CN109125351A - 生物转化熊胆粉在制备抗病毒药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物转化熊胆粉在制备抗病毒药物中的应用。本发明对生物转化熊胆粉的抗病毒药效活性进行了研究,对H1N1流感病毒感染小鼠给药生物转化熊胆粉,并进行了给药后的小鼠生存率观察实验和小鼠肺部病变观察实验。实验结果提示了生物转化熊胆粉在制备抗病毒药物中的应用、特别是生物转化熊胆粉在制备抗H1N1流感病毒药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及制药技术领域,尤其涉及生物转化熊胆粉在制备抗病毒药物中的应用。
背景技术
熊胆,由熊科动物黑熊或棕熊干燥胆囊胆汁得到,具有清热、平肝、明目的功效,其主要成分是牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)。熊胆是四大名贵动物药之一,有2000余年的入药历史,有大量的处方都含有熊胆成分。我国每年熊胆粉产量约30吨,仍然满足不了人类健康的需求。目前高端熊胆粉供需矛盾的日益突出和低端原料用熊胆粉市场需求的持续增加,使得熊胆粉的价格节节攀升,市场价格已经超过了5000元/kg。更为严峻的是,国内外动物保护组织对活熊取胆的长期抵制,特别是最近的“归真堂”事件再次引起了国际国内社会的广泛关注,给国内熊胆粉的生产和相关产业的发展带来了前所未有的阻力。因此,加快人工熊胆的研发是促进熊胆产业可持续发展的关键。
本发明的申请人已于2015年3月4日向专利局提交了发明名称为“一种人工熊胆粉及其制备方法(申请号201410588581.5、申请公布号CN104382941)”的发明专利申请,该发明专利申请的内容以全文引用的方式并入本申请中。
上述发明专利申请201410588581.5中,提供了一种人工熊胆粉及其制备方法,在不添加其他化学成分的前提下,将禽畜胆汁体外模拟生物催化转化,并通过一定工艺制成人工熊胆。本申请所提供的就是该种生物转化熊胆粉在制药中的用途。
发明内容
本发明的目的在于提供生物转化熊胆粉在制备抗病毒药物中的应用。本发明所述的生物转化熊胆粉即为发明专利申请201410588581.5中公开的人工熊胆粉。
本发明通过以下技术方案实现:
本发明提供生物转化熊胆粉在制备抗病毒药物中的应用。
在本发明所提供的应用中,所述病毒为H1N1流感病毒。
所述生物转化熊胆粉是通过如下方法制备的熊胆粉:
a)将禽畜胆粉用pH=7~9的缓冲液溶解后,在11000g条件下离心10min,多次过滤,得到滤渣和滤液,所述滤渣冷冻干燥保存;
b)将所述滤液加入装有7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II的反应器中进行反应;所述7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶在反应器中以固定化的方式存在;
c)将反应完毕后的反应液冷冻干燥48h后与所述滤渣混合,得到人工熊胆粉。
本发明所述的禽畜胆粉是鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉中的一种或多种混合物。
所述禽畜胆粉的主要成分和质量百分比如下:总胆酸:40~65%,氨基酸:4~9%,微量元素:0.5~1%,其中,所述总胆酸中含有TCDCA,所述TCDCA占禽畜胆粉的质量百分比为40~50%。
本发明对生物转化熊胆粉进行了抗H1N1流感病毒药效活性的研究,具体来说,对H1N1流感病毒感染小鼠进行了生物转化熊胆粉给药,并进行了给药后的小鼠生存率观察实验和小鼠肺部病变观察实验。实验结果提示了生物转化熊胆粉在制备抗病毒药物中的应用、特别是生物转化熊胆粉在制备抗H1N1流感病毒药物中的应用。
具体实施方式
实施例1生物转化熊胆粉的制备
按照发明专利申请201410588581.5中的制备方法进行生物转化熊胆粉的制备。本发明所采用的制备原料禽胆可以为(且不局限于)鸡胆、鸭胆、鹅胆、牛胆、兔胆、狗胆、羊胆等。本发明中所述的禽畜胆粉可以为(且不局限于)鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉等禽畜胆粉中的一种或多种混合物。较佳地,禽畜胆粉的主要成分和质量百分比如下:胆酸:40~65%,氨基酸:4~9%,微量元素:0.5~1%;其中,所述总胆酸中含有TCDCA,所述TCDCA占禽畜胆粉的质量百分比为40~50%。除上述主要成分外,禽畜胆粉还含有其他成分,包括:水分、胆色素、维生素、胆固醇、脂肪酸等。
