CN116059251A - 一种采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，所述天然品质牛黄的制备方法为：向胆汁中加入维生素C和天然迷迭香，再加入第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶反应得到天然品质的牛黄。所述第一生物酶为大肠杆菌制备得到，第二生物酶由皱褶假丝酵母菌制备得到，第三生物酶由梭形芽孢杆菌制备得到，维生素C和天然迷迭香的加入有效的防止了胆红素的氧化，通过第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶的协同作用明显提高牛黄的收率，并且保证了牛黄中的胆红素和胆酸的含量。
Description
技术领域
本发明涉及中药制备技术领域，具体一种采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法。
背景技术
牛黄即牛的胆红素结石，用于治疗某些肝、心血管、脑部疾病和癌症等，我国中医药每年需要大量牛黄作为中成药，天然牛黄为牛肝结石或胆结石，但牛患肝、胆结石症的机会很少，仅占千分之几，因此天然牛黄来源甚微，远远不满足临床和科研需求，因此，自牛黄运用于中药以来，一直处于奇缺状态。
为了缓解供需矛盾，促进医药卫生事业的发展，我国药典将人工牛黄、培植牛黄列入收载。近年来国内对牛黄研究有飞速发展，主要有牛体内牛黄培育法、牛体外牛黄培育法、化学合成配比法，其中，牛体内牛黄培育法是以采用外科手术的方法，在牛的胆囊中植入致黄因子，在胆囊内形成牛黄样物，经手术或屠宰时取出牛黄床刮取即可，采用体内培植牛黄的方法生产出得牛黄虽然非常接近于天然牛黄，但无法批量生产，产量有限，难以缓解天然牛黄市场紧缺的状况；化学合成配比法虽然工艺过程简单、易操作、可实现工业化生产，但其有效成分相较于天然牛黄低。
因此，迫切地需要一种采用生物酶培植牛黄的方法，保证生产牛黄产量高能满足目前牛黄的市场需求，同时保证生产出的牛黄有效成分媲美于天然牛黄。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供一种采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，包括以下步骤：
（1）向牛胆汁中加入维生素C和天然迷迭香，加热，得第一混合液；
（2）向第一混合液中加入第一生物酶，反应后依次加入第二生物酶和第三生物酶进行反应，调节pH后再加入胰蛋白酶进行反应，得第二混合液；
（3）调节第二混合液的pH后，静置，弃上清液后，经离心、过滤、洗涤、干燥，即得天然品质牛黄。
优选的，步骤（1）中，牛胆汁、维生素C和天然迷迭香的质量比为1000：（3~8）：（1.5~2）。
优选的，步骤（1）中，加热温度为50~70℃，加热时间为20~40min。
优选的，步骤（2）中，第一生物酶的制备方法为：将大肠杆菌接种于灭菌后的培养基上，于37~40℃下离心培养36h，得到培养液，将培养液离心后，取上清液，加入硫酸铵进行盐析，得到第一生物酶。
进一步优选的，培养基包括：7g/1000mL牛肉膏、14g/1000mL牛肉胨、7g/1000mLNaCl。
优选的，步骤（2）中，第二生物酶的制备方法为：将皱褶假丝酵母接种于灭菌后的培养基上，于35~37℃下离心培养36h，得到培养液，将培养液离心后取上清液，加入硫酸铵进行盐析，得到第二生物酶。
进一步优选的，培养基包括：5g/1000mL马铃薯蔗糖、5g/1000mL橄榄油、5g/1000mL葡萄糖酸钙、1g/1000mLMgSO4·7H2O、1g/1000mL K2HPO4、10g/1000mL(NH4)2SO4、5g/1000mL蛋白胨。
优选的，步骤（2）中，第三生物酶的制备方法为：将梭形芽孢杆菌接种于灭菌后的培养基上，于36~38℃下离心培养36h，得到培养液，将培养液离心后取上清液，加入硫酸铵进行盐析得到第三生物酶。
进一步优选的，培养基包括：10g/1000mL葡萄糖、0.1g/1000mL酵母提取物、0.5g/1000mLKH2PO4、0.2g/1000mLMgSO4·7H2O、0.1g/1000mL蛋白胨、0.5g/1000mLK2HPO4、0.2g/1000mLNaCl、0.01g/1000mLFeSO4。
优选的，步骤（2）中，第一混合液与第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶的质量比为1000：（0.6~1.0）：（0.3~0.5）：（0.2~0.4）：（0.1~0.3）。
