CN107949598A - 制备基于壳聚糖和负电荷聚电解质的水凝胶的方法以及由该水凝胶得到的蜂窝多孔材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种制备水凝胶的方法，该方法依次包括以下步骤：步骤一(i)，提供至少一种阴离子聚合物粉末(A)和至少一种含有胺官能团(‑NH2)的壳聚糖粉末(B)；步骤二(ii)，至少将步骤一中的粉末(A)和(B)干燥混合，以形成粉末混合物；步骤三(iii)，将步骤二得到的粉末混合物悬浮于水性介质中，该水性介质具有能够使阴离子聚合物(A)溶解但壳聚糖(B)不溶解的pH；步骤四(iv)，向步骤三得到的悬浮液中加入酸，以形成水凝胶。或者，将步骤三(iii)和步骤四(iv)用混合步骤五(v)代替，所述混合步骤五(v)包括将由步骤二(ii)得到的至少含有粉末(A)和(B)的所述混合物与含有至少一种化合物(C)，和/或至少一种所述化合物(C)的磷酸酯的酸化水性介质混合，所述化合物(C)含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元。

Description

制备基于壳聚糖和负电荷聚电解质的水凝胶的方法以及由该 水凝胶得到的蜂窝多孔材料
技术领域
本发明涉及制备水凝胶，特别是可植入水凝胶的方法的技术领域，以及由所述水凝胶制备多孔材料的方法的技术领域，特别地，涉及制备物理水凝胶的方法的技术领域。
本发明还涉及水凝胶、由所述水凝胶获得的多孔材料(特别是海绵)和包括这种水凝胶或多孔材料的医疗装置的技术领域。
背景技术
通常主要包含水的水凝胶或大分子凝胶是由大量水膨胀的聚合物基质。大分子相互连接，形成能够构成支架的网络，使得凝胶成为具有粘弹性质的材料。
聚合物链之间的键可以有两种形式：永久的或可逆的。当其是永久的时，可观察到有共价键存在；这些被称为化学水凝胶。当链之间的键是可逆的时，大分子通过氢、离子型或疏水型或偶极-偶极型的非共价键相互作用；这些被称为物理水凝胶。
水凝胶可以用作生物材料，例如用作医疗装置，特别是可植入装置。这样的水凝胶可以包含基于天然多糖(例如淀粉、纤维素、角叉菜胶、藻酸盐等)、蛋白质(明胶)，或基于合成聚合物如聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯(“卡波姆”)的聚合物网络，通过共价键(不可逆或永久化学凝胶)或氢键、疏水键、偶极键(偶极-偶极)或静电键(可逆物理凝胶)形成三维大分子网络。
属于天然多糖家族的壳聚糖(CHT)是目前已知的唯一天然来源的阳离子聚合物(带正电荷的聚电解质，表示为PE+)；它是由几丁质脱乙酰化生成的，或是直接从真菌中提取的。壳聚糖是由随机分布的β-1,4连接的D-葡萄糖胺和N-乙酰-D-葡萄糖胺组成的共聚物。壳聚糖的特征在于其脱乙酰度，代表其大分子链上葡萄糖胺重复单元的百分比。
几丁质是节肢动物(甲壳动物)的外骨骼或头足类动物的内骨骼的组成部分。壳聚糖的特征在于其胺官能团含量高(约5毫摩尔(mmol)/克，取决于其脱乙酰度(通常在60％至90％范围内)。由于其生物相容性、生物可吸收性、血液相容性、愈合性以及对细菌菌株生长的抑制作用，CHT在生物医学应用中被广泛应用。
壳聚糖作为聚合物可以是粉末的形式，或作为具有各种颗粒尺寸的薄片。仅天然胺聚合物是粉末的形式，其在纯水中是不溶的，但溶于最少量的1％(体积/体积)浓缩乙酸的酸化水。存在携带伯胺官能团(-NH2)的其它聚胺，如聚乙烯胺、聚烯丙胺和聚乙烯亚胺，但它们仅以浓缩水溶液或胶中固体的形式存在(因为它们是高度吸湿的)，无法构成具有流动性或可自由流动的粉末。
通过离子路径交联CHT以获得水凝胶是一种温和的方法，易于实施，因为它自发地发生，不需加热或催化剂。因此，阴离子交联剂与硫酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或聚磷酸盐、聚含氧阴离子、或钙盐一起使用。该方法包括将CHT“物料”(薄膜、整料等)浸入含有交联剂的水溶液中，交联剂与水同时扩散到“物料”中，使其膨胀并成胶。可替代的方法包括将交联剂加入到已溶于稀乙酸溶液(例如通常含有至少0.5％的乙酸)的壳聚糖水溶液中，或者相反地，使用注射器将CHT溶液逐滴添加到交联剂溶液中，如(J.Berger et al./EuropeanJournal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 57(2004)1934)。
同属于多糖家族的环糊精是能够与许多活性成分特别是亲脂性活性成分形成可逆包合络合物的笼形分子。环糊精是淀粉酶降解得到的环状多糖。它们由六到八个α-(1,4)-连接的吡喃葡萄糖单元级联构成，形成具有富含羟基官能团的外周的大环化合物，使其易溶于水，而内部为非极性的疏水空腔，使得环糊精具有与亲脂性活性成分形成包合络合物的复杂特性。已知化学凝胶(不可逆)是基于由环糊精与作为交联剂的环氧氯丙烷、二环氧化物、二异氰酸酯、均苯四甲酸二酐、三偏磷酸钠、或EDTA交联得到的环糊精。这些交联的或“超支化的”环糊精聚合物或者形成不溶性的肉眼可见的凝胶，或者形成可溶性的纳米凝胶，对包括治疗剂在内的有机分子具有捕获和导向性(Progress in Polymer Science,Volume 38,Issue 2,February 2013,Pages 344-368,Advanced Drug Delivery Review65(2013)1188-1203；Belstein Journal of Organic Chemistry,2014,10,2586-2593)。
已公开过将环糊精和壳聚糖进行结合的在先研究。然而，这些研究并不涉及由环糊精聚合物和壳聚糖的混合物制备肉眼可见的物理凝胶。举例来说，Auzely(C.R.Chimie14(2011)167-177)，首先将环糊精(CD)共价接枝到壳聚糖(＝CHT-CD)，然后将金刚烷(ada)接枝到壳聚糖(＝CHT-ada)。一旦混合到溶液中，这两种聚合物通过由这两种类型的聚合物形成的网络形成超分子肉眼可见的凝胶，由环糊精和金刚烷之间的包合络合物自发形成，通过CHT-ada和CHT-CD的互穿网络之间的超分子型相互作用形成稳定的水凝胶。此外，如果CD/ada的化学计量(或摩尔比)小于1，则CD-ada复合物的高稳定性不允许第三分子如治疗剂进入环糊精空腔中的包和混合物中，因为所有的空腔都与金刚烷基团不可逆地复合。
大多数作为医疗装置售卖的凝胶是即用的，即已经水合，并且含有矿物填料，例如磷酸钙或磷酸三钙，或活性治疗分子。在骨骼移植方面被提及的In'ossTM，是基于含有羟基磷灰石的HPMC(羟丙基甲基纤维素)的可注射凝胶；或者还有可能被提及的或基于明胶和PLA聚合物(聚乳酸)，分别含有应用于牙周病的活性成分。还存在基于透明质酸或胶原蛋白的凝胶，用于填充皱纹，以及在纺织品面板上也存在基于CMC(羧甲基纤维素)的凝胶涂层，该涂层可选地填充有活性成分，用于产生起保持伤口水合或释放活性成分作用的敷料。Biom'Up销售海绵形式的骨骼移植材料其是基于含有β-磷酸三钙粉末填充剂的胶原蛋白。
也存在由负聚电解质和正聚电解质之间的相互作用产生的离子复合物形成的物理水凝胶。在“国际生物大分子杂志”公开的题为“Recent development of chitosan-based polyelectrolyte complexes with natural polysaccharides for drugdelivery”，作者为Yangchao Luo和Qin Wang，64(2014)353-367的出版物列举了过去十年中，为了形成这样的离子配合物，用壳聚糖进行的研究。与壳聚糖混合的聚阴离子为透明质酸(HA)、果胶、角叉菜胶、黄原胶、结冷胶、腰果胶、阿拉伯胶、羧甲基纤维素、葡甘露聚糖和康达谷谷(kondagogu)胶。
由这种聚电解质复合物形成的水凝胶还通过与较低能量(如偶极-偶极缔合，范德华键和氢键)的物理相互作用获得其水凝胶的形态。与通过化学交联获得的水凝胶相比，由离子配合物形成的水凝胶具有无毒、生物耐受性好、生物相容性好的优点。具体而言，化学交联剂会诱导由其所支持的反应性官能团衍生出一定量的毒性。为了消除其在凝胶中的任何微量痕迹，纯化用于医疗用途的可植入凝胶的步骤(通常通过用水或溶剂洗涤)对于化学交联的水凝胶是必需的。但是，这些步骤可能会降低这些水凝胶的结构。此外，当这样的化学交联的水凝胶包含活性成分时，通过扩散到用于提取痕量交联剂的介质中以对所形成的水凝胶进行纯化的步骤可能导致活性成分的损失。
提高温度，增加离子强度或改变溶剂的极性或pH，会破坏物理凝胶(可逆的)，而化学凝胶则通过共价键被彻底稳定。
由A.H.Krauland和M.J.Alonso在International Journal of Pharmaceutics340(2007)134-142中发表的题为“Chitosan/cyclodextrin nanoparticles asmacromolecular drug delivery system”的出版物描述了以纳米凝胶形式存在的纳米颗粒的合成，其基于壳聚糖和羧甲基化β-环糊精单体，并可以缓慢释放包裹的分子。然后在宏观状态下获得纳米凝胶，而不是凝胶。纳米凝胶可以被定义为强烈水合的球形“物料”，尺寸通常在20纳米(nm)至数百nm的范围内。
