CN112076139B - 一种黑麦发酵产物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种黑麦发酵产物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黑麦发酵产物的制备方法，包括以下步骤：黑麦浸水催芽，经烘干、粉碎，过筛得黑麦粉；将所述黑麦粉加入酶进行酶解，得黑麦粉酶解液；向所述黑麦粉酶解液添加氮源以及无机盐，获得发酵培养基；将乳酸菌种子液接种到所述发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，获得发酵液；将所述发酵液除杂质、除菌。本发明提供的黑麦发酵产物的制备方法，周期短、过程可控、工艺简单易放大、产品稳定、功效好、易吸收、安全健康，符合化妆品原料的特点。

Description

一种黑麦发酵产物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及化妆品领域，特别涉及一种黑麦发酵产物及其制备方法和应用。
背景技术
黑麦(Secale cereale L.)是禾本科，一年或越年生草本植物，具有较强的抗逆性，主要种植在高寒地区、癖薄的沙性或酸性土壤上。黑麦现广泛种植于北欧、北非等地区，如德国、波兰、俄罗斯、土耳其、埃及等，都有相当大的种植面积，有的地区甚至以此为主要粮食作物。在我国，黑麦零星分布在云南、贵州、内蒙、甘肃、新疆等高寒或干旱地区，常与小麦掺合做成黑面包，亦可用来酿酒 (黑啤)、榨油，或用作青饲牧草饲养家畜等。
黑麦富有营养，含淀粉、蛋白质、多不饱和脂肪酸、维生素和钙、钾、铁、磷、硒、碘等矿物质。黑麦中蛋白质含量高达17.1％，并且氨基酸种类全面，除丝氨酸和蛋氨酸外，其他种类氨基酸的含量均比普通小麦高出10％以上，丰富的氨基酸能够维持人体组织生长、更新和修复，因此，黑麦对于儿童、成年人和老年人都能起到很好的保健作用。黑麦所含的维生素主要包括VB1、VB2、VC、VA和VE，其中，VA和VE在一般的禾谷类植物中含量较少，而在黑麦中的含量则相对较高。黑麦中微量元素的含量也高于普通小麦，特别是硒和碘，是普通小麦所没有的。硒和碘能够调节人体新陈代谢、合成抗氧化酶，防止组织细胞氧化伤损，在一定程度上预防疾病甚至癌症，增加人类寿命。
中国专利CN109043631A公开了“一种烟用黑麦发酵物的制备方法及应用”，其特征在于黑麦经焙烤、糊化后接种酒曲发酵5～8d，将发酵液85～90℃进行蒸馏，得馏出液。此发明同样存在仅以黑麦酶解液为培养基，微生物可能会消耗黑麦中的氨基酸、维生素、矿物质和其他生物活性成分的问题，发酵过程中也会产生乙醇，且馏出液中多为易挥发的醇类、酯类物质，其它有益功效成分被丢弃。另外，此发明发酵周期较长、生产效率较低、产品稳定性难以保证，不宜规模化生产。
中国专利CN106359594A公开了“一种功能饮用型黑麦风味发酵乳及其制备方法”，将黑麦芽先进行蛋白质分解并高温烘出焦香，破碎后加酶糖化，过滤浓缩，得黑麦浓缩汁。将黑麦浓缩汁与鲜牛奶、浓缩乳清蛋白、蔗糖混合后，接种乳酸菌进行发酵。此发明的缺点在于黑麦芽经160～230℃高温烘制后，绝大部分有益成分被破坏，失去生物活性功效，产品无法突出黑麦发酵的优势和功效作用。
中国专利CN107456429A公开了“一种燕麦萌芽提取物及其在化妆品中的应用”，其特征在于将萌芽的燕麦热风干燥后，用乙醇超声提取，提取液过滤浓缩后得燕麦萌芽提取物，可用于缓解皮肤刺激和皮肤瘙痒。此发明采用乙醇超声提取法，对活性成分的提取率不高，同时燕麦料渣中的活性物质可能没有充分释放到液体中，原料没有完全被利用。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种黑麦发酵产物的制备方法，采用黑麦作为主要原料，先酶解再接种乳酸菌进行发酵，发酵后离心、过滤即得黑麦发酵产物滤液。采用本发明提供的方法制备的黑麦发酵产物滤液具有良好的抗氧化、修复、防护、美白效果，并且该方法生产周期短、活性物质含量高、安全健康。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种黑麦发酵产物的制备方法，包括以下步骤：
黑麦浸水催芽，经烘干、粉碎，过筛得黑麦粉；
