CN114848583A - 一种水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的制备方法与应用 - Google Patents

一种水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

一种水溶性壳聚糖纳米粒‑温敏水凝胶复合物的制备方法与应用，涉及医药制剂制备技术领域。首先向水溶性壳聚糖溶液中加入三聚磷酸钠溶液制备水溶性壳聚糖纳米粒/水溶性壳聚糖混合溶液，随后以β‑甘油磷酸钠为凝胶因子，与水溶性壳聚糖纳米粒和水溶性壳聚糖溶液发生共组装形成澄清透明的水溶性壳聚糖纳米粒‑温敏水凝胶复合物。制备的温敏水凝胶安全、细胞毒性低，生物相容性好，低温流动性好，37℃时迅速相变为凝胶，且变为凝胶后表面疏松多孔，具有较大的比表面积，利于功能分子的吸附，且具备更为优异的缓释功能。可作为一种优异的药物载体，应用于疫苗、多肽、蛋白、核酸、细胞和细菌的缓慢释放，安全性高，具有较强的临床应用价值。

Description

一种水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及医药制剂制备技术领域，具体是涉及一种水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的制备方法与应用。
背景技术
壳聚糖(chitosan，CS)，化学名为β-(1→4)-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖，由甲壳素经脱乙酰化后形成的一种天然可生物降解的阳离子多糖。CS广泛存在于节肢动物的外壳、真菌以及酵母的细胞壁中，含量丰富，具有良好的生物相容性、可降解性、无毒和抑菌等特性，是一种理想的医用材料。例如，在疫苗接种中，壳聚糖及其衍生物可作为免疫佐剂或递送载体，有效诱导机体产生体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫。但是，由于CS分子中具有大量的羟基和氨基，可形成分子内和分子间氢键，因而难溶于水和有机溶剂，仅溶于酸性溶液，这极大限制了其应用范围。
中国专利CN 102726382 A公开了一种海洋防污剂温敏控释材料的制备方法，该制备方法先将壳聚糖溶解于醋酸(HAc)溶液中，加入吐温80，加入防污剂的丙酮溶液，以3000rpm高速搅拌，超声处理，加入助溶剂异丙醇，使溶液形成油/水分散体系，呈现乳化澄清状态，然后逐滴加入三聚磷酸钠溶液发生交联固化反应，继续搅拌30min，所得混合液滤去溶液，固体用丙酮及去离子水冲洗残留的溶剂，冷冻真空干燥，得壳聚糖聚合物为壳的微囊化粒子；再将壳聚糖溶于HAc溶液中，β-甘油磷酸钠溶于蒸馏水中，冰水浴搅拌下将β-甘油磷酸钠溶液逐滴加入到壳聚糖溶液中，继续搅拌30min后，用磷酸氢二钠饱和溶液调pH至7.0；取制备的壳聚糖聚合物为壳的微囊化粒子用蒸馏水分散后逐滴加入到壳聚糖溶液中，冰浴下继续搅拌30min，经冷冻离心和冷冻干燥得包埋海洋防污剂的温敏控释材料，可有效实现防污剂的温敏控释。然而，由于该体系使用壳聚糖为基础材料，制备过程中需要大量有机试剂的参与，且制备工艺相对复杂，使得该体系难以应用于医疗领域。
水溶性CS是一类通过物理、化学和生物酶法联合改性后形成的一系列分子量可控的、水溶性好的新型CS衍生物，其既保留了CS优异的成膜性与吸湿性，同时通过分子量的调控，能够实现保湿能力与体内滞留时间的延长，相较CS具有更多的生物学功能，更易在医学、生物学领域得到深入的研究和广泛的应用。
发明内容
为了解决现有利用壳聚糖制备温敏水凝胶无法有效负载药物的技术缺陷，本发明提出了一种水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的制备方法与应用，利用水溶性壳聚糖制备能否有效负载药物的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物，利用温敏水凝胶的特性，能够实现药物的优异缓释功能。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
一种水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的制备方法，首先向水溶性壳聚糖溶液中加入三聚磷酸钠溶液制备水溶性壳聚糖纳米粒/水溶性壳聚糖混合溶液，随后以β-甘油磷酸钠为凝胶因子，与水溶性壳聚糖纳米粒和水溶性壳聚糖溶液发生共组装形成澄清透明的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物。
作为本发明的优选技术方案，制备方法步骤如下：