题为“Chemically cross-linked and grafted cyclodextrin hydrogels：fromnanostructures to drug-eluting medical devices”，A.Concheiro,C.Alvarez-Lorenzo,Advanced Drug Reviews 65(2013)1188-1203的出版物描述了基于环糊精的水凝胶的制备，该环糊精化学接枝到预先形成的大分子(通常为聚(丙烯酸)型)上，通过携带环糊精的聚合物单体或与交联剂如二环氧化物、二异氰酸酯、均苯四甲酸二酐、三偏磷酸钠或EDTA等交联而获得。
由M.Prabaharan和J.F.Mano在Carbohydrate Polymers 63(2006)153-156中发表的题为“Chitosan derivatives bearing cyclodextrin cavities as novel adsorbentmatrices”的出版物描述了通过酰胺键接枝环糊精的壳聚糖大分子的合成。
结合在物理水凝胶中的活性剂是高分子量的分子(蛋白质、肽、DNA等)并以受控的方式递送，因为它们缓慢地通过聚电解质复合物的大分子网络扩散。这些活性剂的输送还与水凝胶基质的侵蚀速率或生物再吸收速率直接相关。
相反，通过凝胶的聚合物网络，低分子量的分子迅速扩散。事实上，如果生物活性分子与聚合物或形成凝胶结构的聚合物没有特别的相互作用，则它们的低空间位阻意味着它们可以通过这些非常开放的大分子网络的晶格自由地扩散(水凝胶主要由水组成)，因此这些小分子的释放动力学不受扩散速率的控制，也不受水凝胶侵蚀速率的控制，并且非常迅速。
已知的物理水凝胶及其相应的多孔材料在短时间内(几小时后)崩解，或者甚至当它们浸入水中时(特别是当水充入盐时)自发地崩解；这适用于所有生理液体。这个最终特性对于打算植入体内的水凝胶来说是重要的，以使它们保持其结构一段预定时间，不仅确保它们执行了填充功能和/或增强功能，而且允许可控地并且有针对性地释放一种或多种活性成分。
最后，目前没有能够在植入部位(例如骨缺损)接收或含有矿物填料的水凝胶；这是因为水凝胶结构的降解太快，导致矿物填料在短期内从水凝胶基质中释放出来。矿物填料选自用于骨移植的材料，其含有各种形式(粉末、单质、颗粒等)的磷酸钙、羟基磷灰石或具有类似于骨骼主要矿物质成分的构造的磷酸钙。具体而言，在牙科手术、上颌面手术或甚至整形外科领域的众多应用中，将足够量的矿物填料掺入到水凝胶中并将其保持在植入部位足够长的时间是必需的。然而，将大量的矿物填料掺入到交联的水凝胶中会使其不稳定并促进其分解。
US 2010/0221303A1和WO 2012/028620也是已知的；它们涉及由多糖聚合物制备多孔材料。
因此，本发明试图提出一种由至少一种负电荷聚电解质和至少一种正电荷聚电解质的复合物得到的水凝胶，特别是物理交联的水凝胶，以允许具有低分子量(少于或等于约250克/摩尔(g/mol))的治疗分子复合，然后确保其缓慢释放。
本发明还试图提出一种水凝胶，其可用于包封和控制一种或多种高分子量(特别是超过约250g/mol)组分的释放。
本发明还试图提出一种致密的、可模制的、均匀的和触变性的水凝胶(以使其能被注射)。
此外，本发明试图提出一种由所述水凝胶获得的水凝胶和多孔材料，其是稳定的，当浸入水中或生理介质中时不会自发崩解，却含有大量矿物填料。
本发明试图提出一种由所述水凝胶获得的水凝胶和多孔材料，其能够包含大量矿物填料，特别是高达装置重量的90％，同时保持优异的稠度，良好的延展性，对生物体液(血液)优异的吸收性能，其可以触发细胞分化的生物过程，以使得成骨细胞生成。
发明内容
本发明缓和了上述问题，因为在第一方面，提供了一种制备水凝胶的方法，有利地依次包括以下步骤：
步骤一(i)，提供至少一种阴离子聚合物粉末(A)和至少一种含有胺官能团(-NH2)的壳聚糖粉末(B)；
步骤二(ii)，至少将步骤一中的粉末(A)和(B)干燥混合，以形成粉末混合物；
步骤三(iii)，将步骤二得到的粉末混合物悬浮于水性介质中，特别是在搅拌下，该水性介质具有能够使阴离子聚合物(A)溶解但壳聚糖不溶解的pH，优选具有大于或等于4的pH，更优选具有大于或等于4.5的pH，特别是大于或等于5；优选地，所述水性介质为水(例如蒸馏水或超纯水)或至少一种活细胞的含水悬浮液，对应于培养基或生理液体的pH，其pH约为7(±0.5)，所述活细胞例如人细胞或动物细胞，特别是干细胞；
步骤四(iv)，向步骤三得到的悬浮液中加入酸，以形成水凝胶；或者
将步骤三(iii)和步骤四(iv)用混合步骤五(v)代替，所述混合步骤五(v)包括将由步骤二(ii)得到的至少含有粉末(A)和(B)的所述混合物与含有至少一种化合物(C)，和/或至少一种所述化合物(C)的磷酸酯的酸化水性介质混合，所述化合物(C)含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元。
发明人发现，胶凝过程严格地与两种聚合物(A)和(B)的化学性质以及它们所使用的特定方式有关。
壳聚糖粉末(由葡萄糖胺单体和N-乙酰葡萄糖胺单元构成)不溶于pH大于或等于4，优选大于或等于4.5，特别是大于或等于5的水性介质中。相反，如果壳聚糖含有稀酸如盐酸、乙酸或乳酸，则其可溶解在水性介质中。在具有足够酸性的水溶液中，壳聚糖的胺官能团-NH2被质子化为氨官能团-NH3 +，由于这种性质，在本发明中，壳聚糖被认为是聚阳离子(聚电解质：PE+)。
出版物“Chitin and chitosan:Properties and applications”，Ms.Rinaudo,Prog.Polym.Sci.31(2006)603-632描述了壳聚糖的溶解，其特别依赖于其脱乙酰度、摩尔质量以及溶解了壳聚糖的水性介质的pH值。
应当指出，在小于或等于5且大于或等于4的pH下，壳聚糖(B)的胺官能团将部分质子化，但是不足以溶解壳聚糖(B)。Rinaudo指出，当葡糖胺单元的电离度大于0.5(或50％)时，壳聚糖通常会溶解。
离子化葡萄糖胺单元的比例(相当于壳聚糖的离子化程度)可以通过本领域技术人员熟知的酸碱定量分析或标准胶体滴定来确定。
将含有粉末(A)和(B)的粉末混合物在水性介质中悬浮，当聚阴离子(A)含有酸官能团(例如羧酸，-COOH)时，导致该介质的pH降低，然后升高并稳定。然而，已经观察到，当在加入粉末混合物之前水性介质的pH大于或等于4，优选大于或等于4.5，更优选大于或等于5时，加入粉末混合物后pH的下降不足以引起壳聚糖溶解。只有在步骤四加入酸才能使pH充分降低，以使壳聚糖溶解。
本发明的阴离子聚合物或聚阴离子在大于或等于4，特别是大于或等于4.5，尤其是大于或等于5的pH下是可溶的，并且具有官能团，特别是硫酸官能团(-O-S(＝O)2-OH或-SO4H)和/或其盐，或亚硫酸官能团(-S(＝O)2-OH或-SO3H)和/或其盐，和/或磷酸官能团(-OP(＝O)2-OH或PO4H)和/或其盐，和/或羧酸官能团(-COOH)和/或其盐，其能够在水性介质中形成阴离子官能团，特别是通过释放质子H+，即亚硫酸、硫酸、磷酸或羧酸，形成羧基(-COO-)和/或硫酸根-SO4 -和/或亚硫酸根-SO3 -和/或膦酸根-PO4H-。
具有上述定义的酸官能团和胺官能团的大分子是可电离的，被称为聚电解质。强聚电解质与弱聚电解质的区别在于这些官能团在水溶液中离子化的倾向，这取决于每种聚电解质的pKa。平衡常数Ka为(AH)-><-(A-)+(H+)，(反方向的箭头表示平衡反应)，所以Ka＝([A-]×[H+])/[H+]，因此，pKa被定义为-log(Ka)，其可以利用介质的pH用来评价酸的电离。因此，“聚合物手册”第2卷第4版以聚电解质所携带的可离子化官能团的pKa，将它们分类为强聚电解质和弱聚电解质。硫酸基团、亚硫酸基团和磷酸基团是强聚电解质，即在低pH(小于2)下电离，而带有羧基基团的聚电解质是被分类为弱聚电解质(因为它们通常在pH超过4时电离)的聚阴离子。带有伯胺、仲胺和叔胺的聚电解质是被分类为弱聚电解质的聚阳离子，因为它们在小于5(约)的pH下电离。
聚电解质的复合物通过酸性和碱性离子官能团之间的静电相互作用形成。因此，用于形成聚电解质复合物的最有利的pH条件是溶液的pH高于聚阴离子的pKa且低于聚阳离子官能团的pKa。
因此，在本发明中，术语“阴离子聚合物”或“聚阴离子”是指包含阴离子官能团，或者一旦溶解于水性介质中能够形成阴离子官能团的粉末形式的任意聚合物，该水性介质特别是在大于或等于4的pH，更特别是在大于或等于4.5的pH下，尤其是在大于或等于5的pH下。
在步骤二中，将壳聚糖粉末(B)(PE+)和阴离子聚合物粉末(PE-)(A)紧密混合。因此，PE+颗粒通过静电相互作用与PE-颗粒结合。这些静电相互作用可解释为壳聚糖和阴离子聚合物具有相反符号的ζ电位。
优选地，壳聚糖的ζ电位为+20毫伏(mV)至+50mV的数量级，并且下述本发明优选的环糊精聚合物(A1)的ζ电位为-30mV的数量级。
有利地，步骤三(iii)中，由于存在通过静电相互作用吸附在其表面上的高亲水性PE-，使得未溶解的壳聚糖悬浮在水性介质中，从而形成亲水层以维持为均匀悬浮液。
术语“均匀悬浮液”应理解为是指当搅拌减慢或中断时不会迅速产生沉淀的悬浮液。
术语“粉末”应理解为是指在环境温度下任何减少到小颗粒的固体物质。
术语“环境温度”应理解为是指10℃-35℃，特别是15℃-25℃。
在本文中指出的pH值是在环境温度下使用pH计测量的。