将所述黑麦粉加入酶进行酶解，得黑麦粉酶解液；
向所述黑麦粉酶解液添加氮源以及无机盐，获得发酵培养基；
将乳酸菌种子液接种到所述发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，获得发酵液；
将所述发酵液除杂质、除菌。
具体地，浸水量为黑麦质量的2-3倍，水温28-30℃，催芽时间为 12h-24h。
具体地，黑麦芽烘干温度为50℃-60℃，烘干时间为10h-20h。
具体地，黑麦粉干燥失重小于10％。
具体地，所述氮源为微生物培养常用氮源，如牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、豆饼粉，优选为蛋白胨；所述无机盐优选自K2HPO4，KCl， MgSO4，MnSO4和CaCl2中的至少一种。
具体地，所述氮源与黑麦粉酶解液的质量体积比为 (0.5-2g):100mL，优选为(0.7-1.3g):100mL；所述无机盐与黑麦粉酶解液的质量体积比为(0.01-1g):100mL，优选为(0.05-0.5g):100mL。
进一步地，发酵温度为34℃-38℃，搅拌转速为50-100r/min；发酵终点为发酵液中无葡萄糖。所述葡萄糖含量测定可采用常用的化学法所如DNS法、斐林试剂法、间接碘量法或者旋光法等，或使用生物传感分析仪进行检测。
进一步地，除杂过程为发酵液4000-8000r/min离心10-30min除去沉淀，保留上清发酵液。
进一步地，除菌过程为上清发酵液40-60℃加热30-40min后，0.22 μm孔径滤芯过滤除菌。
进一步地，所述酶解包括分别使用淀粉酶和糖化酶进行酶解。
具体地，所述酶的添加量为所述黑麦粉质量的1％-20％，优选为5％-10％。
进一步地，所述酶包括α-淀粉酶和α-糖化酶。
具体地，所述酶解包括：
先向黑麦粉与水的混合物中加入α-淀粉酶进行第一步酶解，黑麦粉与水的质量体积比为(2g-8g):100mL；酶解pH为6.0-9.0，优选为6.5-7.5，酶解温度70-90℃，优选为85-90℃，酶解时间1-3h，优选为2-3h；然后再加入α-糖化酶进行第二步酶解，酶解pH为 6.0-9.0，优选为8.0-9.0，酶解温度40-60℃，优选为50-55℃，酶解时间1-2h，优选1-1.5h。酶解终点为间隔0.5h的葡萄糖含量不再变化。葡萄糖含量测定可采用常用的化学法如DNS法、斐林试剂法、间接碘量法以及旋光法等，或使用生物传感分析仪进行检测。
进一步地，所述α-淀粉酶和所述α-糖化酶的质量比为3-4:1 (3-4):1。酶活分别优选为150-200U/g和400-500U/g。
具体地，所述乳酸菌为乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌 (Bifidobacterium)或明串珠球菌(Leuconostoc)；优选植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)。所述乳酸菌种子液培养基为MRS液体培养基，培养温度为34℃-38℃，培养时间10-16h。
进一步地，所述黑麦粉的粒度为60-100目，优选70-80目。
具体地，所述黑麦粉与水的混合物中，黑麦粉与水的质量体积比为(2g-8g):100mL，优选为(2g-5g):100mL。
所述乳酸菌种子液的接种量为所述发酵培养基的0.1-2％wt。
本发明还提出了如前任一项所述的制备方法获得的黑麦发酵产物。
本发明还提出了包含如前所述黑麦发酵产物的化妆品。该化妆品具有抗氧化、修复、防护、美白或pH调节等的作用。
本发明还提出了如前所述黑麦发酵产物在抗氧化、修复紫外损伤、美白的用途。
本发明具有以下优点：
本发明提供的黑麦发酵产物的制备方法，采用催芽方式将黑麦中的营养进行转化、富集，然后通过酶解可初步将黑麦中以结合态形式存在的营养物质转化为游离态，同时将黑麦中的大分子淀粉降解为寡糖或单糖作为碳源供给微生物生长，从而提高后续发酵效率。
本发明提供的黑麦发酵产物的制备方法，通过微生物发酵，一方面利用糖类等酶解产物，另一方面多糖、氨基酸、黄酮类等活性成分更有效的释放出来，又会产生丝氨酸、蛋氨酸等黑麦自身没有的活性成分。同时结合代谢调控手段在发酵过程中采用菌体细胞转化方式，相对于其它发酵能够有效提高发酵效率，缩短发酵周期。
