CN107049988A - 载药纳米粒、水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种载药纳米粒。所述载药纳米粒的活性成分为盐酸万古霉素，所用载体材料为羧化壳聚糖和壳聚糖季铵盐通过离子交联复合形成，其中羧化壳聚糖与壳聚糖季铵盐的质量比为10:1‑5。所述载药纳米粒可明显提高对万古霉素载药率，又能达到生物可降解性，可用于骨髓炎治疗。本发明还提供一种载药纳米粒的制备方法和应用。基于所述载药纳米粒，本发明还提供一种水凝胶制备方法和应用。利用水凝胶的温敏特性，利于对病灶部位的给药，并可在病灶部分缓慢释药，以改善病灶部位。

Description

载药纳米粒、水凝胶及其制备方法和应用
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种载药纳米粒、水凝胶及其制备方法和应用。
【背景技术】
感染性骨缺损是创伤性骨髓炎(Traumatic Osteomyelitis)的主要临床表现，易反复发作、长期不愈，致残率高。现代社会交通事故伤以及高能量损伤日益增多，导致严重复杂性创伤性骨髓炎发病率增加。由于其通常合并有骨折、骨缺损及软组织严重损伤，且病情反复多变，病程迁延不愈，病灶周围疤痕增生明显，游离碎骨块常形成死骨，使单纯全身系统抗生素治疗难以奏效，肢残率和复发率高。故该病治疗棘手，是亟待解决的骨外科疑难病种。
骨髓炎治疗目的是控制感染，修复骨缺损，恢复骨的连续性，从而最大程度恢复肢体功能。手术联合抗生素局部缓释系统是目前应用较多的治疗手段，此类缓释系统具有较好的生物相容性和骨传导特性，较低的抗生素用量及较短的用药周期，但尚存在骨不连发生率较高的缺陷，鉴于目前临床对降低术后骨不连发生率尚无有效解决措施，因此构建一种兼具药物缓释作用及骨修复作用的骨组织工程替代材料，对降低术后骨不连发生率、提高疗效具有积极意义。
近年组织工程技术飞速发展，各类复合的组织工程骨替代材料，应用于骨缺损部分，取得了十分良好的效果。常见的骨组织工程支架材料有生物陶瓷类材料，如珊瑚(coral)、羟基磷灰石(HA)等，有机高分子材料，如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及其共聚物PLGA等。上述组织工程材料均为固体，实际应用时需要精心地加工成型才能用于缺损组织的修复，特别是对具有不规则形状的组织缺损修复的时候，应用受限。
因此，有必要提供一种新的药物材料解决上述技术问题。
【发明内容】
本发明的目的是克服上述技术问题，提供一种既可明显提高载药率，又能达到生物可降解性，可用于骨髓炎治疗的载药纳米粒。
本发明的技术方案是：
一种载药纳米粒，所述载药纳米粒的活性成分为盐酸万古霉素，所用载体材料为羧化壳聚糖和壳聚糖季铵盐通过离子交联复合形成，其中羧化壳聚糖与壳聚糖季铵盐的质量比为10:1-5。
优选的，所述载药纳米粒的粒径为173.4～308.0nm，电位为-12.9～-48.2mV。
优选的，所述盐酸万古霉素的包封率为12.61～31.95％；载药率为1.48～15.95％。
优选的，所述羧化壳聚糖与壳聚糖季铵盐的质量比为10:4，所述载药纳米粒的平均粒径为178.4±5.0nm，电位为-25.7±0.52mV，载药率为15.95％，包封率为31.95％。
本发明还提供一种所述载药纳米粒的制备方法。所述载药纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1：将羧化壳聚糖和盐酸万古霉素溶于水中，形成溶液A；
步骤S2：将壳聚糖季铵盐和盐酸万古霉素溶于水中，形成溶液B；
步骤S3：将溶液B滴加到溶液A中，通过离子交联法制备得到载盐酸万古霉素羧化壳聚糖/壳聚糖季铵盐纳米粒，即所述载药纳米粒。
本发明还提供一种载药纳米粒在治疗骨髓炎药物材料中的应用。
本发明还提供一种水凝胶，含有所述载药纳米粒，是一种兼具药物缓释作用及骨修复作用的骨组织工程替代材料，能有效降低术后骨不连发生率、且提高骨髓炎疗效。
一种水凝胶，含有所述的载药纳米粒。
优选的，所述水凝胶为含载药纳米粒壳聚糖/甘油磷酸钠温敏水凝胶，所述水凝胶中的壳聚糖与甘油磷酸钠的质量比为1.2-5:25；所述壳聚糖与所述载药纳米粒中的羧化壳聚糖的质量比为525：0.167-350：0.278。
