CN101897995B

CN101897995B - 一种可植入的披膜三维载体及其制备方法

Info

Publication number: CN101897995B
Application number: CN 201010224488
Authority: CN
Inventors: 吴世凯; 阳小卫; 姜舒; 郑意端; 胡祥
Original assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Beike Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2010-07-09
Filing date: 2010-07-09
Publication date: 2012-12-19
Anticipated expiration: 2030-07-09
Also published as: CN101897995A

Abstract

本发明提供了一种可植入的披膜三维载体及其制备方法，包括载体本体和载体膜，所述载体本体包括生物基质和活性物质，所述载体本体包裹于载体膜内。该载体膜不影响小分子的自由交换，但是可以阻止细胞和大分子量蛋白的交换，保证了载体不易被降解，本发明的结构简单、经济适用，能有效避免移植过程中产生的免疫反应和排斥反应。

Description

一种可植入的披膜三维载体及其制备方法

【技术领域】

本发明涉及生物载体技术领域，具体涉及一种可植入的披膜三维载体及其制备方法。

【背景技术】

随着干细胞在临床中的价值体现，移植免疫问题成为限制干细胞临床应用的主要困难，如何进行异体细胞移植而不产生显著的免疫排斥反应是目前干细胞应用中的一个迫切需要解决的热点课题，近年来，人们采用三维载体培养移植细胞的方法，采用藻酸钠、胶原、明胶等作为细胞支持材料，外围包裹一层多聚赖氨酸或壳聚糖作为包被，细胞既可以在包被中生长，又能通过包被与外界进行小分子物质的交换进而生长增殖，这为细胞的体外培养提供了很好的思路，但是在动物实验和临床实验中，由于多聚赖氨酸或壳聚糖会逐渐被生物体降解，包囊内的支持材料和细胞仍会与生物组织直接接触，从而产生免疫反应或排斥反应，这就使组织修复受到影响，患者可能因此需要二次修复或者造成病痛更加严重，给个人和社会带来巨大的经济负担。

【发明内容】

为了解决现有技术中存在的上述技术问题的不足，本发明提供一种用于组织修复的不易被降解的披膜三维载体及其制备方法。

本发明解决现有的技术问题所采用的技术方案为：提供一种可植入的披膜三维载体，包括载体骨架和披覆于载体骨架内表面的半透膜。本发明的进一步改进是，所述载体骨架内充斥有可流动的包括生物基质和活性物质。

本发明的更进一步改进是，所述载体骨架为球状、柱状或者不规则形状。

本发明的更进一步改进是，所述载体膜厚度为0.1--3mm。

本发明的更进一步改进是，所述载体膜的制备材料是聚醚砜(PES)、聚砜(PSF)、醋酸纤维素(CA)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)、混合纤维素酯(CNA)和聚氨酯中的任一种。

本发明的更进一步改进是，所述活性物质是细胞，或者是活性蛋白因子，或者是细胞和活性蛋白因子的组合。所述细胞包括各种组织的干细胞、祖细胞及其成体细胞，即：胰岛细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、内皮祖细胞、脐血干细胞、脐血单个核细胞、视网膜细胞；所述活性蛋白因子包括白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、生长因子和趋化性细胞因子。

本发明的更进一步改进是，所述生物基质的制备材料包括胶原、藻酸钠、甲壳素、透明质酸、明胶、纤维蛋白。

一种可植入的披膜三维载体的制备方法，包括以下步骤：(1)将浓度为1×10⁵～5×10⁶/ml的MSC与10ml 2％藻酸钠混合，用喷嘴机将混合物与CaCl₂交联成微球；

