CN102133430A - 一种温度敏感牙周组织再生诱导剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种温度敏感牙周组织再生诱导剂，它是以壳聚糖、壳聚糖季铵盐纳米粒和α，β-甘油磷酸钠为载体的温度敏感水凝胶复合体，所述载体负载有含有骨组织生长因子编码基因的质粒，本发明还提供了一种温度敏感牙周组织再生诱导剂的制备方法。本发明将该复合体植入体内后，目的DNA直接转染体靶细胞并持续表达其编码的生长因子，重建并恢复成骨细胞的生长活性；伴随着生物支架材料的逐步降解吸收，形成新的具备原有特殊形态和功能的组织，达到牙槽骨再生和功能重建的目的。该发明克服了直接应用外源性生长因子半衰期较短的不足，突破了由外源性细胞植入体内引发免疫排斥反应的障碍和细胞难以长期存活的问题，具有确切的临床应用价值和潜力。
Description
技术领域
本发明涉及口腔科应用的一种作为组织工程支架并能实现基因靶向治疗和仿生控释的温度敏感牙周组织再生诱导剂，以及这种再生诱导剂的制备方法。
背景技术
温度敏感性水凝胶早期的研究主要集中在温敏性水凝胶材料的合成，包括聚乙二醇/聚丙二醇共聚物、聚乙二醇/聚丁二醇共聚物、聚丙烯酸及聚异丙基丙稀酰胺等具有相变特性的一系列聚合物的制备。但是这些聚合物大多不具有生物可降解性，限制了其在临床上的应用。随后出现了具有生物可降解性、并且在生理条件下可注射给药的替代产品如聚氧乙烯(PEG)与聚乳酸(PLA)的嵌共聚物及三聚物(PEG-PLA-PEG)等聚氧乙烯类(PEG)聚合物，这类物质在较高温度下(45℃左右)呈溶胶状态，当温度降至体温时转变为凝胶状态。近年来温敏性水凝胶材料的研究逐步转向天然材料的开发，天然聚合物如明胶、琼脂糖、纤维素衍生物、木聚糖等具有热可逆凝胶的变化特性。
温度敏感水凝胶具有适合注射、创伤小、应用方便，尤其适合不规则缺损的修复的优势，因此温度敏感水凝胶在医学上尤其是临床医学上具有极其重要的应用作用。目前已有利用温敏水凝胶作为组织工程支架应用的成功例子，如韩国Min Hwan Kim等研究了聚乙二醇-聚己内酯(MPEG-PCL)嵌段共聚物温敏水凝胶支架复合血管内皮细胞生长因子(VEGF)，促进脂肪组织的再生，他的研究表明温敏水凝胶支架为细胞的生长和分化提供了良好的微环境。
目前研究显示因牙周病造成的牙周支持组织的破坏已成为成人失牙的首要原因。牙槽骨的再生是牙周组织再生的基础之一。目前口腔科常将外源性生长因子直接应用于牙病患者以促进其牙槽骨的再生，但是外源性生长因子具有半衰期短、在体内易被降解等缺点，而且将外源性生长因子直接应用于患者还会带来机体的排斥反应，其系统性应用副作用大。
目前温敏性凝胶的研究大多集中在温敏凝胶的缓释剂抑菌特性的研究，因此研究同时具有多重生物学效应的可原位注射的温度敏感牙周组织再生诱导剂对牙周组织的再生具有重要的临床意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种温度敏感牙周组织再生诱导剂，它以壳聚糖、壳聚糖季铵盐纳米粒和α，β-甘油磷酸钠为组织工程支架，并负载有骨组织生长因子BMP2，本发明联合应用组织工程和生长因子基因靶向治疗牙周病，既可充分发挥生长因子的活性诱导作用促进牙槽骨再生又可避免外源性生长因子直接应用引起的半衰期短、在体内易被降解和系统性应用副作用大等弊端。
为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种温度敏感牙周组织再生诱导剂，它是以壳聚糖、壳聚糖季铵盐纳米粒和α，β-甘油磷酸钠为载体的温度敏感水凝胶复合体，所述载体负载有含有骨组织生长因子编码基因的质粒，由壳聚糖季铵化制得壳聚糖季铵盐，再通过超声乳化法制得壳聚糖季铵盐纳米粒，将含有骨组织生长因子编码基因的质粒包封入壳聚糖季铵盐纳米粒，将壳聚糖和包封有质粒的壳聚糖季铵盐纳米粒溶于乳酸中形成质量体积比为1％-10％的溶液，壳聚糖与壳聚糖季铵盐纳米粒的质量比为3-5∶1，含有骨组织生长因子编码基因的质粒的加入量是壳聚糖与壳聚糖季铵盐纳米粒总质量的0.01-1倍，再将质量体积比为40％-50％的α，β-甘油磷酸钠水溶液冰浴后滴加入冰浴后的壳聚糖和壳聚糖季铵盐纳米粒乳酸溶液中，α，β-甘油磷酸钠加入量是壳聚糖与壳聚糖季铵盐纳米粒总质量的0.5-2.0倍，形成温度敏感水凝胶复合体。