在本发明中使用的术语“聚合物”应特别理解为是指本发明的阴离子聚合物和阳离子聚合物(壳聚糖(B))，低聚物或聚合物可以是均聚物或共聚物(即包括至少两种不同的重复单元)。
术语“不溶解壳聚糖”应理解为是指壳聚糖中无胺官能团或壳聚糖中数目不足的胺官能团在水性介质中质子化使得壳聚糖粉末溶解。优选地，相对于壳聚糖的胺葡萄糖单元的总数，壳聚糖(B)在α离子化度至少为0.5，即至少50％数量的壳聚糖(B)的胺葡萄糖单元被电离成葡萄糖铵单元时溶解。
发生溶解所需要的质子化程度还取决于壳聚糖的摩尔质量和脱乙酰度(DDA)：如果DDA较低，则相比其较高时，须使更多的胺官能团质子化。
本发明的壳聚糖(B)的脱乙酰度优选为60％或以上，更优选为75％或以上，特别优选为95％或以下，更优选为90％或以下，特别是85％或以下。
在本发明方法的步骤四(iv)或步骤(v)中加入的酸不同于聚阴离子。
当加入酸时，悬浮液的pH降低，特别是降至小于或等于5，更特别是小于或等于4.5，尤其是小于或等于4，如果加入的酸分别是乙酸和盐酸，则通过其胺(-NH2)质子化为铵官能团(-NH3 +)，乙酸基团(CH3COO-)或氯化物(Cl-)作为抗衡离子，使得壳聚糖溶解。壳聚糖大分子在所形成的铵基之间的分子内静电排斥作用下展开(具有相同符号的静电电荷排斥)，并达到占据水性介质整个体积的“扭曲”构象。同时，在壳聚糖的铵基(-NH3 +)和阴离子聚合物的阴离子官能团(COO-)之间形成离子键。
接下来，一旦胺官能团被质子化，水凝胶的pH升高以使其稳定，优选至大于或等于4的pH，更优选至大于或等于4.5的pH，特别是大于或等于5的pH。
然后所述阴离子聚合物分散在壳聚糖的网络中。这些离子相互作用使得凝胶物理交联并且水分散体固化。
有利地，本发明的水凝胶是具有自持形状的粘弹性材料特性的肉眼可见的凝胶。
优选地，步骤四(iv)之后与酸化的水性介质的pH有关的特征也适用于步骤(v)的水性介质(含有本文定义的化合物(C))。
优选地，在本发明中使用的术语“水凝胶”应理解为是指具有自持形状的固体粘弹性材料，即其从容器中取出后保持所形成的容器的尺寸和形状(几个小时或几天，取决于它的放置条件)。
优选地，本发明的步骤一和/或步骤二和/或步骤三和/或步骤四和/或步骤五(v)在环境温度下进行。
已经观察到在步骤三形成悬浮液之后加入酸是非常重要的，因为这种实施方式意味着可以获得非常坚实、稳定的水凝胶，其可以环境温度或在大约37℃下保持在特定的区域数小时而不流动，特别是至少48小时(h)。
此外，本发明的水凝胶在水性介质中保持其形状和完整性，特别是在环境温度或约37℃下保持数小时，至少24小时，优选至少48小时。
在现有技术中，基于壳聚糖的物理水凝胶是通过将壳聚糖的酸性水溶液与聚阴离子的水溶液混合或通过将聚阴离子(例如羧甲基纤维素)喷洒到壳聚糖的酸性水溶液(pH值为2-3)制备的。在该两种途径中，获得的水凝胶都不如本发明的水凝胶那样坚实和稳定。
本发明水凝胶中的壳聚糖的作用是确保凝胶的结构并使其具有所需的流变性能。
优选地，水凝胶中以克(g)计的水的总重量相对于水凝胶总重量的比例为50％或以上，优选60％或以上，更优选70％或以上，特别是80％或以上，还进一步优选85％或以上，特别是90％或以上。
有利地，本发明的水凝胶能够具有一种或多种性质，包括以下性质：生物相容性，可使用注射器注射，能够保持通过模制获得的特定形状至少数小时和/或不流动从而使其保持在其所施用的区域上，并且能够释放一种或多种活性物质。
本发明的水凝胶有利地是触变性的，这意味着它可以被注射。因此，水凝胶具有流变流化行为：聚合物在暴露于机械剪切应力时会发生流化，并在静止时恢复其凝胶状态，无任何应力。当水凝胶被放置在注射器的圆筒中时，它在经由活塞施加的剪切应力的作用下流动，并且可以穿过注射器的出口孔后进入针头，然后可进入导管，并且最后它一旦在应用区域上没有压力，就可以恢复其坚实的水凝胶形式。
示例性地，与注射器的出口孔流体连通的标准针头的直径在0.1毫米(mm)至0.5mm的范围内。
本发明的水凝胶可以用于许多医学应用中，特别是用作矫正手术、整容手术、泌尿科、牙科手术、眼科、骨科或颌面外科手术中的填充材料，以防止组织粘连和/或促进各种类型的软组织或骨的生成和/或在其施用的区域上释放一种或多种活性物质。
当本发明的水凝胶含有至少一种功能剂和/或活细胞时，它们有助于，例如愈合、治疗疾病(癌症)、减轻疼痛(麻醉作用)、减轻炎症或预防或控制感染。
在步骤三(iii)中，水性介质还可以含有至少一种化合物(C)，和/或至少一种所述化合物(C)的磷酸酯，所述化合物(C)含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元。
本发明中使用的术语“含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元的化合物(C)”是指含有至少一个具有实验式C6H12O6的单元或衍生自所述实验式的任何化合物(C)。例如，它可以是己糖，或通过糖苷键与第二己糖键合的第一己糖，第二己糖可以与第一己糖(或至少一个己糖衍生物单元)相同或不同。
优选地，所述含有一个己糖单元或己糖衍生物单元的化合物选自系列：葡萄糖(L或D形式)、麦芽糖(L或D形式)、蔗糖、甘露糖(L或D形式)、果糖(L或D形式)、乳糖(L或D形式)或其混合物；更优选地，所述化合物是葡萄糖(L或D形式)。
在本文中，术语“化合物(C)的磷酸酯”是指含有至少一个在具有实验式C6H12O6或衍生自所述实验式的单元的至少一个碳上具有磷酸基团(例如磷酰基(PO3 2-))的单元。例如，它可以是磷酸己糖，或通过糖苷键与第二己糖(磷酸酯)键合的第一己糖(磷酸酯)，第二己糖(磷酸酯)可以与第一己糖(磷酸酯)(作为己糖(磷酸酯)衍生物单元)相同或不同。
特别地，化合物(C)的磷酸酯是己糖-n-磷酸酯或己糖-n-磷酸酯的衍生物(n为具有一个磷酸酯基团的己糖单元或己糖衍生物单元的编号为1至6的碳原子之一)。
优选地，化合物(C)的磷酸酯选自葡萄糖-n-磷酸酯(L或D形式)，特别是葡萄糖6-磷酸酯或葡萄糖1-磷酸酯；麦芽糖-n-磷酸酯；蔗糖磷酸酯；甘露糖-n-磷酸酯；果糖-n-磷酸酯，乳糖-n-磷酸酯或其混合物；更优选地，所述化合物是葡萄糖-n-磷酸酯(L或D形式)。
优选地，化合物(C)或所述化合物(C)的磷酸酯含有至多10个己糖单元或己糖衍生物单元，特别是至多5个己糖单元或己糖衍生物单元，特别是1个或2个己糖单元或己糖衍生物。
已经令人惊讶地观察到，可以将由步骤(ii)得到的至少含有粉末(A)和(B)的混合物与酸化水性介质混合，而不需要通过悬浮步骤(iii)，所述酸化水性介质含有至少一种化合物(C)，和/或至少一种所述化合物(C)的磷酸酯，所述化合物(C)含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元。
这种方式能够形成坚实、稳定的水凝胶，甚至在将其注入培养基例如DMEM中仅一小时后。
还观察到在水性介质中基于己糖的化合物(C)的存在并且因此最终其在水凝胶中的存在也可以显著增加水性介质的pH，特别是pH接近6，因此极大地提高了体外测量的细胞相容性。
本发明人还惊奇地发现，在酸化水性介质中基于己糖或己糖磷酸酯的化合物可用于改善基于壳聚糖和聚阴离子的凝胶的形成。已知使用葡萄糖磷酸酯作为胶凝剂是为了提高基于壳聚糖的溶液的稳定性，而不是改善基于壳聚糖的离子水凝胶的形成(参见European journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 88(2014)361-373)。
在一种实施方式中，将由步骤三得到的粉末混合物的悬浮液浇注或注入模具中，然后加入酸以相应地将其成型并形成水凝胶。
在一种实施方式中，混合粉末(A)和(B)的步骤二在用于混合粉末，尤其是不研磨(即，不显着地减小构成粉末的固体的尺寸)的装置中进行，特别是行星式搅拌器。
在一种变型中，不管是在步骤(iii)还是在步骤(v)中，相对于所述水性介质的总体积，水性介质含有至少0.1重量％，优选至少0.5重量％，更优选至少1重量％，特别是至少2重量％，更特别是至少3重量％，再特别是至少4重量％，尤其是至少5重量％的至少一种含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元的化合物(C)，和/或至少一种所述化合物(C)的磷酸酯。
在一种变型中，步骤一中的粉末(A)和/或粉末(B)和/或步骤二中至少含有粉末(A)和(B)的粉末混合物在网孔小于或等于500微米(μm)，优选小于或等于300μm，更优选小于或等于200μm，特别是小于或等于150μm，更特别是小于或等于125μm的筛上过筛。
优选地，粉末(A)和/或粉末(B)或粉末(A)和(B)的混合物的颗粒尺寸分布优选使用Mastersizer S(Malvern Instruments,Orsay,France)300毫米的镜头测定。样品以4巴的压缩空气在干燥状态下分散。
优选地，粉末(A)和/或粉末(B)和/或粉末(A)和(B)的混合物任选地与至少一种不同于粉末(A)和(B)的粉末混合，例如至少一种矿物填料，在参考如下的筛分装置上筛选：Bioblock Scientific销售的塑料筛，Nylon DIN 41p5，编号：948414W：0.125μm。
