CN103627745A - 一种固定赤霉菌生物转化制备烟酸的包埋-交联方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术应用领域，具体涉及一种将产腈水解酶的赤霉菌CA3-1（Gibberella intermedia，CGMCC No. 4903）用聚乙烯醇-壳聚糖、海藻酸钠-明胶复合材料固定化并分别用戊二醛和京尼平进行交联处理后用于制备烟酸的方法。本发明首次将京尼平应用于固定化细胞的制备，提高固定化细胞的机械性能。具体是将赤霉菌CA3-1固定化，加入适量的3-氰基吡啶，在最适反应条件下，得到产物烟酸。研究发现，用京尼平交联处理的壳聚糖-聚乙烯醇固定化细胞保留活力和重复利用性比戊二醛交联处理的固定化细胞要好，并且比海藻酸钠-明胶复合材料活力高；可以重复利用多次，有较高的底物耐受性，能提高单位菌体的生产能力。为赤霉菌CA3-1在由3-氰基吡啶制备烟酸的连续化生产提供技术支持。

Description

一种固定赤霉菌生物转化制备烟酸的包埋-交联方法

技术领域

本发明涉及一种利用京尼平交联聚乙烯醇-壳聚糖复合材料固定化腈水解酶产生菌---赤霉菌CA3-1（Gibberella intermedia,CGMCC No.4903）生物制备烟酸的方法，属于生物工程应用技术领域。

背景技术

烟酸，化学名称吡啶-3-甲酸，又名尼古丁酸，是一种动物所必需的化学物质，它参与有机物的氧化还原作用，在日常生活中被广泛应用。烟酸也是一种重要的医药原料和化工中间体。利用烟酸可以合成许多治疗各种皮肤性疾病、高血压症状和冠心病等的药物。也可作为药物中间体用于异烟肼等药物的生产，同时广泛用于发光材料、染料、饲料等。烟酸在人体内具有维持神经和皮肤健康、扩张血管、促进消化功能的作用。

生物转化制备烟酸是在温和的条件下进行的，催化活性高，反应过程易于控制，底物选择性强。这与传统的化学法生产烟酸相比，提高了生产效率、节约大量能源、减少废气废渣的产生量、降低了生产成本。

固定化细胞的转化活力因受到固定化过程的影响而有所降低，但固定化细胞的优势在于：固定化细胞容易回收重复利用，有利于产物的分离纯化，而且降低了生产成本，提高了单位利用效率。这一点是游离细胞所无法媲美的。因此，选择合适的固定方法和固定化材料制备残留活性高、能多次重复利用、储存和操作稳定性好的固定化细胞前景值得期待。

固定化分为单一材料和复合材料固定；传统固定化方法一般采用单一材料进行固定。复合材料固定化细胞则能够弥补单一材料固定化细胞难以同时兼有良好机械强度和高残留活力的劣势。本专利使用聚乙烯醇-壳聚糖复合材料包埋固定化赤霉菌CA-1，获得了较好的机械强度和保留活力。先包埋固定，而后经过交联剂处理，是进一步提高固定化细胞的机械强度的一种方法。现在主要代表性交联剂有传统交联剂戊二醛和生物交联剂京尼平。京尼平（Genipin）是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物,是一种优良的天然生物交联剂，可以与蛋白质、胶原、明胶和壳聚糖等交联制作生物材料。京尼平的毒性是传统交联剂（戊二醛等）的1/10000左右，大大降低了固定化细胞在交联过程中对细胞的损伤。戊二醛是一种双功能交联剂，其含有的醛基可以与羟基和氨基反应，从而起到交联作用，得到网状凝胶。戊二醛毒性大，在微生物固定化过程中会对其活性造成巨大损伤。

