发明制备的温敏水凝胶中固体含量适宜,使得其整体机械性能适宜,与生命体具有较好的机械适配性。而且本发明水凝胶中的羧甲基壳聚糖本身也具有抑菌效果。
附图说明
图1是实施例1制备的硅酸钙镁纳米空心微球的SEM图;
图2是实施例1制备的硅酸钙镁纳米空心微球的TEM图;
图3是实施例1制备的硅酸钙镁纳米空心微球的XRD图;
图4是实施例1制备的硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的SEM图;
图5是实施例1制备的硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶在4℃条件下的照片;
图6是实施例1制备的硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶在37℃条件下的照片;
图7是实施例1制备的硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶凝固后在紫外灯激发下的照片;
图8是对比例3制备的纯水凝胶的SEM图;
图9是试验例中原代神经干细胞的显微镜照片;
图10是试验例中二代神经干细胞的显微镜照片;
图11是试验例中三代神经干细胞的显微镜照片;
图12是试验例中经温敏水凝胶培养的三代神经干细胞的显微镜照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明,但不限于此。
同时下述的实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例中所用羧甲基壳聚糖,脱乙酰度≥95%,macklin公司有售。
实施例1
一种硅酸钙镁纳米空心微球改性温敏水凝胶的制备方法,包括步骤:
(1)单分散纳米二氧化硅微球的制备
根据Stber法制备单分散纳米二氧化硅微球,即:将150mL无水乙醇,4mL水和12mL的氨水(25wt%)混合,超声震荡 15 min,记为A液;将5mL的正硅酸乙酯(TEOS)溶于50 m L无水乙醇,超声震荡25 min,记为B液。将A液在25℃温度下恒温搅拌 10 min 后,缓慢倒入B液,25℃反应8h至溶液呈浑浊状态后进行收集,收集液经过滤、洗涤后得到滤渣,滤渣置于100 ℃的真空干燥箱中干燥 2 h 以上,即制得单分散纳米二氧化硅微球。
(2)硅酸钙镁纳米空心球的制备
称取 115 mg MgCl2· 6H2O、111mgCaCl2和276 mgNH4Cl 溶解在 20 m L 去离子水中,并加入 1 m L 氨水(25wt%)混合均匀。将50 mg步骤(1)制备的二氧化硅微球均匀分散于20mL 去离子水中,并超声处理 30 min。将上述两种溶液混合均匀后转移到 50 mL 水热釜中,并在170 ℃下反应12 h。反应结束后,自然冷却至室温,过滤、经去离子水和乙醇交替洗涤,最后进行冷冻干燥,即得硅酸钙镁纳米空心球。
(3)硅酸钙镁纳米空心微球改性温敏水凝胶的制备
称取5g羧甲基壳聚糖加入20mL0.1mol/L盐酸水溶液中,搅拌溶解,得羧甲基壳聚糖盐酸水溶液。称取0.5gβ-甘油磷酸钠溶解于5mL纯水中,在连续搅拌下,缓慢滴加入上述羧甲基壳聚糖盐酸水溶液中,得到清澈透明的配合物溶液;再加入500mg步骤(1)制备的硅酸钙镁纳米空心微球,搅拌15 min混合均匀;然后于45℃水浴中,达到初始凝胶化温度后,恒温6h,得到硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶。
本实施例步骤(2)制备的硅酸钙镁纳米空心球的SEM图和TEM图如图1和2 所示,由SEM图可看出,该硅酸钙镁微球大小均匀、分散性好,直径约100nm,表面较粗糙。由TEM图可看出该硅酸钙镁微球为空心结构。
本实施例步骤(2)制备的硅酸钙镁纳米空心球的XRD图如图3所示,由图3可知,该微球主要结晶相为硅酸钙镁。
本实施例制备的硅酸钙镁纳米空心微球改性温敏水凝胶的SEM图如图4所示,由图可知,该温敏水凝胶为疏松多孔结构,且孔隙之间相互连通,允许细胞在内部生长增殖。
图5为本实施例制备的温敏水凝胶在4℃条件下的照片,由图5可看出该水凝胶在4℃条件下流动性较好。
图6为本实施例制备的温敏水凝胶在37℃状态下的照片,由图5可看出该水凝胶在37℃状态下流动性较差,已经凝固成型呈胶冻状。
图7为本实施例制备的温敏水凝胶凝固后在紫外灯激发下的照片,其发出了黄绿色荧光,符合羧甲基壳聚糖具有广泛荧光的特点,表明该温敏水凝胶材料主要由羧甲基壳聚糖组成。
