CN110772460A - 一种红景天发酵提取液的制备方法及应用 - Google Patents

一种红景天发酵提取液的制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110772460A
CN110772460A CN201911202427.9A CN201911202427A CN110772460A CN 110772460 A CN110772460 A CN 110772460A CN 201911202427 A CN201911202427 A CN 201911202427A CN 110772460 A CN110772460 A CN 110772460A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhodiola
fermentation
enzymolysis
rhodiola rosea
root powder
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911202427.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110772460B (zh
Inventor
魏玉洁
陆震
陈玉娟
李芬
王成山
孙元军
石艳丽
郭学平
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Huaxi Rongxi Biotechnology Research Co ltd
Bloomage Biotech Co Ltd
Original Assignee
Huaxi Biotechnology Co Ltd
Shandong Bloomage Hyinc Biopharm Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Huaxi Biotechnology Co Ltd, Shandong Bloomage Hyinc Biopharm Co Ltd filed Critical Huaxi Biotechnology Co Ltd
Priority to CN201911202427.9A priority Critical patent/CN110772460B/zh
Publication of CN110772460A publication Critical patent/CN110772460A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110772460B publication Critical patent/CN110772460B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/97—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from algae, fungi, lichens or plants; from derivatives thereof
    • A61K8/9783—Angiosperms [Magnoliophyta]
    • A61K8/9789—Magnoliopsida [dicotyledons]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/41—Crassulaceae (Stonecrop family)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/02—Preparations for care of the skin for chemically bleaching or whitening the skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
    • A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
    • A61K2236/19—Preparation or pretreatment of starting material involving fermentation using yeast, bacteria or both; enzymatic treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/74—Biological properties of particular ingredients
    • A61K2800/78—Enzyme modulators, e.g. Enzyme agonists
    • A61K2800/782—Enzyme inhibitors; Enzyme antagonists
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
    • A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
    • A61K2800/85—Products or compounds obtained by fermentation, e.g. yoghurt, beer, wine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gerontology & Geriatric Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了一种红景天发酵提取液的制备方法，包括以下步骤：取红景天根经烘干、粉碎，过筛得红景天根粉；将红景天根粉加水混匀，然后加入酶进行酶解，酶解至终点，然后升温灭酶，得红景天根粉酶解液；将酵母菌种子液接种到具有红景天根粉酶解液的发酵培养液中，进行发酵，发酵结束后，获得发酵液；将发酵液除杂、除菌获得所述红景天发酵提取液。本发明还涉及一种红景天发酵提取液的应用。本发明的红景天发酵提取液的制备方法，采用红景天根粉作为主要原料，先酶解再接种酵母菌发酵，发酵后离心、过滤即得红景天发酵提取液。采用本发明提供的方法制备的红景天发酵提取液具有良好的美白淡斑、抗氧化、抗炎效果。

Description

一种红景天发酵提取液的制备方法及应用
技术领域
本申请涉及化妆品原料领域，且更为具体地涉及一种红景天发酵提取液的制备方法及应用。
背景技术
红景天是生长在高寒无污染地带的珍稀野生植物，是我国藏族人民的习用药物，至今已有1000多年的应用历史，具有刺激神经系统、增加工作效率、消除疲劳和预防高山症等作用。除此之外，红景天还具有保护心脑血管，神经细胞以及抗肿瘤抗辐射等功能。因含有黄酮类、氨基酸、多酚类等多种生物活性成分，故红景天还具有抗炎、抗氧化、延缓衰老、美白等美容功效。
迄今为止关于发酵红景天的研究众多，如中国专利CN105996025A公开了“一种红景天发酵液的制备方法”，其特征在于将红景天、辣木粉以及药食同源的多种物料通过合理比例的搭配，充分混合，加入乳酸菌进行发酵，红景天是经过加水打浆煎煮后，抽取上清液用于发酵，红景天料渣中的活性物质可能没有充分释放到液体中，造成浪费。
中国专利CN104257545A公开了“一种红景天发酵原浆化妆品及其制备方法”，其特征在于将红景天根的粉末与水混合，经酵母菌发酵，发酵液经过灭菌、离心，收集上清液，得到所述红景天发酵原浆化妆品。发酵过程中没有添加其他的营养成分，酵母菌在生长发酵过程中很可能会消耗红景天中的氨基酸、多肽等活性成分，而且发明没有将发酵前后的提取液进行成分和功效的对比，无法体现出发酵提取的优势。
中国专利CN107822122A公开了“一种红景天酵素及其制备方法”，其特征在于将红景天、黄芪、木瓜、枸杞、茯苓、玄米等为原料，通过米曲霉菌、黑曲霉、酵母菌和乳酸菌等多种益生菌两步发酵而成，发酵时间为60天～120天。此发明发酵周期较长致使生产效率低，多菌种、两步发酵过程代谢难以精确控制发酵代谢途径，产品稳定性难以保证。
中国专利CN106265846A公开了“一种提高红景天抗氧化能力的发酵方法”，其特征在于将干燥后的红景天粉与水混合，100℃提取，过滤离心除杂得到的上清液加入葡萄糖作为发酵培养液，接入黑曲霉孢子发酵，可有效提高红景天提取液的抗氧化能力。此发明同样存在红景天料渣中的活性物质可能没有充分释放到液体中的问题，而且没有补充氮源等营养物质，发酵过程中菌体可能会消耗红景天中的活性成分，造成发酵后除抗氧化能力外的其他功效能力降低，用于化妆品中是得不偿失的。