优选的，所述壳聚糖与甘油磷酸钠的质量比为1.2：25。
优选的，所述甘油磷酸钠包括α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠，所述α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠的质量比为1:2-8。
优选的，所述α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠的质量比为1:2。
优选的，所述水凝胶中还包括壳聚糖季铵盐，所述壳聚糖与所述壳聚糖季铵盐的质量比为9:1-6:4。
优选的，所述壳聚糖与所述壳聚糖季铵盐的质量比为8.7:1.3。
本发明还提供一种水凝胶的制备方法。所述水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1：制备甘油磷酸钠水溶液，并取适量所述载药纳米粒加入到甘油磷酸钠水溶液中，得到溶液C；
步骤S2：取壳聚糖溶于有机酸中，搅拌得到澄清溶液D；
步骤S3：在冰浴条件下，将溶液C滴加到溶液D中，搅拌得到载药溶胶；
步骤S4：将所述载药溶胶置于温水浴中，形成含载药纳米粒壳聚糖/甘油磷酸钠温敏水凝胶。
优选的，步骤S2中还包括将壳聚糖季铵盐加入溶液D中，其中壳聚糖与壳聚糖季铵盐的质量比为9:1-6:4。
本发明还提供一种水凝胶在治疗骨髓炎药物材料中的应用。
与相关技术相比，本发明提供的载药纳米粒、水凝胶，有益效果在于：
一、所述载药纳米粒，以盐酸万古霉素为活性成分，以纳米材料为载体，其中载体材料为羧化壳聚糖和壳聚糖季铵盐通过离子交联复合形成，通过两种不同电荷的壳聚糖采用离子交联的方式构建载药纳米粒，既可明显提高载药率，又能达到生物可降解性，并可以通过药物释放规律优化活性成分的量，为临床优化载药人工骨治疗方案提供实验依据。
二、所述载药纳米粒分散于水凝胶中，利用水凝胶的温敏特性，利于完成给药，充分达到病灶部位，并可在病灶部分缓慢释药，以改善病灶部位，进一步提高骨不连临床治愈率，减少术后并发症。
【附图说明】
图1为本发明提供的载药纳米粒的制备方法流程示意图；
图2为本发明实施例4所述载药纳米粒的制备方法制备得到的载药纳米粒的粒径分布图；
图3为发明实施例4所述载药纳米粒的制备方法制备得到的载药纳米粒的zeta电位分布图；
图4为本发明提供的载药纳米粒中盐酸万古霉素的标准曲线；
图5为本发明提供的水凝胶的制备方法流程示意图；
图6为本发明提供的水凝胶在25℃下和37℃下的凝胶状态；
图7为本发明提供的水凝胶的制备方法中实施例7-10的凝胶时间检测结果柱状图；
图8为本发明提供的水凝胶的制备方法中实施例11-14的凝胶时间检测结果柱状图；
图9为本发明提供的水凝胶的制备方法中实施例15-20的凝胶时间检测结果柱状图；
图10为本发明提供的载药纳米粒和水凝胶的体外释放效果图；
图11为盐酸万古霉素处理24h的抑菌圈实验结果图；
图12为载药纳米粒处理24h的抑菌圈实验结果图；
图13为游标卡尺测定图11、图12中抑菌圈直径的结果图；
图14为本发明提供的载药纳米粒和水凝胶对成骨细胞的抑制效果图。
【具体实施方式】
下面将结合附图和实施方式具体实施方式对本发明作进一步说明。
为方便描述，以下实施例中，各成分采用简称，具体如下：
盐酸万古霉素(Vancomycin hydrochloride，简称VCM)；
羧化壳聚糖(Carboxylation chitosan，简称CC)；
壳聚糖季铵盐(Chitosan quaternary ammonium salt，简称QAC)；
壳聚糖(Chitosan，简称CS)；
甘油磷酸钠(Sodium glycerophosphate，简称GP)；
α-甘油磷酸钠，简称α-GP；
β-甘油磷酸钠，简称β-GP；
其中，CC带负电荷，QAC带正电荷，且QAC的取代度为92％。
首先详细描述所述载药纳米粒的构建，形成实施例1-5。
实施例1-5
请参阅图1，为本发明提供的载药纳米粒的制备方法流程示意图。所述载药纳米粒的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1：将适量CC和5mgVCM溶于10mL水中，形成溶液A；
步骤S2：将适量QAC和1.8mgVCM溶于8mL水中，形成溶液B；