(1)配置溶液：用水溶解水溶性壳聚糖制得质量体积浓度为30-50g/L的水溶性壳聚糖溶液3mL，用水溶解三聚磷酸钠制得质量体积浓度为1-2g/L三聚磷酸钠溶液0.5mL，用水加热溶解β-甘油磷酸钠制得质量体积浓度为900-1000g/L的β-甘油磷酸钠溶液1mL；
(2)低温搅拌下将三聚磷酸钠溶液缓慢滴入上述水溶性壳聚糖溶液中，搅拌均匀得到水溶性壳聚糖纳米粒/水溶性壳聚糖混合溶液；
(3)将上述水溶性壳聚糖纳米粒/水溶性壳聚糖混合溶液与上述β-甘油磷酸钠溶液混合均匀，即可得到所述水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物。
作为本发明的进一步优选技术方案，制备方法中，用水溶解β-甘油磷酸钠制得β-甘油磷酸钠溶液的加热温度为80-100℃。制备纳米粒以及温敏凝胶过程采用磁力搅拌器进行搅拌混合，搅拌温度为1-5℃，搅拌时间分别为0.5-1.5h、1.5-2.5h。
作为本发明的进一步优选技术方案，制备方法中，所述水溶性壳聚糖选自羧化壳聚糖、羧甲基壳聚糖、类透明质酸壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖硝酸盐、壳聚糖乳酸盐和壳聚糖季铵盐中的一种或多种的组合。
本发明所提出的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物作为药物载体的应用，首先将药物添加至水溶性壳聚糖溶液中混合均匀，接着加入三聚磷酸钠溶液制备负载药物的水溶性壳聚糖纳米粒/水溶性壳聚糖混合溶液，随后以β-甘油磷酸钠为凝胶因子，与负载药物的水溶性壳聚糖纳米粒和水溶性壳聚糖溶液发生共组装形成澄清透明的负载药物的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物。
三聚磷酸钠，一种无定形、水溶性线状聚磷酸盐，其带负电的磷酸根离子可与CS质子化的氨基发生分子内和分子间交联，通过离子凝胶法形成CS纳米粒。β-甘油磷酸钠(GP)为弱碱性化合物(pKa 6.34)，含羟基和磷酸根负离子，是一种安全性较高的双官能团阴离子偶联剂，一定的温度下可与CS形成牢固的氢键，从而使CS溶液凝胶化，形成三维凝胶网络。本发明制备的CS/β-GP凝胶体系中，主要存在着静电作用平衡、氢键作用平衡以及CS的疏水作用力，这些相互作用力的平衡会随温度的改变而改变，从而使得形成的凝胶体系表现出温度敏感性。制备的水溶性壳聚糖纳米粒能够均匀的分散于温敏水凝胶中，使得制剂整体具备更为优异的缓释功能。
与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：
1)本发明制备方法简单，反应条件易于实现。所采用的水溶性CS为天然来源、可降解材料，具有良好的生物相容性；水溶性CS可作为免疫佐剂有效诱导机体产生体液免疫、细胞免疫及黏膜免疫。
2)制备的温敏水凝胶安全、细胞毒性低，低温流动性好，37℃时迅速相变为凝胶，且变为凝胶后表面疏松多孔，具有较大的比表面积，利于功能分子的吸附。进入人体组织后，在体温作用下迅速凝胶化从而固定在局部组织中，极大的提高了药物在病理部位的浓度，同时又降低了部分药物的全身毒副作用。
3)与单一CS水凝胶制品相比，水溶性CS水凝胶中杂合的水溶性CS纳米粒可进一步作为药物储库，发挥缓释效果。因此，本发明制备的水溶性壳聚糖温敏水凝胶可以作为一种优异的药物载体，应用于疫苗、多肽、蛋白、核酸、细胞和细菌的缓慢释放，安全性高，具有较强的临床应用价值。
附图说明
图1为实施例1制备水溶性壳聚糖纳米粒的粒径分布曲线(a)和透射电镜图(b)。
图2a、b分别为实施例2制备壳聚糖、水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的外观形貌照片及孵育变化示意图，图2c为实施例2制备水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的扫描电镜图。
图3为实施例3制备的负载抗弓形虫重组蛋白的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的体外释放曲线。
图4为实施例4制备的两种负载核酸药物的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物对核酸药物的保护作用对比图。
图5为本发明制备的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的安全性评价结果(a表示生理盐水组，b表示水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物组)。
