JP6051587B2 - 細胞培養用基材および細胞の取得方法 - Google Patents
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Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
上記の細胞培養用基材を用いて培養されている細胞から、興味対象の細胞を見出す工程と、
上記の細胞培養用基材に光を照射して、照射範囲内の基材をゾル化する工程と、
上記の範囲内の基材から分離した細胞を回収する工程と
を含む、細胞の取得方法を提供する。
[ゲル]
本発明の細胞培養用基材(以下、単に「基材」ともいう)を構成するゲルは、細胞培養が可能であって、加熱によってゾル化するゲルであれば特に限定されない。ここで、ゾル化とは、ゲルを加熱することによって、該ゲルを、液体を分散媒とするコロイド、すなわちゾルへと変換することを意味する。また、本明細書においては、ゾル化することを「溶解する」ともいう。
本発明の細胞培養用基材にコラーゲンゲルを用いる場合、基材におけるコラーゲン濃度は、通常0.04〜1重量%、好ましくは0.06〜0.15重量%である。また、ゼラチンゲルを用いる場合、基材におけるゼラチンの濃度は、通常1〜20重量%、好ましくは3〜10重量%である。
架橋剤や縮合剤を用いる方法では、該架橋剤は、細胞の生存、増殖、接着性および機能の発揮に影響を及ぼさない架橋剤や縮合剤であれば特に限定されない。そのような架橋剤は当該技術において公知である。例えば、ゼラチンを架橋する場合、架橋剤として、塩化カルシウムなどのカルシウム塩、塩化アルミニウムなどのアルミニウム塩、ジメチロール尿素などのN-メチロール化合物、2, 3-ジヒドロキシジオキサンなどのジオキサン誘導体、1, 3-ビスビニルスルホニル-2-プロパノールなどのビニル化合物、あるいはグルタルアルデヒド、エチレンジアミン、コハク酸などの多官能性化合物、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルフォリニウムクロライドn-ハイドレート(DMT-MM)などの縮合剤などを用い得る。また、N-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)と、ジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)もしくはエチル(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDC)との組み合わせを用いてもよい。なお、本発明の実施形態においては、これらの架橋剤を単独または2種以上組み合わせて用いることができる。
酵素反応を用いる方法では、トランスグルタミナーゼなどを用いることによって、ゼラチンの架橋を行うことができる。
放射線を用いる方法では、ゼラチンに電子線、ガンマ線などの放射線を照射することによって、ゼラチンの架橋を行うことができる。また、紫外線照射による架橋も可能である。
本発明の基材に用いられる金微粒子は、金イオンを含む溶液中で還元剤の存在下に、金からなる種核を成長させて得られ、且つ該金微粒子の体積平均径が35〜65 nmであることを特徴とする。本発明の実施形態において、金微粒子は、上記の特徴を有する限り、特に限定されない。なお、金からなる種核を成長させる方法自体は当該技術において公知であり、例えば、Perrault, S. D.およびChan, W. C. W., J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 17042-17043、Ziegler, C.、Eychmuller, A., J. Phys. Chem. C. 2011, 115, 4502-4506、およびBastus, N. G.ら, Langmuir. 2011, 27, 11098-11105に記載されている。
なお、本発明の基材に含まれる金微粒子の量は特に限定されないが、例えば、金濃度で表して100〜1000μM、好ましくは100〜500μMである。
本発明の基材は、上記の金微粒子を適切な分散媒に分散させた液と、溶解したゲルの溶液(ゾル)とを混合し、得られた混合物を冷却によりゲル化することにより製造することができる。なお、上記の分散液に用いられる分散媒は、細胞に対して毒性のない水性媒体であれば特に限定されず、例えば水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。