优选的，第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶的反应时间均为10~14h。
优选的，步骤（2）中，调节pH为7.8~8.5。
优选的，步骤（3）中，调节pH为2.0~4.0。
优选的，步骤（3）中，静置温度为0~8℃，静置时间为24~36h。
优选的，步骤（3）中，干燥温度为80~100℃，干燥时间为4~6h。
优选的，所述大肠杆菌的保藏编号为CCTCC AB 2012883，皱褶假丝酵母菌的保藏编号为CCTCC WY 2008204，梭形芽孢杆菌的菌株编号为SHBCC D18006。
本发明的有益效果：
本发明通过将第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶加入到胆汁中进行酶促反应制备牛黄，其中，第一生物酶由大肠杆菌制得，第二生物酶由皱褶假丝酵母菌制得，第三生物酶由梭形芽孢杆菌制得，采用第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶四种生物酶协同促进牛黄的形成，使得制备的牛黄收率更高，且有效成分更接近于天然牛黄中的有效成分。
同时，本发明采用牛胆汁，并在胆汁中加入维生素C和天然迷迭香，其中，维生素C和天然迷迭香都是高效的抗氧化剂，将二者复配后加入胆汁中，可有效的防止胆红素氧化而形成胆绿素，且具有消除胃气胀，增强记忆力，促进血液循环等功效，使所得牛黄中胆红素的含量更高，更接近于天然牛黄的品质。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术所述，天然牛黄产量降低，我国中医药每年需要大量牛黄作为中成药，现有体外培植牛黄中的胆红素和胆酸含量相较于天然牛黄有一定差距，基于此，本申请提供了一种采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
其中，大肠杆菌（Escherichia coli）购于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC AB 2012883，大肠杆菌在中国典型培养物保藏中心的收藏时间为2012-09-05；皱褶假丝酵母（Candida rugosa）购于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC WY 2008204，皱褶假丝酵母在中国典型培养物保藏中心的收藏时间为2006-06-07；梭形芽孢杆菌（Bcillus fusiformis）购于上海保藏生物技术中心（SHBCC），菌株编号为SHBCC D18006；胰蛋白酶购于江苏采薇生物科技有限公司。
实施例1：
（1）向牛胆汁中加入维生素C和天然迷迭香，三者质量比为1000:6:1.8，加热至60℃，加热30min，得第一混合液；
（2）第一混合液冷却至36℃，保温，向第一混合液中加入第一生物酶，反应12h，再加入第二生物酶，反应12h，加入第三生物酶，反应12h，调节pH为8.2后，加入胰蛋白酶，反应12h，得到第二混合液；
其中，第一混合液、第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶的质量比为1000：0.8：0.4：0.3：0.2；
第一生物酶的制备为：将大肠杆菌接种到灭菌后的培养基上，培养基包括：7g/1000mL牛肉膏、14g/1000mL牛肉胨、7g/1000mL NaCl，于37℃下培养36h得大肠杆菌培养液，将大肠杆菌培养液在4500r/min离心20min，弃上清液，加入硫酸铵进行盐析，得第一生物酶；
第二生物酶的制备为：将皱褶假丝酵母接种到灭菌后的培养基上，培养基包括：5g/1000mL马铃薯蔗糖、5g/1000mL橄榄油、5g/1000mL葡萄糖酸钙、1g/1000mLMgSO4·7H2O、1g/1000mL K2HPO4、10g/1000mL(NH4)2SO4、5g/1000mL蛋白胨，于35℃下200r/min离心培养36h，得培养液，将培养液在4000r/min离心20min，取上清液，加入硫酸铵进行盐析，得第二生物酶；
第三生物酶的制备过程为：将梭形芽孢杆菌接种到灭菌后的培养基上，培养基包括：10g/1000mL葡萄糖、0.1g/1000mL酵母提取物、0.5g/1000mLKH2PO4、0.2g/1000mLMgSO4·7H2O、0.1g/1000mL蛋白胨、0.5g/1000mLK2HPO4、0.2g/1000mLNaCl、0.01g/1000mLFeSO4，于36℃下培养36h得梭形芽孢杆菌培养液，将梭形芽孢杆菌培养液在4500r/min离心20min，弃上清液，加入硫酸铵进行盐析，得第三生物酶；