本发明提供的黑麦发酵产物的制备方法，对发酵前后产品的功效进行了对比，充分体现出本发明制备方法的整体优势，且为在化妆品等领域中的应用提供功效数据支持。
本发明提供的黑麦发酵产物的制备方法，所得黑麦发酵产物在化妆品中具有良好的抗氧化、修复、防护、美白、pH调节作用。
本发明提供的黑麦发酵产物的制备方法，周期短、过程可控、工艺简单易放大、产品稳定、功效好、易吸收、安全健康符合化妆品原料的特点。
具体实施方式
目前国内外市场上的黑麦类原料多被用于制作面包、酿酒(黑啤)、榨油、饲养家畜等食品行业和农牧饲料行业，而在化妆品中的应用相对较少。在国外特别是韩国、日本上市的以麦类作为化妆品原料的精华水、乳液、膏霜、面膜等产品众多，都广受好评，故开发麦类尤其是黑麦类的化妆品原料意义重大。
目前市场上的麦类原料主要存在以下不足：1、麦类发酵多涉及食品、保健品领域，化妆品领域的研究较少，并且没有黑麦发酵产品在化妆品领域的应用，而食品领域的产品不适用于化妆品领域。另一方面，缺少此类产品的功效数据，这对于应用到化妆品领域十分重要。2、多使用乙醇萃取或加热蒸馏的方法提取麦类原料中活性物质，提取率低，料渣中的功效成分可能没有充分释放到液体中，而且产品中很可能有乙醇残留，会对皮肤产生刺激伤害，安全性无法保证。3、多直接采用麦类或其提取液、酶解液为培养基，未补充其他营养成分，在发酵过程中菌体可能会消耗黑麦中的氨基酸、维生素、矿物质等，导致产品中生物活性成分含量较少，无法达到理想功效。4、麦类尤其是黑麦与乳制品、糖类等其他原料混合发酵时，产品稳定性难以保证，且无法突出黑麦发酵的优势及其在修复、防护等方面的功效作用。
有鉴于此，本发明提供了一种黑麦发酵产物滤液的制备方法，下面将结合实施例对本发明做进一步说明。
本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其他的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
称取100-150U/g的α-淀粉酶和300-400U/g的α-糖化酶分别配制成酶液，活力均为100U/mL，供实施例与对比例中使用。α-淀粉酶和α-糖化酶均为市购。
本发明中所述淀粉酶和糖化酶的酶活力单位为：1U/g是指每克纤维素酶所具有的酶活力。U定义为在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位 (IU，又称U)。
实施例1乳酸菌种子液的制备
从试管挑取植物乳杆菌接种于500mLMRS无菌种子培养液中， 34℃-38℃静置培养10-16h。
实施例2
(1)称取500g黑麦浸入1300g水，28℃催芽22h，然后50℃烘干20h、粉碎为全部过80目的黑麦粉，水分为5.6％。
(2)取步骤(1)中黑麦粉240g加6L水混匀，调节pH为6.5，先加入19.2gα-淀粉酶，85℃酶解，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h 后不再变化。然后调节pH为8.5，加入6.4gα-糖化酶，50℃酶解，每 0.5h测葡萄糖含量，1h后不再变化时，获得黑麦粉酶解液，其葡萄糖含量为35.7g/L。
(3)取上述黑麦粉酶解液5L添加13g/L蛋白胨做氮源，添加 0.8g/LK2HPO4，2.5g/LMgSO4，和1.7g/LCaCl2，溶解混合均匀，获得发酵培养基。
(4)上述发酵培养基经灭菌冷却后，接种实施例1中的乳酸菌种子液100mL，搅拌转速80r/min，37℃发酵26h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液。
(5)取上述发酵液200mL，8000r/min离心15min，除去沉淀，保留上清发酵液，55℃加热35min后，用0.22μm孔径滤芯过滤除菌，滤液用无菌水定容至200mL，获得黑麦发酵产物S1。
实施例3
(1)称取200g黑麦浸入600g水，29℃催芽18h，然后60℃烘干 10h、粉碎为全部过70目的黑麦粉，水分为7.9％。