符合聚阳离子或聚阴离子颗粒的预定尺寸是重要的，因为这意味着可以形成均匀的凝胶，即不存在结块，并具有预期的粘弹性。
粉末(A)和粉末(B)也可以借助振动筛筛分，例如Fritsch出售的那些。
优选地，在步骤一中，粉末(A)和/或粉末(B)在过筛之前分别研磨，优选借助于由Fritsch出售并且提供有200μm筛的Pulverisette 装置。
在一种变型中，步骤二的混合通过至少对粉末(A)和(B)进行干式共研磨的方式实施。
优选地，粉末(A)和(B)在研钵中手工干式共研磨。
粉末(A)和(B)也可以在珠磨机如Fritsch出售的Pulverisette行星式微型磨机中共研磨。
研磨可以减小固体颗粒的尺寸并形成较小的碎片。术语“共研磨”涉及至少两种不同粉末(A)和(B)的同时研磨。在上述变型中，已经观察到共研磨和/或研磨后混合可以有利地减小粉末的固体颗粒的尺寸，并且还可以使粉末(A)和(B)紧密地混合，使得阴离子聚合物和壳聚糖之间的接触表面积更好。该措施促进了步骤三中的含有这些粉末的水分散体的均匀性。由此也提高了水凝胶形成的重现性，阴离子聚合物与壳聚糖之间的反应性也是如此，特别是水凝胶的固化。
在一种变型中，阴离子聚合物含有硫酸官能团(-O-S(＝O)2-OH或-SO4H)，和/或所述硫酸官能团的盐，和/或亚硫酸官能团(-S(＝O)2-OH或-SO3H)，和/或所述亚硫酸官能团的盐，和/或磷酸官能团(-OP(＝O)2-OH或-PO4H)，和/或所述磷酸官能团的盐，和/或羧酸官能团(-COOH)，和/或所述羧酸官能团的盐，优选磷酸官能团和/或所述磷酸官能团的盐；和/或羧酸官能团(-COOH)和/或所述羧酸官能团的盐，更优选羧酸官能团(-COOH)和/或所述羧酸官能团的盐，特别是羧酸官能团(-COOH)。
亚硫酸盐(亚硫酸盐-SO3X)、硫酸盐(硫酸盐-SO4X)、磷酸盐(磷酸盐-PO4X)和羧酸盐(羧酸盐-COOX)是单价的，所述盐还含有至少一个-OX基团(取代酸中存在的OH基团)，其中X优选为选自钠、钾、锂和银；更优选为钾或钠。
在一种变型中，阴离子聚合物选自系列：环糊精聚合物、透明质酸、羧甲基纤维素、肝素、肝素盐(特别是肝素钠)、聚丙烯酸、聚丙烯酸钠、聚丙烯酸盐、果胶、海藻酸、角叉菜胶、黄原胶、结冷胶(羧酸盐)、葡甘露聚糖、康达谷谷(kondagogu)胶、阿拉伯胶、腰果胶，更优选选自环糊精聚合物、透明质酸、羧甲基纤维素、肝素、果胶、海藻酸、藻酸盐、丙烯酸和丙烯酸盐，进一步优选自环糊精聚合物、丙烯酸、果胶和海藻酸钠。
肝素、肝素盐和角叉菜胶含有硫酸官能团或碱性硫酸官能团。
透明质酸、果胶、丙烯酸聚合物或其盐、羧甲基纤维素、海藻酸、黄原胶、结冷胶、葡甘露聚糖、康达谷谷(kondagogu)胶、阿拉伯胶、腰果胶和环糊精聚合物(取决于其合成模式)含有羧酸官能团(-COOH)或所述羧酸官能团的盐(所述盐是在本文上述段落中对阴离子聚合物的定义)。
在一种变型中，阴离子聚合物(A)为环糊精聚合物，所述环糊精聚合物为将含有至少一种环糊精，和/或至少一种环糊精衍生物，和/或至少一种环糊精包合络合物，和/或至少一种环糊精衍生物包合络合物的混合物，与
至少一种(多元)羧酸和/或其相应的(多元)羧酸酐(A1系列)；或者
至少一种焦磷酸盐(A2系列)；或者
至少的环氧氯丙烷，
进行聚合反应得到的，
得到所述聚合物时进行了羧烷基化，特别是羧甲基化的步骤以接枝羧酸官能团(-COOH)(A3系列)。
有利的是，环糊精聚合物的亲水性网络增加了生物相容性并确保水凝胶的内聚力不能自发溶解在生理介质中并迁移。亲水性网络还提供了客体与环糊精空腔之间的稳定包合物。环糊精还通过改善其由主-客亲和力调节的吸附性质(称为储层性质)而有助于凝胶的稳定性，使其以更长或更短的延迟释放。
水凝胶可以含有可溶性环糊精聚合物或不溶性环糊精聚合物或其混合物，优选可溶性环糊精聚合物，更具体地属于族(A1)。
阴离子环糊精聚合物确保通过离子相互作用交联壳聚糖，同时通过形成包合配合物确保与低分子量治疗分子(小于约250g/mol)的复合，然后确保它们缓慢释放。
本发明的环糊精聚合物，特别是交联或超支化的，尤其是系列(A1)中的，可以以可溶形式或不溶形式存在。可溶性聚合物由具有纳米尺寸的凝胶(即，具有小于或等于约100nm的尺寸)构成(参见Green Chemistry，2015,17,24442454，其示出了基于环糊精聚合物的球状纳米凝胶的照片)，在水中形成清澈的溶液。不溶性聚合物对应地为在水中形成两相体系的微米级粒子(即具有大于1μm的尺寸)，毫米级及以上；这样的溶液是混浊不澄清的。
优选地，环糊精聚合物为属于系列(A1)的那些。这种聚合物族(A1)具有易于在水性介质中悬浮的优点，因为这些聚合物是高度亲水的。因此这一限定有助于形成均匀和坚实的水凝胶。
有利地，环糊精聚合物，特别是属于系列(A1)的那些，具有保持其分子的保留和控制释放的功能，特别是壳聚糖不可能实现的小尺寸。壳聚糖是互补的，因为大分子可以保留在其三维大分子网络内，然后以或多或少的延迟的方式释放。
除了以上列出的系列(A1)中的环糊精聚合物以外，还存在其他环糊精聚合物，然而它们是高度特异的，因为它们非常高的羧酸盐官能团水平(每克至少3毫摩尔(mmol)的COOH基团，特别是每克大约至少3-5mmol的COOH基团)，不能通过其它路线进行聚合或进行环糊精聚合物的化学改性。上面列出的系列(A1)中的聚合物族可以用于获得具有自持形状的水凝胶，即可以模制、切割，具有坚实的质地，并且是均匀和耐久的。
优选地，环糊精聚合物，特别是属于系列(A1)的环糊精聚合物，是由碱性混合物得到的，其中，相对于所述碱性混合物的总重量(g)，环糊精和/或环糊精衍生物和/或环糊精(衍生物)的包合络合物的重量(g)为40％或以上，优选为65％或以上。
术语“环糊精”是指任意天然环糊精，特别是α-环糊精或β-环糊精或γ-环糊精。
术语“环糊精衍生物”是指任意天然的环糊精，特别是α-环糊精或β-环糊精或γ-环糊精，其中至少一个羟基，优选至少一半的羟基被胺取代，特别是酯化的、醚化的、烷基化的、羟烷基化的、羧烷基化的，特别是羧甲基化的、磺烷基化的，更特别是磺丁基化的胺官能团(-NH2)，以及它们的混合物。
所述环糊精的至少一个羟基可以被烷基链取代，所述烷基链可以是直链和/或支链的，不饱和的或饱和的，取代或未取代的，含有1-10个碳原子，优选1-6个碳原子，更优选1-4个碳原子，特别是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基，所述基团任选并独立地被一个或多个羟基(-OH)取代；和/或被一个或多个羧酸基团(-COOH)取代；和/或被一个或多个硫酸基团和/或所述硫酸官能团的一种或多种盐取代。所述环糊精的至少一个羟基因此可以被羟丙基或羧甲基取代。
术语“环糊精包合络合物”或“环糊精衍生物包合络合物”是指本发明含义内的任意环糊精或环糊精衍生物与本文定义的功能剂络合，或与本文定义的活细胞络合。
本领域技术人员可以选择能够与交联剂反应的一种或多种环糊精和/或一种或多种环糊精衍生物和/或一种或多种环糊精(衍生物)包合络合物。特别是关于环糊精聚合物的系列(A1)，如果使用一种或多种环糊精衍生物，它/它们必须具有足够的羟基(-OH)以能够与(多元)羧酸和/或其相应的酸酐进行缩聚反应。
EP 1165621B1描述了通过(多元)羧酸和天然环糊精(α，β，γ)或衍生物(甲基，羟丙基环糊精)之间的缩聚反应合成的环糊精聚合物，其理想地适合于实施本发明。所获得的聚合物根据缩聚反应的进行可溶于水或不溶于水。其特征在于具有40重量％-65重量％的高环糊精含量，和每克环糊精聚合物约3.5mmol的丰富的羧酸官能团。
在本发明中，术语“羧酸”是指含有-COOH官能团的酸。在本发明中，术语“多元羧酸”是指含有至少两个-COOH官能团的酸，“其相应的酸酐”是指含有至少一个-CO-O-CO-官能团的酸。
术语“焦磷酸盐”是指含有P-O-P键的任意化合物，特别是含有以下官能团：-O-PO(OH)-O-PO(OH)-O-。
在一种实施方式中，通过与环氧氯丙烷反应获得的环糊精聚合物不含有羧酸官能团，因此其经历了羧烷基化反应，特别是借助氯乙酸进行羧甲基化，以将-CH2COOH基团接枝到所述聚合物上。
羧烷基化反应优选为将至少一个氯原子、溴原子或碘原子取代的(多元)羧酸接枝到烷基链上。优选地，烷基链是直链和/或支链的，不饱和的或饱和的，取代或未取代的，含有1-10个碳原子，优选1-6个碳原子，更优选1-4个碳原子，特别是甲基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
在一种变型中，焦磷酸盐(A2)为三偏磷酸钠。
在一种变型中，(多元)羧酸或其相应的酸酐选自系列：饱和或不饱和或芳族，直链或支链或环状(多元)羧酸和羟基多元(羧基)酸，优选为选自系列：柠檬酸、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、1,2,3,4-丁烷四羧酸(BTCA)、马来酸、柠康酸、衣康酸、1,2,3-丙三羧酸、反式乌头酸、全顺式1,2,3,4-环戊烷四羧酸、苯六甲酸、均苯四甲酸、依地酸(乙二胺四乙酸或EDTA)、氧联二琥珀酸、硫代二琥珀酸或所述(多元)羧酸的酸酐如均苯四甲酸二酐，以及它们的混合物，优选柠檬酸和BTCA。
优选地，(多元)羧酸选自无环酸，更优选不含胺官能团(-NH2)，更特别选自无氮酸。用这些酸得到的环糊精聚合物比用环酸获得的环糊精聚合物更亲水，并且可以通过含水方法合成，相比之下，例如用苯二甲酸二酐获得的聚合物，其合成必须在DMF(二甲基甲酰胺)中进行。