（3）向第二混合液中加入质量分数为25%的硫酸调节pH为3.0，在4℃下静置30h，弃上层清液后，5000r/min离心，抽滤得沉淀物，将沉淀物用纯净水洗涤至中性，在90℃下干燥5h，即得天然品质的牛黄，
所得牛黄产率为10.2‰，其中，产率=生成牛黄质量/新鲜牛胆汁的质量×1000%。
实施例2：
（1）向牛的新鲜胆汁加入维生素C和天然迷迭香，三者质量比为1000:3:1.5，加热至50℃，加热40min，得第一混合液；
（2）第一混合液冷却至35℃，保温，向第一混合液中加入第一生物酶，反应10h，加入第二生物酶，反应10h，加入第三生物酶，反应10h，调节pH为7.8后，加入胰蛋白酶，反应10h，得到第二混合液；
其中，第一混合液、第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶的质量比为1000：0.6：0.3：0.2：0.1；
第一生物酶、第二生物酶和第三生物酶的制备方法同实施例1中第一生物酶、第二生物酶和第三生物酶的制备方法；
（3）向第二混合液中加入25%的硫酸调节pH为2.0，在0℃下静置24h，弃上层清液后，5000r/min离心，抽滤得沉淀物，将沉淀物用纯净水洗涤至中性，于80℃下干燥4h，即得天然品质的牛黄，所得牛黄产率为9.7‰。
实施例3：
（1）向牛的新鲜胆汁中加入维生素C和天然迷迭香，三者质量比为1000:8:2，加热至70℃，加热20min，得第一混合液；
（2）第一混合液冷却至37℃，保温，向第一混合液中加入第一生物酶，反应14h，再加入第二生物酶，反应14h，加入第三生物酶，反应14h，调节pH为8.5后，加入胰蛋白酶，反应14h，得到第二混合液；
其中，第一混合液、第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶的质量比为100：1.0：0.5：0.4：0.3；
第一生物酶、第二生物酶和第三生物酶的制备方法同实施例1中第一生物酶、第二生物酶和第三生物酶的制备方法；
（3）向第二混合液中加入25%的硫酸调节pH为2.0，在8℃下静置36h，弃上层清液后，5000r/min离心，抽滤得沉淀物，将沉淀物用纯净水洗涤至中性，于105℃下干燥6h，即得天然品质的牛黄，所得牛黄产率为8.4‰。
对比例1：
（1）向牛的新鲜胆汁中加入维生素C和天然迷迭香，三者质量比为1000:6:1.8，加热至60℃，加热30min，得第一混合液；
（2）第一混合液冷却至36℃，保温，向第一混合液中加入第一生物酶，反应12h，调节pH为8.2后，得到第二混合液；
其中，第一混合液、第一生物酶的质量比为1000:0.8，第一生物酶的制备过程与实施例1中第一生物酶的制备过程相同；
（3）向第二混合液中加入25%的硫酸调节pH为3，在4℃下静置30h，弃上层清液后，5000r/min离心，抽滤得沉淀物，将沉淀物用纯净水洗涤至中性，于90℃下干燥5h，即得牛黄。
对比例2：
（1）向牛的新鲜胆汁中加入维生素C和天然迷迭香，三者质量比为1000:6:1.8，加热至60℃，加热30min，得第一混合液；
（2）第一混合液冷却至36℃，保温，加入第二生物酶，反应12h，调节pH为8.2后，得到第二混合液；
其中，第一混合液、第二生物酶的质量比为1000:0.4，第二生物酶的制备过程与实施例1中第二生物酶的制备过程相同；
（3）向第二混合液中加入25%的硫酸调节pH为3.0，在4℃下静置30h，弃上层清液后，5000r/min离心，抽滤得沉淀物，将沉淀物用纯净水洗涤至中性，得湿性提取物，于90℃下干燥5h，即得牛黄。
对比例3：
（1）向牛的新鲜胆汁中加入维生素C和天然迷迭香，三者质量比为1000:6:1.8，加热至60℃，加热30min，得第一混合液；
（2）第一混合液冷却至36℃，保温，向第一混合液中加入第三生物酶，反应12h，调节pH为8.2后，加入胰蛋白酶，反应12h，得到第二混合液；
其中，第一混合液和第三生物酶的质量比为1000：0.3，第三生物酶的制备过程与实施例1中第三生物酶的制备过程相同；
（3）向第二混合液中加入25%的硫酸调节pH为3，在4℃下静置30h，弃上层清液后，5000r/min离心，抽滤得沉淀物，将沉淀物用纯净水洗涤至中性，得湿性提取物，于90℃下干燥5h，即得牛黄。
对比例4：