(2)取步骤(1)中黑麦粉120g加6L水混匀，调节pH为7.5，先加入12gα-淀粉酶，90℃酶解，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，1.0h 后不再变化。然后调节pH为8.0，加入3.4gα-糖化酶，55℃酶解，每 0.5h测葡萄糖含量，1.5h后不再变化时，获得黑麦粉酶解液，其葡萄糖含量为13.3g/L。
(3)取上述黑麦粉酶解液5L，添加7g/L蛋白胨做氮源，添加 0.3g/LKCl，0.2g/LMnSO4，溶解混合均匀，获得发酵培养基。
(4)上述发酵培养基经灭菌冷却后，接种实施例1中的乳酸菌种子液75mL，搅拌转速50r/min，38℃发酵18h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液。
(5)取上述发酵液200mL，5000r/min离心30min，除去沉淀，保留上清发酵液，60℃加热40min后，用0.22μm孔径滤芯过滤除菌，滤液用无菌水定容至200mL，获得黑麦发酵产物S2。
实施例4
(1)称取700g黑麦浸入1400g水，28℃催芽24h，然后55℃烘干18h、粉碎为全部过60目的黑麦粉，水分为6.0％。
(2)取步骤(1)中黑麦粉300g加6L水混匀，调节pH为7.0，先加入15gα-淀粉酶，85℃酶解，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，3.0h 后不再变化。然后调节pH为9.0，加入4.69gα-糖化酶，45℃酶解，每0.5h测葡萄糖含量，2.0h后不再变化时，获得黑麦粉酶解液，其葡萄糖含量为41.1g/L。
(3)取上述黑麦粉酶解液5L，添加10g/L蛋白胨做氮源，添加 2g/LK2HPO4，0.7g/LMgSO4，0.3g/LMnSO4溶解混合均匀，获得发酵培养基。
(4)上述发酵培养基经灭菌冷却后，接种实施例1中的乳酸菌种子液25mL，搅拌转速100r/min，36℃发酵28h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液。
(5)取上述发酵液200mL，7000r/min离心20min，除去沉淀，保留上清发酵液，50℃加热30min后，用0.22μm孔径滤芯过滤除菌，滤液用无菌水定容至200mL，获得黑麦发酵产物S3。
实施例5
(1)称取1500g黑麦浸入3750g水，30℃催芽12h，然后55℃烘干15h、粉碎为全部过100目的黑麦粉，水分为7.5％。
(2)取步骤(1)中黑麦粉480g加6L水混匀，调节pH为9.0，先加入76.8gα-淀粉酶，70℃酶解，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.0h 后不再变化。然后调节pH为6.5，加入19.2gα-糖化酶，60℃酶解，每0.5h测葡萄糖含量，2.0h后不再变化时，获得黑麦粉酶解液，其葡萄糖含量为60.2g/L。
(3)取上述黑麦粉酶解5L，液中添加5g/L蛋白胨做氮源，添加 3g/LK2HPO4，3g/LKCl，2g/LMgSO4，2g/LCaCl2溶解混合均匀，获得发酵培养基。
(4)上述发酵培养基经灭菌冷却后，接种实施例1中的乳酸菌种子液50mL，搅拌转速60r/min，34℃发酵32h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液。
(5)取上述发酵液200mL，4000r/min离心25min，除去沉淀，保留上清发酵液，40℃加热35min后，用0.22μm孔径滤芯过滤除菌，滤液用无菌水定容至200mL，获得黑麦发酵产物S4。
实施例6
(1)称取500g黑麦浸入1300g水，28℃催芽22h，然后50℃烘干20h、粉碎为全部过80目的黑麦粉，水分为5.7％。
(2)取步骤(1)中黑麦粉240g加6L水混匀，调节pH为6.5，加入19.2gα-淀粉酶，85℃酶解，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h 后不再变化时，获得黑麦粉酶解液，其葡萄糖含量为17.7g/L。
(3)取上述黑麦粉酶解液5L，添加13g/L蛋白胨做氮源，添加 0.8g/LK2HPO4，2.5g/LMgSO4，和1.7g/LCaCl2，溶解混合均匀，获得发酵培养基。