步骤S3：将溶液B滴加到溶液A中，通过离子交联法制备得到载盐酸万古霉素羧化壳聚糖/壳聚糖季铵盐纳米粒(以下简称VCM/CC-QAC-NPs)，即所述载药纳米粒。
通过固定VCM的量为6.8mg，将羧化壳聚糖与壳聚糖季铵盐的质量比分别设定为10:1、10:2、10:3、10:4、10:5，得到不同方案的VCM/CC-QAC-NPs，形成实施例1-5。
以下通过分析实施例1-5得到的载药纳米粒的粒径、表面电荷、载药率和包封率，分析VCM/CC-QAC-NPs的物理性质。
粒径及表面电荷的测定
取实施例1-5的VCM/CC-QAC-NPs，加适量的离子水稀释至1mL，采用激光粒度测定仪测定纳米粒的粒径和Zeta电位。
其中，Zeta电位(Zeta potential)，是指剪切面的电位，是表征胶体分散系稳定性的重要指标。Zeta电位是对颗粒之间相互排斥或吸引力的强度的度量。分子或分散粒子越小，Zeta电位(正或负)越高，体系越稳定，即溶解或分散可以抵抗聚集。反之，Zeta电位(正或负)越低，越倾向于凝结或凝聚，即吸引力超过了排斥力，分散被破坏而发生凝结或凝聚。
不同CC/QAC(w/w)对应的载药纳米粒粒径、Zeta电位的检测结果如表1：
表1：CC/QAC(w/w)对应的载药纳米粒粒径、Zeta电位(n＝4)
CC/QAC(w/w) 粒径(nm) Zeta电位(mV)
实施例1 10:1 297.2±10.8 -45.7±2.5
实施例2 10:2 221.8±11.9 -39.2±1.6
实施例3 10:3 181.1±8.5 -31.5±1.8
实施例4 10:4 178.4±5.0 -25.7±0.52
实施例5 10:5 235.0±9.4 -14.3±1.4
由表1可以得出，固定VCM的量为6.8mg时，随着CC/QAC比例中QAC含量的增加，纳米粒的粒径先减少后增加，且当CC/QAC的质量比为10:4时，粒径最小。原因分析为：随着处方中QAC量的增加，纳米粒的Zeta电位从负电荷逐渐增加至正电荷所致。
因此，将实施例4中CC/QAC(w/w)＝10:4作为优化方案。
取实施例4的VCM/CC-QAC-NPs溶液适量，用马尔文Nano-ZS90粒度分析仪进一步测定进其粒径和Zeta电位。检测结果请参阅图2和图3，其中，图2为本发明实施例4所述载药纳米粒的制备方法制备得到的载药纳米粒的粒径分布图；图3为发明实施例4所述载药纳米粒的制备方法制备得到的载药纳米粒的Zeta电位分布图。根据图2、图3所示检测结果，其平均粒径为178.4±5.0nm(PDI＝0.262，n＝4)，zeta电位为-25.7±0.52mV(n＝4)，其中PDI表示聚合物分散性指数。
载药率和包封率的测定
测定VCM标准曲线，为测定所述载药纳米粒的载药率和包封率提供依据。请参阅图4，为本发明提供的载药纳米粒中盐酸万古霉素的标准曲线。以VCM的浓度为横坐标，以色谱峰面积为纵坐标，进行回归。
回归方程式为：A＝39.828C-22.63，R2＝0.9999，结果表明盐酸万古霉素在5～100μg/mL范围内具有良好的线性关系。
取400μL实施例1-5的VCM/CC-QAC-NPs溶液在10K超滤管中，4000g离心20min，再加400μL超纯水，4000g离心20min，取下层液，用HPLC检测下层液中VCM含量，根据公式(1)和(2)计算VCM-NPs的载药率和包封率。
液相条件为：以280nm作为检测波长，流动相为磷酸二氢钾溶液(pH 3.20)和甲醇体积比为80:20，进样体积为20μL，记录峰面积。
计算公式：
载药率(％)＝【(投药量-游离的药量)/(载药纳米粒中药物量+载体材料的质量)】*100％ (1)
包封率(％)＝【(投药量-游离的药量)/投药量】*100％ (2)
实施例1-5的VCM/CC-QAC-NPs载药率和包封率的测定结果如表2：
表2：载药率和包封率测定结果
所述载药纳米粒可放入水凝胶中使用，以降低抗生素的释放速度，可发挥更长时间的药效。水凝胶材料，尤其是流动性好的可注射水凝胶越来越多的被引入组织工程细胞支架的研究中，为复杂骨缺损骨髓炎的治疗提供新的骨替代材料。