本発明の細胞の取得方法(以下、単に「方法」ともいう)では、まず、本発明の細胞培養用基材を用いて培養されている細胞から、興味対象の細胞を見出す。
上記の興味対象の細胞は、基材上で培養している細胞の中から選択的に取得しようとする任意の細胞であればよい。そのような細胞としては、例えば、興味対象の機能を有するか、または興味対象の分子を発現している細胞などが挙げられ、より具体的には、上記の幹細胞、免疫細胞、形質転換細胞などである。
光を基材上の興味対象の細胞自体または該細胞を含む領域に照射した場合、興味対象の細胞が該基材から分離する。この分離した細胞を培地ごと回収することにより、興味対象の細胞を取得することができる。また、光を基材上の興味対象の細胞を含まない領域に照射した場合、興味対象の細胞以外の細胞が該基材から分離する。この分離した細胞を培地ごと回収することにより、興味対象の細胞を、容器内に残った基材上に付着した状態で取得できる。あるいは、フォトリゾグラフィーで用いられるマスクにより、光の照射範囲を制御することもできる。
(1)金微粒子の作製
(1-1)アスコルビン酸を用いた金微粒子の作製
(1-1-1)試薬
・HAuCl4水溶液
塩化金酸四水和物(HAuCl4・4H2O) (1g:ナカライテスク株式会社)を超純水(10 ml)に溶解して希釈し、HAuCl4水溶液(230.2 mM)を調製した。さらに、このHAuCl4水溶液を超純水で希釈して、HAuCl4水溶液(7.06 mM)を調製した。
・クエン酸混合溶液
クエン酸三ナトリウム二水和物(27.4 mg:ナカライテスク株式会社)と、クエン酸一水和物(1.3 mg)と、超純水(2.4 ml)を混合して、クエン酸混合溶液(クエン酸三ナトリウム:38.5 mM、クエン酸:2.38 mM)を調製した。
・アスコルビン酸水溶液
アスコルビン酸(48 mg:Sigma-Aldrich社)を超純水に溶解して、アスコルビン酸水溶液(6.8 M、4ml)を調製した。
・クエン酸三ナトリウム水溶液
クエン酸三ナトリウム二水和物(27.4 mg)を超純水に溶解して、クエン酸三ナトリウム水溶液(71 mM、2ml)を調製した。
HAuCl4水溶液(7.06 mM、2.083 ml)と、超純水(47.917 ml)とを混合し、得られた混合溶液を攪拌しながら、オイルバスにて120℃で加熱した。この混合溶液が沸騰した時点で、すばやくクエン酸混合溶液(2ml)を加え、5分間加熱還流して、金からなる種核を含む溶液(金濃度282.9μM) (以下「Seed A溶液」という)を得た。
HAuCl4水溶液(7.06 mM、2ml)と、超純水(10 ml)とを混合して、A1溶液を調製した。アスコルビン酸水溶液(6.8 M、0.5 ml)と、クエン酸三ナトリウム水溶液(71 mM、0.25 ml)と、超純水(11.25 ml)とを混合して、B1溶液を調製した。上記のSeed A溶液(3ml)と、超純水(17 ml)とを混合して、C1溶液を調製した。A1溶液(12 ml)およびB1溶液(12 ml)のそれぞれを別個の10 mlシリンジに入れ、各シリンジにテフロン(登録商標)チューブを繋ぎ、シリンジポンプ(SP-2PC:AS ONE社製)を用いて、それぞれの溶液を独立かつ等速(10 ml/45 min)で、攪拌中のC1溶液へ注入した(室温)。注入後、ただちに混合液をオイルバスにて120℃で30分間加熱還流した。その後、放冷して、種核を成長させて、金微粒子を含む溶液(金濃度315.5μM) (以下「Growth A溶液」という)を得た。
得られたGrowth A(4.5 ml)と、超純水(15.5 ml)とを混合して、C2溶液を調製した。このC2溶液に含まれる金微粒子を種核として、さらに成長させた。すなわち、上記のC1溶液に替えてC2溶液を用いたこと以外は上記と同様にして、金微粒子を含む溶液(金濃度329.8μM) (以下「Growth B溶液」という)を得た。
なお、各溶液中の金微粒子は常温下でさらに成長するので、これらの溶液を所定の期間保存した。保存の開始から0時間、1日、2日および5日目において、各溶液から一部を採取した。また、Seed A溶液についても同様に保存し、サンプリングした。
(1-2-1)試薬
・HAuCl4水溶液
HAuCl4水溶液(230.2 mM)を超純水で希釈して、HAuCl4水溶液(29.47 mM)を調製した。
・クエン酸三ナトリウム水溶液