(4)上述发酵培养基经灭菌冷却后，接种实施例1中的乳酸菌种子液100mL，搅拌转速80r/min，37℃发酵19h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液。
(5)取上述发酵液200mL，8000r/min离心15min，除去沉淀，保留上清发酵液，55℃加热35min后，用0.22μm孔径滤芯过滤除菌，滤液用无菌水定容至200mL，获得黑麦发酵产物滤液S5。
对比例1
(1)称取500g黑麦浸入1300g水，28℃催芽22h，然后50℃烘干20h、粉碎为全部过80目的黑麦粉，水分为5.3％。
(2)取步骤(1)中黑麦粉240g加6L水混匀，40℃超声提取3.5h。
(3)取上述黑麦超声提取液200mL，8000r/min离心15min，除去沉淀，保留上清液，用0.22μm孔径滤芯过滤，滤液用无菌水定容至 200mL，获得黑麦提取液C1。
对比例2
(1)以40g/L葡萄糖为碳源，13g/L蛋白胨做氮源，添加 0.8g/LK2HPO4，2.5g/LMgSO4，和1.7g/LCaCl2，加入5L水，溶解混合均匀，获得发酵培养基。
(2)上述发酵培养基经灭菌冷却后，接种实施例1中的乳酸菌种子液100mL，搅拌转速80r/min，37℃发酵约32h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液。
(5)取上述发酵液200mL，8000r/min离心15min，除去沉淀，保留上清发酵液，55℃加热35min后，用0.22μm孔径滤芯过滤除菌，滤液用无菌水定容至200mL，获得无黑麦乳酸菌发酵滤液C2。
对比例3
(1)称取500g黑麦浸入1300g水，28℃催芽22h，然后50℃烘干20h、粉碎为全部过80目的黑麦粉，水分为5.0％。
(2)取步骤(1)中黑麦粉240g加6L水混匀，调节pH为6.5，先加入19.2gα-淀粉酶，85℃酶解，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h 后不再变化。然后调节pH为8.5，加入6.4gα-糖化酶，50℃酶解，每 0.5h测葡萄糖含量，1h后不再变化时，获得黑麦粉酶解液，其葡萄糖含量为36.3g/L。
(3)取上述黑麦粉酶解液200mL，8000r/min离心15min，除去沉淀，保留上清液，55℃加热35min后，用0.22μm孔径滤芯过滤，滤液用无菌水定容至200mL，获得黑麦提取液C3。
对比例4
(1)称取500g黑麦，粉碎为全部过80目的黑麦粉，水分为6.1％。
(2)取步骤(1)中黑麦粉240g加6L水混匀，调节pH为6.5，加入19.2gα-淀粉酶，85℃酶解，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，3.0h 后不再变化时，获得黑麦粉酶解液，其葡萄糖含量为20.6g/L。
(3)取上述黑麦粉酶解液5L为发酵培养基，经灭菌冷却后，接种实施例1中的乳酸菌种子液100mL，搅拌转速80r/min，37℃发酵20h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液。
(4)取上述发酵液200mL，8000r/min离心15min，除去沉淀，保留上清发酵液，55℃加热35min后，用0.22μm孔径滤芯过滤除菌，滤液用无菌水定容至200mL，获得黑麦发酵产物C4。
对比例5
(1)酵母菌种子液的制备：从试管挑取酵母菌接种于500mLPDA 无菌种子培养液中，摇床转速80r/min，28℃-30℃培养18-24h。
(2)称取500g黑麦浸入1300g水，28℃催芽22h，然后50℃烘干20h、粉碎为全部过80目的黑麦粉，水分为5.0％。
(3)取步骤(2)中黑麦粉240g加6L水混匀，调节pH为6.5，先加入19.2gα-淀粉酶，85℃酶解，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h 后不再变化。然后调节pH为8.5，加入6.4gα-糖化酶，50℃酶解，每 0.5h测葡萄糖含量，1h后不再变化时，获得黑麦粉酶解液，其葡萄糖含量为36.0g/L。