优选的，所述水凝胶为含载药纳米粒壳聚糖/甘油磷酸钠温敏水凝胶。由于壳聚糖在结构上与糖胺聚糖和关节软骨中的透明质酸具有相似的结构，所以此类CS/GP被广泛应用到软骨缺损修复以及髓核再生等医药领域，取得了良好的效果。研究证实其促进成骨细胞吸附和增殖，并且具有良好的骨传导作用，作为支架材料应用于骨组织工程，发现具有骨向分化潜能的干细胞在支架中生长良好，且因其pH值接近中性，多通过物理交联而避免了使用化学的交联剂，尤其适合作为一些敏感大分子如蛋白质及多肽类药物的载体。
以下详细描述含载药纳米粒壳聚糖/甘油磷酸钠温敏水凝胶的构建。
实施例6
请参阅图5，为本发明提供的水凝胶的制备方法流程示意图。所述水凝胶的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1：制备GP水溶液，并取1mL实施例4所述的载药纳米粒加入到甘油磷酸钠水溶液中，混合均匀得到溶液C；
具体的，将GP溶于1mL离子水中，其中GP可以为α-GP或/和β-GP，优选为α-GP和β-GP的混合物；本实施例中，α-GP/β-GP(w/w)＝1:2-8，
步骤S2：取适量CS和QAC溶于0.1M乙酸中，搅拌得到澄清溶液D；
具体的，CS/GP(w/w)＝1.2-5:25；溶剂除乙酸外，还可以为其它有机羧酸、磺酸、亚磺酸等。
步骤S3：在冰浴条件下，将溶液C滴加到溶液D中，搅拌15min后得到载药溶胶；
步骤S4：将所述载药溶胶置于37℃温水浴中，形成含载药纳米粒壳聚糖/甘油磷酸钠温敏水凝胶(以下简称VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel)；其中，温水浴的温度可以为除37℃之外的其它温度，如35-40℃之间的任一温度。
请结合参阅图6，为本发明提供的水凝胶在25℃下和37℃下的凝胶状态。其中(a)表示25℃下的凝胶状态，(b)表示37℃下的凝胶状态。
以下通过具体的实施例进一步考察VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel体系中α-GP/β-GP质量比、CS/GP质量比、CS/CC质量比等因素在37℃对凝胶时间的影响，目的是得到最佳凝胶时间的处方。
实施例7-10
采用实施例6的水凝胶制备方法，以载药纳米粒加量、CS/GP(w/w)＝2:25为定量，通过改变α-GP/β-GP的质量比，得到实施例7-10的VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel，并考察其在37℃下的凝胶时间，如表3。并请结合参阅图7，为本发明提供的水凝胶的制备方法中实施例7-10的凝胶时间检测结果柱状图。
表3：α-GP/β-GP(w/w)对凝胶时间的影响
α-GP/β-GP(w/w) 凝胶时间(min)
实施例7 1:2 3.40
实施例8 1:4 3.6
实施例9 1:6 3.65
实施例10 1:8 4.3
结合图7和表3可以看出，α-GP的量的减少，胶凝时间逐渐增加，说明α-GP有利于缩短凝胶的胶凝时间，且α-GP/β-GP＝1:2(w/w)胶凝时间最小为3.40min。
实施例11-14
采用实施例6的水凝胶制备方法，以α-GP/β-GP(w/w)＝1:2、载药纳米粒加量为定量，通过改变CS/GP(w/w)，得到实施例11-14的VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel，并考察其在37℃下的凝胶时间，如表4。并请结合参阅图8，为本发明提供的水凝胶的制备方法中实施例11-14的凝胶时间检测结果柱状图。
表4：CS/GP(w/w)对凝胶时间的影响
结合图8和表4可以看出，随着CS/GP比例的增加，胶凝时间逐渐增加，说明CS的量对胶凝时间的影响很大，考虑到凝胶时间过短不利于体内给药，将CS/GP＝3:25(w/w)，胶凝时间为5.50min的方案作为优化方案。
实施例15-20
采用实施例6的水凝胶制备方法，以α-GP/β-GP＝1:2(w/w)，CS/GP＝3:25(w/w)为定量，通过在步骤S2中增加不同质量的QAC，得到实施例15-20的VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel，并考察其在37℃下的凝胶时间，如表5。并请结合参阅图9，为本发明提供的水凝胶的制备方法中实施例15-20的凝胶时间检测结果柱状图。
表5：CS/QAC(w/w)对凝胶时间的影响