进一步的，所述壳聚糖是部分脱乙酰基壳聚糖、全部脱乙酰基壳聚糖、低分子量壳聚糖、中分子量壳聚糖或高分子量壳聚糖。
再进一步的，所述骨组织生长因子是骨形态发生蛋白2，所述骨组织生长因子的编码基因为BMP-2序列，其在基因库中编号为：NM-001200。
又进一步的，所述含有骨组织生长因子编码基因的质粒为pT7T3D-PacI。
所述壳聚糖季铵盐纳米粒粒径为180-220nm。
本发明还提供了一种温度敏感牙周组织再生诱导剂的制备方法，它包括以下步骤：
(1)首先将壳聚糖季铵化制得壳聚糖季铵盐；
(2)再通过超声乳化法制得壳聚糖季铵盐纳米粒；
(3)再将含骨组织生长因子编码基因的质粒包封入壳聚糖季铵盐纳米粒，含骨组织生长因子编码基因的质粒经转入大肠杆菌中扩增、分离提取并纯化后，配制90-105mg/mL的含骨组织生长因子编码基因的质粒溶液，配制以乳酸为溶剂的质量体积比为0.02％-0.1％的壳聚糖季铵盐纳米粒溶液，所述两种溶液分别预热至50-55℃，后两种溶液混合，混合后振荡15-30秒钟，形成均匀的包封有质粒的壳聚糖季铵盐纳米粒溶液，将溶液抽真空制得壳聚糖季铵盐纳米粒冻干粉；
(4)最后制备温度敏感水凝胶复合体，配制质量体积比为40％-50％的α，β-甘油磷酸钠水溶液，将壳聚糖和包封有质粒的壳聚糖季铵盐纳米粒溶于乳酸中形成质量体积比为1％-10％的溶液，壳聚糖与壳聚糖季铵盐纳米粒的质量比为3-5∶1，搅拌至完全溶解，所述两种溶液均冰浴15-30分钟，将所述α，β-甘油磷酸钠水溶液逐滴加入壳聚糖季铵盐纳米粒溶液中，α，β-甘油磷酸钠加入量是壳聚糖与壳聚糖季铵盐纳米粒总质量的0.5-2.0倍，继续冰浴搅拌15-25分钟，制得壳聚糖、壳聚糖季铵盐纳米粒和α，β-甘油磷酸钠温度敏感水凝胶复合体。
其中，所述步骤(4)中制备温度为0-5℃；所采用的搅拌速度为2000-5000rpm；所采用的乳酸的浓度为0.01-1mol/L，pH值为3.0-6.0。
由于采用本发明的技术方案，本发明体外制备组织工程支架与编码生长因子的质粒DNA复合体，将该复合体植入体内后，目的DNA直接转染体靶细胞并持续表达其编码的生长因子，重建并恢复成骨细胞的生长活性；伴随着生物支架材料的逐步降解吸收，形成新的具备原有特殊形态和功能的组织，达到牙槽骨再生和功能重建的目的。该发明不仅克服了直接应用外源性生长因子半衰期较短的不足，更重要的是突破了由外源性细胞植入体内引发免疫排斥反应的障碍和细胞难以长期存活的问题，使其具有确切的临床应用价值和潜力。
本发明制得的CS/HTCCn-GP温敏水凝胶拥有良好的温敏性、能够促进细胞的增值和细胞外基质相关基因的表达，壳聚糖温敏水凝胶作为组织工程支架具备以下优势：
(1)具有良好的生物相容性、具有多孔性结构和高孔隙率、生物可降解性、良好的表面活性及可塑性，可满足组织工程支架的基本要求。
(2)具有可原位注射特性，可减少植入过程中的侵入性、操作简单、尤其适合于治疗不规则形状如根分叉区域的缺损。
(3)除作为支架材料除发挥机械支撑作用外，还可作为基因的缓释载体，使基因持续稳定释放，转染周围细胞。
(4)本发明经实验表明，壳聚糖、壳聚糖季铵盐及其温敏水凝胶具有较强的抑制牙周致病菌的能力，这一优良特性可以避免因牙周致病微生物的出现和菌斑生物膜的残留而影响成骨效果，是优于其他支架材料的优良特性之一。
(5)甘油磷酸钠参与构成的组织工程支架能促进成骨细胞的生长和分化，抑制破骨细胞的吸收，同时是基因释放的可靠材料，可更好的促进基因的表达。
本发明还具有操作简便，制备工艺稳定，制造成本低廉等优点，而且对原材料有广泛的适用性，所有具有游离氨基的壳聚糖衍生物均可以适用于本发明。因此，本发明的原料来源十分广泛，具有良好的研究开发应用前景和经济开发潜力。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。