(3)取上述黑麦粉酶解液5L，添加13g/L蛋白胨做氮源，添加 0.8g/LK2HPO4，2.5g/LMgSO4，和1.7g/LCaCl2，溶解混合均匀，获得发酵培养基。
(4)上述发酵培养基经灭菌冷却后，接种步骤(1)中的酵母菌种子液100mL，搅拌转速80r/min，30℃发酵42h，无残糖后，发酵结束，获得发酵液。
(5)取上述发酵液200mL，8000r/min离心15min，除去沉淀，保留上清发酵液，55℃加热35min后，用0.22μm孔径滤芯过滤除菌，滤液用无菌水定容至200mL，获得黑麦发酵产物C5。
实施例5理化性质检测
1氨基酸含量
以实施例2-6中的样品S1、S2、S3、S4、S5，对比例1-5中样品 C1、C2、C3、C4、C5为实验样品，采用氨基酸自动分析仪进行氨基酸含量测定，结果如表1所示。
表1不同样品中氨基酸含量对比
Figure RE-GDA0002772879660000111
从表1中可以看出，本发明制备的黑麦发酵产物S1、S2、S3、S4、 S5中的小分子氨基酸种类和含量总体来看高于传统提取法获得的样品黑麦提取液C1、无黑麦乳酸菌发酵滤液C2、酶解后发酵前的样品黑麦提取液C3、变更黑麦处理条件及发酵条件后获得的黑麦发酵产物C4、酵母菌黑麦发酵产物C5。尤其是C1、C2、C3、C5样品中都没有丝氨酸和蛋氨酸，C3、C4样品中仅含有很少谷氨酰胺，但本发明制备的黑麦发酵产物中含有丝氨酸、蛋氨酸和谷氨酰胺。这说明采用本发明的制备方法，不仅将黑麦中的营养成分进行了转化、释放、富集，还通过发酵产生了新的活性成分。
2细胞毒性评价
取对数生长期人表皮角质形成细胞HaCaT，以2×104个/mL密度接种于96孔板，每孔100uL，培养体系是DMEM高糖培养液，添加 10％胎牛血清，样品原液浓度按照100％计，再以无血清培养液配置成 2％(v/v)低浓度的样品溶液。接种的细胞置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养24h后，弃去培养液，换成100μL样品溶液，无血清培养液作为正常对照(control)。继续培养48h后，采用WST-1法检测细胞相对增殖率。相对增殖率(RGR)为样品组吸光度与正常对照组吸光度的比值。按照GB/T16886.5-2017的要求，RGR低于70％时，认为样品具有细胞毒性(以阴性对照的增殖率为100％)。结果如表2所示。
表2不同样品的细胞毒性评价
Figure RE-GDA0002772879660000121
Figure RE-GDA0002772879660000131
由表2中数据所示，在2％(v/v)的浓度下，10个样品溶液中， C5有细胞毒性，其它样品无细胞毒性。样品S1、S2、S3、S4、S5、 C2、C4的相对增值率均大于90％，其中样品S1、S2、S3、S4、S5的相对增值率大于100％，说明本发明制备的黑麦发酵产物可以促进表皮角质形成细胞的增殖，并且安全健康。
3抗氧化活性
将待测样品用纯化水配置成2％(v/v)浓度的样品溶液，分别精密量取样品溶液各5.0mL，置具塞试管中，加入DPPH溶液5.0mL混匀。以等体积的纯化水与95％乙醇混合溶液为空白对照。室温避光放置30 分钟后，于523nm处分别测定溶液吸光度值。另设一组分别精密量取 DPPH溶液5.0mL和纯化水5.0mL混合，操作同上。计算方法如下：
Figure RE-GDA0002772879660000132
结果如表3所示。由表中数据可知，在添加2％(v/v)的浓度下，样品S1、S2、S3、S4、S5具有较高的清除自由基的能力，可达30％以上，有较好的抗氧化性。
表3不同样品清除DPPH自由基活性对比
Figure RE-GDA0002772879660000133
4创伤修复实验
样品溶液的配置：取各待测样品分别用含5％血清的DMEM高糖培养液配制成2％(v/v)浓度的样品溶液，用0.22μm滤膜过滤除菌，备用。
在新的24孔培养板中，放置ibidi小室，取处于对数生长期的人表皮角质形成细胞HaCaT，以3×105个/mL的密度接种于24孔板中的 ibidi小室中，小室的左右两孔各70μL细胞悬液，小室外补充400μL 完全培养液，37℃、5％CO2条件下培养24h。取出小室，吸弃旧培养液，加入1mL样品溶液。继续培养6h、24h后观察拍照。对照组用不含样品的培养液代替。