(2)将微球转移至无菌离心管中，并采用多种无菌溶液依次洗涤；

(3)将0.05％多聚赖氨酸与洗涤过的微球交联5-7min，并采用多种无菌溶液依次洗涤；

(4)将洗涤过的微球用0.03％藻酸钠包被3-5min形成外层结构，再用0.55mmol/L柠檬酸钠溶解内核5-7min；

(5)用无血清培养基洗涤两次，置入正常培养基中培养；

(6)用载体膜制备材料将之包裹后封口。

本发明的进一步改进是，所述步骤(2)中的无菌溶液依次为：0.55％CaCl₂，0.28％CaCl₂，0.85％生理盐水，0.1％CHES(2-N环基氨基-乙基磺酸)，1.1％CaCl₂。

本发明的更进一步改进是，所述步骤(3)中的无菌溶液依次为：0.1％CHES，1.1％CaCl₂，0.85％生理盐水。

本发明的更进一步改进是，所述步骤(6)的封口方法可以采用热封口或者机械封口。

一种可植入的披膜三维载体的制备方法，包括以下步骤：将浓度为1×10⁵～5×10⁶/ml细胞直接与基质材料混合均匀，注入载体膜制备材料中并封口。

一种可植入的披膜三维载体的制备方法，包括以下步骤：(7)收集浓度为1×10⁵～5×10⁶/ml细胞；

(8)将壳聚糖溶于10ml/L的乙酸溶液中，制备成浓度为2g/L的壳聚糖乙酸溶液；

(9)将壳聚糖乙酸溶液过滤除去杂质；

(10)利用高压静电场成囊装置，将浓度为17.5g/L的海藻酸钠溶液喷雾至0.12mol/LCaCl₂溶液中，形成海藻酸钙凝胶微粒；

(11)将凝胶微粒与2g/L壳聚糖溶液反应8-12min，使微粒外包裹一层壳聚糖；

(12)加入1.5g/L海藻酸钠溶液，中和微粒表面过剩电荷；

(13)用55mmol/L柠檬酸钠液化囊芯得到海藻酸钠-壳聚糖微球，将该微球装入半透膜袋中并封口。

本发明的进一步改进是，所述步骤(9)包括：加入浓度为20mol/L的NaOH溶液，使壳聚糖析出；过滤后用三蒸水洗涤至中性；然后经低温干燥得到纯化壳聚糖；将纯化壳聚糖溶于生理盐水中，并用一次性针式过滤器过滤除菌。

一种可植入的披膜三维载体的制备方法，包括以下步骤：(14)取生长状态良好的成骨细胞进行消化离心，加入明胶溶液中使细胞重悬，调整细胞密度为2×10⁶cells/mL；

(15)在培养箱中孵育25-35min，使成骨细胞与明胶充分接触；

(16)加入海藻酸钠溶液，混合均匀后，加入到注射器中；

(17)启动微囊制备装置，滴加1mL细胞混合液到30mLCaCl₂溶液中进行凝胶化反应，形成载细胞明胶海藻酸钠微胶珠；

(18)将胶珠加到壳聚糖溶液中覆膜反应8-12min，形成载细胞微囊；

(19)把载细胞微囊先用PBS洗涤，再用无血清培养基洗涤；

(20)将该微球装入半透膜袋中并封口。

本发明的有益效果是：1、本发明制备过程简单，常温常压下即可完成，适合大规模生产。

2、本发明的载体膜不影响小分子的自由交换，但是可以阻止细胞和大分子量蛋白的交换，保证了载体不易被降解，能有效避免移植过程中产生的免疫反应和排斥反应。

【附图说明】

图1为本发明的球状藻酸钠载体的示意图；

图2为本发明的披膜三维载体的示意图。

【具体实施方式】

下面结合附图说明及具体实施方式对本发明进一步说明。

如图1、图2所示，本发明提供一种可植入的披膜三维载体，包括载体本体2和载体膜1，载体本体2包裹于载体膜1内；载体本体2包括生物基质4和活性物质3；载体本体2为球状、柱状或者不规则形状；载体膜1厚度为0.1--3mm。