在一种变型中，在步骤四中加入到悬浮液中的酸或在本发明的方法的步骤(v)中用于酸化水性介质的酸选自系列：乙酸，特别是冰醋酸、甲酸、酒石酸、水杨酸、谷氨酸、丙酸、盐酸、柠檬酸、乳酸及其混合物；优选乙酸、盐酸、乳酸及其混合物，更优选乙酸和盐酸。
优选地，所述乙酸为至少50％浓缩的，更优选至少80％，再优选至少95％，尤其是至少99％(“纯”乙酸，被称为“冰”乙酸)。
优选地，相对于所述水性介质的总体积，通常在步骤(iii)或步骤(v)中将至少0.5体积％，更优选至少1体积％的酸加入到水性介质中。
在从属变型中，在本发明方法的步骤四(iv)或步骤(v)中加入到悬浮液中的酸选自盐酸、乙酸和乳酸，更优选选自乳酸和盐酸，特别是乳酸。
已经观察到，采用这些酸，尤其是乳酸时，注射水凝胶束的坚实度和稳定性更好。
另外，与醋酸相比，盐酸和乳酸具有无臭的优点。
有利的是，还观察到盐酸、乙酸和乳酸，尤其是乳酸，特别是当它们与至少一种含有至少一个己糖单元或至少一个己糖衍生物单元的化合物在水性介质中结合时，可用于在体外细胞相容性(MC3T3测试细胞)方面获得良好的结果。
优选地，所添加的乳酸是相对于所述水溶液的体积含有至少85重量％纯乳酸的水溶液。
在一种变型中，阴离子环糊精聚合物(A)含有至少2毫摩尔每克(mmoles/g)的羧酸官能团(-COOH)，优选至少3mmoles/g的羧酸官能团(-COOH)，更优选至少3.5mmoles/g羧酸官能团(-COOH)。
每克环糊精聚合物中羧酸官能团的量可以通过在有色指示剂存在下的酸碱滴定来测定。
测量方法包括将预定量的环糊精聚合物在有色指示剂例如酚酞(几滴)的存在下溶解在给定体积的水中，然后逐渐加入到所述溶液中(逐滴地)，特别是使用刻度管、0.1摩尔/升(mol/liter)的氢氧化钠溶液，同时搅拌(例如使用磁棒)，直到含有有色指示剂的溶液变色。所添加的氢氧化钠的摩尔数对应于被中和的羧酸官能团(-COOH)的摩尔数。
在一种变型中，所述至少一种壳聚糖粉末(B)的重量(g)为相对于步骤四(iv)获得的或步骤五(v)获得的水凝胶的总重量(g)的1％或以上，优选8％或以上，更优选5％或以上，再优选4％或以上。
在一种变型中，所述至少一种阴离子聚合物粉末(A)的重量(g)为步骤四(iv)获得的或步骤五(v)获得的水凝胶的总重量(g)的1％或以上，优选20％或以上，更优选15％或以下，再优选10％或以下，特别是6％或以下。
在一种变型中，壳聚糖粉末(b)的重量(g)与阴离子聚合物粉末(A)的重量(g)的比例在0.6-1.4的范围内，更优选在0.8-1.2的范围内，进一步优选在0.9-1.1的范围内。
在一种变型中，本发明的制备水凝胶的方法包括将至少一种粉末形式的矿物填料加入到步骤二得到的粉末混合物中；优选地，矿物填料的重量(g)相对于粉末混合物的总重量(g)的比例为30％或以上。由此所述至少一种矿物填料与粉末(A)和(B)紧密混合。
优选地，根据所述粉末(A)和(B)的上述变型，特别是关于筛分颗粒的尺寸，对所述矿物填料进行筛分和/或(共)研磨。
在一种变型中，所述至少一种矿物填料选自系列：生物陶瓷、氧化铝(Al2O3)、氧化锆(ZrO2)、玻璃、玻璃离聚物、二氧化钛和它们的混合物(用于骨重建)；所述生物陶瓷特别是钙的磷酸盐，例如羟基磷灰石、β-磷酸三钙、碳酸钙。
在一种变型中，步骤(iii)或步骤(v)中的水性介质含有至少一种功能剂和/或至少一种活细胞。
特别地，所述功能剂为生物活性剂，更具体地是具有治疗活性的分子、大分子或微生物。该定义也适用于本文的其余部分。
有利地，所述功能剂选自以下第一系列(I)：抗凝血剂、抗血栓形成剂、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗粘连剂、抗迁移剂、细胞粘附促进剂、生长因子、抗寄生虫剂、抗炎剂、维生素、激素、蛋白质、抗真菌剂、抗微生物分子、防腐剂、抗生素(特别是环丙沙星和氯己定)、尼古丁、一种或多种精油及它们的混合物；所述至少一个活细胞选自以下第二系列(II)：人细胞、动物细胞和植物细胞。
优选地，活细胞包括原核细胞、真核细胞、细菌、酵母、植物细胞、动物细胞如内皮细胞、神经细胞、成淋巴细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、干细胞、胚细胞、脂肪细胞等，以及设计为表达特定分子的细胞。
第二方面，本发明还提供一种制备多孔材料，特别是例如海绵的海绵材料的方法，其包括第一方面给出的任何上述变型中描述的制备水凝胶的方法以获得水凝胶，并且还包括将步骤四(iv)或步骤(v)得到的水凝胶冷冻干燥以形成多孔材料的步骤。
优选地，冷冻干燥步骤是通过冷冻然后在减压气氛下升华为冰来干燥水合化合物的步骤。
在一种变型中，在制备水凝胶的方法的步骤二(ii)中，将粉末形式的成孔剂添加入到粉末混合物中。
这种类型的成孔剂可以是能够在酸性条件下转化成气体的任何试剂，其pH值小于或等于5，其孔由二氧化碳分子从水凝胶中逸出而形成。像这样的成孔剂可以是碳酸铵、碳酸氢铵、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钙及它们的混合物。在步骤二中，相对于粉末混合物的总重量，成孔剂的重量比例在1％-15％的范围内。这些化合物可从Sigma-Aldrich获得。
在现有技术中，多孔材料被称为“多孔支架”。
成孔剂的浓度影响多孔材料中孔隙的大小。多孔材料中的平均孔径优选为大于或等于1μm且小于或等于1000μm，更优选为100μm-500μm。孔密度在4％-75％的范围内。
优选地，多孔材料是柔软而富有弹性的，即它可以被手动地在所有方向上压缩或拉伸而不被损坏(特别是没有撕裂)，并且在消除压缩或拉伸之后倾向于恢复其初始尺寸(或接近其初始尺寸)。
优选地，多孔材料包括闭合孔。
优选地，多孔材料具有海绵状结构，例如泡沫的结构。
该冷冻干燥步骤可以用本领域已知的任何设备进行。进行冷冻干燥足够的时间以除去至少98％的水，至少99％的水，更优选至少99.5％的水。
有利的是，该冷冻干燥步骤在制备具有预定形状的水凝胶之后进行，例如通过将所述水凝胶放置在模具中，然后使其经历预先冷冻步骤。
在一种变型中，制备多孔材料的方法包括在大于或等于100℃的温度下处理所述多孔材料至少5分钟，特别是至少60分钟的热处理步骤，优选在温度大于或等于120℃处理至少5分钟，特别是至少30分钟，更优选在大于或等于140℃的温度下处理至少5分钟。
该热处理步骤在制得的多孔材料上进行，特别是在冷冻干燥步骤之后进行。
这一限定非常显著地改善了多孔材料的机械性能及其在水性介质中的弹性和行为，特别是降低了其溶解速率。
有利的是，已经观察到压缩强度也得到改善。在手动施加压缩应力的作用下，多孔材料被压缩，但是一旦释放应力，其趋于恢复初始尺寸和形状。已经观察到不仅是干燥的多孔材料，用水浸渍的所述多孔材料也具有这样的品质。
在一种变型中，所述方法包括在含有至少一种功能剂和/或至少一种活细胞的溶液中浸渍多孔材料的步骤。
特别地，所述功能剂为生物活性剂。
有利地，所述功能剂选自以下第一系列(I)：抗凝血剂、抗血栓形成剂、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗粘连剂、抗迁移剂、细胞粘附促进剂、生长因子、抗寄生虫分子、抗炎剂、维生素、激素、蛋白质、抗真菌剂、抗微生物分子、防腐剂、抗生素(特别是环丙沙星和氯己定)、尼古丁、一种或多种精油，以及它们的混合物；所述至少一种活细胞选自以下第二系列(II)：动物细胞和/或人细胞和/或植物细胞。
优选地，活细胞包括原核细胞、真核细胞、细菌、酵母、植物细胞、动物细胞如内皮细胞、神经细胞、成淋巴细胞、成纤维细胞、成骨细胞、肝细胞、干细胞、胚胎细胞、脂肪细胞等，以及设计为表达特定分子的细胞。
第三方面，本发明提供用于吸收和/或排出和/或用于释放功能剂和/或用于支撑至少一种活细胞的装置，该装置包括：
通过实施根据本发明第一方面的任何一种变型所描述的方法制备的水凝胶；或者
包括通过实施根据本发明第二方面的任何一种变型所描述的方法制备的多孔材料。
有利地，所述装置选自：包括至少一个接收预定体积的水凝胶的储存器的注射器；能够递送至少一种功能剂和/或能够引流伤口的敷料；能够递送至少一种功能剂如尼古丁的贴剂。
特别地，所述功能剂为生物活性剂。
第四方面，本发明提供用于实施根据本发明第一方面的任何一种变型的方法制备水凝胶的装置，该装置包括接收由步骤(ii)得到的所述混合物的第一注射器和接受预定体积的酸化水性介质的第二注射器，所述混合物至少含有步骤(ii)得到的粉末(A)和(B)，所述水性介质含有至少一种化合物(C)和/或至少一种所述化合物(C)的磷酸酯，所述化合物(C)含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元，所述装置包括用于使第一注射器和第二注射器流体连通的工具，以使得含有所述化合物(C)和/或至少一种所述化合物(C)的磷酸酯的酸化水性混合物与至少包含粉末(A)和(B)的所述混合物混合，所述化合物(C)含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元。
所述用于流体连通的工具可以可选地从第一注射器和第二注射器拆卸；优选地，它们是可拆卸的。