图6为本发明制备的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的粉末剂型化测试图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本申请的具体实施方式作进一步详细描述，以下所述仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例制备过程中所采用的主要原料来源为：
类透明质酸壳聚糖，金壳药业；壳聚糖、壳聚糖季铵盐，壳聚糖盐酸盐，三聚磷酸钠，上海麦克林生物科技有限公司；β-甘油磷酸钠，索莱宝生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种水溶性壳聚糖纳米粒的制备：
(1)配置溶液：用水溶解类透明质酸壳聚糖制得质量体积浓度为30g/L的类透明质酸壳聚糖溶液3mL，用水溶解三聚磷酸钠制得质量体积浓度为1.6g/L三聚磷酸钠溶液0.5mL。
(2)4℃磁力搅拌条件下将三聚磷酸钠溶液缓慢滴入上述类透明质酸壳聚糖溶液中，搅拌1h得到水溶性壳聚糖纳米粒/水溶性壳聚糖混合溶液。
将制备的水溶性壳聚糖纳米颗粒溶液滴至有碳膜的铜网上，滴加2％的磷钨酸染色剂1滴进行负染，自然挥干，置于透射电子显微镜下观察粒子形态。采用动态光散射仪测量纳米粒子的粒径：将制得的纳米粒高速离心水洗后，加入去离子水为分散介质，测定粒径。
图1为实施例1制备水溶性壳聚糖纳米粒的粒径分布曲线(a)和透射电镜图(b)，通过图1能够看出，水溶性壳聚糖纳米粒粒径分布均匀，为427.63±14.11nm，外观形态为均一立方结构。
实施例2
本实施例提供一种水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的制备：
(1)配置溶液：用水溶解类透明质酸壳聚糖制得质量体积浓度为30g/L的类透明质酸壳聚糖溶液3mL，用水溶解三聚磷酸钠制得质量体积浓度为1.6g/L三聚磷酸钠溶液0.5mL，用水加热溶解β-甘油磷酸钠制得质量体积浓度为1000g/L的β-甘油磷酸钠溶液1mL。
(2)4℃磁力搅拌条件下将三聚磷酸钠溶液缓慢滴入上述类透明质酸壳聚糖溶液中，搅拌1h得到类透明质酸壳聚糖纳米粒/类透明质酸壳聚糖混合溶液。
(3)4℃磁力搅拌条件下将上述类透明质酸壳聚糖纳米粒/类透明质酸壳聚糖混合溶液与上述β-甘油磷酸钠溶液混合2h，即可得到水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物。
(4)作为对比例，以壳聚糖代替上述类透明质酸壳聚糖，其余方法相同，制备壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物。
采用倒置试管法(inverted tube testing method)测定凝胶时间：将上述制备的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物溶液(2mL)在冰水浴中搅拌约5min，装入玻璃瓶中。从玻璃瓶在保持在37℃的水浴中孵育开始，记录凝胶化时间。通过倒置小瓶来检查溶液流动性，并且当凝胶停止流动时记录凝胶化时间。同时，取2mL上述制备的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物溶液，冷冻干燥并在真空条件下喷金，然后观察水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的形态。
通过图2可以看出，以壳聚糖为原料制备的复合物中存在大量不溶性壳聚糖，难以形成壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物(a)。而以类透明质酸壳聚糖制备的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物在37℃孵育下，90s内即可迅速凝胶(b)。扫描电镜图中可以看到水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物内部呈交联结构，并且在网状结构中可以发现清晰的水溶性壳聚糖纳米粒(c)。
实施例3
本实施例提供一种负载抗弓形虫重组蛋白的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的制备及体外释放：
(1)配置溶液：用水溶解类透明质酸壳聚糖制得质量体积浓度为50g/L的类透明质酸壳聚糖溶液3mL，用水溶解三聚磷酸钠制得质量体积浓度为2g/L三聚磷酸钠溶液0.5mL，用水加热溶解β-甘油磷酸钠制得质量体积浓度为950g/L的β-甘油磷酸钠溶液1mL。