本实施例制备的温敏水凝胶中固体含量适宜,使得温敏水凝胶整体机械性能适宜,与生命体具有较好的机械适配性。
实施例2
一种硅酸钙镁纳米空心微球改性温敏水凝胶的制备方法,包括步骤:
(1)单分散纳米二氧化硅微球的制备
如实施例1所述;
(2)硅酸钙镁纳米空心球的制备
称取 115 mg MgCl2· 6H2O、111mgCaCl2和276 mgNH4Cl 溶解在 20 m L 去离子水中,并加入 1 m L 氨水(25wt%)混合均匀。将55 mg步骤(1)制备的二氧化硅微球均匀分散于20mL 去离子水中,并超声处理 30 min。将上述两种溶液混合均匀后转移到 50 mL 水热釜中,并在150 ℃下反应15h。反应结束后,自然冷却至室温,过滤、经去离子水和乙醇交替洗涤,最后进行冷冻干燥,即得硅酸钙镁纳米空心球。
(3)硅酸钙镁纳米空心微球改性温敏水凝胶的制备
称取6g羧甲基壳聚糖加入20mL0.1mol/L盐酸水溶液中,搅拌溶解,得羧甲基壳聚糖盐酸水溶液。称取0.5gβ-甘油磷酸钠溶解于5mL纯水中,在连续搅拌下,缓慢滴加入上述羧甲基壳聚糖盐酸水溶液中,得到清澈透明的配合物溶液;再加入500mg步骤(1)制备的硅酸钙镁纳米空心微球,搅拌15 min混合均匀;然后于30℃水浴中,达到初始凝胶化温度后,恒温4h,得到硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶。
实施例3
一种硅酸钙镁纳米空心微球改性温敏水凝胶的制备方法,包括步骤:
(1)单分散纳米二氧化硅微球的制备
如实施例1所述;
(2)硅酸钙镁纳米空心球的制备
称取 115 mg MgCl2· 6H2O、111mgCaCl2和276 mgNH4Cl 溶解在 20 m L 去离子水中,并加入 1 m L 氨水(25wt%)混合均匀。将40 mg步骤(1)制备的二氧化硅微球均匀分散于20mL 去离子水中,并超声处理 30 min。将上述两种溶液混合均匀后转移到 50 mL 水热釜中,并在190 ℃下反应10h。反应结束后,自然冷却至室温,过滤、经去离子水和乙醇交替洗涤,最后进行冷冻干燥,即得硅酸钙镁纳米空心球。
(3)硅酸钙镁纳米空心微球改性温敏水凝胶的制备
称取4g羧甲基壳聚糖加入20mL0.1mol/L盐酸水溶液中,搅拌溶解,得羧甲基壳聚糖盐酸水溶液。称取0.5g β-甘油磷酸钠溶解于5mL纯水中,在连续搅拌下,缓慢滴加入上述羧甲基壳聚糖盐酸水溶液中,得到清澈透明的配合物溶液;再加入500mg步骤(1)制备的硅酸钙镁纳米空心微球,搅拌15 min混合均匀;然后于70℃水浴中,达到初始凝胶化温度后,恒温7h,得到硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶。
对比例1
一种硅酸钙镁纳米空心微球改性温敏水凝胶的制备方法,包括步骤:
(1)单分散纳米二氧化硅微球的制备
根据Stber法制备单分散纳米二氧化硅微球,即:将150mL无水乙醇,4mL水和12mL的氨水(25wt%)混合,超声震荡 15 min,记为A液;将10mL的正硅酸乙酯(TEOS)溶于50 m L无水乙醇,超声震荡25 min,记为B液。将A液在25℃温度下恒温搅拌 10 min 后,缓慢倒入B液,25℃反应10h至溶液呈浑浊状态后进行收集,收集液经过滤、洗涤后得到滤渣,滤渣置于100 ℃的真空干燥箱中干燥 2 h 以上,即制得单分散纳米二氧化硅微球。
(2)硅酸钙镁纳米空心球的制备
称取 115 mg MgCl2· 6H2O、111mg CaCl2和276 mg NH4Cl 溶解在 20 m L 去离子水中,并加入 1 m L 氨水(25wt%)混合均匀。将100 mg步骤(1)制备的二氧化硅微球均匀分散于20mL 去离子水中,并超声处理 30 min。将上述两种溶液混合均匀后转移到 50 mL水热釜中,并在200℃下反应12 h。反应结束后,自然冷却至室温,过滤、经去离子水和乙醇交替洗涤,最后进行冷冻干燥,即得硅酸钙镁纳米空心球。
(3)负载硅酸钙镁纳米空心微球的温敏水凝胶的制备
称取5g羧甲基壳聚糖加入50mL 0.1mol/L盐酸水溶液中,搅拌溶解,得羧甲基壳聚糖盐酸水溶液。称取0.5g β-甘油磷酸钠溶解于5mL纯水中,在连续搅拌下,缓慢滴加入上述羧甲基壳聚糖盐酸水溶液中,得到清澈透明的配合物溶液;再加入500mg步骤(1)制备的单分散纳米硅酸钙镁微球,搅拌15 min混合均匀;然后于45℃水浴中,达到初始凝胶化温度后,恒温12h,得到负载硅酸钙镁纳米空心微球的温敏水凝胶。
