CN112190597A - 一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用 - Google Patents
一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及制药技术领域,尤其为一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用,包括如下步骤:S1,制备生物转化熊胆粉;S2,确定研究方向:生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用;S3,将生物转化熊胆粉和天然熊胆粉进行解热药效活性的对比研究;S4,通过实验确定生物转化熊胆粉的解热药效活性,得到生物转化熊胆粉可在制备解热药物中应用。本发明分别进行了人工熊胆粉和天然熊胆粉对内毒素致新西兰家兔发热模型的实验研究,实验结果显示,生物转化熊胆粉给药组明显降低内毒素致发热家兔的体温,效果优于天然熊胆粉,提示生物转化熊胆粉用于制备解热药物、并具有较佳药效活性,由此提示了生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域,涉及一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用。
背景技术
熊胆,由熊科动物黑熊或棕熊干燥胆囊胆汁得到,具有清热、平肝、明目的功效,其主要成分是牛磺熊去氧胆酸,熊胆是四大名贵动物药之一,有2000余年的入药历史,有大量的处方都含有熊胆成分,我国每年熊胆粉产量约30吨,仍然满足不了人类健康的需求,目前高端熊胆粉供需矛盾的日益突出和低端原料用熊胆粉市场需求的持续增加,使得熊胆粉的价格节节攀升,市场价格已经超过了5000 元/kg,因此,加快人工熊胆的研发是促进熊胆产业可持续发展的关键。
发明专利申请201410588581.5中,提供了一种人工熊胆粉及其制备方法,在不添加其他化学成分的前提下,将禽畜胆汁体外模拟生物催化转化,并通过一定工艺制成人工熊胆,为人工熊胆的制备提供了方式方法。
人工熊胆的应用前景是否可解决目前高端熊胆粉供需矛盾的日益突出和低端原料用熊胆粉市场需求的持续增加问题,因此需要一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用对上述问题做出改善。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点,而提出的一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用。
为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:
一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用,包括如下步骤:
S1,制备生物转化熊胆粉;
S2,确定研究方向:生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用;
S3,将生物转化熊胆粉和天然熊胆粉进行解热药效活性的对比研究;
S4,通过实验确定生物转化熊胆粉的解热药效活性,得到生物转化熊胆粉可在制备解热药物中应用。
优选的,所述S1,所述生物转化熊胆粉制备步骤:
S1,选取主要成分和质量百分比为:总胆酸:40~65%,氨基酸: 4~9%,微量元素:0.5~1%的鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉中的一种或多种混合物,形成禽畜胆粉,并将禽畜胆粉用pH=7~9的缓冲液溶解后,离心,过滤,得到滤渣和滤液,所述滤渣冷冻干燥保存;
S2,将所述滤液加入装有7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II的反应器中进行反应;所述7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶在反应器中以固定化的方式存在;
S3,将反应完毕后的反应液冷冻干燥后与所述滤渣混合,得到人工熊胆粉。
优选的,所述S2,所述解热药物为降低体温的药物。
优选的,所述S3,生物转化熊胆粉和天然熊胆粉进行解热药效活性的对比研究采用生物转化熊胆粉和天然熊胆粉对内毒素致新西兰家兔发热模型的实验研究,具体实现步骤如实施例1和实施例2。
优选的,所述S3,生物转化熊胆粉和天然熊胆粉进行解热药效活性的对比研究中阳性药采用吲哚美辛作为对照组。
优选的,所述S4,实验的统计分析方法采用:SPSS软件对各组间数据进行正态分布检验、LSD、Bonferroni及SNK检验进行统计分析和Dunnett’s T3检验、Dunnett’s C检验进行统计分析。