因此目前市场上的红景天类原料主要存在以下不足：
1、红景天发酵多与其他原料混合发酵，产品稳定性难以保证，且无法突出红景天的抗氧化、美白等功效优势。
2、多使用加热提取过滤后的红景天提取液作为发酵培养液，红景天料渣中的活性物质可能没有充分释放到液体中，而且没有补充其他营养物质，发酵过程中菌体可能会消耗红景天中的活性成分。
3、没有对红景天抑制透明质酸酶活性及抗炎功效进行研究。
发明内容
为了解决上述技术问题，提出了本申请。本发明提供一种红景天发酵提取液的制备方法，采用红景天根粉作为主要原料，先酶解再接种酵母菌发酵，发酵后离心、过滤即得红景天发酵提取液。采用本发明提供的方法制备的红景天发酵提取液具有良好的美白淡斑、抗氧化、抗炎效果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
1、一种红景天发酵提取液的制备方法，包括以下步骤：
取红景天根经烘干、粉碎，过筛得红景天根粉；
将所述红景天根粉加水混匀，然后加入酶进行酶解，酶解至终点，然后升温灭酶以结束酶解反应，得红景天根粉酶解液；
将酵母菌种子液接种到具有所述红景天根粉酶解液的发酵培养液中，进行发酵，发酵结束后，获得发酵液；
将所述发酵液除杂质、除菌从而获得所述红景天发酵提取液。
2、根据项1所述的红景天发酵提取液的制备方法，所述红景天根粉的粒度为60-100目，优选70-80目；
所述红景天根粉与水的质量体积比为(0.5g-3g)：100ml，优选为(1g-2g):100ml。
3、根据项1所述的红景天发酵提取液的制备方法，所述酶为纤维素酶和果胶酶，
在进行酶解时，先向红景天根粉水溶液中加入纤维素酶进行第一步酶解，然后再向红景天根粉水溶液中添加果胶酶进行第二步酶解。
4、根据项3所述的红景天发酵提取液的制备方法，在第一步酶解中，添加的所述纤维素酶的酶活与所述红景天根粉质量的比值为(50万U-500万U)：1kg，优选为(200万U-400万U)：1kg；
在第二步酶解中，添加的所述果胶酶的酶活与所述红景天根粉质量的比值为(50万U-500万U)：1kg，优选为(200万U-400万U)：1kg。
5、根据项3所述的红景天发酵提取液的制备方法，在进行酶解时，先向红景天根粉水溶液中加入纤维素酶，并将红景天根粉水溶液的pH调节至3.0-6.0，优选为4.0-5.0，温度控制在40-60℃进行第一步酶解，第一步酶解进行时间为1-3h，优选为1.5-2.5h，然后再向红景天根粉水溶液中添加果胶酶，并将红景天根粉水溶液的pH调节至2.5-4.5，优选为3.0-4.0，温度控制在40-60℃，优选45-55℃，进行第二步酶解，第二步酶解进行时间为1-3h，优选为1.5-2.5h。
6、根据项1所述的红景天发酵提取液的制备方法，进行灭酶的温度为90-100℃，灭酶时间为10-20min。
7、根据项1所述的红景天发酵提取液的制备方法，所述酵母菌种子液的接种量与所述培养液的体积比为(0.1-1)：100，优选为(0.5-0.7):100。
8、根据项1所述的红景天发酵提取液的制备方法，所述发酵培养液包括所述红景天根粉酶解液、氮源、碳源、无机盐以及水，其中，所述红景天根粉酶解液占所述发酵培养液体积的10-40％，优选为20-35％。
9、根据项8所述的红景天发酵提取液的制备方法，所述氮源与发酵培养液的质量体积比为(1kg-3kg)：100L，优选为(1.5kg-2.5kg)：100L，所述碳源与发酵培养液的质量体积比为(1kg-3kg)：100L，优选为(1.5kg-2.5kg)：100L，所述无机盐与发酵培养液的质量体积比为(0.1kg-0.5kg)：100L，优选为(0.2kg-0.3kg)：100L。
10、根据项8所述的红景天发酵提取液的制备方法，所述氮源为微生物培养常用氮源；所述碳源选自蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、甘露醇、甘油、半乳糖或麦芽糖醇中的一种；所述无机盐优选自K2HPO4，KH2PO4，MgSO4，MnSO4和CaCl2中的至少一种。
11、根据项1所述的红景天发酵提取液的制备方法，发酵温度为22℃-28℃；发酵时间为20-40h。
12、一种根据项1-11中任一项所述的制备方法获得的红景天发酵提取液。
13、一种化妆品，包含红景天或红景天发酵提取液，所述化妆品具有抗氧化、美白或抗炎的作用。
14、一种透明质酸酶抑制剂，其包括红景天或红景天发酵提取液。
15、一种抗炎药物，其包括红景天或红景天发酵提取液。
16、一种根据项12所述的红景天发酵提取液在化妆品中的应用，所述红景天发酵提取液在化妆品中作为抗氧化、美白、抗炎、透明质酸酶抑制剂的成分。
17、一种红景天在化妆品中的应用，所述红景天在化妆品中作为抗氧化、美白、抗炎、透明质酸酶抑制剂的成分。
18、一种红景天或红景天发酵提取液用于抑制透明质酸酶的用途。
19、一种红景天或红景天发酵提取液在制备用于抗炎药物中的用途。
本发明的红景天发酵提取液的制备方法，通过对红景天根粉进行酶解可初步将红景天中以结合态形式存在的营养物质转化为游离态，从而提高后续发酵效率，如将大分子纤维素、果胶降解为寡糖或单糖等。
本发明的红景天发酵提取液的制备方法，结合代谢调控手段在发酵过程中采用菌体细胞转化方式能够有效提高发酵效率，缩短发酵周期。
本发明的红景天发酵提取液的制备方法，对发酵前后的主要成分及其功效进行对比，充分体现出发酵提取的优势，且为在化妆品中的应用提供功效数据支持；另外红景天发酵提取液可以有效抑制透明质酸酶的活性，透明质酸酶广泛分布于生物体中，连皮肤中也存在，因此，可以认为通过抑制透明质酸酶的活性，有助于化妆品添加的及皮肤中存在的透明质酸的稳定性。
本发明中的红景天发酵提取液的制备方法，制备出来的红景天发酵提取液在化妆品中具有良好的抗氧化、美白、抗炎等作用。
附图说明
图1为本发明中标准品中的红景天苷含量测定的HPLC图谱；
图2为本发明中实施例4中红景天发酵提取液中的红景天苷含量测定的HPLC图谱；
图3为本发明中对比例1中红景天发酵提取液中的红景天苷含量测定的HPLC图谱。
发明的具体实施方式
以下将对本发明做以详细说明。
根据本发明的一个方面提供一种红景天发酵提取液的制备方法，包括以下步骤：
步骤一：取红景天根经烘干、粉碎，过筛得红景天根粉；
步骤二：将所述红景天根粉加水混匀，然后加入酶进行酶解，酶解至终点，然后升温灭酶以结束酶解反应，得红景天根粉酶解液；
步骤三：将酵母菌种子液接种到具有所述红景天根粉酶解液的发酵培养液上，进行发酵，发酵结束后，获得发酵液；
步骤四：将所述发酵液除杂质、除菌获得所述红景天发酵提取液。
所述红景天选自大花红景天、高山红景天、蔷薇红景天、小花红景天、玫瑰红景天中的一种，优选为大花红景天。所述大花红景天(学名:Rhodiola crenulata(HK.f.et.Thoms)H.Ohba)地上根颈短，残存花枝茎少数，黑色。不育枝直立，先端密着宽倒卵形叶。产自西藏、云南西北部、四川西部。有清肺、益气的作用。高山红景天(学名：Rhodiola cretinii(Hamet)H.Ohba subsp.sino-alpina(Frod.))H.Ohba)景天科：红景天属多年生草本植物，高达5厘米。根颈细，叶互生，花茎全部疏生，花序顶生，雌株有花，聚伞状着生。花常为四基数；雌花淡绿色或白色，8月初开花。7-8月结果。生于高山草地、岳桦林下及沟谷岩石附近。高山红景天是生长在海拔1700-2500米环境恶劣、气候多变的苔原带野生植物，生命力极强。清朝曾做为宫廷贡品，被康熙大帝钦封为“仙赐草”。蔷薇红景天(Rhodiola rosea L.)为景天科红景天属植物,是一种具有优良保健功效的珍稀药用植物资源,含有多种生理活性成分,如红景天苷、酪醇、黄酮类等。小花红景天一种对心，脑血管疾病有显著疗效的天然草药。红景天植物中富含多种维生素和氨基酸，有抗缺氧、抗疲劳、抗紫外线照射、提高记忆力、增强机体免疫力的功能。青海藏族牧民在翻山越岭时也有口含红景天的习惯，以减少疲劳。玫瑰红景天是滋补强壮的珍稀药用植物，现价格约为人参的5倍左右，是其它红景天品种的10倍。主要分布在长白山区等海拔1700-3500米的高山岳桦林附近，土壤为土层较浅的山地苔原及森林土，pH5.0-5.5。红景天适应性极强，冬季严寒漫长，常年气温低，年降水量700-1400毫米，无霜期100天左右即可人工栽培。
在本发明的步骤一中，所述红景天根粉的粒度为60-100目，优选为70-80目。所述红景天根粉的粒度可以为60目、70目、80目、90目以及100目中的一种。在本发明中的红景天根粉的粒度是通过将红景天根粉磨碎，然后分别过60目、70目、80目、90目或100目的筛子，从而得到60目、70目、80目、90目或100目的红景天根粉。