本对比例步骤(2)制备的硅酸钙镁纳米空心球大小不够均匀且直径较大(直径约为600nm),表面较实施例1所得空心球粗糙,很难通过胞吞作用进入神经干细胞,从而使其对神经干细胞的分化作用不如本发明实施例1。本对比例步骤(3)制备的温敏水凝胶中固体含量较低,导致水凝胶整体机械性能较差,与生命体的机械适配性较低。
对比例2
一种硅酸钙镁纳米空心微球改性温敏水凝胶的制备方法,包括步骤:
(1)单分散纳米二氧化硅微球的制备
根据Stber法制备单分散纳米二氧化硅微球,即:将150mL无水乙醇,4mL水和12mL的氨水(25wt%)混合,超声震荡 15 min,记为A液;将2mL的正硅酸乙酯(TEOS)溶于50 m L无水乙醇,超声震荡25 min,记为B液。将A液在25℃温度下恒温搅拌 10 min 后,缓慢倒入B液, 25℃反应6h至溶液呈浑浊状态后进行收集,收集液经过滤、洗涤后得到滤渣,滤渣置于100 ℃的真空干燥箱中干燥 2 h 以上,即制得单分散纳米二氧化硅微球。
(2)硅酸钙镁纳米空心球的制备
称取 115 mg MgCl2· 6H2O、111mg CaCl2和276 mg NH4Cl 溶解在 20 m L 去离子水中,并加入 1 m L 氨水(25wt%)混合均匀。将30 mg步骤(1)制备的二氧化硅微球均匀分散于20mL 去离子水中,并超声处理 30 min。将上述两种溶液混合均匀后转移到 50 mL水热釜中,并在170℃下反应12 h。反应结束后,自然冷却至室温,过滤、经去离子水和乙醇交替洗涤,最后进行冷冻干燥,即得硅酸钙镁纳米空心球。
(3)负载硅酸钙镁纳米空心微球的温敏水凝胶的制备
称取5g羧甲基壳聚糖加入20mL 0.1mol/L盐酸水溶液中,搅拌溶解,得羧甲基壳聚糖盐酸水溶液。称取0.5g β-甘油磷酸钠溶解于5mL纯水中,在连续搅拌下,缓慢滴加入上述羧甲基壳聚糖盐酸水溶液中,得到清澈透明的配合物溶液;再加入500mg步骤(1)制备的单分散纳米硅酸钙镁微球,搅拌15 min混合均匀;然后于45℃水浴中,达到初始凝胶化温度后,恒温12h,得到负载硅酸钙镁纳米空心微球的温敏水凝胶。
本对比例步骤(2)制备的硅酸钙镁纳米空心球大小不够均匀且直径太小(直径约为50nm),比较容易团聚成大颗粒,表面较实施例1所得空心球粗糙,很难通过胞吞作用进入神经干细胞,从而使其对神经干细胞的分化作用不如本发明实施例1。本对比例步骤(3)制备的硅酸钙镁纳米空心微球改性温敏水凝胶恒温时间过长致使其中固体含量过高,导致水凝胶吸水性差,整体偏硬,与生命体的机械适配性较低。
对比例3
一种水凝胶的制备方法,包括步骤如下:
称取5g羧甲基壳聚糖加入20mL 0.1mol/L盐酸水溶液中,搅拌溶解,得羧甲基壳聚糖盐酸水溶液。称取0.5g β-甘油磷酸钠溶解于5mL纯水中,在连续搅拌下,缓慢滴加入上述羧甲基壳聚糖盐酸水溶液中,得到清澈透明的配合物溶液;再继续搅拌15 min混合均匀;然后于45℃水浴中,达到初始凝胶化温度后,恒温6h,得到纯水凝胶。
本对比例制备的水凝胶的SEM图如图8所示,由图8可知,该水凝胶为疏松多孔结构,且孔隙之间相互连通。
应用例
将水凝胶应用于修复脑组织损伤试验。
试验样品:实施例1及对比例3制备的最终产物
试验方法如下:
(1)小鼠神经干细胞的提取培养:提取实验的前一天将手术弯盘2个、眼科剪1把、止血钳4把、手术剪3把、直头镊子3把、弯头镊子3把、200目滤网一个进行高压灭菌,放置于60度烘箱烘干备用。实验动物由山东大学医学院实验动物中心提供。
孕14天的小鼠,10%水合氯醛麻醉后脱颈处死,然后用75%的酒精浸泡15min除菌,在生物安全柜内剪开腹部皮肤及肌肉,取出胚胎置入4℃预冷的PBS缓冲溶液中。取下胚胎头部,在10倍解剖镜下剥离脑膜及血管,取左右脑的大脑皮层,置于4℃预冷的PBS缓冲溶液中,然后剪碎成约0.1cm3大小的碎片并反复吹打,通过200目铜网过滤,取滤液加入预先配制的无血清培养基,接种于培养瓶中后放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。每天加1ml新的无血清培养基,3-5天传代,采用常规倒置显微镜通过明场直接观察细胞的生长状态。原代、二代、三代神经干细胞的显微镜照片如图9-11所示。
