CN104774885A - 一种利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，主要包括牛胆汁的发酵、牛胆汁发酵液的灭菌、胆红素的形成、胆红素的提取与精制等四个步骤。本发明主要将高产β-葡萄糖醛酸苷酶且耐胆汁的产气荚膜梭状芽胞杆菌加入到动物胆汁中并进行发酵，通过加入巯醇类还原剂起到提高β-葡萄糖醛酸苷酶的活性和抗氧化剂的作用，在特殊条件的控制下使得整个工艺得到极大的优化，提高生产效率，降低成本，最终得到胆红素产品的收率在0.010-0.014%之间，其纯度达到92%以上。

Description

一种利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法

技术领域

本发明涉及一种提取胆红素的方法，尤其涉及一种利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法。

背景技术

胆红素具备多种药理作用，是制造人工牛黄的主要原料，在医药中应用极为广泛，市场的需求量极大。但目前胆红素的提取方法主要是从各种动物胆汁中（猪、牛、羊）提取的，而动物胆汁中胆红素的含量极低，提取的过程比较繁琐，提取率低（如吴炜平等利用直接快速提取法得到产品的收率为0.008%-0.013%，尚文学等利用树酯法得到的收率为0.006174%，胆钙盐法的收率更低，生产成本高，从而造成胆红素价格极其昂贵，因此亟待通过改进胆红素的提取工艺途径来提高胆红素提取效率，降低生产成本，缓和市场上胆红素供不应求的局面。

    当前胆红素的提取方法较多，传统的方法有胆钙盐法以及相关的改进法，如中国专利“200810232077.6”中，对原料中的胆绿素进行还原从而提高胆红素的收率，但该类方法的关键点控制条件太多，稳定性差，操作过程繁琐，成本高，纯度低。也有离子树脂法，虽可以得到较高纯度胆红素。但操作较为复杂，在实际生产中应用的较少。而快速提取法具备生产工艺简单，周期短，成本低等优点，故在工业化生产中最具有发展前景，其具体是先用氢氧化钠进行皂化，使得结合型的胆红素生成水溶性的胆红素钠盐，再在酸性条件下和氯仿溶液中，萃取出游离胆红素，再通过乙醇多次洗涤得到高纯度的胆红素。

发明内容

本发明的目的是针对已有技术的问题，提供一种从牛胆汁中提取胆红素的新途径，提高胆红素的收率和纯度。

  为实现上述的目的，本发明的特征包括以下步骤：

一种利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，步骤如下：

  （1）将产气荚膜梭状芽胞杆菌的菌株在液体培养基中进行扩大培养 22-24h,得到扩增菌液；向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液在温度为28-32℃条件下进行发酵45-48h，得到发酵液，发酵过程中维持发酵液的pH为5-6；所述扩增菌液的体积为新鲜牛胆汁体积的9-11%；

   （2）向上步所得的发酵液中加入溶菌酶，在温度为37-38度条件下进行酶解30-50min后，调节其pH值为6.8-7.5，得到裂解液；

所述溶菌酶在发酵液中的质量体积浓度为0.2-0.25g/L;

（3）向上步所得裂解液中加入浓度为10%的NaOH溶液，调节其pH 为11-12，得到皂化液；

（4）将上步所得皂化液加热煮沸1-3min，过滤，收集滤液，冷却至室温后向滤液中依次加入抗氧化剂溶液、乙酸乙酯，然后加入混合酸调节其pH为5-5.5，充分搅拌后静置分层，首次取乙酸乙酯层；用饱和NaCl的HCl溶液对前述乙酸乙酯层进行二次酸化萃取，静置分层后再次取乙酸乙酯层进行蒸馏回收，得到的粗品胆红素；

所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，抗氧化剂溶液的质量浓度为1%，抗氧化剂溶液与滤液的体积比为1:100；

所述乙酸乙酯的体积为滤液体积的50-60%，所述混合酸为HCl和HAc，其中HCl和HAc的体积比为1: （4-5)；再次酸化萃取时饱和NaCl的稀HCl溶液的体积为首次取得的乙酸乙酯层体积的30%；

（5）将上步所得粗品胆红素用温度为60-70℃的无水乙醇进行2次以上溶解洗涤，降温冷却结晶得胆红素精制品。

作为优选项：

所述步骤1中，在向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液前，向已经过滤的新鲜牛胆汁中依次加入质量浓度为0.5%的乙二胺四乙酸钠溶液和质量浓度为1%的抗氧化剂；

所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，所述乙二胺四乙酸钠溶液和抗氧化剂的体积与新鲜牛胆汁的体积比均为1:100。