与现有技术相比,本发明提出了一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用,具有以下有益效果:
1、本发明对生物转化熊胆粉和天然熊胆粉进行了解热药效活性的对比研究,分别进行了生物转化熊胆粉和天然熊胆粉对内毒素致新西兰家兔发热模型的实验研究,实验采用内毒素诱导新西兰家兔发热,内毒素是公认的导致发热效应很强的外源性致热源之一,是革兰氏阴性细菌内毒素的活性成分,它能够刺激机体内生性致热原,引起强烈的炎症反应,从而使体温升高,PGE2、cAMP是目前公认的体温调节中枢发热介质,此外,吲哚美辛为非甾体类抗炎药,能通过对环氧合酶的抑制而减少前列腺素的合成,能作用于下丘脑体温调节中枢,引起外周血管扩张及出汗,使散热增加,以吲哚美辛作为阳性药,通过对生物转化熊胆粉对新西兰家兔的发热模型影响的动物实验,显示生物转化熊胆粉可降低发热家兔的体温,其解热作用优于天然熊胆粉相当,提示生物转化熊胆粉用于制备解热药物、并具有较佳药效活性,由此揭示了生物转化熊胆粉在制备解热药物中的用途前景,从而解决目前高端熊胆粉供需矛盾的日益突出和低端原料用熊胆粉市场需求的持续增加问题。
附图说明
图1为本发明一种痰热清注射液中四种熊胆粉相关成分含量的生物转化熊胆粉对内毒素致新西兰兔发热4h的影响结果图;
图2为本发明一种痰热清注射液中四种熊胆粉相关成分含量的生物转化熊胆粉对内毒素致新西兰兔发热5h的影响结果图;
图3为本发明一种痰热清注射液中四种熊胆粉相关成分含量的生物转化熊胆粉对内毒素致新西兰兔发热6h的影响结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
请参照图1-3,一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用,包括如下步骤:
S1,制备生物转化熊胆粉;
S2,确定研究方向:生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用;
S3,将生物转化熊胆粉和天然熊胆粉进行解热药效活性的对比研究;
S4,通过实验确定生物转化熊胆粉的解热药效活性,得到生物转化熊胆粉可在制备解热药物中应用。
所述S1,所述生物转化熊胆粉制备步骤:
S1,选取主要成分和质量百分比为:总胆酸:40~65%,氨基酸: 4~9%,微量元素:0.5~1%的鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉中的一种或多种混合物,形成禽畜胆粉,并将禽畜胆粉用pH=7~9的缓冲液溶解后,离心,过滤,得到滤渣和滤液,所述滤渣冷冻干燥保存;
S2,将所述滤液加入装有7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II的反应器中进行反应;所述7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶在反应器中以固定化的方式存在;
S3,将反应完毕后的反应液冷冻干燥后与所述滤渣混合,得到人工熊胆粉。
所述S2,所述解热药物为降低体温的药物。
所述S3,生物转化熊胆粉和天然熊胆粉进行解热药效活性的对比研究采用生物转化熊胆粉和天然熊胆粉对内毒素致新西兰家兔发热模型的实验研究,具体实现步骤如实施例1和实施例2。
所述S3,生物转化熊胆粉和天然熊胆粉进行解热药效活性的对比研究中阳性药采用吲哚美辛作为对照组。
所述S4,实验的统计分析方法采用:SPSS软件对各组间数据进行正态分布检验、LSD、Bonferroni及SNK检验进行统计分析和Dunnett’s T3检验、Dunnett’s C检验进行统计分析。
具体实施方式:
实施例1生物转化熊胆粉的制备
按照发明专利申请201410588581.5中的制备方法进行生物转化熊胆粉的制备
1.选取选料:采用的制备原料禽胆可以为鸡胆、鸭胆、鹅胆、牛胆、兔胆、狗胆、羊胆等,且采用的禽畜胆粉可以为鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉等禽畜胆粉中的一种或多种混合物,其中较佳地禽畜胆粉的主要成分和质量百分比如下:胆酸:40~65%,氨基酸:4~9%,微量元素:0.5~1%,其中总胆酸中含有TCDCA,且TCDCA占禽畜胆粉的质量百分比为 40~50%,除上述主要成分外,禽畜胆粉还含有其他成分,包括:水分、胆色素、维生素、胆固醇、脂肪酸等。
2.进行制备:以鸡胆粉制备生物转化熊胆粉为例,步骤具体如下:
(1)鸡胆粉的制备:鸡胆从屠宰场购买得到,首先确定胆的数量和重量,用75%酒精对鸡胆局部进行消毒,然后分别剖取胆汁,将取出的胆汁冷冻干燥48h,得到鸡胆粉,放置干燥器中保存备用;
(2)生物转化熊胆粉的制备:
①鸡胆粉的处理:使用pH 7.0~9.0的磷酸盐缓冲液(PBS)、 Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(Gly-NaOH)溶解鸡胆粉,配制1L溶液,超声充分溶解,将鸡胆粉溶液在11000g条件下离心10min后,多次过滤,上清液(滤液)作为禽畜胆粉处理液在4℃保存,备用,滤渣冷冻干燥,保存备用;
②固定化酶的制备:在1%的壳聚糖(水溶性)溶液中加入适量醋酸,磁力搅拌30min制得壳聚糖醋酸溶液,将上述溶液用高压注射泵注入到100mL 3%(w/v)的三聚磷酸钠溶液中固化1~2h,得到粒度均匀、形状规则的白色的壳聚糖球,然后过滤,用去离子水洗涤多次,将制备好的壳聚糖球放入盛有0.125%戊二醛水溶液的烧杯中,并置于37℃,170g下的摇床中,活化2~4h,即得活化壳聚糖微球,称取10g活化好的壳聚糖微球,装入小型层析柱,加入适量的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶液,所述 7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶 (7β-HSDH)来自于微生物,如撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense,DSM599/ATCC27555)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilisATCC25825)或产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens ATCC25986),采用垂直混合方式结合4~6h,固定完毕,放出酶液,并用PBS缓冲液冲洗固定后酶柱3~5次,结果检测表明7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的固定率大于90%;
③生物催化转化:在固定化酶柱中加入制备好的鸡胆粉溶液处理后的滤液作为反应底物溶液,加入辅酶I或辅酶II,使辅酶I(或辅酶II):TCDCA=1:2~1:4(摩尔比),在20~30℃下,反应2~6h;
④反应液的处理:将反应完毕后的反应液冷冻干燥48h,得固体反应产物,最后将制备鸡胆粉的滤渣与反应产物混合均匀,即得生物转化熊胆粉。
实施例2对内毒素致新西兰兔发热模型的影响
1.选取实验动物;
2.实验动物的基本情况:
(1)动物种系:新西兰兔;
(2)年龄:6-9周龄;
(3)性别:雌雄各半;
(4)体重范围:①接收时体重范围:雄性1.924-2.803kg,雌性1.974-2.746kg,②给药时体重范围:雄性1.950-3.024kg,雌性 1.924-2.940kg;
(5)来源:广州市花都区花东信华实验动物养殖场;
(6)等级:普通级;
(7)实验动物生产许可证号:SCXK(粤)2014-0023(有效期至 2019年04月22日),广东科学技术厅签发,实验动物质量合格证明号:44007600006426;
3.进行动物分组,动物分组方法如下:检疫结束后,选用检疫观察合格的小鼠,根据体重、性别按照分组方法(一)均衡随机分成9 组即:分别为阴性对照组(8只/组),模型组(8只/组)、生物转化熊胆粉低、中、高剂量组(8只/组),天然熊胆粉低、中、高剂量组(8只/组)、阳性对照组(8只/组);
4.制作阴性对照品及溶媒:
阴性对照品:0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)(分析纯),规格为500g/瓶,批号为20150806,生产厂家为天津市大茂化学试剂厂;
配制方法:(1)配制环境要求:配制时,无特殊温湿度限制;
(2)配制:称取CMC-Na,加超纯水溶解,配成浓度为0.5%CMC-Na 溶液;
(3)配制后保存条件及期限:常温保存,无湿度限制;保存期为7天;
溶媒:配置受试物及对照品溶媒均为0.5%羧甲基纤维素钠 (CMC-Na)(分析纯),规格为500g/瓶,批号为20150806,生产厂家为天津市大茂化学试剂厂;
5.根据试验方法进行试验设计:
(1)剂量和组别设计:试验共设9组,即:阴性对照组、模型组、生物转化熊胆低、中、高剂量组,天然熊胆粉低、中、高剂量组、阳性对照组,每组8只动物,雌雄各半详见表2:
表2组别、剂量设计一览表
注:①各组均以10mL/kg给药,②阴性对照组、模型组给予 0.5%CMC-Na溶液;
(2)受试物和对照品的给药途径、给药频率、给药期限:均为灌胃给药,给药容积为10mL/kg,检疫结束分组合格动物后,各组均给药1次;
(3)试验方法综述:选用检疫合格的新西兰兔,于试验前2天测基础肛温,连续测两次,选择两次肛温相差不超过0.3℃的动物,试验前1天,取体温合格的新西兰兔72只,按体重、性别随机分为9个组,分别为空白对照组,模型组,s生物转化熊胆粉低、中、高剂量组,熊胆粉低、中、高剂量组,阳性对照吲哚美辛组,阴性对照组和模型组给予溶媒,实验当天测量动物体温两次,取其平均值作为基础体温,用无热原0.9%氯化钠溶液将内毒素配成2μg/mL悬液,按0.3mL/kg经兔耳缘静脉注射内毒素,阴性对照组注射等体积0.9%氯化钠溶液,注射内毒素后,立即灌胃给予相应药物,测量动物体温于造模后0~6h 的变化情况;