实施例1
本发明的目的是提供一种以壳聚糖、壳聚糖季铵盐纳米粒和α，β-甘油磷酸钠为载体并负载含有BMP-2序列的质粒的壳聚糖温度敏感水凝胶复合体，还提供了此温度敏感水凝胶复合体的制备方法。
壳聚糖是自然界中唯一天然阳离子多糖，其结构类似于细胞外基质糖胺聚糖GAGs，具有组织相容性好、可生物降解、抑菌性和无毒等优良特性。可与多种阴离子聚电解质以多种方式复合，形成生理环境温敏水凝胶，可广泛应用于组织工程支架、载药系统及细胞培养载体等。壳聚糖因具备阳离子特性，能够作为非病毒载体与阴性电荷的DNA、RNA及寡核苷酸结合成聚电解质。壳聚糖的水溶性衍生物壳聚糖季铵盐(HTCC)因在其分子链中引入了季铵基团，呈强阳离子特性，比壳聚糖具有更强大的基因转染效能。
本发明采用壳聚糖(CS)、壳聚糖季铵盐纳米粒(HTCCn)和α，β-甘油磷酸钠(αβ-GP)作为温度敏感水凝胶复合体的载体，其中壳聚糖(CS)和α，β-甘油磷酸钠(αβ-GP)可由商业购买，壳聚糖季铵盐纳米粒(HTCCn)先由壳聚糖(CS)季铵化修饰成壳聚糖季铵盐(HTCC)，然后将壳聚糖季铵盐通过超声乳化法制得。
BMP2是近年来研究较多的骨组织工程中的生长因子，目前BMP-2质粒已被FDA批准应用，本发明所用质粒为包含BMP-2序列的pT7T3D-PacI质粒，从Res-Gen，Invitrogen公司(美国)购买。
CS与负载有质粒的HTCCn以不同质量比溶于乳酸缓冲液中，搅拌至完全溶解(CS/HTCCn)，然后置于冰浴；将α，β-GP溶于蒸馏水中，冷却，在搅拌下缓缓加入CS/HTCCn溶液中，继续搅拌即得到缓释CS/HTC Cn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶。此水凝胶具有在25-37℃由液态溶胶状转变为固态凝胶状的温敏特性。其中壳聚糖分子量范围是大于38KDa，脱乙酰度范围是50％-100％，壳聚糖与壳聚糖季铵盐纳米粒浓度是1％-10％；壳聚糖与季铵盐纳米粒的质量比为3-5∶1；α，β-甘油磷酸钠的浓度是40％-50％，其加入量是壳聚糖与壳聚糖季铵盐总质量的0.5-2.0倍，BMP-2质粒DNA的加入量是壳聚糖与壳聚糖季铵盐总质量的0.01-1倍，制备温度为0-5℃；所采用的搅拌速度为2000-5000rpm；所采用的乳酸缓冲液的浓度为0.01-1mol/L，pH值为3.0-6.0。
本实施例制备C S/HTCCn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶复合体的具体步骤如下：
(1)首先制备壳聚糖季铵盐纳米粒(HTCCn)溶液。将壳聚糖CS通过季铵化修饰成为壳聚糖季铵盐HTCC，具体季铵化步骤如下：
称取2g C S置于三颈烧瓶中，加入75ml异丙醇，水浴加热，搅拌下升温至80-90℃，再加入2，3-环氧丙基三甲基氯化铵(GTMAC)9.16g，用25ml蒸馏水溶解后加入，恒温搅拌反应9h，所得产物经过滤、洗涤、抽滤、干燥后，备用。将所得产物用乙醇溶液在索氏提取器中抽提24h，于80℃烘箱中烘干24h得到精制产物。
壳聚糖 壳聚糖季铵盐
(2)然后将所制得的壳聚糖季铵盐(HTCC)通过超声乳化法制得壳聚糖季铵盐纳米粒(HTCCn)。本实施例中HTCCn的具体制备过程为：称取40mgHTCC，加入20mg0.1％的乳酸，搅拌至充分溶解，加入0.4ml二氯甲烷(油相，终浓度为3％)，16000r/min高速均质5min，重复操作三次，抽真空30min，以去除二氯甲烷，然后边搅拌边缓慢滴加0.25％TPP(交联剂)溶液1mL，搅拌过夜，用4000r/min离心10min，离心两次，弃去沉淀，清液于4℃保存，即得到壳聚糖季铵盐纳米粒HTC Cn(pDNA-BMP2)溶液。采用激光粒度散射仪测定得到的纳米粒溶液，检测角为90度，λ＝670nm，温度25.2℃，检测得知纳米粒粒径在180-220nm，呈球形，且形态完整。抽真空制得壳聚糖季铵盐纳米粒冻干粉。