有利地，第一注射器和第二注射器通过用于流体连通的工具(例如Lueur型配件)在其注射端处流体连通，其允许至少含有化合物(C)的酸化水性介质借助第二注射器的活塞被引入到第一注射器中，相反也可以通过第一注射器的活塞被引入到第二注射器中。
活塞多次启动直到形成水凝胶；产生的剪切促进壳聚糖粉末溶解并与阴离子聚合物的离子相互作用，以便形成稳定、坚实的水凝胶。
根据第五方面，本发明提供易于通过实施本发明的第一方面所述的任何一种变型的方法制备的水凝胶，所述水凝胶有利地含有环糊精聚合物(A)和含有胺官能团(NH2)的壳聚糖聚合物(B)；
所述环糊精聚合物(A)为将含有至少一种环糊精，和/或至少一种环糊精衍生物，和/或至少一种环糊精包合络合物，和/或至少一种环糊精衍生物包合络合物的混合物，和
至少一种(多元)羧酸和/或其相应的(多元)羧酸酐(A1)；或者
至少一种焦磷酸盐(A2)；或者
至少的环氧氯丙烷，
进行聚合反应得到的；
得到所述聚合物时进行了羧烷基化的步骤以接枝羧酸官能团(-COOH)(A3)。
优选地，环糊精聚合物属于族(A1)。
在一种变型中，阴离子聚合物(A)含有羧酸官能团(-COOH)。
在一种变型中，阴离子聚合物(A)含有至少3mmoles/g羧酸官能(COOH)。
优选地，根据本发明的第五方面的水凝胶，独立地适用于参照以上方面一至四方面中任一方面描述的变型和定义。
附图说明
图1A和1B示出了采用与本发明的制备水凝胶的方法不同的方法获得的水凝胶；
图2A和2B示出了采用该制备方法获得的水凝胶；
图3示出了本发明的多孔材料的弹性模量G'；
图4是直方图，纵坐标表示环丙沙星(CFX)的吸附量，单位为毫克每克(mg/g)；
图5是对应于图4中的各种多孔材料的环丙沙星释放度与时间的函数图；
图6示出了本发明的水凝胶实施例的弹性和粘性模量G'和G"随时间(分钟)和交替施加的两个应力A和B的变化的曲线图；
图7和8分别示出了本发明的水凝胶形成后1小时和24小时的照片。
具体实施方式
从以下实施例中可以更好地理解本发明，这些实施例是非限制性的。
使用下列化合物：
壳聚糖粉末(CHT1)：由Sigma Aldrich销售的“壳聚糖-中等分子量”(中等分子量：431000g/mol)，CAS号：9012-76-4，粉末形式，在1％乙酸中浓度为1％时的粘度为563.00厘泊(cps)，脱乙酰度大于或等于75％，特别是大约75％。
壳聚糖粉末(CHT2)：由Sigma Aldrich销售的“壳聚糖-低分子量”(低分子量：39000g/mol)，CAS号：9012-76-4，粉末和/或颗粒形式，在1％乙酸中浓度为1％时的粘度为96cps，脱乙酰度大于或等于75％。
壳聚糖粉末(CHT3)：由BioResources销售的“壳聚糖-高分子量”(高分子量：1250000g/mol)，CAS号：9012-76-4，粉末和/或颗粒形式，脱乙酰度为大于或等于75％。
环糊精聚合物：聚合物如下合成：400gβ-环糊精(Roquette Frères，莱斯特朗，法国)，400g柠檬酸(CAS77-92-9，Sigma Aldrich，Saint Quentin Fallavier，法国)和120克次磷酸钠(Sigma Aldrich，Saint Quentin Fallavier，法国)溶于2升水溶液(蒸馏水)中。然后将此水溶液的水在60℃和58mm汞柱的真空下在旋转蒸发器中蒸发足够的时间至干燥以获得固体混合物。然后将蒸发的固体残余物在140℃真空下加热120分钟。接下来，将该固体混合物投入2升蒸馏水中悬浮。悬浮液通过玻璃料过滤。在过滤器中回收不溶性聚合物，并用大量的水洗涤，然后在环境温度下干燥一周(也可以例如在60℃的通风烘箱中干燥24小时)。将含有可溶性聚合物的滤液在6000-8000道尔顿膜上透析5天，然后使用旋转蒸发器浓缩透析后的溶液。将纯化的过滤器冷冻，然后冷冻干燥，在此情况下采用型号为α12/LD的基质冷冻干燥器，在温度为63℃，0.06毫巴(mbar)的真空下，持续一段时间以获得粉末形式的固体。作为冷冻干燥的替代方案，也可以采用例如Büchi B-290的雾化器将纯化的滤液雾化。
得到71g可溶性环糊精聚合物(CDs1)和320g不溶性环糊精聚合物(Cdi1)。
聚(丙烯)酸(PAA)：由Sigma Aldrich提供，产品代码(323667-250G)，分子量为1800和450000。
海藻酸钠：产品代码(180947-500G)，批次(09611DD)，
来自苹果的果胶(聚-D-半乳糖醛酸甲酯)：产品代码(75282-500G)，批次(BCBG4396V)，Sigma
乳酸：CAS号50-21-5，相对于溶液的总体积，含有85重量％至90重量％的乳酸，ACS试剂级，Sigma
I-用于测量环糊精聚合物(Cds1或Cdi1)的IEC(离子交换容量)的操作模式的描 述，即测量每克环糊精聚合物中每毫摩尔的羧酸官能团(-COOH)的数量：
将100mg聚合物(CD1或Cdi1)溶于100毫升(mL)0.1M NaCl溶液中，然后在酚酞存在下用标准0.1M氢氧化钠作为有色指示剂进行测定。正常的IEC大约是每克聚合物(CDs1或Cdi1)4mmol；这与壳聚糖非常接近，壳聚糖每克具有约5mmol胺官能团(对于约80％的脱乙酰度)。胶凝现象与壳聚糖和环糊精聚合物(在族(A1)中)的IEC接近有关，并且与形成凝胶的壳聚糖和环糊精聚合物的比例有关。
II-制备本发明的水凝胶的实施例和对比例
标有w/w的比例表示所加成分的重量与由本发明方法的步骤四或步骤(v)制得的水凝胶的总重量的比例。
实施例1：将0.04g壳聚糖(CHT1)(2％w/w)和0.05g(2.5％w/w)环糊精聚合物(CDs1)在研钵中共研磨1分钟。将得到的粉末投入1.89g超纯水中悬浮，然后涡旋混合15秒(溶液的瞬时pH值为3.5，升至4.1)。然后向该悬浮液中加入0.02g冰醋酸溶液(在加入酸的过程中pH降至3.2，然后再升至5以上)，涡旋混合20秒。搅拌后即得到致密凝胶。所得水凝胶含有89％的水。
实施例2：将0.04g(2％w/w)壳聚糖(CHT1)和0.06g(3％w/w)环糊精聚合物(CDs1)在研钵中共研磨1分钟。将得到的粉末投入1.88g超纯水中，然后涡旋混合15秒。然后将0.02g冰醋酸溶液加入到涡旋混合20秒的悬浮液中。搅拌后即得到致密凝胶。所得水凝胶含有72％的水。
实施例3：将0.04g(2％w/w)壳聚糖(CHT1)和0.20g(10％w/w)环糊精聚合物(CDs1)在研钵中共研磨1分钟。将得到的粉末投入1.74g超纯水中悬浮，然后涡旋混合15秒。然后将0.02g冰醋酸溶液加入到涡旋混合20秒的悬浮液中。搅拌后即得到致密凝胶。所得水凝胶含有60％的水。
实施例4：将0.05g(2.5％w/w)壳聚糖(CHT1)和0.06g(3％w/w)环糊精聚合物(CDs1)在研钵中共研磨1分钟。将得到的粉末投入1.87g超纯水中，然后涡旋混合15秒。然后将0.02g冰醋酸溶液加入到涡旋混合20秒的悬浮液中。搅拌后即得到致密凝胶。所得水凝胶含有93％的水。
实施例5：将0.02g(1％w/w)壳聚糖(CHT1)和0.04g(2％w/w)环糊精聚合物(CDs1)在研钵中共研磨1分钟。将得到的粉末投入1.92g超纯水中悬浮，然后涡旋混合15秒。然后将0.02g 1％乙酸溶液加入到涡旋混合20秒的悬浮液中。所得到的凝胶不紧凑并具有缓慢流动的趋势。
实施例6：将0.06g(3％w/w)壳聚糖(CHT1)和0.04g(2％w/w)环糊精共聚物(CDs1)在研钵中共研磨1分钟。将得到的粉末投入1.88g超纯水中悬浮，然后涡旋混合15秒。然后将0.02g 1％乙酸溶液加入到涡旋混合20秒的悬浮液中。搅拌后即得到致密，不流动，并且能够被成型的凝胶。
实施例7：将0.04g(2％w/w)壳聚糖(CHT1)和0.02g(1％w/w)环糊精聚合物(CDs1)在研钵中共研磨1分钟。将得到的粉末投入1.92g超纯水中悬浮，然后涡旋混合15秒。然后将0.02g 1％乙酸溶液加入到涡旋混合20秒的悬浮液中。所得到的凝胶具有流动的趋势。
实施例8：将0.06g壳聚糖(CHT1)(3％w/w)和0.06g(3％w/w)环糊精聚合物(CDs1)在研钵中共研磨1分钟。将得到的粉末投入1.86g超纯水中悬浮，然后涡旋混合15秒。然后将0.02g冰醋酸溶液加入到涡旋混合20秒的悬浮液中。搅拌后即得到致密凝胶；它是均匀的，不在重力下流动。
实施例9：将0.06g壳聚糖(CHT1)(3％w/w)和0.1g(5％w/w)环糊精聚合物(CDs1)在研钵中共研磨1分钟。将得到的粉末投入1.82g超纯水中悬浮，然后涡旋混合15秒。然后将0.02g冰醋酸溶液加入到涡旋混合20秒的悬浮液中。搅拌后即得到致密凝胶；它是均匀的，不在重力下流动。
实施例10：与实施例8相同，区别在于壳聚糖为CHT2。
实施例11：与实施例8相同，区别在于壳聚糖为CHT3。
对于实施例10和11，所得到的水凝胶坚实、致密且均匀。如果翻倒不会流动。
实施例12：与实施例8相同，区别在于壳聚糖的量为3％w/w，环糊精聚合物(CDs1)的量为10％w/w。所得到的水凝胶坚实且致密，但是比本发明中其它实施例的水凝胶更粘稠，并且更厚。
对比例13：与实施例8相同，区别在于环糊精聚合物(CDs1)被市售的羧甲基β-环糊精钠盐(Aldrich，产品代码21906)代替。所得到的水凝胶翻转时流动且不坚实。
实施例14：与实施例8相同，区别在于，环糊精聚合物(CDs1)被分子量为1800的聚丙烯酸聚合物(产品代码上文给出)代替。