CS/QAC(w/w) 凝胶时间(min)
实施例15 10:0 6.1
实施例16 9:1 10.1
实施例17 8.7:1.3 9
实施例18 8.3:1.7 15.1
实施例19 8:2 18.3
实施例20 6:4 20
结合图9和表5可以看出，QAC的加入，会降低胶凝时间，随着CS/QAC比例的增加，胶凝时间先增加后减少，当CS/QAC＝8.7:1.3(w/w)时，胶凝时间最短，为9min。
实施例21-22
采用实施例12的水凝胶制备方法，通过改变CS与所述载药纳米粒中CC的质量比，并考察其在37℃下的凝胶时间，如表6：
表6：CS/CC(w/w)对凝胶时间的影响
CS/CC(w/w) 凝胶时间(min)
实施例21 525：0.167 半凝
实施例22 350：0.278 半凝
由表6的结果可以看出，CS/CC(w/w)在不同比例下，水凝胶处于半凝状态，均未达到较好的胶凝效果，考虑是由于载药纳米粒中含有较多的壳聚糖类材料，而GP的含量不足所致，故为得到更好的VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel，故通过提高GP的浓度可以有效的提高胶凝效果。
实施例23
采用实施例21的水凝胶制备方法，将CS/GP(w/w)调整为1.2:25，得到实施例23的VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel，其在12min时，表现出完全凝固的状态。
CS/GP(w/w) 凝胶时间(min)
实施例21 3:25 半凝
实施例23 1.2:25 12
通过上述分析可知，所述水凝胶的制备方法中，α-GP/β-GP(w/w)的优选方案为1:2，CS/GP(w/w)的优选方案为1.2:25，CS/QAC(w/w)的优选方案是8.7:1.3。
以下分别通过体外释放实验、抑菌圈实验、体外细胞实验分析VCM/CC-QAC-NPs和VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel的化学性质。
VCM/CC-QAC-NPs和VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel的体外释放实验
取VCM/CC-QAC-NPs 1mL和VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel 11mL进行实验。将两者分别加入截留分子量MWCO 8000的悬浮式透析袋，在符合漏槽条件下用pH7.4的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)填充释放介质，密封后置于37℃恒温水浴箱以转数200rpm振荡，于0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、7、8、10、12、24、36、48、60h，分别取出1mL释放介质，同时补加相同体积pH 7.4的PBS缓冲液。收集样品通过HPLC测定VCM浓度，每次进样20μL，计算累积释药百分数。
请参阅图10，为本发明提供的载药纳米粒和水凝胶的体外释放效果图。其中曲线a表示水凝胶的体外释放效果曲线，曲线b表示载药纳米粒的体外释放效果曲线。由图10可以看出，VCM/CC-QAC-NPs和VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel均在6h药物释放达80％，两者的释放均未出现突释现象，与文献报道CS/GP温敏凝胶会出现突释现象相比，说明加入QAC后有助于消除该体系的突释效应。在6h前，凝胶释放速度比纳米粒的慢，说明凝胶对于载药纳米粒的释放具有一定的缓释效果。
VCM/CC-QAC-NPs的抑菌圈实验
将直径为6mm滤纸片置于浓度为58.8、29.4、14.7、7.35、3.675、和1.8375μg/mL的VCM/CC-QAC-NPs纳米粒和VCM溶液中浸泡至饱和，在无菌操作下，用镊子夹取纸片，将纸片贴在预先涂布金环黄色葡萄球菌(106CFU)的固体琼脂平板上，保证其与培养基表面贴牢，将平板孵育在37℃生化培养箱中培养24小时后测量抑菌圈直径，所有样本均平行操作四次，取平均值，以平均数±标准差表示。