在步骤二中，酶解至终点是通过间隔0.5h测定葡萄糖含量不再变化来确定，当葡萄糖含量不再变化时，达到终点。
在本发明中，对于所述酶解条件没有具体的限定，只要能够完成酶解反应即可，本领域技术人员可以适当地来调节酶解过程中的温度、pH和酶解时间。
在本发明的步骤二中，所述红景天根粉与水的质量体积比为(0.5-3)：100，优选为(1-2)：100。
在本发明的步骤二中，所述酶为纤维素酶和果胶酶，在进行酶解时，向所述红景天根粉的水溶液中加入纤维素酶和果胶酶进行酶解。
在本发明的步骤二的一个具体实施方式中，所述酶为纤维素酶和果胶酶，在进行酶解时，先向所述红景天根粉的水溶液中加入所述纤维素酶进行第一步酶解，然后再向红景天根粉的水溶液中加入果胶酶进行第二步酶解。
在本发明的步骤二优选的一个具体实施方式中，所述酶为纤维素酶和果胶酶，在进行酶解时，先向所述红景天根粉的水溶液中加入所述纤维素酶进行第一步酶解，然后再向红景天根粉的水溶液中加入果胶酶进行第二步酶解。干燥的红景天根中含纤维素较多，先使用纤维素酶进行降解，可使红景天中的其他成分充分释放出来，防止被纤维素包裹的果胶不能得到降解。
在本发明的步骤二中，第一步酶解时，添加的所述纤维素酶的酶活与所述红景天根粉质量的比值为(50万U-500万U)：1kg，优选为(200万U-400万U)：1kg；
第二步酶解时，添加的所述果胶酶的酶活与所述红景天根粉质量的比值为(50万U-500万U)：1kg，优选为(200万U-400万U)：1kg。
在本发明的步骤二中，所述纤维素酶的酶活优选1万-5万U/g，所述果胶酶的酶活优选5万-10万U/g；
在本发明的步骤二中，在进行酶解时，先向红景天根粉水溶液中加所述纤维素酶，并将红景天根粉水溶液的pH调节至3.0-6.0，优选为4.0-5.0，温度控制在40-60℃进行第一步酶解，第一步酶解进行时间为1-3h，优选为1.5-2.5h，然后再向红景天根粉水溶液中添加所述果胶酶，并将红景天根粉水溶液的pH调节至2.5-4.5，优选为3.0-4.0，温度控制在40-60℃，优选45-55℃，进行第二步酶解，第二步酶解进行时间为1-3h，优选为1.5-2.5h；
第一步酶解进行时间是通过间隔0.5h葡萄糖含量不再变化来确定，所述葡萄糖含量测定可采用常用的化学法所如DNS法、斐林试剂法、间接碘量法或者旋光法等，或使用SBA-40D型生物传感分析仪进行检测。
第二步酶解进行时间是通过间隔0.5h葡萄糖含量不再变化来确定，所述葡萄糖含量测定可采用常用的化学法所如DNS法、斐林试剂法、间接碘量法或者旋光法等，或使用SBA-40D型生物传感分析仪进行检测。
本发明红景天根粉的水溶液的pH的调节为现有技术，当所述红景天根粉的水溶液为酸性时，加碱调节，当所述红景天根粉的水溶液为碱性时，加酸调节。
在本发明的步骤二中，灭酶的温度为90-100℃，灭酶的时间为10-20min。
在本发明的步骤三中，所述酵母菌种子液的接种量与所述培养液中的培养液的体积比为(0.1-1)：100，优选为(0.5-0.7):100。
所述酵母菌选自化妆品领域可应用的安全菌种；优选为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)，红冬孢酵母(Rhodospordium spp.)，啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiaeHansen)，孢汉生酵母(Hanseniaspora spp.)，毕赤酵母(Pichia spp.)中的一种。
在本发明的步骤三中，所述发酵培养液包括所述红景天根粉酶解液、氮源、碳源、无机盐以及水，其中，所述红景天根粉酶解液占所述发酵培养液体积的10-40％，优选为20-35％，所述氮源与发酵培养液的质量体积比为(1-3kg)：100L，优选为(1.5-2.5kg)：100L，所述碳源与发酵培养液的质量体积比为(1-3kg)：100L，优选为(1.5-2.5kg)：100L，所述无机盐与发酵培养液的质量体积比为(0.1-0.5kg)：100L，优选为(0.2-0.3kg)：100L。
在本发明的步骤三中，所述氮源为微生物培养常用氮源，如蛋白胨、酵母粉、大豆肽粉、牛肉膏；所述碳源选自蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、甘露醇、甘油、半乳糖或麦芽糖醇中的一种；所述无机盐优选自K2HPO4，KH2PO4，MgSO4，MnSO4和CaCl2中的至少一种。
在本发明的步骤三中，发酵温度为22℃-28℃；发酵时间为20-40h。
所述发酵的终点是通过测定残余葡萄糖的含量来确定，当培养液中无残留葡萄糖时为发酵终点。所述残余葡萄糖含量测定可采用常用的化学法所如DNS法、斐林试剂法、间接碘量法或者旋光法等，或使用SBA-40D型生物传感分析仪进行检测。
在本发明的步骤四中，所述除杂质、除菌为发酵液经离心、取上清液，再经过1.2μm的精细过滤纸板、0.22μm.聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到所述红景天发酵提取液。
本发明还提供一种通过所述红景天发酵提取液的制备方法获得的红景天发酵提取液。
本发明还提供一种红景天发酵提取液在化妆品中可作为抗氧化、美白、抗炎、透明质酸酶抑制剂成分的应用。
本发明还提供一种化妆品，包含红景天或红景天发酵提取液，所述化妆品具有抗氧化、美白或抗炎的作用。
本发明还提供一种透明质酸酶抑制剂，其包括红景天或红景天发酵提取液，所述透明质酸酶抑制剂中还包括其他配料，所述红景天或所述红景天发酵提取液为活性物质。
本发明提供一种抗炎药物，其包括红景天或红景天发酵提取液。所述抗炎药物中还包括其他辅料，所述红景天或所述红景天发酵提取液为活性物质。
本发明提供一种红景天在化妆品中的应用，所述红景天在化妆品中作为抗氧化、美白、抗炎、透明质酸酶抑制剂的成分。此处的红景天为红景天根粉或红景天根粉酶解液(即所述红景天根经过物理处理)。
本发明提供一种红景天或红景天发酵提取液用于抑制透明质酸酶的用途。
本发明提供一种红景天或红景天发酵提取液在制备用于抗炎药物中的用途。
本发明的以下实施例仅用来说明实现本发明的具体实施方式，这些实施方式不能理解为是对本发明的限制。其他的任何在未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均视为等效的置换方式，落在本发明的保护范围之内。
实施例
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊要求，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
称取1万-5万U/g的纤维素酶和5万-10万U/g的果胶酶分别用去离子水配制成酶液，活力均为5万U/mL，混合后供实施例与对比例中使用。纤维素酶和果胶酶均为市购。
本发明中所述纤维素酶的酶活为：1U/g是指每克纤维素酶所具有的酶活力。U定义为在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位(IU，又称U)。
本发明中所述果胶酶的酶活为：1U/g是指每克果胶酶所具有的酶活力。U定义为在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位(IU，又称U)。
酿酒酵母种子液的制备
从试管挑取酿酒酵母菌种接种于500mL含有葡萄糖2-5％wt、蛋白胨1-2％wt、酵母粉0.5-1％wt的无菌种子培养液中，25℃下静置培养13h后，至对数生长期，再次接种扩培到5L种子培养基中，二次培养10h后至对数期。
实施例1
取1.1kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过60目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1kg，混匀于50L饮用水中，调pH为3.0，添加纤维素酶10mL，40℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，3h后不再变化，调pH为2.5，添加果胶酶100mL，60℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，1.0h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，然后再添加3.75kg麦芽糖醇、1.25kg蛋白胨，0.125kg K2HPO4，补充自来水至125L充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入125ml酿酒酵母种子液，25℃培养35h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S1。
