CN104117095B

CN104117095B - 锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法

Info

Publication number: CN104117095B
Application number: CN201410367558.3A
Authority: CN
Inventors: 陈世益; 张鹏; 陈俊; 蒋佳; 吴子英; 万方; 陈天午
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2034-07-29
Also published as: CN104117095A

Abstract

本发明公开了一种锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，包括如下步骤：步骤一、PET人工韧带改性；步骤二、将预处理PET人工韧带材料浸泡在含锶的丝蛋白混合液中，搅拌反应20～30min，取出，晾干；再放入丝蛋白溶液静置后晾干；步骤三、重复步骤二，直至达到预设的循环次数，即得所述锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带。本发明通过利用仿生矿化的方法，以丝蛋白作为矿化模板，在人工韧带表面进行锶仿生丝蛋白复合涂层修饰，形成矿化结构均匀且性能稳定的复合涂层，改善人工韧带在体内应用存在的腱骨愈合差的问题。

Description

锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法

技术领域

本发明属生物医学领域，涉及一种锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法。

背景技术

膝关节交叉韧带损伤重建的移植物选择，多项临床研究已证明聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)人工韧带的中短期疗效及安全性较为满意，但其仍存在腱骨愈合不佳和并发滑膜炎等问题。因此，提高PET材料的生物相容性，促进人工韧带骨道两端腱骨愈合尤为重要。

由于PET人工韧带移植物表面首先接触到宿主内坏境，对其表面进行涂层(surfacecoating)处理，以增进生物材料的亲水性、生物相容性及骨传导性已成为骨科生物材料的发展重点。合理利用多种成分复合构建生物医用材料，不仅能兼得各组分的优良性质，还可能得到单一组分所不具备的新性能。将大分子蛋白质或酶等有机高分子物质以及HAp或Ca-P物等无机材料同时引入材料表面，使复合涂层材料兼备两者的优势，已经成为骨科领域促进植入物与宿主骨愈合的理想涂层方法。

一些研究通过对PET人工韧带材料表面应用明胶溶液复合羟基磷灰石(Hap)人工涂覆法进行了表面涂层，初步验证了应用HAp复合涂层对PET材料进行改性的可行性。但是，研究结果也显示通过人工直接涂覆的方法进行HAp复合涂层存在涂层不均匀、缺乏稳定性、实验结果可重复性较差以及成骨分化速率不高等问题。

丝素蛋白是从蚕丝中提取的天然高分子纤维蛋白，相对于胶原蛋白，其具有来源广，价格低，制备简单，具有优良的生物相容性和良好的物理化学性能。丝素蛋白18种氨基酸组成，含量约占蚕丝的70％～80％，因其本身具有良好的机械性能、理化性质及生物相容性，近年来成为组织工程支架材料研究的热点对象之一。研究表明丝素材料具有比其他天然纤维和高性能合成纤维更独特的力学性能；纤维表面易于化学共价修饰黏附位点和细胞因子，可通过不同方法处理获得多种形态及改变表面性能；在体内可以缓慢降解为氨基酸，且降解产物对生物体无危险性。但迄今为止，国内外尚无丝蛋白涂层对人工韧带涂层中应用的相关报道。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种制备简单，条件温和、节能环保、材料组织相容性好的锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，解决在长期临床应用暴露出来人工韧带与腱骨愈合程度低和速度慢的问题。本发明通过利用仿生矿化的方法，以丝蛋白作为矿化模板，在人工韧带表面进行锶仿生丝蛋白复合涂层修饰，形成矿化结构均匀且性能稳定的复合涂层，改善人工韧带在体内应用存在的腱骨愈合差的问题。

锶是一种银白色带黄色光泽的碱土金属，在自然界主要以化合态存在。锶元素广泛存在于矿泉水中，人体99％的锶蓄积于骨骼，在骨中的含量约占骨重量的0.01％，是人体骨中必需元素之一。在骨质发生的早期缺乏锶元素可以导致骨形成不足及骨钙化不良，锶离子在骨基质中保持一定的比例以维持骨质的正常功能。目前研究表明，少量增加的锶离子浓度可以显著促进成骨细胞的生长复制，刺激新骨形成；并抑制破骨细胞活性，减少新形成骨的再吸收。由于锶本身就是人体重要的微量元素，加入锶可以增加了生物相容性和安全性。研究发现，植入物中含有和/或释放锶离子的表面氧化物层则可诱导成骨细胞中的碱性磷酸酶的生成增加，其对于进一步的分化和矿化至关重要。