活性物质3是细胞，或者是活性蛋白因子，或者是细胞和活性蛋白因子的组合。所述细胞包括各种组织的干细胞、祖细胞及其成体细胞，即：胰岛细胞、造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、内皮祖细胞、脐血干细胞、脐血单个核细胞、视网膜细胞；所述活性蛋白因子包括白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、生长因子和趋化性细胞因子。细胞可以是具有适合于施加生物学上有用效用的任何类型。典型实例包括但不限于完全分化的细胞、依赖贴壁细胞、出生组织、不完全分化的胎儿组织、新生组织、不依赖贴壁转化细胞、细胞系等。更具体但非唯一地，细胞可以包括胰岛素生产细胞(例如胰岛)、肾上腺嗜铬细胞、抗体分泌细胞、成纤维细胞(尤其是利用遗传工程处理为产生重组神经生长因子的成纤维细胞)、星形胶质细胞和/或β细胞系；所述生物活性物质可以是任何活性因子，例如神经递质、神经调质、儿茶酚胺、生长因子、辅助因子、营养因子和激素，活性物质也可以是类似物、激动剂、衍生物或具有活性的活性因子片段，活性物质还可以是生物活性物质的抑制剂。

生物基质4的制备材料包括胶原、藻酸钠、甲壳素、透明质酸、明胶、纤维蛋白。

载体膜1的制备材料是具有较好的生物相容性的高分子材料，可以是聚醚砜(PES)、聚砜(PSF)、醋酸纤维素(CA)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)、混合纤维素酯(CNA)和聚氨酯中的任一种。非极性材料需经过极性处理，组织工程优选的合成材料是合成聚合体，包括由加聚反应和缩聚反应而来的低聚物、同聚物和共聚物。根据载体本体形状将之包裹后封口，封口方法采用热封口或机械封口，并保存于培养液中，使用前需用生理盐水洗涤。当该三维载体植入组织中时，载体内细胞可以正常生长代谢，但被载体膜阻隔不能直接接触组织细胞，大大降低了发生免疫排斥的几率。

球状藻酸钠载体的制备方法：将浓度为1×10⁵～5×10⁶/ml的MSC与10ml 2％藻酸钠混合，混合物通过喷嘴机与CaCl₂交联成微球；将微球转移至50ml无菌离心管中，依次采用以下无菌溶液洗涤0.55％CaCl₂，0.28％CaCl₂，0.85％生理盐水，0.1％CHES(2-N环基氨基-乙基磺酸)，1.1％CaCl₂；接下来，微球与0.05％多聚赖氨酸(MW 15000，Fluka，USA)交联6min，然后依次采用0.1％CHES，1.1％CaCl₂，0.85％生理盐水洗涤，再用0.03％藻酸钠包被4min形成外层结构；将洗涤后的微球用0.55mmol/L柠檬酸钠溶解内核6min；用无血清培养基洗涤两次，置入正常培养基中培养；最后用载体膜制备材料将之包裹后用机械封口。

披膜三维载体制备方法二：将浓度为1×10⁵～5×10⁶/ml细胞直接与基质材料混合均匀，注入载体膜制备材料中并封口，封口方法可以采用热封口或者机械封口。

披膜三维载体制备方法三：收集浓度为1×10⁵～5×10⁶/ml细胞；将壳聚糖溶于10ml/L的乙酸溶液中，制备成浓度为2g/L的壳聚糖乙酸溶液，过滤除去杂质，加入浓度为20mol/L的NaOH溶液使壳聚糖析出，过滤后用三蒸水洗涤至中性，然后经低温干燥得到纯化壳聚糖。羧甲基壳聚糖溶于生理盐水中，并用一次性针式过滤器(0.22um)过滤除菌；利用高压静电场成囊装置，将浓度为17.5g/L的海藻酸钠溶液在电压3.0×10⁴V、推进速度50mm/h和液面距50mm条件下，喷雾至0.12mol/LCaCl₂溶液中，形成海藻酸钙凝胶微粒；将凝胶微粒与2g/L壳聚糖溶液反应10min，使微粒外包裹一层壳聚糖；然后加入1.5g/L海藻酸钠溶液，中和微粒表面过剩电荷；最后用55mmol/L柠檬酸钠液化囊芯得到海藻酸钠-壳聚糖微球。将该微球装入半透膜袋中并封口。