实施例2
取1.4kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过100目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1kg，混匀于50L饮用水中，调pH为6.0，添加纤维素酶100mL，60℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，1h后不再变化，调pH为4.5，添加果胶酶10mL，40℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，3.0h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加15kg甘油、15kg小麦蛋白胨，0.5kg CaCl2，补充自来水至500L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入500ml酿酒酵母种子液，25℃培养40h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S2。
实施例3
取1.1kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过60目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1kg，混匀于50L饮用水中，调pH为3.5，添加纤维素酶15mL，40℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，3h后不再变化，调pH为4.5，添加果胶酶15mL，42℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，3.0h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加3.5kg葡萄糖、3.5kg蛋白胨，1.75kg K2HPO4，补充自来水至350L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入2.8L酿酒酵母种子液，25℃培养20h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S3。
实施例4
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，调pH为4.5，添加纤维素酶40mL，55℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h后不再变化，调pH为3.5，添加果胶酶44mL，50℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.0h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加3kg葡萄糖、4kg蛋白胨，0.4kg K2HPO4，补充自来水至200L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入1L酿酒酵母种子液，25℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S4。
实施例5
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，调pH为4.0，添加纤维素酶50mL，50℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.0h后不再变化，调pH为3.0，添加果胶酶60mL，55℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h后不再变化，然后升温至90℃，保持20min进行灭酶，再添加5kg蔗糖、3kg大豆肽粉，0.6kg KH2PO4，补充自来水至180L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至22℃时，接入1.08L酿酒酵母种子液，22℃培养40h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S5。
实施例6
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，调pH为5.0，添加纤维素酶60mL，45℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h后不再变化，调pH为4.0，添加果胶酶60mL，45℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加3kg果糖、5kg酵母粉，0.5kg MnSO4，补充自来水至170L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至26℃时，接入850ml酿酒酵母种子液，26℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S6。
实施例7
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1kg，混匀于50L饮用水中，调pH为5.0，添加纤维素酶80mL，55℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，1.5h后不再变化，调pH为3.5，添加果胶酶80mL，55℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，1.5h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加3.5kg乳糖、3kg蛋白胨，0.4kg MgSO4，补充自来水至200L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入1.4L酿酒酵母种子液，25℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S7。
实施例8
取1.1kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过70目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1kg，混匀于50L饮用水中，调pH为4.5，添加纤维素酶23mL，50℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h后不再变化，调pH为2.5，添加果胶酶50mL，60℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，1.5h后不再变化，然后升温至90℃，保持20min进行灭酶，再添加12.5kg麦芽糖醇、5kg蛋白胨，0.5kgKH2PO4，补充自来水至300L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至28℃时，接入1.5L％酿酒酵母种子液，28℃培养35h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S8。
实施例9
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1kg，混匀于130L饮用水中，调pH为3.0，添加纤维素酶50mL，55℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h后不再变化，调pH为3.5，添加果胶酶25mL，60℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，1.5h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加4kg甘露醇、2kg大豆蛋白胨，0.3kg MgSO4，补充自来水至350L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入2.8L酿酒酵母种子液，25℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S9。