本发明采用丝蛋白掺杂锶形成有机涂层。这种技术在材料表面进行复合涂层，从而改善材料的生物相容性及骨传导性，使之在生物活性和力学性能方面满足临床医学的要求。丝蛋白在仿生矿化过程中具有明显的促进和调控作用。丝蛋白本身含有大量的β-折叠结构，能使亲水集团暴露于分子表面。在矿化过程中，丝蛋白作为模板，在自身凝聚形成纤维化的同时，还能诱导羟基磷灰石成核并吸附其继续结晶生长，形成细小均匀、排列规整、具有良好生物学性状的复合基质，是一种优越的矿化模板。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，包含如下步骤：

步骤一、PET人工韧带材料表面改性：用等离子体处理后，取出暴露于空气，清洗并真空干燥，得预处理PET人工韧带材料；

步骤二、将预处理PET人工韧带材料浸泡在含锶的丝蛋白混合液中，搅拌反应20～30min，取出，晾干；再放入丝蛋白溶液静置后晾干；

步骤三、重复步骤二，直至达到预设的循环次数，即得所述锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带。

优选的，步骤一中，所述等离子体处理是指，在本底真空3×10^-2～10×10^-5Pa、功率50～100W条件下用H₂、N₂或O₂等离子体对PET人工韧带材料表面膜层进行处理15～60min。

优选的，步骤二中，所述含锶的丝蛋白混合液的制备具体为：将锶源溶液与丝蛋白溶液混合搅拌，调节pH值为7.4～8即可。

优选的，所述锶源溶液的浓度为1～10mM，所述丝蛋白溶液的浓度为50～100mM；所述锶源溶液与丝蛋白溶液的体积比为1∶10～100。优选锶源溶液用量0.1～1ml，丝蛋白溶液用量1～100ml。

优选的，所述锶源选自硝酸锶、氯化锶、二氯化锶中的一种或几种的混合物。

优选的，所述丝蛋白选自天然丝蛋白、重组丝蛋白、天然蜘蛛丝中的一种或几种的混合物。

优选的，步骤二中，所述丝蛋白溶液的浓度为50～100mM。所述丝蛋白选自天然丝蛋白、重组丝蛋白、天然蜘蛛丝中的一种或几种的混合物。优选丝蛋白溶液用量1～100ml。

优选的，步骤二中，所述静置温度为常温，所述静置时间为5～45min。

优选的，步骤三中，所述预设的循环次数为5～30次。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

(1)掺锶丝蛋白涂层沉积于类似人体组织内环境条件，其成分更接近于人体骨无机质，从而提高材料的生物相容性和骨结合能力；

(2)锶离子可进步改善人工韧带的生物相容性、骨传导性及良好力学性能，促进腱骨愈合；

(3)该工艺在常温下进行，保持天然蛋白质等生物大分子的自然活性；

(4)该类工艺可在结构复杂的材料上生成较为均匀的涂层，可解决前期研究中通过在材料表面应用直接人工涂覆的方法而造成的涂层不均匀、稳定性较差的问题。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为PET人工韧带处理前后的细胞粘附率变化示意图；

图2为PET人工韧带表面涂层修饰前后与BMCS共培养24小时的MTT检测结果示意图；

图3为表面处理前后的PET人工韧带与BMCS细胞共培养不同时间的ALP检测结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明以下实施例中的原料均为现有常用原料，可以直接通过商家购买获得。本发明以下实施例中没有特别说明的操作，均可以采用现有常规技术手段。

实施例1

在氮气保护下，以水为溶剂，将0.1ml1mmol/L的SrNO₃和1ml50mM的天然丝蛋白溶液混合，调节pH值到8，25℃下搅拌5min。在本底真空10×10^-5Pa、功率50W，用H₂等离子体对人工韧带材料处理60min，再纯水清洗并真空干燥，得预处理人工韧带材料。

然后将人工韧带浸泡于上述含锶的丝蛋白混合液中，搅拌反应30min。使体系中游离的锶离子与丝蛋白的氨基残基充分结合，再取出滤纸吸干，再浸泡于1ml50mM的丝蛋白溶液，在25℃下反应5min，重复以上步骤5次，得到锶/丝蛋白仿生涂层修饰的新型人工韧带。