(4)统计分析方法:所有数据均输入EXCEL2003进行统计分析,在不同组别中,对体温计算平均值±标准差,采用SPSS软件对各组间数据进行正态分布检验,采用单因素方差分析进行组间差异的比较,在比较前先对数据进行方差齐性检验,当组间方差齐同时,采用LSD、Bonferroni及SNK检验进行统计分析;当组间方差不齐时,采用Dunnett’s T3检验、Dunnett’s C检验进行统计分析;
(5)试验结果:实验结果显示,与阴性对照组比较,模型组体温明显增加(P<0.01),表明内毒素已成功引起发热,造模成功,与模型组相比,生物转化熊胆粉0.014g/kg、0.048g/kg、0.144g/kg 组和天然熊胆粉0.014g/kg、0.047g/kg、0.141g/kg组中体温均降低(P<0.05或p<0.01),且生物转化熊胆粉降低体温效果更明显,提示,生物转化熊胆粉组对内毒素致发热模型动物具有优于天然熊胆粉的解热作用,图1、图2和图3中,与阴性对照组相比,#表示 p<0.05,##表示p<0.01,与阴性对照组相比,*表示p<=0.05,**表示p<=0.01,生物转化熊胆粉对内毒素致新西兰家发兔热模型动物体温的影响试验结果详见统计表3、图1、图2和图3:
表3对内毒素致新西兰家发兔热模型动物体温的影响(n=8,单因素方差分析)
注:与阴性对照组相比,#表示p<0.05,##表示p<0.01;与阴性对照组相比,*表示p<=0.05,**表示p<=0.01。
以上药效实验数据表明,生物转化熊胆粉在解热方面的药效活性相对于天然熊胆粉有预料不到的提高,提示生物转化熊胆粉用于制备解热药物、并具有较佳药效活性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (6)
1.一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用,其特征在于,包括如下步骤:
S1,制备生物转化熊胆粉;
S2,确定研究方向:生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用;
S3,将生物转化熊胆粉和天然熊胆粉进行解热药效活性的对比研究;
S4,通过实验确定生物转化熊胆粉的解热药效活性,得到生物转化熊胆粉可在制备解热药物中应用。
2.根据权利要求1所述的一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用,其特征在于,所述S1,所述生物转化熊胆粉制备步骤:
S1,选取主要成分和质量百分比为:总胆酸:40~65%,氨基酸:4~9%,微量元素:0.5~1%的鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉中的一种或多种混合物,形成禽畜胆粉,并将禽畜胆粉用pH=7~9的缓冲液溶解后,离心,过滤,得到滤渣和滤液,所述滤渣冷冻干燥保存;
S2,将所述滤液加入装有7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II的反应器中进行反应;所述7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶在反应器中以固定化的方式存在;
S3,将反应完毕后的反应液冷冻干燥后与所述滤渣混合,得到人工熊胆粉。
3.根据权利要求1所述的一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用,其特征在于,所述S2,所述解热药物为降低体温的药物。
4.根据权利要求1所述的一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用,其特征在于,所述S3,生物转化熊胆粉和天然熊胆粉进行解热药效活性的对比研究采用生物转化熊胆粉和天然熊胆粉对内毒素致新西兰家兔发热模型的实验研究,具体实现步骤如实施例1和实施例2。
5.根据权利要求1所述的一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用,其特征在于,所述S3,生物转化熊胆粉和天然熊胆粉进行解热药效活性的对比研究中阳性药采用吲哚美辛作为对照组。
6.根据权利要求1所述的一种生物转化熊胆粉在制备解热药物中的应用,其特征在于,所述S4,实验的统计分析方法采用:SPSS软件对各组间数据进行正态分布检验、LSD、Bonferroni及SNK检验进行统计分析和Dunnett’s T3检验、Dunnett’s C检验进行统计分析。
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