(3)再制备包封有质粒的壳聚糖季铵盐纳米粒溶液。将包含BMP-2序列的pT7T3D-PacI质粒2μl加入到100μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃准确热激90s，冰浴2-3min，加入LB液体培养基，37℃恢复培养1h，质粒DNA在大肠杆菌的转化体中扩增后，用PureLinkTM HiPure质粒DNA纯化试剂盒-Maxiprep K2100-07(Invitrogen公司，美国)分离提取并纯化质粒。DNA浓度使用PicoGreen dsDNA定量试剂盒(分子探头，Invitrogen公司，美国)确定。
因壳聚糖具备阳离子特性，而壳聚糖季铵盐在其分子链中引入了季铵基团，呈强阳离子特性，能够与作为非病毒载体与阴性电荷的质粒DNA结合成聚电解质。借助于两种物质通过电荷吸引的原理，将经过体外扩增、提纯和鉴定的pT7T3D-PacI质粒(pDNA-BMP2)包封到HTCCn中。本实施例具体包封过程如下：HTCCn溶液(0.02％，溶于5ml乳酸溶液中，pH 5.0)，配制90mg/mL的DNA水溶液，两种溶液均需预热至50℃。将上述两种平衡液很快混合震荡混合15秒钟。最终的混合液的体积限制在500ml以内，形成均匀的包封有质粒的纳米粒子溶液(HTCCn(pDNA-BMP2))。
用移液器准确量取一定量的包封有质粒的纳米粒子溶液(HTCCn(pDNA-BMP2)-GP)，高速离心，将微球离心下去，测定上清液中的游离药物的浓度，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算包封率，计算公式如下：
包封率＝(投药量-上清液中的药物质量)/投药量×100％。经计算，本实施例所制得的HTCCn的包封率为62.20％。
(4)最后制备CS/HTCCn(pDNA-BMP2)-GP温度敏感水凝胶复合体。先用去离子水配制浓度为50％(W/V)的α，β-GP溶液。室温下将0.18g CS+HTCCn(pDNA-BMP2)的混合物溶解于7mL 0.1M的乳酸溶液中，搅拌至完全溶解，形成质量体积比(W/V)为2％的溶液，其中CS∶HTCCn＝5∶1，即C S为0.15g，HTCCn为0.03g，后再加入2mLH2O以稀释溶液，上述两种溶液均冰浴15min，将α，β-GP(50％W/V)逐滴加入C S溶液中，滴入的体积为0.72ml，α，β-GP的加入量是CS和HTCCn总质量的2倍，复合体中质粒的加入量是壳聚糖和壳聚糖季铵盐纳米粒总质量的1倍，继续冰浴搅拌20min，即制得CS/HTCCn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶复合体。
实施例2
本实施例制备C S/HTCCn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶复合体的具体步骤如下：
(1)首先制备壳聚糖季铵盐纳米粒(HTCCn)溶液。具体季铵化步骤同实施例1。
(2)然后将所制得的壳聚糖季铵盐(HTCC)通过超声乳化法制得壳聚糖季铵盐纳米粒(HTCCn)。具体制备过程同实施例1。
(3)再制备包封有质粒的壳聚糖季铵盐纳米粒溶液。将包含BMP-2序列的pT7T3D-PacI质粒转入大肠杆菌中扩增，分离提取后纯化质粒，步骤同实施例1。
本实施例具体包封过程如下：HTC Cn溶液(0.1％，溶于5ml乳酸溶液中，pH 5.0)，配制100mg/mL的质粒DNA水溶液，两种溶液均需预热至55℃。将上述两种平衡液很快混合震荡混合30秒钟.最终的混合液的体积限制在500mL以内，形成均匀的包封有质粒的纳米粒子溶液(HTC Cn(pDNA-BMP2)-GP)。按照同实施例1的测定包封率方法计算出其包封率为74.6％。