实施例14A：与实施例8相同，区别在于用果胶(产品代码上文给出)代替环糊精聚合物(CDs1)。
实施例14B：与实施例8相同，区别在于用海藻酸钠(产品代码上文给出)代替环糊精聚合物(CDs1)。
图7示出了实施例8，14，14A和14B的水凝胶形成一小时后的照片。
图8示出了实施例8，14，14A和14B的水凝胶。应该观察到由这些聚阴离子形成的水凝胶是坚实的，甚至在其形成24小时后也不流动。
实施例15：与实施例8相同，区别在于用高分子量聚丙烯酸聚合物(分子量：450000，上文给出)代替壳聚糖聚合物。
实施例14和15得到的的水凝胶是坚实的并且不流动。
实施例16，对照：与实施例8相同，区别在于所用的环糊精聚合物是通过用麦芽糖糊精(具有D19(19个重复单元)的葡萄糖当量值，以商品名出售，由Roquette生产，其线性分子结构不形成空腔)代替β-环糊精合成的。形成的凝胶坚实，不流动。
对比例17：将0.3g壳聚糖(CHT1)(3％w/w)研磨并在网孔为125μm的筛上过筛，溶解于9.3mL体积的已经加入0.1mL冰醋酸(1％w/w)的超纯水(93％w/w)，采用Ultra型匀浆器以约10000转/分钟(rpm)将其全部混合1分钟。然后，也将0.3g环糊精聚合物(CDs1)(3％w/w)研磨并在网孔为125μm的筛上过筛，加入到酸性壳聚糖溶液(CHT1)中；然后用Ultra型匀浆器以大约10000rpm将溶液搅拌1分钟。由G'和G”的值计算出的胶凝时间为5天，形成的凝胶为“液体”，有结块，不均匀，不适合成型(其在重力作用下流动)。因此将阴离子聚合物(CDs1)加入到酸性壳聚糖溶液中不能形成具有自持形状的坚实且紧凑的水凝胶。所得水凝胶示于图1A和1B。应该指出的是，在图1A的合成釜中，水凝胶沿壁流动，因此不坚实。在图1B中，当用注射器将水凝胶沉积在水平表面上时，其没有保持绳的形状。
对比例18：将0.3g未经研磨和筛分的壳聚糖粉末(CHT1)(3％w/w)和0.3g未经研磨和筛分的环糊精聚合物粉末(CDs1)(3％w/w)进行干式共研磨以减小粒度并将其混合。将共研磨的粉末混合物加入到9.3mL超纯水(93％w/w)中，然后涡旋混合所得的水溶液20秒，然后加入0.1mL(1％w/w)冰醋酸溶液。由G'和G”的值计算出的胶凝时间大于两个半小时。水凝胶具有坚实性，但结块。
对比例19：将经研磨并在网孔为125μm的筛上过筛的0.3g壳聚糖粉末(CHT1)(3％w/w)与0.3g经研磨并在网孔为125μm的筛上过筛的环糊精共聚物粉末(CDs1)(3％w/w)共研磨。将共研磨的粉末混合物悬浮于9.3mL超纯水(93％w/w)中，同时采用匀浆器以大约10000rpm搅拌20秒。接下来，将0.1mL(1％w/w)的冰醋酸溶液加入悬浮液中，并用匀浆器在大约10000rpm下搅拌20秒。从G'和G”的值计算出的胶凝时间大于2h30。形成的凝胶具有良好的质地，光滑，均匀且坚实，即在重力作用下不流动，能够成型为预定的形状。该水凝胶示于图2A和2B。从图2A中可以看出，水凝胶在翻转后不会流到制备釜的壁上，而且非常坚实。在图2B中，可以看出，水凝胶保持其从注射器射出时的绳状。也可以看出，它是均匀的，光滑的，不流动。
实施例17，18和19计算的胶凝时间是由弹性和粘性模量G'和G”与时间建立的函数曲线获得的，应力为100％，γ振幅为100％，使用例如由AntonPaar出售的那些动态机械光谱仪测得在25℃的温度下的角频率ω为每秒钟(s-1)10次。
实施例20：将0.3g壳聚糖(CHT1)(3％w/w)，0.3g(3％w/w)环糊精聚合物(CDs1)和0.3g羟基磷灰石(3％w/w)，即粉末混合物的总干重为33.3％，在研钵中共研磨1分钟。将得到的粉末混合物悬浮于9mL超纯水中，然后涡旋混合15秒。然后将0.01mL(0.1％w/w)的冰醋酸溶液加入到涡旋混合45秒的悬浮液中。制得了在重力作用下不流动的致密均匀的凝胶。
含有葡萄糖的水性介质的实施例
实施例27：将0.3g壳聚糖(CHT1)(3％w/w)，0.3g(3％w/w)环糊精聚合物(CDs1)和0.3g羟基磷灰石(3％w/w)，即粉末混合物的总干重为33.3％，在研钵中共研磨1分钟。将得到的粉末混合物悬浮于9mL相对于所述体积的所述水性介质含有5重量％的葡萄糖的水性介质中，然后涡旋混合15秒。然后将0.1mL的85％-90％浓缩乳酸溶液加入悬浮液中，涡旋混合45秒。用注射器将凝胶以绳状注入DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养基中并注入PBS型培养基中。所形成的绳是坚实的(可以用抹刀操纵)和稳定的(形成后长达一个小时)。
实施例28：该实施例与实施例27相同，区别在于，用已经用乳酸酸化的相对于所述介质的体积含有5重量％葡萄糖的水性介质制备粉末混合物，使用包括接收粉末混合物的第一注射器和包括含有葡萄糖的所述酸化的水性介质体积的第二注射器以及用于使所述第一注射器和第二注射器流体连通的工具的装置。所述第一注射器和第二注射器流体连通，从而使得酸化的水性介质进入粉末混合物中，反之亦然。该设备在粉末和水性介质混合期间产生剪切，由此促进水凝胶的形成。然后借助于所述装置(仅保留第一或第二注射器)将所形成的凝胶以绳状注入DMEM培养基中并注入生理学PBS型培养基中。与实施例27相比，绳的硬度和稳定性得到改善。
实施例29：该实施例与实施例28相同，区别在于用盐酸(0.036M)代替乳酸。然后将形成的凝胶借助于所述装置以绳状注入DMEM培养基中并注入生理学PBS型培养基中。与实施例27相比，绳的硬度和稳定性得到改善，但是比实施例28得到的差。
III-制备本发明的多孔材料
实施例21：采用Christie型α1/2冷冻干燥器，在-63℃，0.06毫巴的真空下，将实施例8的水凝胶进行冷冻干燥步骤至少24小时，以形成如泡沫的海绵状多孔材料。环境温度下6小时后，在水中的溶胀度为1739.0％，在PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH7.4，0.1M)中的溶胀度为445.0％([(湿重-干重)/干重]×100)。
实施例22：采用Christie型α1/2冷冻干燥器，在-63℃，0.06毫巴的真空下，将实施例9的水凝胶进行冷冻干燥步骤至少24小时。环境温度下6小时后，在水中的溶胀度为262.0％，在PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4，0.3M)中的溶胀度为336.0％。
实施例23：将实施例21的多孔材料置于140℃的容器中进行热处理1小时。该热处理使多孔材料的离子键转化为共价键，特别是转化成酰胺键而交联。然后观察到多孔材料的压缩强度即压碎强度得到非常显著的改善。这通过在两根手指之间压碎实施例23的多孔材料而肉眼观察到，与实施例21或22的多孔材料相反，在变形停止后，其瞬间准确恢复其形状。从图3中可以看出，实施例22和21的弹性模量G'的曲线图表明，经过热处理的实施例23的弹性模量G'明显高于实施例21的弹性模量G'。
实施例24：与实施例21相同，区别在于水凝胶用10％(w/w)的环糊精聚合物(CDs1)合成。
实施例25，对照：将实施例16的水凝胶进行冷冻干燥步骤以形成多孔材料。
实施例26：采用Christie型α1/2冷冻干燥器，在-63℃，0.06毫巴的真空下，将实施例20的水凝胶进行冷冻干燥步骤至少24小时，以形成含有羟基磷灰石(33.3％w/w)的多孔材料。
IV-细胞相容性的测定
根据ISO标准10993-5：2009医疗器械的生物学评价-第5部分-体外细胞毒性测试，测定实施例8得到的水凝胶和实施例21和22的多孔材料的细胞相容性。细胞活性方法为阿尔玛蓝-提取试验-L132(ATCC-CCL5)细胞方法。
测得实施例8的活性在1小时后为80％，在PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4，0.1M)中冲洗1小时后为84％。测得实施例21的活性在1小时后为91％和85％。
使用与上述相同的标准采用细胞MC3T3测量细胞毒性；对照为TCPS(组织培养聚苯乙烯)。实施例28的值约为90％，尽管当水性介质不含葡萄糖时，该值降至60％(约55％)以下。有利的是，当水性介质含有葡萄糖时，细胞毒性得到非常显著的改善。
V-浸渍多孔材料
将40mg实施例21、22、24和25的多孔材料在环境温度，250rpm搅拌下浸渍到含有2mg/mL环丙沙星的水溶液中4h。
将处理后的多孔材料置于37℃的0.1N氢氧化钠溶液中24小时以提取所吸附的环丙沙星。使用UV分光光度法在271nm的波长下测试所得的溶液，以测定每种多孔材料吸附的环丙沙星的量(mg/g)。得到的吸附图如图4所示。每个直方图上的竖线代表标准偏差。这里应该注意的是，基于麦芽糖糊精的实施例25的标准偏差高于基于环糊精的其他实施例计算的标准偏差。这表明，如果使用的糊精不具有疏水性空腔并且因此不形成包合物，则活性成分的加载水平更随机。实施例21、22和24表明，由环糊精聚合物得到的水凝胶的吸附能力随着用于制备水凝胶的参数的变化而变化，然而这些差异并不显著。
