CN112999428B - 用于耳廓重建载细胞聚合物多孔微球三维生物打印墨水及其制造方法与应用 - Google Patents

用于耳廓重建载细胞聚合物多孔微球三维生物打印墨水及其制造方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于耳廓重建载细胞聚合物多孔微球三维生物打印墨水及其制造方法与应用。本发明的用于耳廓重建载细胞聚合物多孔微球三维生物打印墨水是基于PLGA或聚乳酸多孔微球，二者皆具有良好的生物降解性和生物相容性，可作为三维生物打印中重要的生物墨水组分，用以制造高强度、高质量的类器官。本发明构建的用于生物墨水的载细胞多孔微球内有耳廓软骨细胞且细胞形态良好，所得用于耳廓重建载细胞聚合物多孔微球三维生物打印墨水可为在颅颌面部软骨修复重建中构建仿生化功能性组织器官提供有效的解决方案。

Description

用于耳廓重建载细胞聚合物多孔微球三维生物打印墨水及其 制造方法与应用
技术领域
本发明属于三维打印器官修复重建领域，特别涉及一种用于耳廓重建载细胞聚合物多孔微球三维生物打印墨水及其制造方法与应用。
背景技术
近年，增材制造(Additive manufacturing)技术发展迅速，在医疗、工业、教育等领域应用愈发广泛，特别是三维生物打印(Three-dimension bio-printing)在组织工程的研究中占有重要地位，为组织器官再生、体外组织模型建立提供了具有现实意义和广阔前景的有效解决方案。通过三维生物打印技术，可实现生物材料和细胞的同步挤出打印，有助于制造出更优化的组织器官，相对于传统的通过材料支架—细胞接种模式构建出的工程化组织，其具有更加精细、可控、仿生化的微结构，且细胞能更均匀地分布在三维材料结构之中，有利于细胞增殖、基质分泌、信号传导及组织分化，最终有望通过三维生物打印技术构建出满足临床需求的组织器官代替品【Mandrycky C,Wang Z,et al.3D bioprinting forengineering complex tissues[J].Biotechnology advances,2016,34:422-434；MataiI,Kaur G,et al.Progress in 3D bioprinting technology for tissue/organregenerative engineering[J].Biomaterials,2020,226:119536.】。在耳廓软骨等颅颌面部软骨组织的修复重建中，制备具有精细结构及相应功能的可植入工程化组织至关重要【Zopf DA,Mitsak AG,et al.Computer aided-designed,3-dimensionally printedporous tissue bioscaffolds for craniofacial soft tissue reconstruction[J].Otolaryngology--head and neck surgery,2015,152:57-62.】。三维生物打印在颅颌面部软骨修复重建中的应用潜力大，有助于构建仿生化的功能性组织器官【Crafts TD,Ellsperman SE,et al.Three-Dimensional Printing and Its Applications inOtorhinolaryngology-Head and Neck Surgery[J].Otolaryngology--head and necksurgery,2017,156:999-1010.】。
生物墨水是三维生物打印中最重要的元素之一，其需具有良好的生物相容性，适宜的剪切稀化和自我修复属性，以实现负载细胞打印成型的目的。水凝胶类生物墨水已广泛用于3D打印，但实现高质量地三维生物打印，满足构建组织器官的各方面需求，仍面临挑战【Huijun Li,Yu Jun Tan,et al.3D Bioprinting of Highly Thixotropic Alginate/Methylcellulose Hydrogel With Strong Interface Bonding[J].ACS AppliedMaterials&Interfaces,2017,9:20086-20097；Murphy SV,De Coppi P,AtalaA.Opportunities and challenges of translational 3D bioprinting.Naturebiomedical engineering2020,4:370-380.】。负载于水凝胶中的细胞，其活力受多种因素的影响，尤其是在打印时，自喷头挤出的过程中，细小喷头的剪切力对细胞活力有较大的影响【Ozbolat IT,Hospodiuk M.Current Advances and Future Perspectives inExtrusion-Based Bioprinting[J].Biomaterials,2016,76:321-343.】