实施例10
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，调pH为4.5，添加纤维素酶10mL，50℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2h后不再变化，调pH为4.5，添加果胶酶30mL，60℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，1.5h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加3kg葡萄糖、2kg酵母粉，0.4kg K2HPO4，补充自来水至400L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入2.4L酿酒酵母种子液，25℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S10。
实施例11
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，调pH为3.5，添加果胶酶40mL，50℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.0h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加3kg葡萄糖、4kg蛋白胨，0.4kg K2HPO4，补充自来水至200L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入1L酿酒酵母种子液，25℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S11。
实施例12
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，调pH为4.5，添加纤维素酶40mL，55℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加3kg葡萄糖、4kg蛋白胨，0.4kg K2HPO4，补充自来水至200L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入1L酿酒酵母种子液，25℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S12。
实施例13
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，调pH为3.5，添加果胶酶44mL，50℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.0h后不再变化，调pH为4.5，添加纤维素酶40mL，55℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加3kg葡萄糖、4kg蛋白胨，0.4kg K2HPO4，补充自来水至200L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入1L酿酒酵母种子液，25℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S13。
实施例14
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，调pH为4.5，添加纤维素酶40mL，果胶酶44ml，55℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加3kg葡萄糖、4kg蛋白胨，0.4kg K2HPO4，补充自来水至200L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入1L酿酒酵母种子液，25℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液S14。
对比例1
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，调pH为4.5，添加纤维素酶40mL，55℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h后不再变化，调pH为3.5，添加果胶酶44mL，50℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.0h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，补充自来水至200L，充分混匀灭菌，冷却至25℃时再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天酶解液C1。
对比例2
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，100℃加热1h，再添加3kg葡萄糖、4kg蛋白胨，0.4kgK2HPO4，补充自来水至200L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入1L酿酒酵母种子液，25℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液C2。
对比例3
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，40℃超声1h，再添加3kg葡萄糖、4kg蛋白胨，0.4kgK2HPO4，补充自来水至200L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入1L酿酒酵母种子液，25℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液C3。
对比例4
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，调pH为6.5，添加纤维素酶5mL，35℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，3.5h后不再变化，调pH为5.0，添加果胶酶5mL，35℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，4.5h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加1kg葡萄糖、1kg蛋白胨，0.1kg K2HPO4，补充自来水至200L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入2.4L酿酒酵母种子液，25℃培养20h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液C4。
对比例5
取1.2kg干的大花红景天根作为原料，经碾磨式粉碎机充分粉碎后，再过80目筛，筛下红景天根粉备用。称量筛下红景天根粉约1.0kg，混匀于50L饮用水中，调pH为4.5，添加纤维素酶4mL，55℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，2.5h后不再变化，调pH为5.5，添加果胶酶50mL，35℃保温，每隔0.5h测葡萄糖含量变化，4.0h后不再变化，然后升温至100℃，保持10min进行灭酶，再添加3kg葡萄糖、2kg蛋白胨，0.1kg K2HPO4，补充自来水至200L，充分混匀后作为发酵培养液，灭菌后冷却至25℃时，接入1L酿酒酵母种子液，25℃培养30h，无残糖后，结束发酵。8000rpm离心除去杂质，再经过1.2μm精细过滤纸板、0.22μm聚醚砜滤芯过滤除菌即可得到红景天发酵提取液C5。
表1为各实施例以及对比例的参数对比
Figure BDA0002296194530000161
Figure BDA0002296194530000171