吴国杰等在《壳聚糖-聚乙烯醇的硬度研究》中得出结论聚乙烯醇-壳聚糖凝胶硬度随着聚乙烯醇与壳聚糖质量比和交联剂戊二醛浓度的增大而增大，证明利用戊二醛交联增加固定化细胞机械强度是可以实现的。在专利《一种京尼平交联大豆蛋白基茶叶碱控释胶囊制剂及其制备方法》中，以京尼平为交联剂，制备了表面光滑，内部致密的凝胶。具有无毒，稳定的三维网络结构。使得药物稳定性明显提高。在《生物交联剂京尼平交联牛心包生物支架材料的性能》一文中认为，京尼平交联比戊二醛交联效果具有更好生物相容性，交联效果好，是较好的交联方法。京尼平在生物材料领域应用较多，利用京尼平交联制备生物相容性好，毒性低的生物组织和生物骨骼。

本专利使用聚乙烯醇-壳聚糖复合材料固定赤霉菌CA3-1，并且分别使用戊二醛和生物交联剂京尼平对固定化细胞进行交联大幅提高其强度。利用京尼平进行固定化细胞的制备，这是首次报道。本专利使用京尼平交联的固定化细胞，很好的解决了固定化细胞重复利用次数少，交联处理后固定化细胞保留活力低等突出的问题，更好发挥固定化细胞的优势。

发明内容

本发明目的是提供一种京尼平交联复合材料固定化赤霉菌CA3-1（Gibberella intermedia, CGMCC No. 4903）生物制备烟酸的方法。

本发明的技术方案为：赤霉菌CA3-1通过液体培养获得菌液，经过离心分离获得湿菌体，用生理盐水离心洗涤数次后重悬于生理盐水中，分别与聚乙烯醇和壳聚糖的混合包埋材料溶液、海藻酸钠和明胶混合包埋材料溶液混合均匀后分别用注射器平稳的注入到含多聚磷酸钠的饱和硼酸溶液、氯化钙溶液中固化，得到的固定化小球经过滤、用PBS洗去表面未固定的细胞和固化溶液。1、戊二醛交联固定化细胞的制备：取定量的固定化细胞加入到含有戊二醛的PBS缓冲液中交联处理一定时间，交联结束后用生理盐水反复洗涤固定化细胞，除去残余戊二醛。2、京尼平固定化细胞的制备：取定量的固定化细胞加入到含有京尼平的PBS缓冲液中，在一定温度下下处理一段时间，结束后用PBS缓冲液反复洗涤数次，除去残余京尼平。取定量的固定化小球参与反应，加入PBS缓冲液，加底物3-氰基吡啶，在一定温度、一定pH值的条件下反应一定时间后，得到产物烟酸。

上述过程中，赤霉菌CA3-1的液体培养基（g/L）为：磷酸二氢钾2.72，硫酸亚铁0.0139，葡萄糖10，酵母粉7.5，氯化钠1.16，己内酰胺3.39，pH值为7.0。培养条件为：500mL三角瓶装60mL培养基在32℃，200rpm，往复式摇床振荡培养60h。离心分离所得菌体重悬于生理盐水中，获得10g/L的菌悬液。聚乙烯醇-壳聚糖固定化过程中，聚乙烯醇的质量分数为3%，壳聚糖溶液的质量分数为6%，多聚磷酸钠的质量分数为8%；海藻酸钠-明教固定化过程中，海藻酸钠的质量分数为3%，明胶质量浓度为1.5%，氯化钙质量分数为0.6%。形成的固定化细胞在0℃固化时间6h，用纱布过滤，用PBS缓冲液洗涤。戊二醛交联时，戊二醛浓度为0.5%，处理时间40s；京尼平交联时，京尼平浓度为0.1%，处理温度为30℃，处理12h。PBS缓冲液的加入量为7mL，pH值为7.4，底物3-氰基吡啶的浓度为100mM，加入量为7mL，温度为40℃。在以上条件下进行转化反应。