，这限制了挤出力的大小、针头和生物墨水的选择。各种光敏化水凝胶(如明胶甲基丙烯酸甲酯，GelMA)由于可在光照下快速成型、固化的特点，在生物打印中具有重要应用价值，但分散在水凝胶中的细胞易受到光照损伤，细胞活力存在一定程度的降低【Derakhshanfar S,Mbeleck R,etal.3D Bioprinting for Biomedical Devices and Tissue Engineering:A Review ofRecent Trends and Advances[J].Bioactive materials,2018,3:144-156.】。因此，在打印过程中，如何降低剪切力及光固化对细胞的损伤，且保证生物墨水能实现流畅地、高质量地打印，受到了学术界和工业界的广泛关注。
在组织修复重建中，一方面微球可作为药物或生长因子载体，释放药物或生长因子，以诱导干细胞增殖分化。Yi-Ting Wen等将含有载Y27632药物的聚氨酯微球，以生物墨水的形式，打印出了无细胞组织工程支架，利用药物Y27632的连续释放，来诱导干细胞向软骨分化【Yi-Ting Wen,Niann-Tzyy Dai,et al.Biodegradable Water-BasedPolyurethane Scaffolds With a Sequential Release Function for Cell-FreeCartilage Tissue Engineering[J].Acta Biomaterialia,2019,88:301-313.】。另一方面微球可作为细胞载体，以可注射或三维生物打印的形式来实现组织修复及重建。刘垚杉等研究发现载牙龈干细胞的可注射丝素改性PLGA多孔微球，在牙周组织修复上具有重要应用前景【刘垚杉,吴海林,贾智,杜博,刘大勇,周志敏.丝素改性聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔微球作为牙龈间充质干细胞递送载体的研究[J].高等学校化学学报,2019,40:2419-2426.】。Chieh-Cheng Huan等发现载人羊水干细胞PLGA多孔微球有望实现心肌修复【Chieh-Cheng Huang,Hao-Ji Wei,et al.Injectable PLGA Porous Beads Cellularizedby hAFSCs for Cellular Cardiomyoplasty[J].Biomaterials,2012,33:4069-4077.】。YuJun Tan等制备了载小鼠成纤维细胞的PLGA多孔微球水凝胶生物墨水，为生物墨水设计提供了新思路【Yu Jun Tan,Xipeng Tan,et al.Hybrid microscaffold-based 3Dbioprinting of multi-cellular constructs with high compressive strength:A newbiofabrication strategy[J].Scientific Reports,2016,6:39140.】。此外，在人工器官领域，微球也具有广阔的应用前景，如负载分泌胰岛素细胞的多孔微球，可实现人工胰岛或胰腺的构建，具有重要的应用前景【专利申请201910924259.8,一种人工胰岛或人工胰腺及其制备方法】。
目前应用于耳廓软骨修复重建的载细胞PLGA或聚乳酸多孔微球水凝胶生物墨水的研究未见有文献报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种种用于耳廓重建载细胞聚合物多孔微球三维生物打印墨水及其制造方法与应用。
本发明要求保护一种用于耳廓重建载细胞聚合物多孔微球的三维生物打印墨水，包括a、b和c；
所述a为具有多孔结构的可降解聚合物微球；
所述b为生长于所述a多孔结构中的细胞；
所述c为水凝胶；
所述c与所述a和b体积之和的比值为1-10：1。
上述三维生物打印墨水中，所述a为PLGA或聚乳酸多孔微球；
所述a的平均粒径小于100μm；具体为79.22±16.63μm；
所述多孔的孔径为14.77-27.37μm；具体为21.07±6.30μm。
所述细胞为耳廓软骨细胞。
所述c中，细胞为不大于50μm的贴壁细胞；
所述水凝胶具有光敏性和/或温敏性；具体为GelMA水凝胶。
本发明提供的制备所述三维生物打印墨水的方法，包括：
1)制备所述a；
2)将所述b中细胞种植于所述a中；
3)将负载耳廓软骨细胞的PLGA或聚乳酸多孔微球与水凝胶复合，得到所述三维生物打印墨水。
上述方法中，所述1)包括：
S1)将PLGA于有机溶剂中混匀，得到油相，再向其中加入致孔剂，得到初乳；