试验例
一、理化性质的测试
1、红景天苷含量
以实施例1-实施例14以及对比例1-对比例5中制备的红景天发酵提取液为实验样品，采用高效液相色谱进行红景天苷含量测定，HPLC条件：色谱柱：MCI GEL CK08EH(8×300mm，5μm)，柱温：40℃；流动相：1％磷酸溶液，流速：0.6mL/min，检测波长：210nm；进样量：20μL；色谱图如图1-图3所示，其中，图1为标准品(红景天苷含量浓度为100mg/L)的色谱图，图2为实施例5的色谱图，图3为对比例1的色谱图；表2所示的是S1-S14以及C1-C5中红景天苷的含量。
Figure BDA0002296194530000172
表2各实施例以及对比例中红景天提取液中红景天苷含量比较
Figure BDA0002296194530000173
由表2中数据可以看出，发酵后红景天苷含量有所增多，发酵提取法能使红景天中的活性成分释放更彻底。
2、总黄酮含量
2.1标准曲线制备
精密称取120℃干燥恒重的芦丁标准品10mg，加无水乙醇溶解，定容至50mL量瓶中，摇匀，制成浓度为0.2mg·mL-1的标准品溶液。分别取标准品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于50mL量瓶中，加95％乙醇至总体积为15mL，依次加入100g/L硝酸铝溶液1.0mL、9.8g/L醋酸钾溶液1.0mL，摇匀，加水至刻度，摇匀，静置1h，以30％乙醇溶液为空白，进行全波长扫描，在410nm处均有最大吸收。
2.2样品含量测定
精密吸取供试品溶液(此处的供试品溶液是实施例1-14以及对比例1-对比例5制备得到的红景天发酵提取液)1.0mL，置50mL量瓶中，按“标准曲线制备”相同的方法显色测定。通过标准曲线，计算出实施例1-实施例14以及对比例1-对比例5中红景天发酵提取液中总黄酮含量，结果见表3。
表3发酵前后提取液中总黄酮含量比较
Figure BDA0002296194530000181
由表3中数据可以看出，发酵后总黄酮含量有所增多，发酵提取法能使红景天中的活性成分释放更彻底。
二、抗氧化、美白及抗炎效果评价
本实施例旨在对实施例4-实施例6以及对比例1-对比例5制得的红景天发酵提取液进行抗氧化、美白效果评价。
1.抗氧化活性
1.1 DPPH自由基清除试验
样品溶液的配制：以纯化水作为稀释液，将实施例4-6中的样品S4-S6及对比例中的样品C1-C5配制成体积浓度为0.1％、0.25％、0.5％及1％的溶液。
分别精密量取DPPH溶液5.0mL和不同浓度样品溶液5.0mL置具塞试管中，混匀。以等体积的水与95％乙醇混合溶液为空白对照。室温放置30分钟，于523nm处分别测定溶液吸光度值。另设一组分别精密量取DPPH溶液5.0mL和纯化水5.0mL混合，操作同上。计算方法如下：
Figure BDA0002296194530000191
表4清除DPPH自由基活性
结果如表4所示，由表中数据可知，在添加红景天发酵提取液的浓度在0.1％-1％的梯度下，实施例4-6以及对比例1-5中红景天发酵提取液中的清除自由基的能力越来越强，而且实施例5制备的红景天发酵提取液在浓度为1％时可达85.2％，有较好的抗氧化性。
1.2活性氧自由基清除试验
样品溶液的配制：以无血清DMEM培养液作为稀释液，分别将实施例4-6中的样品S4-S6及对比例中的样品C1-C5配制成体积浓度为1％的溶液，0.22μm滤膜过滤除菌。
二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)探针溶液的配制：按0.375uL DCFH-DA:1mLPBS比例稀释。
取处于对数生长期的HaCaT细胞，以5×104个/mL密度接种于12孔培养板，每孔2mL细胞悬液，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养24h。照射组弃去1mL培养液，盖保鲜膜，UVA用2000μW/cm2的强度照射2-3h，UVB用700h射保鲜膜的强度照射7min。照射后弃去旧培养液，实验组加入样品溶液，对照组加入无血清培养液，每孔均为2mL，继续培养16h后，弃去全部培养液，用PBS洗两遍。每孔加入1.5mL DCFH-DA溶液，放入细胞培养箱中继续孵育30min，每隔5min混匀一次使探针充分结合。弃去探针，用预热的无血清培养液洗两遍，每孔加入1ml无血清培养液37℃孵育10min。PBS洗一遍后，胰酶消化细胞，PBS洗两遍，300μL PBS重悬，用流式细胞仪双通道检测(上机前细胞需要过滤)，FL1-H通道，每个样品收集10000个细胞。
根据1通道(FL1-H)获取的信号数据，即DCF产生的荧光强度或荧光总量计算ROS清除率。
用平均荧光强度(GMEAN)计算ROS清除率：
统计学分析采用SPSS 19.0软件，进行配对t检验。
表5发酵前后提取液对活性氧自由基(ROS)生成的影响
Figure BDA0002296194530000202
结果如表5所示，与正常培养的细胞相比，经过UVA+UVB照射损伤，细胞内的ROS水平显著增加，实施例4-实施例6以及对比例1-对比例5中红景天提取液均对产生的ROS有一定的清除效果，而且实施例4-实施例6中的红景天发酵提取液比对比例1-对比例5效果明显提高。
2美白
样品溶液的配制：以含血清完全培养液作为稀释液，分别将实施例4-6中的样品S4-S6及对比例中的样品C1-C5配制成体积浓度为1％的溶液，0.22μm滤膜过滤除菌。
取处于对数生长期的B16小鼠黑色素瘤细胞，以2×104个/mL密度接种于96孔细胞培养板，每孔100μL细胞悬液，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2常规培养过夜。弃去旧培养液，实验组加入体积浓度为1％的样品，正常对照组加入等量的含血清细胞培养液，继续培养24h后，采用WST-1法检测细胞相对增殖率。相对增殖率(RGR)为样品组吸光度与正常对照组吸光度的比值。
取对数生长期B16细胞，以2×104个/mL密度接种于6孔培养板，每孔3mL，置二氧化碳培养箱37℃、5％CO2培养24h，弃去旧培养液，正常对照组和模型组加入3mL含血清培养液，实验组加入3mL样品溶液，模型组和实验组每孔再加入60μL毛喉素溶液(2mM)，以刺激黑色素的产生，继续培养72h。
细胞内黑色素含量的测定方法如下：胰酶消化，离心去上清，加入1mol/L(含10％DMSO)的NaOH溶液500uL裂解细胞，80℃加热30min后，3000rpm离心10min，取上清加入96孔板，100uL/孔，测定450nm吸光度，从而获得黑色素总量，以模型组黑色素含量为100％，获得实验组黑色素含量的相对值及抑制率，计算方法如下。
Figure BDA0002296194530000211
表6红景天发酵提取物对黑色素含量的影响
Figure BDA0002296194530000212
结果如表6所示，实施例4-实施例6以及对比例1-对比例5中红景天发酵提取液体积浓度在1％时，对B16细胞的增殖和黑色素的分泌均表现出一定程度的抑制，而且，实施例4-实施例6中红景天发酵提取液的美白作用更加明显。
3、抗炎
样品溶液的配制：以LPS(sigma，025M4040V，1万单位/mL)作为稀释液，分别将实施例4-6中的样品S4-S6及对比例中的样品C1-C5配制成体积浓度为1％的溶液，0.22μm滤膜过滤除菌。
正常对照组：将Raw264.7细胞以5×104/ml接种于24孔板，在37℃、5％CO2条件下培养24h，加入无血清培养基，继续培养24h，用ELISA试剂盒检测炎性因子。
模型组：将Raw264.7细胞以5×104/ml接种于24孔板，在37℃、5％CO2条件下培养24h，加入与正常对照组无血清培养基等体积的LPS(sigma，025M4040V，1万单位/mL)，继续培养24h，用ELISA试剂盒检测炎性因子。
实验组：将Raw264.7细胞以5×104/ml接种于24孔板，在37℃、5％CO2条件下培养24h，加入与正常对照组无血清培养基等体积的样品溶液，继续培养24h，用ELISA试剂盒检测炎性因子。
在LPS的刺激下，小鼠巨噬细胞的IL-1，这两种促炎性因子的分泌量有所增加，经过样品溶液处理之后，与未经样品处理的LPS模型组相比，IL-1比的分泌量显著降低，说明红景天发酵提取液对IL-1酵具有明显的抑制作用，而且实施例4-实施例6中红景天发酵提取液的抗炎作用更加明显，如表7所示。抑制率计算方法如下：
Figure BDA0002296194530000221
表7红景天发酵提取物对IL-1酵的抑制作用