请参阅图11、图12和图13，其中图11为盐酸万古霉素处理24h的抑菌圈实验结果图；图12为载药纳米粒处理24h的抑菌圈实验结果图；图13为游标卡尺测定图11、图12中抑菌圈直径的结果图。其中(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)分别表示VCM浓度为58.8μg/mL、29.4μg/mL、14.7μg/mL、7.35μg/mL、3.675μg/mL和1.8375μg/mL。
结合图11-13可以看出，游标卡尺测得当相同药物浓度为58.8μg/mL、29.4μg/mL、14.7μg/mL、7.35μg/mL、3.675μg/mL和1.8375μg/mL时，VCM溶液组抑菌圈分别为0.927cm、0.882cm、0.608cm、0.562cm、0.482cm和0.481cm，而VCM/CC-QAC-NPs组的抑菌圈分别是1.615cm、1.386cm、1.087cm、1.005cm、0.755cm和0.523cm。由实验结果可知，将VCM制备成纳米粒有利于提高其对金环黄色葡萄球菌的抑制效果。
体外细胞实验
细胞培养
通过酶消化法从出生24h内SD大鼠颅盖骨分离得到成骨细胞。乳鼠10只75％乙醇中浸泡10min；切下颅盖骨置于D-Hanks液内；清除骨膜、血管等结缔组织，用D-Hanks液洗净颅盖骨，剪成1mm×1mm大小的骨片置于0.25％胰蛋白酶溶液中消化20min；将消化后的颅盖骨片移入0.1％Ⅱ型胶原酶溶液中振荡消化40min；将含细胞的消化液在1000r/min下离心10min，吸去上清液，沉淀的细胞团块用培养液制成细胞悬液，放置于5％CO2培养箱中培养，每2～3天更换培养液，至80％细胞融合进行传代。选择第3代细胞用于实验。
培养成骨细胞在含10％胎牛血清的DMEM培养液，37℃，5％CO2条件下培养，隔天换培养液，细胞长满单层铺满培养瓶后，用0.25％胰蛋白酶消化，2～3min后，待镜下细胞圆缩时，用尖吸管吹打细胞使其悬于液体中，加10％FBS培养液终止消化，分瓶，加10％FBS培养。
以成骨细胞为模型，采用MTT法评价VCM/CC-QAC-NPs和VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel细胞毒性。MTT法又叫MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
阳性对照组用纯铅材料，按10mL/cm2加入培养液制备的VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel浸提液。消化第3代SD大鼠成骨细胞，离心后用含体积分数为10％胎牛血清的DMEM-F12培养液吹打成单细胞悬液，用细胞计数板调整细胞浓度。96孔培养板接种消化下来的成骨细胞，每孔加入0.1mL。放入培养箱中培养24h后取出，加入浸提液0.1mL/孔；阴性对照组加入0.1mL完全培养液，阳性对照组加入0.1mL纯铅材料浸提液，继续培养，分别于4d和7d取出1块培养板，加20μL MTT，4h后加150μL二甲基亚砜，振荡10min，用酶标仪检测490nm下的吸光度值。
VCM/CC-QAC-NP的细胞毒试验与VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel相同。
请结合参阅图14，为本发明提供的载药纳米粒和水凝胶对成骨细胞的抑制效果图。由图14可看出，VCM/CC-QAC-NPs和VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel都可以促进成骨细胞的增殖，且具有时间依赖性。两者相比之下，VCM/CC-QAC-NPs/CS-QAC-Gel促进成骨细胞增值的效果更为显著。
与相关技术相比，本发明提供的载药纳米粒、水凝胶，有益效果在于：
一、所述载药纳米粒，以盐酸万古霉素为活性成分，以纳米材料为载体，其中载体材料为羧化壳聚糖和壳聚糖季铵盐通过离子交联复合形成，通过两种不同电荷的壳聚糖采用离子交联的方式构建载药纳米粒，既可明显提高载药率，又能达到生物可降解性，并可以通过药物释放规律优化活性成分的量，为临床优化载药人工骨治疗方案提供实验依据。