(2)将试验样品滴加到12孔细胞培养板中,紫外照射30min灭菌后放入37℃培养箱中固化成型。然后将培养到第三代的神经干细胞用胰酶消化后轻柔吹打为单细胞悬液,加到成型后的温敏水凝胶表面,直至浸没整块水凝胶。在恒温37℃的培养箱中培养12h后,采用常规倒置显微镜通过明场直接观察细胞形态。
经本发明实施例1温敏水凝胶培养的三代神经干细胞的显微镜照片如图12所示,可见,神经干细胞进行了分化,说明本发明制备的硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶能够有效促进神经干细胞向神经元及神经胶质分化,进而修复脑组织损伤。而经对比例3中纯水凝胶培养的三代神经干细胞分化程度较弱,说明硅酸钙镁纳米空心微球对神经干细胞的分化具有直接促进作用。
Claims (8)
1.一种硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的制备方法,其特征在于,所述温敏水凝胶是水凝胶中均匀分散有硅酸钙镁纳米空心微球,所述硅酸钙镁纳米空心微球的粒径为100-300nm;所述温敏水凝胶具有在4℃-25℃下流动性好,37℃时迅速变为凝胶的特性;且变为凝胶后疏松多孔,孔隙分布均匀且相互连通;
制备方法包括步骤:
(1)将可溶性镁盐、可溶性钙盐、铵盐和氨水溶于水中,加入单分散纳米二氧化硅微球,超声分散20-40min;然后于150-190℃下水热反应10-15h,经过滤、洗涤、干燥得硅酸钙镁纳米空心微球;
(2)将羧甲基壳聚糖盐酸水溶液和β-甘油磷酸钠水溶液混合均匀,得配合物溶液;加入步骤(1)制备的硅酸钙镁纳米空心微球,分散混合均匀后,于30-70℃处理4-8h,得到硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶。
2.根据权利要求1所述硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,包括以下条件中的一项或多项:
a、所述可溶性镁盐为氯化镁,可溶性钙盐为氯化钙,铵盐为氯化铵,氨水的质量浓度为20-30%;
b、所述可溶性镁盐、可溶性钙盐和铵盐的摩尔比为0.4-0.7:1:4-7,所述铵盐的质量和氨水的体积比为200-300mg/mL,所述可溶性钙盐和水的质量比为0.004-0.007:1;
c、所述单分散纳米二氧化硅微球和可溶性钙盐的质量比为1:1-4。
3.根据权利要求1所述硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述水热反应温度为170℃,水热反应时间为12h。
4.根据权利要求1所述硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述单分散纳米二氧化硅微球按下述方法制备得到:将无水乙醇、水和质量浓度为25%的氨水混合均匀得A液;将正硅酸乙酯充分溶于无水乙醇中得B液;在15-25℃下,将B液缓慢倒入A液中,反应8-10h至体系呈浑浊状态后,经过滤、洗涤、干燥,即得单分散纳米二氧化硅微球。
5.根据权利要求4所述硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的制备方法,其特征在于,所述A液中,无水乙醇、水和质量浓度为25%的氨水的体积比为37-38:1:3;所述B液中,正硅酸乙酯和无水乙醇的体积比为1:10-15;所述B液和A液的体积比为1:3-5。
6.根据权利要求1所述硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述羧甲基壳聚糖的脱乙酰度≥95%。
7.根据权利要求1所述硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述羧甲基壳聚糖盐酸水溶液是将羧甲基壳聚糖溶于浓度为0.05-0.15mol/L的盐酸水溶液中制得,所述羧甲基壳聚糖的质量与盐酸水溶液的体积比为1:3-5g/mL;β-甘油磷酸钠水溶液是将β-甘油磷酸钠溶于水中制得,所述β-甘油磷酸钠的质量和水的体积比为0.005-0.15g/mL。
8.根据权利要求1所述硅酸钙镁纳米空心微球改性的温敏水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述羧甲基壳聚糖、β-甘油磷酸钠和硅酸钙镁纳米空心微球的质量比为8-12:1:1。
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