(4)最后制备CS/HTC Cn(pDNA-BMP2)-GP温度敏感水凝胶复合体。先用去离子水配制浓度为40％(W/V)的α，β-GP溶液。室温下将0.8g CS+HTCCn(pDNA-BMP2)的混合物溶解于6mL 0.1M的乳酸溶液中，搅拌至完全溶解，形成质量体积比(W/V)为10％的溶液，其中CS∶HTCCn＝3∶1，即C S为0.6g，HTCCn为0.2g，后再加入2mL H2O以稀释溶液，上述两种溶液均冰浴30min，将α，β-GP(40％W/V)逐滴加入C S溶液中，滴入的体积为1ml，α，β-GP的加入量是C S和HTCCn总质量的0.5倍，复合体中质粒的加入量是壳聚糖和壳聚糖季铵盐纳米粒总质量的0.01倍，继续冰浴搅拌25min，即制得CS/HTCCn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶复合体。
实施例3
将本发明获得的C S/HTC Cn(pDNA-BMP2)-GP温度敏感水凝胶复合体作为牙周组织诱导剂用于动物实验和临床试验，试验结果如下：
(1)、建立犬牙周病动物模型，给予有牙槽骨吸收的局部粘骨膜下注射CS/HTCCn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶复合体，1、3、6个月X片显示均有不同程度的骨再生。
(2)、王某某，男，34岁。因牙齿松动3年就诊。临床检查和X线片检查诊断为“成人牙周炎(重度)”。临床给予基础SPR治疗三个月后，给予局部CS/HTC Cn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶复合体注射，3个月拍X片显示牙槽骨较注射前再生约0.6mm。
(3)、张某，女，28岁，因刷牙出血6个月就诊。临床检查和X片诊断为“局限性侵袭性牙周炎”。临床在5个月的基础治疗后，给予局部C S/HTCCn(pDNA-BMP2)-GP温敏水凝胶复合体注射，术后3、6、12个月的x片显示牙槽骨再生平均1mm。
在制备本发明所述的温度敏感水凝胶时，还可以将质粒和壳聚糖、壳聚糖季铵盐纳米粒、α，β-甘油磷酸钠一起制备水凝胶复合体，使质粒DNA均匀分散入水凝胶体系中。将水凝胶复合体注射到局部牙周组织后，水凝胶原位成型形成多孔的组织工程支架。复合体中的质粒和包封于壳聚糖季铵盐纳米粒中的质粒形成梯度释放，达到缓释DNA的目的。缓释的pDNA-BMP2持续、高效的作用于牙周靶细胞，促进成骨转化。HTCCn的存在在增强体系性质的同时，其强阳离子特性可增强转染效率，起到“一靶双效”的作用。
本发明所述可注射温敏牙周组织再生诱导剂，其中壳聚糖还可以是部分脱乙酰基壳聚糖、全部脱乙酰基壳聚糖、低分子量壳聚糖、中分子量壳聚糖或高分子量壳聚糖等；生长因子还可以是血小板衍化生长因子、转化生长因子、骨形成蛋白、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、纤维结合蛋白或胰岛素样生长因子等。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种温度敏感牙周组织再生诱导剂，其特征在于它是以壳聚糖、壳聚糖季铵盐纳米粒和α，β-甘油磷酸钠为载体的温度敏感水凝胶复合体，所述载体负载有含有骨组织生长因子编码基因的质粒，由壳聚糖季铵化制得壳聚糖季铵盐，再通过超声乳化法制得壳聚糖季铵盐纳米粒，将含有骨组织生长因子编码基因的质粒包封入壳聚糖季铵盐纳米粒，将壳聚糖和包封有质粒的壳聚糖季铵盐纳米粒溶于乳酸中形成质量体积比为1％-10％的溶液，壳聚糖与壳聚糖季铵盐纳米粒的质量比为3-5∶1，含有骨组织生长因子编码基因的质粒的加入量是壳聚糖与壳聚糖季铵盐纳米粒总质量的0.01-1倍，再将质量体积比为40％-50％的α，β-甘油磷酸钠水溶液冰浴后滴加入冰浴后的壳聚糖和壳聚糖季铵盐纳米粒乳酸溶液中，α，β-甘油磷酸钠加入量是壳聚糖与壳聚糖季铵盐纳米粒总质量的0.5-2.0倍，形成温度敏感水凝胶复合体。
2.根据权利要求1所述的一种温度敏感牙周组织再生诱导剂，其特征在于所述壳聚糖是部分脱乙酰基壳聚糖、全部脱乙酰基壳聚糖、低分子量壳聚糖、中分子量壳聚糖或高分子量壳聚糖。
3.根据权利要求1所述的一种温度敏感牙周组织再生诱导剂，其特征在于所述骨组织生长因子是骨形态发生蛋白2，所述骨组织生长因子的编码基因为BMP-2序列，其在基因库中编号为：NM-001200。