照片中划痕区域的愈合率用Image J软件分析。
结果如表4所示，在2％(v/v)浓度下，黑麦发酵产物样品S1、S2、S3、S4、S5的创伤修复能力高于样品C1、C2、C3、C4、C5，特别是修复24h后，样品S1、S2、S3、S4、S5、C4的愈合率明显高于样品C1、C2、C3和C5，说明乳酸菌发酵过程有利于提高创伤修复能力。
表4不同样品的创伤修复作用对比
Figure RE-GDA0002772879660000141
5对细胞凋亡比例的影响
(1)将各待测样品分别用无血清DMEM培养液配成2％(v/v) 浓度的样品溶液，0.22μm滤膜过滤除菌备用。以DMEM培养基添加 10％胎牛血清为培养液，取对数生长期HaCaT细胞，以5×105个/mL 密度接种于12孔板中，每孔1mL，常规培养过夜。
(2)紫外损伤后与样品接触
实验组和模型组盖保鲜膜后，用700μW/cm2强度的UVB照射 5min，正常对照组不照射。
照射后弃去旧培养液，实验组加入样品溶液，正常对照组和模型组加入无血清培养液，每孔均为1mL，继续培养16-24h后，胰酶消化获取细胞，用PBS洗两遍。每孔加入1×Binding Buffer重悬细胞，使细胞密度为1×106个/mL，取100μL细胞悬液至5mLEP管中，加入5 μL的FITC-Annexin V和5μLPI溶液，轻轻混匀，室温避光孵育15min，每管加入400μL的1×Binding Buffer，用流式细胞仪进行检测。
(3)紫外损伤前与样品接触
重复(1)的操作后，实验组弃去旧培养液，加入样品溶液，正常对照组和模型组替换新的无血清培养液，每孔均为1mL，继续培养24h 后UVB照射。
实验组与模型组盖保鲜膜，用700μW/cm2强度的UVB照射5min，正常对照组不照射，各组继续培养16-24h。胰酶消化获取细胞，用PBS 洗两遍。每孔加入1×Binding Buffer重悬细胞，使细胞密度为1×106个/mL，取100μL细胞悬液至5mLEP管中，加入5μL的FITC-Annexin V和5μLPI溶液，轻轻混匀，室温避光孵育15min，每管加入400μL 的1×BindingBuffer，用流式细胞仪进行检测。
结果如表5所示，对已经形成紫外损伤的细胞，样品S1、S2、S3、 S4、S5、C3、C4都有较好的紫外损伤修复作用，能显著降低细胞凋亡的比例，其中，S1、S2、S3、S4、S5的修复效果较C3、C4好；对紫外损伤的防护作用，样品S1、S2、S3、S4、S5均能有效抑制细胞的凋亡，且效果优于C1、C2、C3、C4、C5。故综合表5中10个样品与细胞紫外损伤前、后接触的凋亡比例数据，可以得知，本发明制备的黑麦发酵产物对紫外损伤有较好的修复和防护作用。
表5不同样品对细胞凋亡的影响
Figure RE-GDA0002772879660000151
6黑色素含量检测
取对数生长期B16细胞，以2×104个/mL密度接种于6孔培养板，每孔3mL，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2培养24h，弃去旧培养液，正常对照组和模型组加入3mL含血清培养基，实验组加入3mL用含血清培养液配制的2％(v/v)浓度生物样品溶液，模型组和实验组每孔再加入60μL毛喉素溶液(2mM)，以刺激黑色素的产生，继续培养72h。
细胞内黑色素含量的测定方法如下：胰酶消化，离心去上清，加入1mol/L(含10％DMSO)的NaOH溶液500uL裂解细胞，80℃加热 30min后，3000rpm离心10min，取上清加入96孔板，100uL/孔，测定450nm吸光度，从而获得黑色素总量，以模型组黑色素含量为100％，获得实验组黑色素含量的相对值及抑制率，计算方法如下：
Figure RE-GDA0002772879660000161
检测结果如表6所示，样品S1、S2、S3、S4、S5、C4对于黑色素分泌都有较好抑制效果，且S1、S2、S3、S4、S5抑制效果优于C4，而样品C1、C2、C3、C5对于黑色素的分泌也有抑制效果，但相对较弱。
表6不同样品对细胞黑色素含量的影响
样品名称 黑色素含量抑制率(％)
S1 57.32
S2 43.82
S3 54.71
S4 42.22
S5 41.80