所述PLGA与所述有机溶剂的用量比为1g-2.5g：100ml；
S2)将所述初乳转移至0.1％的PVA水溶液中，形成复乳，搅拌3h，去离子水洗涤3次，0.1M的NaOH洗涤后去离子水洗涤3次，冷冻干燥，得到PLGA多孔微球；
所述初乳与所述0.1％的PVA水溶液的体积比为1：10-20。
所述S1)中，致孔剂为NH4HCO3水溶液；所述NH4HCO3水溶液中，NH4HCO3与水的用量比为1-3g：100ml。
本发明还要求保护一种所述三维生物打印墨水在打印人耳廓组织中的应用；具体的，所述打印步骤中，打印速度为4-5mm/s；
挤出压力为2-3psi；
打印平台温度为15-18℃；
每层打印后405nm蓝光照射5s固化。
聚乳酸，聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)是一类可降解人工合成高分子材料，具有良好的生物相容性和可塑性，已被广泛用于生物医学领域【Farah S,Anderson DG,LangerR.Physical and mechanical properties of PLA,and their functions in widespreadapplications-A comprehensive review[J].Advanced drug delivery reviews,2016,107:367-392；Martins C,Sousa F,et al.Functionalizing PLGA and PLGA Derivativesfor Drug Delivery and Tissue Regeneration Applications[J].Advanced healthcarematerials,2018,7:1701035.】。利用复乳法制备合理尺寸和孔径PLGA或聚乳酸多孔微球，既满足耳软骨细胞进入微球内部，并辅以细胞灌注方式，提高细胞负载量，从而更大程度上保护细胞免受打印过程中剪切力以及打印后光固化的损伤，让更多的细胞能穿上“盔甲”得到保护。相比传统的细胞接种方法(细胞与微载体共混)，细胞灌注能使细胞负载量得到提升【专利申请201910145473.3，一种用于细胞三维培养的接种装置及其使用方法】。此外，相互连接的微球内部结构，有利于氧气及营养物质的运输和代谢物的排出，有利于细胞增殖。该PLGA或聚乳酸多孔微球的粒径可满足不同打印尺寸(微球直径应占打印喷头直径的1/4-1/2以下)的需求，载细胞多孔微球水凝胶生物墨水可实现流畅、完整地挤出打印。此外，通过改变PLGA中的PLA的比例或其分子量大小，可调节聚合物的力学性质，从而调节生物墨水整体的力学性能，以满足耳廓软骨修复重建的力学要求。因此，基于该乳酸基聚合物多孔微球的三维生物打印生物墨水用于耳廓软骨及其他颅颌面部软骨修复重建具有重要的实用价值和良好发展前景。
本发明的有益效果体现在：
(1)本发明涉及一种用于挤出式三维生物打印的负载细胞的PLGA或聚乳酸多孔微球构建、制备和应用。PLGA，聚乳酸已经FDA认证，具有良好的生物降解性和生物相容性。所得的可负载细胞的PLGA或聚乳酸多孔微球可做为三维生物打印中重要的生物墨水组分，用以制造高强度、高质量的类器官。
(2)该多孔微球孔径可调，细胞可进入多孔微球之中，并在内增殖。此外，在三维立体结构的多孔微球中，细胞得以更好地生长和增殖。
(3)该多孔微球粒径可调，将该负载细胞的多孔微球与水凝胶混合形成生物墨水，适用于不同大小的挤出式三维打印机喷头，用以满足不同打印需求。
(4)通过可塑的PLGA或聚乳酸多孔微球和水凝胶复合构建的结构体，力学强度显著增强，有益于强度和刚度较大的类器官构建。
(5)该负载细胞的多孔微球在挤出式三维生物打印过程中及打印后光照固化时，合适的孔径以及细胞灌注法的协同应用，让更多细胞穿上“盔甲”，得到一定的保护作用。
(6)本方法简单，反应条件温和，操作简便易行，易于工业化，经过体外试验验证相容性良好，所得用于耳廓重建载细胞聚合物多孔微球三维生物打印墨水可为在颅颌面部软骨修复重建中构建仿生化功能性组织器官提供有效的解决方案。
附图说明
图1为PLGA多孔微球的SEM图；
图2为微球与细胞共培养第3天Live/Dead染色图；
图3为微球与细胞共培养第3天DAPI染色共聚焦层扫图；
图4为大体观和光镜下的负载细胞的PLGA多孔微球复合GelMA水凝胶打印结构体图(5％PLGA微球)；
图5为光镜下负载细胞的PLGA多孔微球复合GelMA水凝胶打印结构体图(A：2.5％PLGA微球，B：7.5％PLGA微球)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1：制备PLGA多孔微球：
S1、将120mg PLGA充分溶解在8mL的二氯甲烷中制备成油相，在搅拌条件下恒速滴加1％(也即NH4HCO3与水的用量比为1g：100ml)的NH4HCO3溶液形成初乳。