二、所述载药纳米粒分散于水凝胶中，利用水凝胶的温敏特性，利于完成给药，充分达到病灶部位，并可在病灶部分缓慢释药，以改善病灶部位，进一步提高骨不连临床治愈率，减少术后并发症。
以上所述的仅是本发明的实施方式，在此应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出改进，但这些均属于本发明的保护范围。

Claims (16)

1.一种载药纳米粒，其特征在于，所述载药纳米粒的活性成分为盐酸万古霉素，所用载体材料为羧化壳聚糖和壳聚糖季铵盐通过离子交联复合形成，其中羧化壳聚糖与壳聚糖季铵盐的质量比为10:1-5。
2.根据权利要求1所述的载药纳米粒，其特征在于，所述载药纳米粒的粒径为173.4～308.0nm，电位为-12.9～-48.2mV。
3.根据权利要求1所述的载药纳米粒，其特征在于，所述盐酸万古霉素的包封率为12.61～31.95％；载药率为1.48～15.95％。
4.根据权利要求1所述的载药纳米粒，其特征在于，所述羧化壳聚糖与壳聚糖季铵盐的质量比为10:4，所述载药纳米粒的平均粒径为178.4±5.0nm，电位为-25.7±0.52mV，载药率为15.95％，包封率为31.95％。
5.一种如权利要求1-4中任一项所述的载药纳米粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1：将羧化壳聚糖和盐酸万古霉素溶于水中，形成溶液A；
步骤S2：将壳聚糖季铵盐和盐酸万古霉素溶于水中，形成溶液B；
步骤S3：将溶液B滴加到溶液A中，通过离子交联法制备得到载盐酸万古霉素羧化壳聚糖/壳聚糖季铵盐纳米粒，即所述载药纳米粒。
6.一种如权利要求1-4中任一项所述的载药纳米粒在治疗骨髓炎药物材料中的应用。
7.一种水凝胶，其特征在于，含有权利要求1-4中任一项所述的载药纳米粒。
8.根据权利要求7所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶为含载药纳米粒壳聚糖/甘油磷酸钠温敏水凝胶，所述水凝胶中的壳聚糖与甘油磷酸钠的质量比为1.2-5:25；所述壳聚糖与所述载药纳米粒中的羧化壳聚糖的质量比为525：0.167-350：0.278。
9.根据权利要求8所述的水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖与甘油磷酸钠的质量比为1.2：25。
10.根据权利要求8或9所述的水凝胶，其特征在于，所述甘油磷酸钠包括α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠，所述α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠的质量比为1:2-8。
11.根据权利要求10所述的水凝胶，其特征在于，所述α-甘油磷酸钠和β-甘油磷酸钠的质量比为1:2。
12.根据权利要求8所述的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶中还包括壳聚糖季铵盐，所述壳聚糖与所述壳聚糖季铵盐的质量比为9:1-6:4。
13.根据权利要求12所述的水凝胶，其特征在于，所述壳聚糖与所述壳聚糖季铵盐的质量比为8.7:1.3。
14.一种如权利要求8-11中任一项所述的水凝胶的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤S1：制备甘油磷酸钠水溶液，并取适量权利要求1-4中任一项所述的载药纳米粒加入到甘油磷酸钠水溶液中，得到溶液C；
步骤S2：取壳聚糖溶于有机酸中，搅拌得到澄清溶液D；
步骤S3：在冰浴条件下，将溶液C滴加到溶液D中，搅拌得到载药溶胶；
步骤S4：将所述载药溶胶置于温水浴中，形成含载药纳米粒壳聚糖/甘油磷酸钠温敏水凝胶。
15.根据权利要求14所述的水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S2中还包括将壳聚糖季铵盐加入溶液D中，其中壳聚糖与壳聚糖季铵盐的质量比为9:1-6:4。
16.一种如权利要求7-13中任一项所述的水凝胶在治疗骨髓炎药物材料中的应用。
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