（1）向牛的新鲜胆汁中加入维生素C和天然迷迭香，三者质量比为1000:6:1.8，加热至60℃，加热30min，得第一混合液；
（2）第一混合液冷却至36℃，保温，调节pH为8.2后，加入胰蛋白酶，反应12h，得到第二混合液；
其中，第一混合液和胰蛋白酶的质量比为1000:0.2；
（3）向第二混合液中加入25%的硫酸调节pH为3，在4℃下静置30h，弃上层清液后，5000r/min离心，抽滤得沉淀物，将沉淀物用纯净水洗涤至中性，得湿性提取物，于90℃下干燥5h，即得牛黄。
试验例1：
参照中国药典2020版第一部进行体外培植牛黄胆红素含量测定，具体如下：
（1）精密称定胆红素对照品10mg，放置于100mL棕色量瓶中，加入三氯甲烷溶解后，稀释至刻度，并振摇片刻使均匀；然后精密量取5mL，放置于50mL棕色量瓶中，加入乙醇至刻度，摇匀后可得含胆红素10μg/mL－１的对照品溶液；
（2）精密称定实施例1和对比例1~4中的牛黄样品约10mg，放置于锥形瓶中，加入盐酸一滴，三氯甲烷-乙醇混合溶液60mL、振摇并均匀；放于水浴中加热回流30min后冷却，转移到100mL棕色量瓶中，加上述混合溶液至刻度并摇匀，精密量取上清液10mL，放置于50mL棕色量瓶中，加乙醇到刻度后摇匀，得试验组牛黄溶液；
（3）精密量取步骤（1）中对照组溶液1mL、2mL、3mL、4mL、5mL，分别放置于具塞试管中，再分别加乙醇至9mL，并精密加入重氮化溶液（溶液组成见中国药典一部牛黄项下）1mL后摇匀，在15~20℃暗处放置1h，以乙醇为空白，采用紫外-可见分光光度法，在533nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线；得回归方程y=98.8x~0.0182，R2=0.999；
（4）分别测定步骤（2）中试验组牛黄溶液的吸光度，带入标准曲线中，计算胆红素含量；结果如表1所示。
表1 胆红素含量（%）
由表1可见，实施例1制备的牛黄中胆红素的含量远高于对比例1~4制备的牛黄中胆红素的含量，且实施例1制备的牛黄中国胆红素含量远高于2020版中国药典第一部中的要求（胆红素含量不得少于35.0%），由此可见，本申请通过采用第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶的协同作用，共同对胆汁进行酶促反应，使得制备得到的牛黄中胆红素含量明显高于药典中的标准。
试验例2：
参照中国药典2020版第一部进行体外培植牛黄的胆酸含量的测定，具体如下：
（1）精密称取胆酸对照品，加入甲醇制成0.48mg/mL的对照品溶液；
（2）精密称定实施例1、对比例1~4制备所得牛黄细粉0.2g，放置于锥形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，称定重量后超声处理30min，冷却后称定重量，再用甲醇补足减失重量，摇匀并过滤；精密量取续滤液25mL，蒸干后残渣加20%氢氧化钠溶液10mL，加热回流2h，冷却后加稀盐酸19mL，调节pH值至酸性，用同一铺有少量无水硫酸钠的脱脂棉滤过的乙酸乙酯萃取4次，所用乙酸乙酯的量分别为25mL、25mL、20mL、20mL，滤液合并后回收溶剂至干，取残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加入甲醇至刻度，振摇备用，即试验组溶液；
（3）精密吸取步骤（1）中对照品溶液1μL，2μL，3μL，4μL，5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，用异辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸-甲酸（8:4:2:1）为展开剂展开至15cm，取出后晾干，喷30%硫酸乙醇溶液后在105℃加热至斑点清晰可见，然后采用薄层色谱扫描法进行扫描，扫描波长为：λS=380nm，λR=650nm，测量对照品吸光度，以胆酸的量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，其回归方程为y=1588.2+847.81x，R2=0.9986；
（4）分别精密吸取2μL的步骤（2）中试验组溶液，1μL和3μL的对照品溶液，分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，按照步骤（3）中的方法展开，根据对照品溶液与试验组溶液扫描面积积分值，计算样品含量；结果如表2所示：
表2 胆酸含量