所述步骤2中酶解的同时利用超声波对发酵液进行处理。

所述步骤2中，发酵液裂解的同时加入质量浓度为1-2%的巯醇类还原剂溶液；

所述的巯醇类还原剂溶液与裂解液的体积比为1:（50-60）。

所述巯醇类还原剂为β-巯基乙醇或二硫苏糖醇。

   本发明的原理：牛胆汁中有胆红素和结合胆红素，通过向牛胆汁中加入螯合剂和抗氧化剂尽最大限度的避免胆红素的氧化，并且产气荚膜梭状芽胞杆菌的菌株能产生大量的β-葡萄糖醛酸苷酶（在含有巯醇类还原剂的条件下具有更好的活性，同时该还原剂还能起到还原剂的作用），该酶能快速的将胆汁中的结合胆红素转化为胆红素，再通过优化后续皂化，萃取，精提等各步骤条件,提高胆红素的质量和提取率

  本发明主要将高产β-葡萄糖醛酸苷酶且耐胆汁的产气荚膜梭状芽胞杆菌加入到动物胆汁中并进行发酵，通过加入巯醇类还原剂起到提高β-葡萄糖醛酸苷酶的活性和抗氧化剂的作用，在特殊条件的控制下使得整个工艺得到极大的优化，提高生产效率，降低成本，最终得到胆红素产品的收率在0.010-0.014%之间，其纯度达到92%以上。

本技术与已有技术相比的优势在于：

    其一：本技术在新鲜胆汁加入乙二胺四乙酸钠和抗氧化剂，其中前者能够螯合胆汁中的存在的重金属元素，可以进一步降低胆红素转化胆绿素的可能性，同时，乙二胺四乙酸钠通过螯合重金属元素可以维持β-葡萄糖醛酸苷酶的处于较高的活性。

    其二：本技术直接利用高产β-葡萄糖醛酸苷酶且耐胆汁的产气荚膜梭状芽胞杆菌的菌株进行胆汁的发酵，该菌种的发酵过程稳定易控制。

其三：本技术在裂解液中加入了巯醇类还原剂，可以提高β-葡萄糖醛酸苷酶的活性，从而提高提取的效率。

本发明的有益技术效果为：按照本方法可以使得胆红素的提取率达到0.010-0.014%,其纯度也在92%以上。

具体实施方式

实施例1

（1）将产气荚膜梭状芽胞杆菌的菌株在液体培养基中进行扩大培养 22h,得到扩增菌液；向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液在温度为28℃条件下进行发酵45h，得到发酵液，发酵过程中维持发酵液的pH为5；所述扩增菌液的体积为新鲜牛胆汁体积的9%；

（2）向上步所得的发酵液中加入溶菌酶，在温度为37-38度条件下进行酶解30min后，调节其pH值为6.8，得到裂解液；

所述溶菌酶在发酵液中的质量体积浓度为0.2g/1L;

（3）向上步所得裂解液中加入浓度为10%的NaOH溶液，调节其pH 为11，得到皂化液；

（4）将上步所得皂化液加热煮沸1min，过滤，收集滤液，冷却至室温后向滤液中依次加入抗氧化剂溶液、乙酸乙酯，然后加入混合酸调节其pH为5，充分搅拌后静置分层，首次取乙酸乙酯层；用饱和NaCl的HCl溶液对前述乙酸乙酯层进行二次酸化萃取，静置分层后再次取乙酸乙酯层进行蒸馏回收，得到的粗品胆红素；

所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，抗氧化剂溶液的质量浓度为1%，抗氧化剂溶液与滤液的体积比为1:100；

所述乙酸乙酯的体积为滤液体积的50%，所述混合酸为HCl和HAc，其中HCl和HAc的体积比为HCl：HAc=1: 4；再次酸化萃取时饱和NaCl的稀HCl溶液的体积的体积为首次取得的乙酸乙酯层体积的30%；

（5）将上步所得粗品胆红素用温度为60-70℃ 的浓度为95%的无水乙醇进行2次以上溶解洗涤，降温冷却结晶得胆红素精制品；

所述步骤1中，在向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液前，向已经过滤的新鲜牛胆汁中依次加入质量浓度为0.5%的乙二胺四乙酸钠溶液和质量浓度为1%的抗氧化剂；

所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，所述乙二胺四乙酸钠溶液和抗氧化剂的体积与新鲜牛胆汁的体积比均为1:100。

所述步骤2中酶解的同时利用超声波对发酵液进行处理。

所述步骤2中，发酵液裂解的同时加入质量浓度为1-2%的巯醇类还原剂溶液；

所述的巯醇类还原剂溶液与裂解液的体积比为1: 50。

所述巯醇类还原剂为β-巯基乙醇或二硫苏糖醇。

最终得到胆红素的产率为0.0102%，纯度为93%。

实施例2

（1）将产气荚膜梭状芽胞杆菌的菌株在液体培养基中进行扩大培养 24h,得到扩增菌液；向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液在温度为32℃条件下进行发酵48h，得到发酵液，发酵过程中维持发酵液的pH为6；所述扩增菌液的体积为新鲜牛胆汁体积的11%；

（2）向上步所得的发酵液中加入溶菌酶，在温度为37-38度条件下进行酶解50min后，调节其pH值为7.5，得到裂解液；

所述溶菌酶在发酵液中的质量体积浓度为0.25g/1L;