本实施例以鸡胆粉制备生物转化熊胆粉为例,步骤具体如下:
1、鸡胆粉的制备
鸡胆从屠宰场购买得到。首先确定胆的数量和重量。用75%酒精对鸡胆局部进行消毒,然后分别剖取胆汁。将取出的胆汁冷冻干燥48h,得到鸡胆粉,放置干燥器中保存备用。
2、生物转化熊胆粉的制备
(1)鸡胆粉的处理
使用pH 7.0~9.0的缓冲液溶解鸡胆粉,配制1L溶液,超声充分溶解,所述缓冲液优选磷酸盐缓冲液(PBS)、Tris-HCl缓冲液(三羟甲基氨基甲烷)或甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(Gly-NaOH);将鸡胆粉溶液在11000g条件下离心10min后,多次过滤,上清液(滤液)作为禽畜胆粉处理液在4℃保存,备用;滤渣冷冻干燥,保存备用
(2)固定化酶的制备
在1%的壳聚糖(水溶性)溶液中加入适量醋酸,磁力搅拌30min制得壳聚糖醋酸溶液。将上述溶液用高压注射泵注入到100mL 3%(w/v)的三聚磷酸钠溶液中固化1~2h,得到粒度均匀、形状规则的白色的壳聚糖球,然后过滤,用去离子水洗涤多次。将制备好的壳聚糖球放入盛有0.125%戊二醛水溶液的烧杯中,并置于37℃,170g下的摇床中,活化2~4h,即得活化壳聚糖微球。称取10g活化好的壳聚糖微球,装入小型层析柱,加入适量的7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶液,所述7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)来自于微生物,如撒丁岛梭菌(Clostridium sardiniense,DSM599/ATCC27555)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis ATCC25825)或产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens ATCC25986)。采用垂直混合方式结合4~6h,固定完毕,放出酶液,并用PBS缓冲液冲洗固定后酶柱3~5次。结果检测表明7α-羟基类固醇脱氢酶和7β-羟基类固醇脱氢酶的固定率大于90%。
(3)生物催化转化
在固定化酶柱中加入第(1)步制备好的鸡胆粉溶液处理后的滤液作为反应底物溶液,加入辅酶I或辅酶II,使辅酶I(或辅酶II):TCDCA=1:2~1:4(摩尔比),在20~30℃下,反应2~6h。
(4)反应液的处理
将反应完毕后的反应液冷冻干燥48h,得固体反应产物。最后将在第(1)步得到的滤渣与反应产物混合均匀,即得生物转化熊胆粉。
实施例2体内抗病毒实验
1.材料与方法
1.1实验动物:
Babl/C小鼠,SPF级别,雄性,初始体重16-18g,从西普尔-必凯实验动物有限公司购买(合格证:2008001667220)。
1.2病毒感染:
H1N1FM1毒株,为鼠肺适应株,本实验室保存。临用前,配制成10-3次方稀释液,小鼠麻醉后,鼻腔吸入感染30ul。感染小鼠按照体重区间,随机分组。
1.3药物配制:
实验药物用0.5%CMC溶解配制成不同浓度。
1.4给药方案:
生存率分析:口服灌胃给药,一天一次,7次给药(0-6天)后,停药,观察14天。
肺病变分析:口服灌胃给药,一天一次,6次给药(0-5天)后,解剖,观察肺部病变和肺指数。
1.5分组给药:
首次给药时间为病毒滴鼻感染后2小时,后续给药间隔24h。
正常组Normal:0.5%CMC
病毒组Virus:0.5%CMC
生物转化熊胆粉组ABBP:0.2g/kg;0.1g/kg;0.05g/kg
1.6生存率实验,观察指标:
每2天称量体重(0,2,4,6天),每天观察小鼠死亡情况,进行记录。1.7肺部病变观察:
每天称量小鼠体重,按照体重改变和小鼠发病状态,解剖。小鼠断颈处死后,解剖,打开胸腔,观察全肺的充血实质化病变程度,按照0,25%,50%,75%,100%,对无病变,轻微,中度,重度,全肺病变进行打分,如在两相区间内,进行相应增减。摘取小鼠全肺,吸去残血后,称量全肺重,根据肺重/体重*100公式计算肺指数,对病变进行数据量化校正。