4.根据权利要求1所述的一种温度敏感牙周组织再生诱导剂，其特征在于所述含有骨组织生长因子编码基因的质粒为pT7T3D-PacI。
5.根据权利要求1所述的一种温度敏感牙周组织再生诱导剂，其特征在于所述壳聚糖季铵盐纳米粒粒径为180-220nm。
6.一种根据权利要求1-4任一项所述的温度敏感牙周组织再生诱导剂的制备方法，其特征在于它包括以下步骤：
(1)首先将壳聚糖季铵化制得壳聚糖季铵盐；
(2)再通过超声乳化法制得壳聚糖季铵盐纳米粒；
(3)再将含骨组织生长因子编码基因的质粒包封入壳聚糖季铵盐纳米粒，含骨组织生长因子编码基因的质粒经转入大肠杆菌中扩增、分离提取并纯化后，配制90-105mg/mL的含骨组织生长因子编码基因的质粒溶液，配制以乳酸为溶剂的质量体积比为0.02％-0.1％的壳聚糖季铵盐纳米粒溶液，所述两种溶液分别预热至50-55℃，然后两种溶液混合，混合后振荡15-30秒钟，形成均匀的包封有质粒的壳聚糖季铵盐纳米粒溶液，将溶液抽真空制得壳聚糖季铵盐纳米粒冻干粉；
(4)最后制备温度敏感水凝胶复合体，配制质量体积比为40％-50％的α，β-甘油磷酸钠水溶液，将壳聚糖和包封有质粒的壳聚糖季铵盐纳米粒溶于乳酸中形成质量体积比为1％-10％的溶液，壳聚糖与壳聚糖季铵盐纳米粒的质量比为3-5∶1，搅拌至完全溶解，所述两种溶液均冰浴15-30分钟，将所述α，β-甘油磷酸钠水溶液逐滴加入壳聚糖季铵盐纳米粒溶液中，α，β-甘油磷酸钠加入量是壳聚糖与壳聚糖季铵盐纳米粒总质量的0.5-2.0倍，继续冰浴搅拌15-25分钟，制得壳聚糖、壳聚糖季铵盐纳米粒和α，β-甘油磷酸钠温度敏感水凝胶复合体。
7.根据权利要求
所述的一种温度敏感牙周组织再生诱导剂的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中制备温度为0-5℃；所采用的搅拌速度为2000-5000rpm；所采用的乳酸的浓度为0.01-1mol/L，pH值为3.0-6.0。
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2011
- 2011-03-01 CN CN2011100539352A patent/CN102133430B/zh not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 吉秋霞: "原位可注射壳聚糖基温敏水凝胶缓释体系的构建及其在牙周病治疗领域的应用研究", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN102432895A (zh) * | 2011-08-16 | 2012-05-02 | 武汉大学 | 一种温敏型纤维素季铵盐/β-甘油磷酸钠水凝胶的制备方法 |
| CN102432895B (zh) * | 2011-08-16 | 2013-06-05 | 武汉大学 | 一种温敏型纤维素季铵盐/β-甘油磷酸钠水凝胶的制备方法 |
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| CN103690993A (zh) * | 2013-11-26 | 2014-04-02 | 四川大学 | 可用于牙周治疗的血糖感应控释药物的支架材料及其制备方法 |
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| CN107049988B (zh) * | 2017-04-13 | 2019-12-31 | 浙江医药高等专科学校 | 载药纳米粒、水凝胶及其制备方法和应用 |
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|---|---|
| CN102133430B (zh) | 2013-09-18 |
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