クエン酸三ナトリウム二水和物を超純水に溶解して、クエン酸三ナトリウム水溶液(38.7 mM)を調製した。
・ヒドロキノン
ヒドロキノン(ナカライテスク株式会社)を超純水に溶解して、ヒドロキノン水溶液(30 mM)を調製した。
HAuCl4水溶液(29.47 mM、0.3 ml)と、超純水(30 ml)とを混合し、得られた混合溶液を激しく攪拌しながら、オイルバスにて130℃で加熱した。この混合溶液が沸騰した時点で、クエン酸三ナトリウム二水和物水溶液(38.7 mM、0.9 ml)を加え、10分間加熱還流した。その後、常温にて静置して、金からなる種核を含む溶液(金濃度283.7μM) (以下「Seed B溶液」という)を得た。
HAuCl4水溶液(29.47 mM)を遠心分離(25℃、11000 rpm、60分)して、上澄み液を回収した。回収したHAuCl4水溶液の上澄み液(29.47 mM、0.1 ml)と、超純水(9.372 ml)と、Seed B溶液(0.406 ml)とを混合し、25℃に保ったインキュベータ(TAITEC BCP-120F)内で激しく攪拌した。得られた混合液にクエン酸三ナトリウム水溶液(38.7 mM、0.022 ml)を加えた後、すばやくヒドロキノン水溶液(30 mM、0.1 ml)を加えた。そして、1時間攪拌して種核を成長させて、金微粒子を含む溶液(金濃度306.2μM) (以下「Growth1溶液」という)を得た。
また、Seed B 溶液の量を0.2 mlおよび0.1 mlに変更したことと、最終的な水溶液の体積をそれぞれ10 mlとするために超純水の量を変更したこと以外は上記と同様にして、それぞれ、金微粒子を含む溶液(金濃度300.4μM) (以下「Growth2溶液」という)、および金微粒子を含む溶液(金濃度297.5μM) (以下「Growth3溶液」という)を得た。
なお、各溶液中の金微粒子は常温下でさらに成長するので、これらの溶液をクールインキュベータ(三菱電機エンジニアリング株式会社製)内で25℃にて暗室保存した。保存の開始から0時間、1日、3日、7日および30日目において、各溶液から一部を採取した。また、Seed B溶液についても同様に保存し、サンプリングした。
比較のため、デンドリマーに内包された金微粒子を作製した。
(1-3-1)試薬
・HAuCl4水溶液
HAuCl4水溶液(230.2 mM)を超純水で希釈して、HAuCl4水溶液(7.06 mM)を調製した。
・NaBH4-NaOH溶液
NaBH4 (2.27 mg:和光純薬工業株式会社)をNaOH水溶液(0.3 M、0.4 ml)に溶解して、NaBH4-NaOH溶液(1.96 mM)を調製した。
・PEG修飾デンドリマー(PEG-PAMAM-G4den)
PEG-PAMAM-G4denは、Kojima, C.ら, Bioconjugate Chem., vol. 11, 910-917 (2000) に記載の合成法に従って合成した。
PEG-PAMAM-G4den水溶液(10μM、16.7 ml)を超純水(12.294 ml)で希釈して攪拌しながら、HAuCl4水溶液(7.06μM、1.30 ml、デンドリマーに対して55当量)を加えた。ここに、NaBH4-NaOH溶液(1.96 mM、0.306 ml、デンドリマーに対して275当量)を加え、1時間攪拌して、金微粒子内包デンドリマーを含む溶液(金濃度300μM ) (以下「Dendrimer溶液」という)を得た。なお、作製方法は、Haba, Y. Kojima, C.ら, Langmuir, vol. 23, 5243-5246 (2007)に記載されている。
(2-1)金微粒子の表面プラズモン共鳴(SPR)測定
上記の各溶液について、UV/vis Spectrophotometer (JASCO V-630:JASCO社製)を用いて25℃での400〜800 nmの吸収スペクトルを測定した。なお、各溶液の金濃度が100μMとなるように超純水で希釈して、測定サンプルとした。測定結果から、530 nm付近のSPRに由来する、金微粒子に特有の吸収スペクトルの強度を比較することにより、各溶液に含まれる金微粒子の光吸収効率を評価した。
Seed A溶液中の種核、ならびにGrowth A溶液およびGrowth B溶液中の金微粒子の吸収スペクトルでは、Growth A、Growth Bの順にスペクトルのピークトップ位置のレッドシフトが見られ、スペクトル強度の増加が見られたことから、種核の成長が行えたと考えられる。