2.实验结果
实验1:生存率观察实验
1.1小鼠体重改变情况如下表1所示:
表1小鼠体重改变
1.2生存率观察
感染后小鼠死亡情况(14天观察)如下表2所示:
表2感染后小鼠死亡情况
用药期间生存率观察(感染后5-6天)数据如下表3所示:
表3用药期间生存率观察(感染后5-6天)
小鼠平均生存时间对比(14天)见下表4所示:
表4小鼠平均生存时间对比(14天)
平均生存天数Mean | 标准偏差SD | 延长天数 | 延长率% | |
Normal | 13.30 | 2.21 | ||
Virus | 5.70 | 1.57 | ||
ABBP0.2 | 6.90 | 1.97 | 1.20 | 21.1% |
ABBP0.1 | 6.80 | 1.55 | 1.10 | 19.3% |
ABBP0.05 | 6.00 | 1.41 | 0.30 | 5.3% |
实验2:肺病变观察
2.1给药期间小鼠体重改变数据见下表5所示:
表5给药期间小鼠体重改变
小鼠5天死亡率数据见下表6所示:
表6小鼠5天死亡率
0d | 5d | 5d死亡率 | |
Normal | 4 | 4 | 0.0% |
Virus | 16 | 4 | 75.0% |
ABBP0.2 | 5 | 5 | 0.0% |
ABBP0.1 | 6 | 5 | 16.7% |
ABBP0.05 | 5 | 3 | 40.0% |
小鼠5天肺病变(死亡小鼠计算为100%病变)数据见下表7所示:
表7小鼠5天肺病变
肺病变%M | SD | 肺病变改善% | |
Normal | 0 | 0 | |
virus | 67.31% | 37.34% | |
ABBP0.05 | 37.00% | 39.94% | 45.03% |
ABBP0.1 | 35.00% | 36.06% | 48.00% |
ABBP0.2 | 37.00% | 25.64% | 45.03% |
存活小鼠肺指数观察数据见下表8所示:
表8存活小鼠肺指数观察
肺指数(肺重/体重*100%) | SD | 肺指数改善% | |
Normal | 0.69% | 0.04% | |
virus | 1.89% | 0.80% | |
ABBP0.05 | 1.40% | 0.68% | 25.6% |
ABBP0.1 | 1.19% | 0.40% | 36.8% |
ABBP0.2 | 1.44% | 0.54% | 23.6% |
3.实验结论
生存率观察实验和肺指数观察实验数据提示:生物转化熊胆粉对H1N1流感病毒感染小鼠具有保护作用(该作用明显优于天然熊胆粉),由此提示了生物转化熊胆粉在制备抗病毒药物中的应用、特别是生物转化熊胆粉在制备抗H1N1流感病毒药物中的应用。
Claims (5)
1.生物转化熊胆粉在制备抗病毒药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述病毒为H1N1流感病毒。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的应用,其特征在于,所述生物转化熊胆粉是通过如下方法制备的熊胆粉:
a)将禽畜胆粉用pH=7~9的缓冲液溶解后,在11000g条件下离心10min,多次过滤,得到滤渣和滤液,所述滤渣冷冻干燥保存;
b)将所述滤液加入装有7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶和辅酶I或辅酶II的反应器中进行反应;所述7α-羟基类固醇脱氢酶、7β-羟基类固醇脱氢酶在反应器中以固定化的方式存在;
c)将反应完毕后的反应液冷冻干燥48h后与所述滤渣混合,得到人工熊胆粉。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述禽畜胆粉是鸡胆粉、鸭胆粉、鹅胆粉、牛胆粉、兔胆粉、狗胆粉、羊胆粉中的一种或多种混合物。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述禽畜胆粉的主要成分和质量百分比如下:
总胆酸:40~65%,
氨基酸:4~9%,
微量元素:0.5~1%,
其中,所述总胆酸中含有TCDCA,所述TCDCA占禽畜胆粉的质量百分比为40~50%。
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