C1 5.70
C2 12.07
C3 24.65
C4 34.30
C5 9.93
7酪氨酸酶活性检测
取对数生长期B16细胞，以1×105个/mL密度接种于6孔培养板，每孔3mL，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2培养24h，弃去旧培养液，更换为用含血清培养液配制的2％(v/v)浓度的样品溶液，孵育72h，胰酶消化细胞，用PBS洗涤细胞两次，再用500uL含有1％Triton X-100 的Tirs-HCl(0.02mol/L,pH6.8)溶液裂解细胞，超声处理10min，添加 1.0mL含0.1％L-多巴的PBS(0.01mol/L,pH8.0)底物，37℃孵育30min 后，测定490nm吸光度，试验组与对照组吸光度之比作为评价酪氨酸酶活性高低的指标。
样品对酪氨酸酶活性的影响检测结果如表7所示，样品C1、C2、 C3对酪氨酸酶活性几乎没有抑制作用，样品C4、C5对酪氨酸酶活性有一定的抑制作用，但抑制作用不强，而样品S1、S2、S3、S4、S5 对酪氨酸酶活性抑制作用显著。
表7不同样品对酪氨酸酶活性的影响
Figure RE-GDA0002772879660000162
Figure RE-GDA0002772879660000171
以上所述，仅是本发明的较佳实例，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

Claims (12)

1.一种黑麦发酵产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
黑麦浸水催芽，经烘干、粉碎，过筛得黑麦粉；
将所述黑麦粉加入淀粉酶和糖化酶进行酶解，得黑麦粉酶解液；
向所述黑麦粉酶解液添加氮源以及无机盐，获得发酵培养基；
将乳酸菌种子液接种到所述发酵培养基中进行发酵，发酵结束后，获得发酵液；
将所述发酵液除杂质、除菌。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述酶的添加量为所述黑麦粉质量的1%-20%；
所述酶包括α-淀粉酶和α-糖化酶。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
所述酶的添加量为所述黑麦粉质量的5%-10%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶解包括：
先向黑麦粉与水的混合物中加入α-淀粉酶进行第一步酶解，酶解pH为6.0-9.0，酶解温度70-90℃，酶解时间1-3h；然后再加入α-糖化酶进行第二步酶解，酶解pH为6.0-9.0，酶解温度40-60℃，酶解时间为1-2h。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述酶解包括：
先向黑麦粉与水的混合物中加入α-淀粉酶进行第一步酶解，酶解pH为6.5-7.5，酶解温度为85-90℃，酶解时间为2-3h；然后再加入α-糖化酶进行第二步酶解，酶解pH为8.0-9.0，酶解温度为50-55℃，酶解时间为1-1.5h。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，
所述α-淀粉酶和所述α-糖化酶的质量比为（3-4）：1。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述乳酸菌包括乳酸杆菌、双歧杆菌或明串珠球菌。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述乳酸菌为植物乳杆菌。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述黑麦粉的粒度为60-100目；
所述乳酸菌种子液的接种量为所述发酵培养基的0.1-2%wt。
10.如权利要求1-9中任一项所述的制备方法获得的黑麦发酵产物。
11.包含权利要求10所述黑麦发酵产物的化妆品。
12.权利要求10所述黑麦发酵产物在制备抗氧化、修复紫外损伤、美白产品中的用途。
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