具体实施方式

下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。

实例一

戊二醛交联固定化细胞

聚乙烯醇-壳聚糖复合材料固定化细胞的方法：将制备的菌液经离心分离获得湿菌体，用生理盐水离心洗涤后，取0.05g菌体重悬于生理盐水中，制备成10g/L的菌悬液，向其加入质量分数为3%的聚乙烯醇溶液和6%的壳聚糖溶液，按一定比例充分混合均匀后用注射器平稳注入到含有8%（w/v）多聚磷酸钠的饱和硼酸溶液中，0℃下固化6h，得到固定化小球经过纱布过滤后用PBS缓冲液洗去未固定的细胞和混合固化溶液，固化结束后小球保存于生理盐水中。固定化小球呈乳白色，直径2mm左右。

海藻酸钠-明胶固定化细胞的方法：将制备的菌液经离心分离获得湿菌体，用生理盐水离心洗涤后，取0.05g菌体重悬于生理盐水中，制备成10g/L的菌悬液，向其加入质量分数为3%的海藻酸钠溶液和1.5%的壳聚糖溶液，按一定比例充分混合均匀后用注射器平稳注入到质量分数为0.6%的氯化钙溶液中成球，0℃下固化6h，得到固定化小球经过纱布过滤后用PBS缓冲液洗去未固定的细胞和混合固化溶液，固化结束后小球保存于含有10mM氯化钙的生理盐水中。

每一种固定化细胞取等量的7份两种固定化细胞，对每一份固定化细胞用不同浓度的戊二醛处理40秒，交联结束后用生理盐水洗涤经处理的固定化细胞，然后将固定化细胞置于生理盐水中，与4℃保存。

测定活力的条件为：取经过戊二醛交联的固定化细胞置于7mL pH为7.4的PBS缓冲液中，向其中加入100mM 3-氰基吡啶7mL，组成14mL反应体系反应30min。反应结束利用液相检测转化结果。

表1 不同浓度戊二醛处理聚乙烯醇-壳聚糖固定化细胞

表2  不同浓度戊二醛处理海藻酸钠-明胶固定化细胞

实验测定不同浓度戊二醛处理固定化细胞的保留活力数据。由实验数据可以得出，用戊二醛作为交联剂处理聚乙烯醇-壳聚糖、海藻酸钠-明胶复合材料固定化细胞对保留活力的影响较大，戊二醛在对材料起交联作用的同时会对菌体产生较大的作用，使菌体受损而失活。因此通过戊二醛交联来提高固定化细胞机械性能的方法是以损失较大部分活力作代价的。由此看来，戊二醛并不是一个优良的交联剂。

实例二

京尼平交联固定化细胞

按照实例一中的方法分别制备等量的7份两种固定化细胞，对每一份固定化细胞用不同浓度京尼平处理12h，交联结束用生理盐水洗涤经处理的固定化细胞，然后将固定化细胞置于生理盐水中，与4℃保存。

测定活力的条件为：取经过京尼平交联的固定化细胞置于7mL pH为7.4的PBS缓冲液中，向其中加入100mM 3-氰基吡啶7mL，组成14mL反应体系反应30min。反应结束利用液相检测转化结果。

表3 不同浓度京尼平处理聚乙烯醇-壳聚糖固定化细胞

表4 不同浓度京尼平处理海藻酸钠-明胶固定化细胞

实验测定不同浓度京尼平处理固定化细胞的保留活力数据。从数据可看出，用京尼平处理固定化细胞对固定化细胞的活力影响较小。与戊二醛相比，京尼平具有更好的应用前途，它满足了我们提高机械性能的要求，却没有造成固定化细胞保留活力的降低。

实例三

利用两种交联剂处理的两种固定化细胞进行批次转化烟酸

分别利用一定量京尼平和戊二醛处理的两种固定化细胞6mL进行批次试验，然后向其中加入7mL的PBS缓冲液，加入浓度为100mM的底物3-氰基吡啶溶液7mL，40℃，反应40min。每一批次转化结束用PBS缓冲液洗涤固定化细胞3次后投入到新的转化体系中进行下一批次反应。