环丙沙星的释放是在闭路条件下，在37℃以30mL/min从500mL的PBS的储存器开始，注射PBS物流到30mg用环丙沙星浸渍的多孔材料。然后将离开多孔材料的PBS物流通入测量环丙沙星释放量的UV分光光度计(波长271nm)，然后所述物流被再导入到PBS储存器。相对于上面测得的吸收水平测定环丙沙星释放度(％)，并示于图4。图5中所示的环丙沙星释放度显示了环丙沙星释放曲线的非常显著的差异，基于麦芽糖糊精的聚合物(实施例25)非常快速，而实施例21、22和24的多孔材料缓慢。
VI-本发明的水凝胶的流变性能(实施例8)
所用测量仪器的规格：流变仪(MCR301-Anton-Paar)：
表1
应用 Rheoplus/32V3.00 21003114-33024
装置 MCR301SN80167488；FW 3.11；Slot7
测量系统 PP25-SN17009；间隙[d＝1mm]
剪切率 1.308min/s
剪应力 327.039Pa/mNm
电机修正系数 1
时间设定 每分钟1分
伽玛幅度(γ) 100％(第一和第二周期)
角频率(ω): 10s-1(第一周期)；50s-1(第二周期)
温度 25℃
图6示出了实施例8的经过两个应力循环A和B的水凝胶的弹性和粘性模量G'和G”的变化；在t0，G'(230Pa)>G”(130Pa)，则施加45分钟的应力A导致G'减小直到该值与G”相合并。停止应力A，随后立即施加应力B，导致G'瞬时增加，重新接近实验初始值(200Pa)，在应力B下5分钟后，再次施加应力A，G'恢复到最小值。经过连续3个每周期5分钟的交变应力A和B的循环，显示模量G'的变化是可逆的，表明水凝胶的粘性或弹性类型的行为取决于所施加的应力。该特性是具有流变流体行为(因此是触变性的)材料的特性。通过该测试表明，水凝胶具有有必要被认为是可注射的性质，即通过注射器可用：当注射器的活塞被推动时，凝胶在剪切力作用下在针头或导管中流动，并且一旦在其植入部位(例如骨缺损)就位，水凝胶再次凝固并恢复足够的内聚力以保持原位。
VII-实施例21和23的多孔材料的动态机械热分析(DMTA)
表2 仪器规格：流变仪(MCR301-Anton-Paar)。
表3 DMTA分析样品的特征和DMTA结果：
样品 厚度(mm) 长度(mm) 高度(mm) G'(Pa) G"(Pa)
实施例21 2.49 7 29 1.75E+06 1.84E+05
实施例23 1.7 7 29 5.11E+06 3.79E+05
以上表3示出了实施例21和23的多孔材料(例如海绵)的粘弹性结果。在25℃分析20分钟后，观察到弹性模量(G')总是高于粘性模量(G”)，这表明实施例21和23的两种多孔材料都显示出弹性行为。还应该指出，实施例23的两个模量G'和G”的值远高于实施例21的值。实施例23中采用的热处理由此改善了多孔材料的机械性能。因此，可以得出结论，在该热处理步骤中，分子内行为已经被改变，可能是由于离子键转化为共价键，这为实施例23的多孔材料提供了一定的硬度。

Claims (15)

1.一种制备水凝胶的方法，其特征在于，该方法依次包括以下步骤：
步骤一(i)，提供至少一种阴离子聚合物粉末(A)和至少一种含有胺官能团(-NH2)的壳聚糖粉末(B)；
步骤二(ii)，至少将步骤一中的粉末(A)和(B)干燥混合，以形成粉末混合物；
步骤三(iii)，将步骤二得到的粉末混合物悬浮于水性介质中，该水性介质具有能够使阴离子聚合物(A)溶解但壳聚糖(B)不溶解的pH；
步骤四(iv)，向步骤三得到的悬浮液中加入酸，以形成水凝胶；或者
将步骤三(iii)和步骤四(iv)用混合步骤五(v)代替，所述混合步骤五(v)包括将由步骤二(ii)得到的至少含有粉末(A)和(B)的所述混合物与含有至少一种化合物(C)，和/或至少一种所述化合物(C)的磷酸酯的酸化水性介质混合，所述化合物(C)含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将步骤一中的粉末(A)和/或粉末(B)和/或步骤二中的至少含有粉末(A)和(B)的粉末混合物在网孔小于或等于500μm，特别是小于或等于150μm的筛上过筛。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤二的混合为采用至少对所述粉末(A)和(B)进行干式共研磨的方式实施。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子聚合物含有硫酸官能团(-O-S(＝O)2-OH或-SO4H)，和/或所述硫酸官能团的盐，和/或亚硫酸官能团(-S(＝O)2-OH或-SO3H)，和/或所述亚硫酸官能团的盐，和/或磷酸官能团(-OP(＝O)2-OH或-PO4H)，和/或所述磷酸官能团的盐，和/或羧酸官能团(-COOH)，和/或所述羧酸官能团的盐。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述阴离子聚合物(A)为环糊精聚合物，
所述环糊精聚合物为将
含有至少一种环糊精，和/或至少一种环糊精衍生物，和/或至少一种环糊精包合络合物，和/或至少一种环糊精衍生物包合络合物的混合物，与
至少一种(多元)羧酸和/或其相应的(多元)羧酸酐(A1)；或者
至少一种焦磷酸盐(A2)；或者
至少的环氧氯丙烷，
进行聚合反应得到的，
得到所述聚合物时进行了羧烷基化的步骤以接枝羧酸官能团(A3)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，相对于所述水性介质的总体积，步骤(iii)或步骤(v)中的水性介质含有至少1重量％，优选至少4重量％的至少一种含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元的化合物(C)，和/或至少一种所述化合物(C)的磷酸酯。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括，将至少一种粉末形式的矿物填料加入到步骤二得到的粉末混合物中，矿物填料的重量(g)相对于粉末混合物的总重量优选为30％或以上。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述矿物填料为选自生物陶瓷、氧化铝(Al2O3)、氧化锆(ZrO2)、玻璃、玻璃离聚物、二氧化钛和它们的混合物；所述生物陶瓷优选为钙的磷酸盐，例如羟基磷灰石、β-磷酸三钙、碳酸钙。
9.一种制备多孔材料的方法，其特征在于，该方法包括权利要求1-8中任一项所述的制备水凝胶的方法以获得所述水凝胶，并且还包括将步骤四(iv)或步骤五(v)得到的水凝胶冷冻干燥以形成多孔材料的步骤。
10.根据权利要求9所述的制备多孔材料的方法，其特征在于，在制备所述水凝胶的方法的步骤二(ii)中，将成孔剂以粉末形式加入到所述粉末混合物中。
11.根据权利要求9或10所述的制备多孔材料的方法，其特征在于，所述方法包括在大于或等于100℃的温度下处理所述多孔材料至少5分钟的热处理步骤。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的制备多孔材料的方法，其特征在于，所述方法包括在含有至少一种功能剂和/或至少一种活细胞的溶液中浸渍多孔材料的步骤，所述功能剂选自以下第一系列(I)：抗凝血剂、抗血栓形成剂、抗有丝分裂剂、抗增殖剂、抗粘连剂、抗迁移剂、细胞粘附促进剂、生长因子、抗寄生虫分子、抗炎剂、维生素、激素、蛋白质、抗真菌剂、抗微生物分子、防腐剂、抗生素、尼古丁、一种或多种精油及它们的混合物，所述抗生素特别地为环丙沙星；所述至少一种活细胞选自以下第二系列(II)：人细胞、动物细胞和植物细胞。
13.一种用于吸收和排出和/或用于释放功能剂和/或用于支撑活细胞的装置，该装置包括采用权利要求1-8中任一项所述的方法制备的水凝胶或采用权利要求9-12中任一项所述的方法制备的多孔材料，其特征在于，所述装置选自：包括至少一个接收预定体积的水凝胶的储存器的注射器；能够递送至少一种功能剂和/或能够引流伤口的敷料；能够递送至少一种功能剂如尼古丁的贴剂。
14.一种用于实施权利要求1-8中任一项所述的制备水凝胶的方法的装置，包括接收由步骤(ii)得到的所述混合物的第一注射器和接收预定体积的酸化水性介质的第二注射器，所述混合物至少含有粉末(A)和(B)，所述酸化水性介质含有至少一种化合物(C)和/或至少一种所述化合物(C)的磷酸酯，所述化合物(C)含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元，所述装置包括用于使第一注射器和第二注射器流体连通的工具，以使得含有至少一种化合物(C)和/或至少一种所述化合物(C)的磷酸酯的酸化水性混合物与至少包含粉末(A)和(B)的所述混合物混合，所述化合物(C)含有至少一个己糖单元或己糖衍生物单元。
15.一种采用权利要求1-8中任一项所述的方法制备得到的水凝胶，其特征在于，所述水凝胶含有环糊精聚合物(A)和含有胺官能团(NH2)的壳聚糖聚合物(B)；
所述环糊精聚合物(A)为将含有至少一种环糊精，和/或至少一种环糊精衍生物，和/或至少一种环糊精包合络合物，和/或至少一种环糊精衍生物包合络合物的混合物，与
至少一种(多元)羧酸和/或其相应的(多元)羧酸酐(A1)；或者
至少一种焦磷酸盐(A2)；或者
至少的环氧氯丙烷，
进行聚合反应得到的；
得到所述聚合物时进行了羧烷基化的步骤以接枝羧酸官能团(-COOH)(A3)。
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