(2)取0.5mg抗弓形虫重组蛋白加入上述类透明质酸壳聚糖溶液中，5℃磁力搅拌条件下混合0.5h，得到含有抗弓形虫重组蛋白的类透明质酸壳聚糖溶液。
(3)5℃磁力搅拌条件下将三聚磷酸钠溶液缓慢滴入上述含有抗弓形虫重组蛋白的类透明质酸壳聚糖溶液中，搅拌1.5h得到含有抗弓形虫重组蛋白的类透明质酸壳聚糖纳米粒/类透明质酸壳聚糖混合溶液。
(4)5℃磁力搅拌条件下将上述含有抗弓形虫重组蛋白的类透明质酸壳聚糖纳米粒/类透明质酸壳聚糖混合溶液与上述β-甘油磷酸钠溶液混合2.5h，即可得到负载抗弓形虫重组蛋白的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物。
(5)取0.3mL制备的负载抗弓形虫重组蛋白的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物，装入圆底小瓶，置于37℃水浴锅中，至形成透明凝胶。将37℃预平衡的0.3mL释放介质(0.9％NaCl)加于凝胶表面，将小瓶置于恒温振动摇床(100rpm，37℃)中。分别于0.5、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24和48h，吸取60μL溶液，并补充等体积新鲜释放介质。通过BCA蛋白定量试剂盒测定释放介质中抗弓形虫重组蛋白的浓度，得到抗弓形虫重组蛋白的释放曲线。
结果如图3所示，可以观察到2h内抗弓形虫重组蛋白释放迅速达到50％，随后抗弓形虫重组蛋白的释放速率保持持续缓慢释放，在12h释放量可以达到100％。
实施例4
水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物对核酸药物的保护作用：
(1)配置溶液：用水溶解壳聚糖盐酸盐制得质量体积浓度为40g/L的壳聚糖盐酸盐溶液3mL，用水溶解三聚磷酸钠制得质量体积浓度为1g/L三聚磷酸钠溶液0.5mL，用水加热溶解β-甘油磷酸钠制得质量体积浓度为900g/L的β-甘油磷酸钠溶液1mL。
(2)取200μMsiRNACD98加入上述壳聚糖盐酸盐溶液中，2℃磁力搅拌条件下混合0.5h，得到含有核酸药物的壳聚糖盐酸盐溶液。
(3)2℃磁力搅拌条件下将三聚磷酸钠溶液缓慢滴入上述含有核酸药物的壳聚糖盐酸盐溶液中，搅拌0.5h得到含有核酸药物的壳聚糖盐酸盐纳米粒/壳聚糖盐酸盐混合溶液。
(4)2℃磁力搅拌条件下将上述含有核酸药物的壳聚糖盐酸盐纳米粒/壳聚糖盐酸盐混合溶液与上述β-甘油磷酸钠溶液混合1.5h，即可得到负载核酸药物的壳聚糖盐酸盐纳米粒-温敏水凝胶复合物。
(5)作为对比例，以壳聚糖季铵盐代替上述壳聚糖盐酸盐，其余方法相同，制备负载核酸药物的壳聚糖季铵盐纳米粒-温敏水凝胶复合物。
对各组纳米粒的粒径、PDI和Zeta电位进行测定，结果见表1。空白壳聚糖盐酸盐纳米粒和壳聚糖季铵盐纳米粒的Zeta电位均为正电荷，表明其可通过静电作用有效负载核酸药物。负载核酸药物的壳聚糖盐酸盐纳米粒和壳聚糖季铵盐纳米粒Zeta电位相较空白纳米粒均减小。
表1纳米粒的粒径与电位
Figure BDA0003626232450000071
使用琼脂糖凝胶电泳对水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物对核酸药物的保护作用进行研究。使用1％琼脂糖凝胶，使用GelRed对siRNA进行染色。结果如图4所示，壳聚糖盐酸盐纳米粒-温敏水凝胶复合物和壳聚糖季铵盐纳米粒-温敏水凝胶复合物均可有效保护核酸药物。
实施例5
水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的安全性评价：
向BALB/c小鼠皮下分别注射100μL生理盐水和实施例2制备的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物，7d后观察小鼠存活情况，取出注射部位皮肤组织，4％多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，制成4μm切片，H&E染色观察。结果如图5所示，生理盐水组观察到松散的结缔组织和脂肪组织，未见炎性细胞浸润(a)；水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物注射组的小鼠皮肤仅结缔组织显示出现少量增生，表皮和真皮层出现轻微炎性细胞浸润(b)。
实施例6
水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的粉末剂型化测试：