上記で得られた各溶液(10μl)を、グリッド(応研商事製)上に滴下し、室温で2分間静置した。そして、ろ紙で水分を吸い取り、デシケーター内で乾燥させてサンプルを得た。得られたサンプルを透過型電子顕微鏡(JEM-2000F、加速電圧200 kV:日本電子製)を用いて観察し、粒径を測定した。得られた画像を図1および図2に示す。図1の(a)〜(c)はそれぞれ、調製から2日後のSeed A溶液中の種核、ならびにGrowth A溶液およびGrowth B溶液中の金微粒子の画像である。また、図2の(a)〜(d)はそれぞれ、調製から7日後のSeed溶液中の種核、およびGrowth1〜3の溶液中の金微粒子の画像である。なお、図1および図2中のスケールバーはぞれぞれ20nmおよび50 nmを表す。
図1より、種核の体積平均径は13 nmであり、アスコルビン酸を用いて調製したGrowth A溶液およびGrowth B溶液中の金微粒子の体積平均径はそれぞれ31 nmおよび69 nmであった。この結果より、種核の成長を適切に行えたことがわかった。
図2より、種核の体積平均径は13 nmであり、ヒドロキノンを用いて調製したGrowth1〜3の溶液中の金微粒子の体積平均径はそれぞれ39 nm、49 nmおよび64 nmであった。この結果より、種核の成長を適切に行えたことがわかった。また、ヘキサゴナルな形状の粒子が多く見られた。これらの金微粒子の粒度分布を図3に示す。図3より、Growth1〜3の粒径の標準誤差(SD)は15%以内であり、単分散性が比較的高いことがわかった。
以降の実験では、ヒドロキノンを用いて作製した金微粒子を用いた。
Dendrimer溶液、ならびに調製から7日目のGrowth1〜3の溶液にレーザを照射して、溶液の温度変化を測定することにより、金微粒子の光熱変換能を検討した。
金濃度を100μMに調整した各溶液(3ml)を、可視光透過型プラスチックセル(Kartell社製)に入れ、撹拌しながら、レーザ射出装置(JUNO-5000:昭和オプトロニクス社製)を用いてレーザ(波長532 nm、強度0.9 W、光径3mm)を5分間照射した。この間に、熱電対(SK-1250MCIIIα:SATO KEIRYOKI社製)を用いて各溶液の温度を経時的に測定した。結果を図4に示す。
加熱により溶解する各種のゲル中に、上記のSeed B溶液中の種核、およびGrowth1〜3の溶液中の金微粒子をそれぞれ分散させた細胞培養用基材を作製した。
超純水で希釈した各溶液(1.3 ml)を、ウォーターバスを用いて60℃〜70℃で加熱した。ここへ、固体ゼラチン(90 mg、豚皮由来、タイプA:Sigma-Aldrich社製)を加え、30分間加熱しながら攪拌してゼラチンを溶解させた後、40℃に保った。これをマルチディッシュプレート(nunc社製)へ加え、サーモミキサー(eppendorf社製)を用いて40℃で1時間静置した。その後、冷蔵庫(4℃)で12時間以上静置して、金微粒子分散ゼラチンゲルを得た。得られた金微粒子分散ゼラチンゲルは、ゼラチン濃度が6wt%、金濃度が250μMであった。
超純水で希釈した各溶液(1.5 ml)を、ウォーターバスを用いて60℃〜70℃で加熱した。ここへ、固体ゼラチン(90 mg、豚皮由来、タイプA:Sigma-Aldrich社製)を加え、30分間加熱しながら攪拌してゼラチンを溶解させた後、40℃に保った。ここへ、NHS水溶液(0.087 M、0.075 ml:東京化成工業)を加えて素早く撹拌し、次いで、EDC水溶液(0.516 M、0.125 ml:ペプチド研究所)を加えて素早く攪拌した。これを、ただちにマルチディッシュプレート(nunc社製)へ加え、サーモミキサー(eppendorf社製)を用いて40℃で1時間静置した。その後、冷蔵庫(4℃)で12時間以上静置して、金微粒子分散架橋ゼラチンゲルを得た。得られたゲルに、ゲル300μl当たり600μlのPBS(-)を添加して37℃でインキュベーションして洗浄した。その後、PBS(-)を2回置換し、24時間にわたって洗浄を計3回行った。その後、Opti-MEM(300μl/well:GIBCO社)で置換して、37℃で24時間インキュベーションした。得られた金微粒子分散架橋ゼラチンゲルは、ゼラチン濃度が6wt%、NHS濃度が0.05 wt%、EDC濃度が0.5 wt%、金濃度が250μMであった。
(3-3-1)試薬
・10倍濃度無機塩培地