三、红景天发酵提取液对透明质酸酶的抑制作用
1、磷酸盐缓冲液的配制
称取Na2HPO4·12H2O 8.81g，NaH2PO4·2H2O 27.37g，采用少量纯化水溶解，完全溶解后转移至1000ml容量瓶中定容。配制为0.2M，pH 6.0磷酸盐缓冲液(PBS)。
采用移液管取25ml的0.2M，pH 6.0的磷酸盐缓冲液放于1000ml容量瓶中，采用纯化水定容，配制为5mM，pH 6.0的PBS，放于4℃冰箱中。
2、透明质酸钠底物溶液配制
实验组：精确称取1.0g(除水分)的透明质酸钠(Mr 1300KDa～1800KDa左右，pH6.0-8.0)，放入500ml的容量瓶中，分别加入2.5mL、5mL、7.5mL、10mL的实施例5以及对比例1制备的样品S5及C1，然后采用5mM，pH 6.0的磷酸盐缓冲液定容，配制含不同浓度的实施例5以及对比例1中样品的2mg/ml的透明质酸钠溶液，颠倒溶解，放于4℃冰箱中备用，一般保质期限3天，一旦发现溶液浑浊弃用。
对照组与实验组的不同之处在于不加红景天发酵提取物，其它操作与实验组均相同。
3、测定
取20ml具塞试管放置于试管架上，置于冰水中(冷水中放置冰袋)，吸取9.9ml透明质酸钠底物溶液加入到具塞试管中，将加入0.1ml透明质酸酶稀释液，混匀后，将具塞试管置于42℃恒温水浴，反应30min后，经沸水浴作用2min终止反应。每个酶液稀释液做3个平行，对照在加入酶液稀释液混匀后，立即沸水煮沸2min备用。待冷却后，以对照调零，在232nm波长下测定紫外吸收。
由供试品溶液测得的吸光度，按下式计算：
每1ml的单位＝A232×稀释倍数×10
算出3份供试品的平均数，即为供试品透明质酸酶的效价单位。
表8不同浓度红景天发酵提取液对HAase的抑制率
样品 样品浓度(％) 酶活(U/mL) 对HAase抑制率(％)
对照组 - 71.93 -
对比例1 0.5 66.45 7.62
实施例5 0.5 60.86 15.39
实施例5 1 54.62 24.06
实施例5 1.5 47.36 34.16
实施例5 2 40.57 43.53
结果如表8所示，从结果可以看出，实施例5中的红景天发酵提取液对透明质酸酶的抑制作用明显提高，且这种抑制作用与浓度成正比。

Claims (10)

1.一种红景天发酵提取液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
取红景天根经烘干、粉碎，过筛得红景天根粉；
将所述红景天根粉加水混匀，然后加入酶进行酶解，酶解至终点，然后升温灭酶以结束酶解反应，得红景天根粉酶解液；
将酵母菌种子液接种到具有所述红景天根粉酶解液的发酵培养液中，进行发酵，发酵结束后，获得发酵液；
将所述发酵液除杂质、除菌从而获得所述红景天发酵提取液。
2.根据权利要求1所述的红景天发酵提取液的制备方法，其特征在于，所述红景天根粉的粒度为60-100目，优选70-80目；
所述红景天根粉与水的质量体积比为(0.5g-3g)：100ml，优选为(1g-2g):100ml。
3.根据权利要求1所述的红景天发酵提取液的制备方法，其特征在于，所述酶为纤维素酶和果胶酶，
在进行酶解时，先向红景天根粉水溶液中加入纤维素酶进行第一步酶解，然后再向红景天根粉水溶液中添加果胶酶进行第二步酶解。
4.根据权利要求3所述的红景天发酵提取液的制备方法，其特征在于，
在第一步酶解中，添加的所述纤维素酶的酶活与所述红景天根粉质量的比值为(50万U-500万U)：1kg，优选为(200万U-400万U)：1kg；
在第二步酶解中，添加的所述果胶酶的酶活与所述红景天根粉质量的比值为(50万U-500万U)：1kg；优选为(200万U-400万U)：1kg。
5.根据权利要求3所述的红景天发酵提取液的制备方法，其特征在于，在进行酶解时，先将红景天根粉水溶液的pH调节至3.0-6.0，再向红景天根粉水溶液中加入纤维素酶，pH优选为4.0-5.0，温度控制在40-60℃进行第一步酶解，第一步酶解进行时间为1-3h，优选为1.5-2.5h，然后将红景天根粉水溶液的pH调节至2.5-4.5，再向红景天根粉水溶液中添加果胶酶，pH优选为3.0-4.0，温度控制在40-60℃，优选45-55℃，进行第二步酶解，第二步酶解进行时间为1-3h，优选为1.5-2.5h。
6.根据权利要求1所述的红景天发酵提取液的制备方法，其特征在于，进行灭酶的温度为90-100℃，灭酶时间为10-20min。
7.根据权利要求1所述的红景天发酵提取液的制备方法，其特征在于，所述酵母菌种子液的接种量与所述培养液的体积比为(0.1-1)：100，优选为(0.5-0.7):100。
8.根据权利要求1所述的红景天发酵提取液的制备方法，其特征在于，所述发酵培养液包括所述红景天根粉酶解液、氮源、碳源、无机盐以及水，其中，所述红景天根粉酶解液占所述发酵培养液体积的10-40％，优选为20-35％。
9.根据权利要求8所述的红景天发酵提取液的制备方法，其特征在于，所述氮源与发酵培养液的质量体积比为(1kg-3kg)：100L，优选为(1.5kg-2.5kg)：100L，所述碳源与发酵培养液的质量体积比为(1kg-3kg)：100L，优选为(1.5kg-2.5kg)：100L，所述无机盐与发酵培养液的质量体积比为(0.1kg-0.5kg)：100L，优选为(0.2kg-0.3kg)：100L。
10.根据权利要求8所述的红景天发酵提取液的制备方法，其特征在于，所述氮源为微生物培养常用氮源；所述碳源选自蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖、甘露醇、甘油、半乳糖或麦芽糖醇中的一种；所述无机盐优选自K2HPO4，KH2PO4，MgSO4，MnSO4和CaCl2中的至少一种。
CN201911202427.9A 2019-11-29 2019-11-29 一种红景天发酵提取液的制备方法及应用 Active CN110772460B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911202427.9A CN110772460B (zh) 2019-11-29 2019-11-29 一种红景天发酵提取液的制备方法及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911202427.9A CN110772460B (zh) 2019-11-29 2019-11-29 一种红景天发酵提取液的制备方法及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110772460A true CN110772460A (zh) 2020-02-11
CN110772460B CN110772460B (zh) 2022-07-12

Family

ID=69393640

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911202427.9A Active CN110772460B (zh) 2019-11-29 2019-11-29 一种红景天发酵提取液的制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110772460B (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111602813A (zh) * 2020-05-27 2020-09-01 华熙生物科技股份有限公司 一种保健食品用葵花盘发酵原液的制备方法及其产品
CN112076139A (zh) * 2020-09-11 2020-12-15 山东华熙海御生物医药有限公司 一种黑麦发酵产物及其制备方法和应用
CN112754960A (zh) * 2021-02-03 2021-05-07 现代百朗德生物科技(江苏)有限公司 一种含有酵母菌和红景天发酵产物提取物的化妆品、制备方法及其应用
CN113897406A (zh) * 2021-09-29 2022-01-07 山东恒鲁生物科技有限公司 一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法
CN114099378A (zh) * 2021-09-09 2022-03-01 成都师范学院 一种天然抗氧化祛斑淡斑护肤液的制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002020301A (ja) * 2000-06-29 2002-01-23 Nagaoka Koryo Kk 活性酸素消去剤、皮膚保全剤および消臭剤