其中对所得到羟基磷灰石掺杂锶复合丝蛋白矿化涂层修饰的新型人工韧带进行生物学评价：

1)细胞粘附率检测。沉淀法取24孔培养板，在孔内植入锶/丝蛋白仿生涂层修饰的PET材料5块，大小约1cm×1cm。将细胞浓度为2×10⁶个/ml的细胞悬液0.5ml滴加到材料上。于孵育箱中复合培养4h后，PBS冲洗，去除未粘附的细胞。用0.25％胰蛋白酶进行消化，收集细胞并记数，计算细胞粘附率。细胞粘附率计算公式为：粘附率＝粘附细胞数/总细胞数×100％。对照组用未处理的PET材料，处理方法同上。具体结果如图1、2、3：

由图1可以看出，通过锶/丝蛋白表面仿生涂层修饰后的PET人工韧带具有很好的细胞粘附率，同时，随后的细胞增殖实验也证明，所制备的锶/丝蛋白表面仿生涂层能更好的促进骨髓间中质(BMCS)细胞的生长和增殖(图2)，这说明锶/丝蛋白表面仿生涂层具有良好的生物相容性。

进一步通过培养骨髓间充质(BMCS)细胞，DMEM培养基生长至对数生长期，消化传代，24h后待细胞贴壁长好，加入原始材料浸提液，同时设置未表面处理PET人工韧带浸提液处理细胞作为对照组。继续培养24小时后，通过碱性磷酸酶(ALP)试剂盒测定细胞的ALP活性。如图3，也表明所制备的抗感染人工韧带能有效促进骨髓间充质细胞粘附和生长。

其他实例的相关结果类似，在此就不一一例举。

实施例2

以水为溶剂，将1ml10mmol/L的氯化锶和100毫升100mM的重组丝蛋白溶液混合，调节pH值到7.4，25摄氏度下搅拌45分钟，在本底真空10×10^-5Pa、功率100W，用N₂等离子体对PET人工韧带处理60min，再纯水清洗并真空干燥；然后将人工韧带浸泡于此混合液中，搅拌反应20min。使体系中游离的Si离子与丝蛋白的氨基残基充分结合，再取出滤纸晾干，最后浸泡于100毫升100mM的重组丝蛋白溶液，在25摄氏度下搅拌反应45分钟，重复以上步骤30次，得到羟基磷灰石掺杂锶复合丝蛋白矿化涂层修饰的新型人工韧带。

实施例3

常温常压下，将0.5毫升5mM的硝酸锶和氯化锶的混合物与25毫升85mM的天然丝蛋白和重组丝蛋白混合溶液在25摄氏度下搅拌15分钟混匀，调节pH值到7.6，在本底真空10×10^-2Pa、功率80W，用O₂等离子体对PET人工韧带处理30min，再纯水清洗并真空干燥；然后将人工韧带浸泡于此混合液中，搅拌反应25min，使体系中游离的Si离子与丝蛋白的氨基残基充分结合，再取出滤纸晾干，最后浸泡于50毫升85mM的丝蛋白溶液，在25摄氏度下搅拌反应15分钟，重复以上步骤15次，得到羟基磷灰石掺杂锶复合丝蛋白矿化涂层修饰的新型人工韧带。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims

1.一种锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：

2.根据权利要求1所述的锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述等离子体处理是指，在本底真空3×10^-2～10×10^-5Pa、功率50～100W条件下用H₂、N₂或O₂等离子体对PET人工韧带材料表面膜层进行处理15～60min。

3.根据权利要求1所述的锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述含锶的丝蛋白混合液的制备具体为：将锶源溶液与丝蛋白溶液混合搅拌，调节pH值为7.4～8即可。

4.根据权利要求3所述的锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，所述锶源溶液的浓度为1～10mM，所述丝蛋白溶液的浓度为50～100mM；所述锶源溶液与丝蛋白溶液的体积比为1:10～100。

5.根据权利要求3所述的锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，所述锶源选自硝酸锶、氯化锶、二氯化锶中的一种或几种的混合物。

6.根据权利要求3所述的锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，所述丝蛋白选自天然丝蛋白、重组丝蛋白中的一种或几种的混合物。

7.根据权利要求1所述的锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述丝蛋白溶液的浓度为50～100mM。

8.根据权利要求1所述的锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，步骤二中，所述静置温度为常温，所述静置时间为5～45min。

9.根据权利要求1所述的锶/丝蛋白仿生涂层修饰人工韧带的制备方法，其特征在于，步骤三中，所述预设的循环次数为5～30次。