表5 戊二醛交联固定化细胞与京尼平固定化细胞批次转化对比

  由表5可以看出，未经交联处理的海藻酸钠-明胶固定化细胞只能进行17个批次反应，经戊二醛交联固定化细胞可以重复利用23个批次反应，而京尼平交联固定化细胞重复利用28个批次。对于聚乙烯醇-壳聚糖固定化细胞，未交联处理的固定化细胞只能重复25批次，戊二醛交联处理固定化细胞使用31批次，京尼平交联处理能进行36批次。相比较而言，京尼平交联固定化细胞机械强度最好，使用次数最多。并且活力只有微小的降低。

由此可以得出，京尼平用于固定化细胞技术也具有很大的应用前途，比传统的化学交联剂戊二醛交联能力强，毒性低，使得固定化细胞在交联处理后活力保留高，损失少。

Claims (8)

1.一种利用固定化赤霉菌CA3-1细胞制备烟酸的方法，其特征在于分别利用京尼平和戊二醛处理聚乙烯醇-壳聚糖、海藻酸钠-明胶复合材料进行赤霉菌CA3-1的全细胞固定化，并用于烟酸的生物转化。

2.根据权利要求1所述的腈水解酶产生菌的固定化方法，其特征是用于固定化的腈水解酶产生菌为赤霉菌CA3-1，保藏编号为CGMCC No. 4903。

3.根据权利要求1所述的腈水解酶产生菌的固定化方法，其特征是腈水解酶产生菌的液体培养基为葡萄糖 6-12g，酵母粉 5-10g，磷酸二氢钾 1-5g，氯化钠 1-6g，硫酸亚铁 0.01-0.1g，己内酰胺 1-5g，加水至1L，pH为7.0，培养条件为500mL三角瓶装液30-60mL，于25-35℃、160-250rpm摇床培养30-90h。

4.根据权利要求1所述的方法，聚乙烯醇-壳聚糖固定化步骤是腈水解酶产生菌经过液体培养得到菌液，经过离心分离获得菌体，用生理盐水离心洗涤后重悬于生理盐水中，得到浓度为6-15g/L的菌悬液；取2-10mL菌悬液加入2-10mL 1-6%聚乙烯醇溶液和1-9%的壳聚糖溶液的混合溶液，混合均匀后用注射器平稳的注入到含有3-15%多聚磷酸钠的饱和硼酸混合固化溶液中，于-4-10℃下，固化2-8h，得到的固定化小球经过滤、洗涤，除去表面未固定的细胞和混合固化溶液，最后将固定化细胞保存在0-10℃的生理盐水中，以备用于生物转化制备烟酸。

5.根据权利要求1所述的方法，海藻酸钠-明胶固定化细胞步骤是腈水解酶产生菌经过液体培养得到菌液，经过离心分离获得菌体，用生理盐水离心洗涤后重悬于生理盐水中，得到浓度为6-15g/L的菌悬液；取2-10mL菌悬液加入2-10mL 1-6%海藻酸钠溶液和1-9%的明胶溶液的混合溶液，混合均匀后用注射器平稳的注入到0.6%氯化钙固化溶液中，于-4-10℃下，固化2-8h，得到的固定化小球经过滤、洗涤，除去表面未固定的细胞和混合固化溶液，最后将固定化细胞保存在0-10℃的生理盐水中，以备用于生物转化制备烟酸。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征为用0%-5%的京尼平在10-50℃下，交联处理复合材料固定化细胞4-16h，固定过程中，会伴随有颜色的变化；处理结束后，用生理盐水反复洗涤1-6次，除去未参与交联的京尼平。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征为用0-5%的戊二醛交联处理复合材料固定化细胞10-100s，交联过程中在摇床上进行，摇床转速在10-150rpm。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征为取3-13mL的固定化小球参与反应，加入3-8mL pH值6.0-10.0 的PBS缓冲液，加50-150mM底物3-氰基吡啶3-8mL，在30-50℃、pH值为6.0-10.0的条件下反应20-60min，得到产物烟酸和副产物烟酰胺的混合溶液。