取2mL实施例2制备的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物进行冰冻干燥，制备粉末形态的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物，来确认该复合物的粉末剂型化可能性。将上述粉末形态的复合物溶解于2mL纯水中。结果如图6所示，冻干粉状态下再复溶的复合物可再次进行交联形成水凝胶。这种意味着本发明相较同类产品更为便利及保存更加容易。

Claims (9)

1.一种水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的制备方法，其特征在于，首先向水溶性壳聚糖溶液中加入三聚磷酸钠溶液制备水溶性壳聚糖纳米粒/水溶性壳聚糖混合溶液，随后以β-甘油磷酸钠为凝胶因子，与水溶性壳聚糖纳米粒和水溶性壳聚糖溶液发生共组装形成澄清透明的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)配置溶液：用水溶解水溶性壳聚糖制得质量体积浓度为30-50g/L的水溶性壳聚糖溶液3mL，用水溶解三聚磷酸钠制得质量体积浓度为1-2g/L三聚磷酸钠溶液0.5mL，用水加热溶解β-甘油磷酸钠制得质量体积浓度为900-1000g/L的β-甘油磷酸钠溶液1mL；
(2)低温搅拌下将三聚磷酸钠溶液缓慢滴入上述水溶性壳聚糖溶液中，搅拌均匀得到水溶性壳聚糖纳米粒/水溶性壳聚糖混合溶液；
(3)将上述水溶性壳聚糖纳米粒/水溶性壳聚糖混合溶液与上述β-甘油磷酸钠溶液混合均匀，即可得到所述水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，用水溶解β-甘油磷酸钠制得β-甘油磷酸钠溶液的加热温度为80-100℃。
4.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，制备纳米粒以及温敏凝胶过程的搅拌温度为1-5℃，搅拌时间分别为0.5-1.5h、1.5-2.5h。
5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，制备纳米粒以及温敏凝胶过程采用磁力搅拌器进行搅拌混合。
6.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述水溶性壳聚糖选自羧化壳聚糖、羧甲基壳聚糖、类透明质酸壳聚糖、壳聚糖盐酸盐、壳聚糖硝酸盐、壳聚糖乳酸盐和壳聚糖季铵盐中的一种或多种的组合。
7.如权利要求1-6任一项所述方法制备的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物作为药物载体的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，制备负载药物的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物的方法为：首先将药物添加至水溶性壳聚糖溶液中混合均匀，接着加入三聚磷酸钠溶液制备负载药物的水溶性壳聚糖纳米粒/水溶性壳聚糖混合溶液，随后以β-甘油磷酸钠为凝胶因子，与负载药物的水溶性壳聚糖纳米粒和水溶性壳聚糖溶液发生共组装形成澄清透明的负载药物的水溶性壳聚糖纳米粒-温敏水凝胶复合物。
9.如权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述负载的药物选自疫苗、多肽、蛋白、核酸、细胞或细菌。
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CN104958252A (zh) * 2015-06-24 2015-10-07 青岛农业大学 一种壳聚糖载药温敏水凝胶、制备方法及其应用
CN107049988A (zh) * 2017-04-13 2017-08-18 浙江医药高等专科学校 载药纳米粒、水凝胶及其制备方法和应用
US20190015550A1 (en) * 2017-07-12 2019-01-17 Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation Preparation method of injectable thermosensitive chitosan/tempo based-oxidized cellulose hydrogel

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Title
肖玲等: "镶嵌壳聚糖季铵盐微纳米粒子的壳聚糖温敏水凝胶的制备", 《武汉大学学报（理学版）》, vol. 53, no. 2, pages 1 - 2 *

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