披膜三维载体制备方法四：取生长状态良好的成骨细胞进行消化离心，加入明胶溶液(2.0％(w/v)，溶于DMEM培养基)中使细胞重悬，调整细胞密度为2×10⁶cells/mL。在培养箱中孵育30min，使成骨细胞与明胶充分接触。按海藻酸钠∶明胶＝3∶1的比例加入海藻酸钠溶液(2.0％(w/v))，混合均匀后，加入到注射器中，此时细胞密度为5×10cells/mL。启动微囊制备装置，在电压6kV，流速40mL/h条件下，滴加1mL细胞混合液到30mLCaCl₂(1.1％(w/v))溶液中进行凝胶化反应，形成载细胞明胶海藻酸钠微胶珠。然后将胶珠加到壳聚糖溶液(0.5％(w/v))中覆膜反应10min，形成载细胞微囊。用PBS洗涤三次，再用无血清培养基洗涤一次。将该微球装入半透膜袋中，口沿处用医用缝合线缝合。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种可植入的披膜三维载体，其特征在于：所述三维载体包括载体骨架和披覆于载体骨架内表面的半透膜；所述载体骨架内充斥有可流动的生物基质和活性物质；所述活性物质是细胞，或者是活性蛋白因子，或者是细胞和活性蛋白因子的组合；所述细胞包括各种组织的干细胞、祖细胞及其成体细胞；所述活性蛋白因子包括白细胞介素、干扰素、集落刺激因子、生长因子和趋化性细胞因子。

2.根据权利要求1所述的一种可植入的披膜三维载体，其特征在于：所述载体骨架为球状、柱状或者不规则形状。

3.根据权利要求1所述的一种可植入的披膜三维载体，其特征在于：所述半透膜厚度为0.1--3mm。

4.根据权利要求1所述的一种可植入的披膜三维载体，其特征在于：所述半透膜的制备材料是聚醚砜(PES)、聚砜(PSF)、醋酸纤维素(CA)、聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚丙烯(PP)、混合纤维素酯(CNA)和聚氨酯中的任一种。

5.根据权利要求1所述的一种可植入的披膜三维载体，其特征在于：所述生物基质的制备材料包括胶原、藻酸钠、甲壳素、透明质酸、明胶、纤维蛋白。

6.一种可植入的披膜三维载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将浓度为1×10⁵～5×10⁶/ml的MSC（mesenchymal stem cell）与10ml 2%生物基质制备材料混合，用喷嘴机将混合物与CaCl₂交联成微球；

（2）将微球转移至无菌离心管中，并采用多种无菌溶液依次洗涤；

（3）将多聚赖氨酸与洗涤过的微球交联5-7min，并采用无菌溶液依次洗涤；

（4）将洗涤过的微球用0.03%步骤1）所述的生物基质制备材料包被3-5min形成外层结构，再用柠檬酸钠溶解内核5-7min，制备得载体骨架；

（5）用无血清培养基洗涤，置入正常培养基中培养；

（6）用半透膜制备材料将之包裹后封口，制得披膜载体。

7.根据权利要求6所述的一种可植入的披膜三维载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中的无菌溶液依次为：0.55%CaCl₂，0.28%CaCl₂， 0.85%生理盐水，0.1%2-N环基氨基-乙基磺酸（CHES），1.1%CaCl₂。

8.根据权利要求7所述的一种可植入的披膜三维载体的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中的无菌溶液依次为：0.1%CHES，1.1%CaCl₂，0.85%生理盐水。