由表2可知，实施例1制备得到的牛黄中胆酸的含量明显高于对比例1~4制备得到的牛黄中胆酸含量，2020版中国药典第一部规定体外培育牛黄中胆酸含量不得少于6.0%，实施例1中制备得到的牛黄中胆酸含量液明显高于药典中要求。通过实施例1与对比例1~4中牛黄胆酸含量对比可知，本发明采用的第一生物酶、第二生物酶和胰蛋白酶三者之间协同作用，实现了本发明制备的到的牛黄中胆酸含量高。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）向牛胆汁中加入维生素C和天然迷迭香，加热，得第一混合液；
（2）向第一混合液中加入第一生物酶，反应后依次加入第二生物酶和第三生物酶进行反应，调节pH后再加入胰蛋白酶进行反应，得第二混合液；
（3）调节第二混合液的pH，静置，弃上清液后，离心、过滤、洗涤、干燥，即得天然品质牛黄。
2.如权利要求1所述的采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，其特征在于，步骤（1）中，胆汁、维生素C和天然迷迭香的质量比为1000：（3~8）：（1.5~2）。
3.如权利要求1所述的采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，其特征在于，步骤（1）中，加热温度为50~70℃，加热时间为20~40min。
4.如权利要求1所述的采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，其特征在于，步骤（2）中，第一混合液与第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶的质量比为1000：（0.6~1.0）：（0.3~0.5）：（0.2~0.4）：（0.1~0.3）。
5.如权利要求1所述的采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，其特征在于，步骤（2）中，第一生物酶、第二生物酶、第三生物酶和胰蛋白酶的反应时间均为10~14h。
6.如权利要求1所述的采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，其特征在于，步骤（2）中，第一生物酶的制备方法为：将大肠杆菌接种于灭菌后的培养基上，在37℃下离心培养36h，得到培养液，将培养液离心后取上清液，加入硫酸铵进行盐析得到第一生物酶；
培养基包括：7g/1000mL牛肉膏、14g/1000mL牛肉胨、7g/1000mL NaCl。
7.如权利要求1所述的采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，其特征在于，步骤（2）中，第二生物酶的制备方法为：将皱褶假丝酵母接种于灭菌后的培养基上，于35℃下离心培养36h，得到培养液，将培养液离心后取上清液，加入硫酸铵进行盐析得到第二生物酶；
培养基包括：5g/1000mL马铃薯蔗糖、5g/1000mL橄榄油、5g/1000mL葡萄糖酸钙、1g/1000mL MgSO4·7H2O、1g /1000mL K2HPO4、10g/1000mL (NH4)2SO4、5g/1000mL蛋白胨。
8.如权利要求1所述的采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，其特征在于，步骤（2）中，第三生物酶的制备方法为：将梭形芽孢杆菌接种于灭菌后的培养基上，于36℃下离心培养36h，得到培养液，将培养液离心后取上清液，加入硫酸铵进行盐析得到第三生物酶；
培养基包括：10g/1000mL 葡萄糖、0.1g/1000mL 酵母提取物、0.5g/1000mL KH2PO4、0.2g/1000mL MgSO4·7H2O、0.1g/1000mL蛋白胨、0.5g/1000mL K2HPO4、0.2g/1000mL NaCl、0.01g/1000mLFeSO4。
9.如权利要求1所述的采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，其特征在于，步骤（2）中，调节pH为7.8~8.5。
10.如权利要求1所述的采用生物酶体外培植天然品质牛黄的方法，其特征在于，步骤（3）中，调节pH为2.0~4.0；
静置温度为0~8℃，静置时间为24~36h；
干燥温度为80~100℃，干燥时间为4~6h。
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