（3）向上步所得裂解液中加入浓度为10%的NaOH溶液，调节其pH 为12，得到皂化液；

（4）将上步所得皂化液加热煮沸3min，过滤，收集滤液，冷却至室温后向滤液中依次加入抗氧化剂溶液、乙酸乙酯，然后加入混合酸调节其pH为5.5，充分搅拌后静置分层，首次取乙酸乙酯层；用饱和NaCl的HCl溶液对前述乙酸乙酯层进行二次酸化萃取，静置分层后再次取乙酸乙酯层进行蒸馏回收，得到的粗品胆红素；

所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，抗氧化剂溶液的质量浓度为1%，抗氧化剂溶液与滤液的体积比为1:100；

所述乙酸乙酯的体积为滤液体积的60%，所述混合酸为HCl和HAc，其中HCl和HAc的体积比为HCl：HAc=1: 5；再次酸化萃取时饱和NaCl的稀HCl溶液的体积为首次取得的乙酸乙酯层体积的30%；

（5）将上步所得粗品胆红素用温度为60-70℃ 的浓度为95%的无水乙醇进行2次以上溶解洗涤，降温冷却结晶得胆红素精制品；

所述步骤1中，在向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液前，向已经过滤的新鲜牛胆汁中依次加入质量浓度为0.5%的乙二胺四乙酸钠溶液和质量浓度为1%的抗氧化剂；

所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，所述乙二胺四乙酸钠溶液和抗氧化剂的体积与新鲜牛胆汁的体积比均为1:100。

所述步骤2中酶解的同时利用超声波对发酵液进行处理。

所述步骤2中，发酵液裂解的同时加入质量浓度为2%的巯醇类还原剂溶液；

所述的巯醇类还原剂溶液与裂解液的体积比为1: 60。

所述巯醇类还原剂为β-巯基乙醇或二硫苏糖醇。

最终得到胆红素的产率为0.014%，纯度为92%。

上述实施例中菌体的筛选和培养均为现有技术。

上述实施例中步骤1中发酵过程用于维持发酵液PH值的溶剂可以为盐酸和氢氧化钠。

Claims (5)

1.一种利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，其特征在于：步骤如下：

（1）将产气荚膜梭状芽胞杆菌的菌株在液体培养基中进行扩大培养 22-24h,得到扩增菌液；

向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液在温度为28-32℃条件下进行发酵45-48h，得到发酵液，发酵过程中维持发酵液的pH为5-6；所述扩增菌液的体积为新鲜牛胆汁体积的9-11%；

（2）向上步所得的发酵液中加入溶菌酶，在温度为37-38度条件下进行酶解30-50min后，调节其pH值为6.8-7.5，得到裂解液；

所述溶菌酶在发酵液中的质量体积浓度为0.2-0.25g/L;

（3）向上步所得裂解液中加入浓度为10%的NaOH溶液，调节其pH 为11-12，得到皂化液；

（4）将上步所得皂化液加热煮沸1-3min，过滤，收集滤液，冷却至室温后向滤液中依次加入抗氧化剂溶液、乙酸乙酯，然后加入混合酸调节其pH为5-5.5，充分搅拌后静置分层，首次取乙酸乙酯层；用饱和NaCl的HCl溶液对前述乙酸乙酯层进行二次酸化萃取，静置分层后再次取乙酸乙酯层进行蒸馏回收，得到的粗品胆红素；

所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，抗氧化剂溶液的质量浓度为1%，抗氧化剂溶液与滤液的体积比为1:100；

所述乙酸乙酯的体积为滤液体积的50-60%，所述混合酸为HCl和HAc，其中HCl和HAc的体积比为1:（4-5)；再次酸化萃取时饱和NaCl的稀HCl溶液的体积为首次取得的乙酸乙酯层体积的30%；

（5）将上步所得粗品胆红素用温度为60-70℃的无水乙醇进行2次以上溶解洗涤，降温冷却结晶得胆红素精制品。

2.如权利要求1所述的利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，其特征在于：所述步骤1中，在向过滤后的新鲜牛胆汁中加入扩增菌液前，向已经过滤的新鲜牛胆汁中依次加入质量浓度为0.5%的乙二胺四乙酸钠溶液和质量浓度为1%的抗氧化剂；

所述抗氧化剂为抗坏血酸或亚硫酸氢钠，所述乙二胺四乙酸钠溶液和抗氧化剂的体积与新鲜牛胆汁的体积比均为1:100。

3.如权利要求1所述的利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，其特征在于：所述步骤2中酶解的同时利用超声波对发酵液进行处理。

4.如权利要求1所述的利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，其特征在于：所述步骤2中，发酵液裂解的同时加入质量浓度为1-2%的巯醇类还原剂溶液；

所述的巯醇类还原剂溶液与裂解液的体积比为1:（50-60）。

5.如权利要求4所述的利用发酵法从牛胆汁中提取胆红素的方法，其特征在于：所述巯醇类还原剂为β-巯基乙醇或二硫苏糖醇。