CN101313913A (zh) * 2008-01-29 2008-12-03 杏辉天力（杭州）药业有限公司 透明质酸酶抑制剂
CN104257545A (zh) * 2014-09-18 2015-01-07 北京工商大学 一种红景天发酵原浆化妆品及其制备方法
CN105861600A (zh) * 2016-04-13 2016-08-17 河南省商业科学研究所有限责任公司 一种有效促进睡眠、提高免疫力的红景天提取物的制备方法
CN106214846A (zh) * 2016-08-29 2016-12-14 蒋伟哲 养肝调脂的辣木制剂及其制备方法与应用
CN106265846A (zh) * 2016-09-18 2017-01-04 天津北洋百川生物技术有限公司 一种提高红景天抗氧化能力的发酵方法
CN107058431A (zh) * 2017-05-09 2017-08-18 王智森 一种红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002020301A (ja) * 2000-06-29 2002-01-23 Nagaoka Koryo Kk 活性酸素消去剤、皮膚保全剤および消臭剤
CN101313913A (zh) * 2008-01-29 2008-12-03 杏辉天力（杭州）药业有限公司 透明质酸酶抑制剂
CN104257545A (zh) * 2014-09-18 2015-01-07 北京工商大学 一种红景天发酵原浆化妆品及其制备方法
CN105861600A (zh) * 2016-04-13 2016-08-17 河南省商业科学研究所有限责任公司 一种有效促进睡眠、提高免疫力的红景天提取物的制备方法
CN106214846A (zh) * 2016-08-29 2016-12-14 蒋伟哲 养肝调脂的辣木制剂及其制备方法与应用
CN106265846A (zh) * 2016-09-18 2017-01-04 天津北洋百川生物技术有限公司 一种提高红景天抗氧化能力的发酵方法
CN107058431A (zh) * 2017-05-09 2017-08-18 王智森 一种红景天液体深层发酵生产红景天苷的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘吉华: "《中药生物技术》", 31 October 2015, 中国医药科技出版社 *
戴玥等: "抗氧化菌的筛选及混菌发酵红景天条件优化", 《日用化学工业》 *
潘立东: "发酵红景天抗氧化活性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
王建新等: "《化妆品植物原料大全》", 30 June 2012, 中国纺织出版社 *
罗达尚: "《晶珠本草正本诠释》", 31 January 2018, 四川科学技术出版社 *
韩丽: "《实用中药制剂新技术》", 30 November 2002, 化学工业出版社 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111602813A (zh) * 2020-05-27 2020-09-01 华熙生物科技股份有限公司 一种保健食品用葵花盘发酵原液的制备方法及其产品
CN111602813B (zh) * 2020-05-27 2022-11-15 华熙生物科技股份有限公司 一种保健食品用葵花盘发酵原液的制备方法及其产品
CN112076139A (zh) * 2020-09-11 2020-12-15 山东华熙海御生物医药有限公司 一种黑麦发酵产物及其制备方法和应用
CN112076139B (zh) * 2020-09-11 2022-07-26 山东华熙海御生物医药有限公司 一种黑麦发酵产物及其制备方法和应用
CN112754960A (zh) * 2021-02-03 2021-05-07 现代百朗德生物科技(江苏)有限公司 一种含有酵母菌和红景天发酵产物提取物的化妆品、制备方法及其应用
CN114099378A (zh) * 2021-09-09 2022-03-01 成都师范学院 一种天然抗氧化祛斑淡斑护肤液的制备方法
CN113897406A (zh) * 2021-09-29 2022-01-07 山东恒鲁生物科技有限公司 一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法
CN113897406B (zh) * 2021-09-29 2024-06-04 山东恒鲁生物科技有限公司 一种从红景天粉末中提取并纯化红景天苷的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110772460B (zh) 2022-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110772460B (zh) 一种红景天发酵提取液的制备方法及应用
CN106173613B (zh) 一种利用益生菌发酵制备果蔬或谷物或药食同源酵素保健食品的方法
CN108324633B (zh) 一种化妆品用糙米发酵原液的制备方法及其产品
CN106070779A (zh) 一种虫草菌丝发酵茶及其加工方法
CN104522455A (zh) 一种雪莲培养物蜂蜜膏及其制备方法
CN108042436B (zh) 蓝铜胜肽抗衰保湿精华霜
KR20200054864A (ko) 증진된 항당뇨 및 항비만 활성을 갖는 파바톤 콩잎과 오미자 복합발효 조성물 및 그 제조방법
CN113893310A (zh) 一种高山植物发酵组合物及其制备方法和应用
CN113402626A (zh) 一种香水莲花多糖提取物及其制备方法和应用
CN116463183B (zh) 融入杏鲍菇的苦荞养生酒及其制备方法
CN113730318B (zh) 一种含铁皮石斛-皂角酵素液的洗发液及其制备方法
CN109673792A (zh) 苦荞发酵茶的制备方法
CN114259515A (zh) 一种具有抗糖化作用的组合物及应用
KR101761771B1 (ko) 닥나무 또는 그 추출물의 발효방법, 그 발효 추출물 및 이를 포함하는 화장료 조성물
KR102365480B1 (ko) 개미취(Aster tataricus) 발효추출물을 함유하는 음료 조성물의 제조방법
CN114586903A (zh) 一种蜂蜜果汁饮料及其制备方法
CN104584821B (zh) 一种含红景天苷的植物的栽培方法及应用
KR20130017431A (ko) 홍국균주를 이용한 감와인 유래의 항산화 기능성 식품 조성물
CN105188419B (zh) 制备圆叶葡萄果渣提取物的方法
CN107475122B (zh) 一种高产类胡萝卜素的迷力菌菌质培养方法及其产品制备
CN104719912A (zh) 一种生物活性较高的雪莲培养物蜂蜜膏及其制备方法
CN111686172A (zh) 一种从绿茶中提取茶多酚的工艺
CN104686886A (zh) 一种高效雪莲培养物蜂蜜膏及其制备方法
KR101724550B1 (ko) 발효된 패로부터 분리된 다당류를 유효성분으로 포함하는, 방사선 방호용 조성물
CN114317348B (zh) 一种植物乳杆菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230625

Address after: Tianchen Avenue, Ji'nan hi tech Development Zone of Shandong Province, No. 678 250101

Patentee after: BLOOMAGE BIOTECH Co.,Ltd.

Patentee after: Beijing Huaxi Rongxi Biotechnology Research Co.,Ltd.

Address before: Tianchen Avenue, Ji'nan hi tech Development Zone of Shandong Province, No. 678 250101

Patentee before: BLOOMAGE BIOTECH Co.,Ltd.

Patentee before: SHANDONG BLOOMAGE HYINC BIOPHARM Corp.,Ltd.