S2、将初乳转移至0.1％的PVA水溶液中，形成复乳，搅拌3h；收集PLGA多孔微球。
S3、去离子水洗涤3次，0.1M的NaOH洗涤后去离子水洗涤3次，分装。
S4、冷冻干燥后得到多孔微球固体粉末，定量。
所得PLGA多孔微球的SEM图如图1所示，得到的PLGA多孔微球的粒径为79.22±16.63μm，孔径为21.07±6.30μm。
实施例2：将耳软骨细胞种植于PLGA多孔微球中：
实施例1所得PLGA微球消毒灭菌，在无菌操作条件下，加入培养基，制PLGA悬液，备用；提取兔耳软骨原代细胞并传代为一代，胰酶消化一代兔耳软骨细胞后计数，取约1×10^7个细胞置于无菌15mL离心管，制成细胞悬液，备用。吸取1mL PLGA多孔球悬液置于细胞灌注装置中，等装置中的液体快要流尽后，加入细胞悬液，使细胞悬液反复过装有PLGA多孔球的细胞灌注装置4-5次，将装置中PLGA多孔球与耳软骨细胞置于培养基中培养3天。所用细胞灌注装置可为申请号为201910145473.3、发明名称为“一种用于细胞三维培养的接种装置及其使用方法”的专利申请实施例1所述接种装置。
取PLGA微球和耳软骨细胞的共培养体系固定、DAPI染色，live/dead染色，共聚焦荧光显微镜分析观察PLGA多孔球内细胞的形态和存活情况，如图2和图3所示。通过共聚焦荧光显微镜观察发现，多孔球内有耳软骨且细胞形态良好。
实施例3：将负载细胞的多孔球复合于GelMA水凝胶中：
配制GelMA水凝胶：将按照现有方法，将14w/v％GelMA和1w/v％Lap水凝胶置于37°水浴中，30min后取出，使其通过针头式滤器过滤除菌。
实施例2所得负载细胞的PLGA多孔球称湿重后，以不同质量体积比(2.5％、5％、7.5％)，加入培养基中形成悬液，将多孔球悬液与水凝胶1：1(体积比)混合均匀，得到7w/v％导入打印墨盒中预热(20-24℃)备用。
实施例4：将生物墨水用于三维生物打印：
应用三维建模软件，构建正方体网格结构(孔隙率60％)，将其导入挤出式三维生物打印机切割软件中，进行分层切割(8层)，应用实施例3中制备的生物墨水，进行三维生物打印。其中，根据打印具体情况逐渐调节打印参数，打印速度：4-5mm/s；挤出压力：2-3psi；打印平台温度：15-18℃；每层打印后405nm蓝光照射5s固化。打印后将结构体植入培养基中，在显微镜下观察(图4、图5)。

Claims (7)

1.一种用于耳廓重建载细胞聚合物多孔微球的三维生物打印墨水，包括a、b和c；
所述a为PLGA或聚乳酸多孔微球；所述a的平均粒径小于100 μm；所述多孔的孔径为14.77-27.37 μm；
所述b为生长于所述a多孔结构中的细胞；所述细胞为耳廓软骨细胞；
所述c为水凝胶；所述水凝胶为GelMA水凝胶；
所述c与所述a和b体积之和的比值为1-10：1；
制备所述三维生物打印墨水的方法，包括：
1）采用复乳法制备所述a；
2）采用细胞灌注方式将所述b中细胞种植于所述a中；
3）将负载耳廓软骨细胞的PLGA或聚乳酸多孔微球与水凝胶复合，得到所述三维生物打印墨水。
2.根据权利要求1所述的三维生物打印墨水，其特征在于：所述a的平均粒径为79.22±16.63μm。
3.一种制备权利要求1或2所述三维生物打印墨水的方法，包括：
1）采用复乳法制备所述a；
2）采用细胞灌注方式将所述b中细胞种植于所述a中；
3）将负载耳廓软骨细胞的PLGA或聚乳酸多孔微球与水凝胶复合，得到所述三维生物打印墨水。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述1）包括：
S1）将PLGA于有机溶剂中混匀，得到油相，再向其中加入致孔剂水溶液，得到初乳；
所述PLGA与所述有机溶剂的用量比为1g-2.5g：100ml；
S2）将所述初乳转移至0.1%的PVA水溶液中，形成复乳，搅拌3h，去离子水洗涤3次，0.1M的NaOH洗涤后去离子水洗涤3次，冷冻干燥，得到PLGA多孔微球；
所述初乳与所述0.1%的PVA水溶液的体积比为1：10-20。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述S1）中，致孔剂水溶液为NH4HCO3水溶液；所述NH4HCO3水溶液中，NH4HCO3与水的用量比为1-3g：100ml。
6.权利要求1或2所述三维生物打印墨水在打印人耳廓组织中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述打印的步骤中，打印速度为4-5 mm/s；
挤出压力为2-3 psi；
打印平台温度为15-18 ℃；
每层打印后405 nm蓝光照射5s固化。
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