イオン交換水(10 ml)に、CaCl無水物(20.2 mg)、MgCl・6H2O (23.5 mg)、KCl (40.4 mg)、NaCl (639.7 mg)およびNaH2PO4・2H2O (14.1 mg)を加えて溶解させ、得られた溶液をフィルター滅菌して、10倍濃度無機塩培地を調製した。
・再構成溶液
NaOH (0.05 M、10 ml)に、NaHCO3 (219.7 mg)およびHEPES (477.12 mg)を加えて溶解させ、得られた溶液をフィルター滅菌して、再構成溶液を調製した。
・水(pH3)
イオン交換水にHCl水溶液(0.05 M)を加え、pHメーターを用いてpH3に調整し、得られた溶液をフィルター滅菌して、水(pH3)を調製した。
クリーンベンチ内で、氷冷下でCellmatrix I-A(コラーゲン濃度0.3wt%、pH3.0、0.447 ml:新田ゼラチン株式会社)に、金微粒子を含む溶液(0.333 ml)、10倍濃度無機塩培地(0.1 ml)、水(pH3、0.02 ml)、および再構成溶液(0.1 ml)を加えて、コラーゲン−金微粒子混合溶液(1ml)を調製した。これをマルチディッシュプレート(nunc社製)へ加え、ダイレクトヒートCO2インキュベータ(Thermo scientific社製)内で37℃にて1時間静置して、金微粒子分散コラーゲンゲルを得た。得られたゲルに、ゲル300μl当たり600μlのPBS(-)を添加して37℃で24時間インキュベーションして洗浄した。得られた金微粒子分散コラーゲンゲルは、コラーゲン濃度が0.134 wt%、金濃度が250μMであった。
比較のため、各種のゲル中に金微粒子内包デンドリマーを分散させた細胞培養用基材を作製した。具体的には、金微粒子を含む溶液に替えてDendrimer溶液を用いたこと以外は上記の(3-1)〜(3-3)と同様にして、同じ金濃度の細胞培養用基材を作製した。
(4-1)金微粒子分散ゲルのSPR測定
上記で得られたマルチディッシュプレート中の金微粒子分散ゲル(200μl/well、金濃度100μM)について、UV/visスペクトルを400〜800 nmの範囲でマルチプレートリーダー(Multiskan spectrum:eppendorf社製)を用いて測定した。測定は、ゲル作製直後、24時間PBS(-)洗浄後、24時間Opti-MEM処理後の順に行った。なお、コントロールとして、金微粒子を含まないゲルを用いた。
上記のマルチディッシュプレート内に作製した細胞培養用基材を、25℃または37℃に設定したサーモミキサー上に載せ、真上から垂直にレーザ(波長532 nm、強度0.9 W、光径3mm、照射面積約7mm2)を5分間照射して、ゾル化したゲルの面積を記録した。具体的には、デジタルカメラで撮影したゲルの画像からゾル化部分の長径および短径を実測して算出した。なお、架橋ゼラチンゲルおよびコラーゲンゲルでは、レーザの照射前にゲル上の培地などを除去した。
実施例1で得た、コラーゲンゲル中に金微粒子としてGrowth1〜3をそれぞれ分散させた細胞培養用基材を用いて、ヒト子宮頸癌由来のHeLa細胞を培養した。培地としてOpti-MEMを用いて、37℃、5%CO2雰囲気下で培養した。そして、培地を除去して、レーザ(波長532 nm、強度0.9 W、径3mm)をHeLa細胞が存在する基材上に5分間照射した後、すみやかに培地を添加した。レーザ照射の前後の細胞培養用基材の写真を、図11に示す。
Claims (5)
- 加熱によってゾル化するゲル中に金微粒子を分散させてなり、前記金微粒子が、金イオンを含む溶液中で還元剤の存在下に、金からなる種核を成長させて得られ、且つ前記金微粒子の体積平均径が39〜49nmであることを特徴とする細胞培養用基材。
- 前記還元剤が、金イオンを還元することにより、金からなる種核を成長させる物質である請求項1に記載の細胞培養用基材。
- 前記物質が、ヒドロキノン、アスコルビン酸およびクエン酸から選択される少なくとも1種である請求項2に記載の細胞培養用基材。
- 前記ゲルが、ゼラチンゲルまたはコラーゲンゲルである請求項1〜3のいずれか1項に記載の細胞培養用基材。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の細胞培養用基材を用いて培養されている細胞から、興味対象の細胞を見出す工程と、
前記細胞培養用基材に光を照射して、照射範囲内の基材をゾル化する工程と、
前記範囲内の基材から分離した細胞を回収する工程と
を含む、細胞の取得方法。
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