CN102961784B - 一种细菌纤维素/聚乙烯醇复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种细菌纤维素/聚乙烯醇复合材料及其制备方法和应用，包括如下步骤：（1）医用细菌纤维素湿膜块的制备；（2）高分子溶液的配制：在高温95~130℃，高压0.05~0.15MPa的条件下，配制质量浓度20~40%的聚乙烯醇水溶液，即为高分子溶液；（3）细菌纤维素湿膜块浸渍高分子溶液：（4）冻融交联，形成复合材料。本发明制备的PVA/BC复合系列材料，当PVA浓度达到20%时，压缩模量达到30MPa以上，尤其是PVA浓度达到28%时，压缩模量达到50MPa以上，可用于制备半月板或软骨组织的替换物，或制备半月板或软骨组织的修复制品，能满足软骨、半月板等承重型组织的力学强度需要。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料，制备了一种细菌纤维素/聚乙烯醇复合水凝胶材料，具有高含水量、高强度、高生物相容性、低摩擦系数、粘弹性、及可固定等特征，可用于软骨、半月板等承重组织的替换物。
背景技术
细菌纤维素（bacterial cellulose，BC）是一种用途非常广泛的生物材料，其典型生产菌种是Acetobacter xylinum木醋杆菌，其细胞的侧壁孔分泌直径1.78nm微纤丝，组成3~4nm直径的微纤丝束，再构成纤维丝带宽30~100nm，厚3~8nm，进而交织成多级纤维网络结构。
细菌纤维素作为医用材料在20世纪80年代就开始引起关注，经过多年来各个领域科研工作者的研究证实：细菌纤维素纯度高，含水量高，结晶度高，具有独特的粘弹性力学行为，力学性能优良（尤其是拉伸强度显著，柔韧度高）、生物相容性优异，其独特的纳米多级纤维网络结构在某种程度上模拟了细胞外基质中的胶原网络结构，不仅在力学性能上有重要作用，且对细胞有引导作用，免疫原性低于胶原，用于组织工程支架有独特的优势，被广泛地用于各类型临床医用材料的研究开发，主要研究热点有伤口敷料、组织工程支架、组织替代物以及药物缓释载体等。
将天然细菌纤维素用于半月板、关节软骨等承重组织替换物时，尽管其力学行为与天然的半月板、关节软骨等一致，但其力学强度还不能达到天然组织的水平，不能直接用于临床修复，需进一步改性提高其力学强度以满足对材料强度具有高要求的组织修复材料的需要。A.Bodin等发现未经修饰的细菌纤维素在载荷为2kMPa时，与猪半月板的杨氏模量在同一个水平，但是在高载荷下，细菌纤维素半月板的杨氏模量无法与天然半月板匹配。
细菌纤维素膜的力学性能优异，干膜BC的弹性模量可达5000MPa；A.Bodin等测得形变20%时的湿态BC压缩模量是3.5KPa；A.Svensson等测得湿态下0.3mm厚的BC的压缩模量大约10KPa，3mm厚的BC的压缩模量大约70KPa左右,0.3mm厚的BC拉伸的杨氏模量为10MPa左右。因此，细菌纤维素的力学强度干态远大于湿态，且试样的厚度也对力学结果有影响，另外其拉伸模量远高于压缩模量。
聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，PVA)是一种很有应用前景的生物医用高分子材料，化学性质稳定，通过物理交联可获得的凝胶，有良好的生物相容性，同自然关节软骨类似的力学行为，是一种优良的关节软骨修复材料，但其力学强度和摩擦性能需进一步提高。
聚乙烯醇由于聚合度、醇解度、醇解方式等不同，在溶解时间、温度上有一定的差异，因此其溶解方法和时间需要进行摸索。一般采用95℃左右水浴间接加热并同时搅拌来溶解，聚乙烯醇的水溶液浓度一般在12～14%以下；低醇解度聚乙烯醇树脂产品水溶液浓度一般可在20%左右。
聚乙烯基吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone，PVP)具有优良的溶解性、生物相容性、低毒性、成膜性，广泛地应用于医药、化妆品等领域中，诸如口服药物的缓释载体，口服或注射药物的稳定剂，注射药物的增溶剂和分散剂，以及外伤包扎带，人工玻璃体等。此外，由于PVP是一种高亲水的高分子材料，在医学中也常被用作润滑性涂层，与PVA复合可改善材料表面润滑性能。
BC作为半月板替代物的原材料，其力学行为与天然半月板一致，都属于粘弹性材料，缺陷是力学强度不足。但BC具有纳米纤维网络结构，可仿生细胞基质中的胶原等纤维性成分；同样亲水、生物安全性高、且交联方法简单安全的高分子聚合物PVA与PVP，可仿生细胞基质中的糖氨聚糖等空间填充物质。
将BC与高分子材料复合提高其力学强度，目前已有的BC/PVA复合材料，有三种制备方法：一是在培养基中添加低浓度PVA，进行原位合成，制得的BC/PVA复合材料在脱水后测拉伸强度低于纯BC，力学强度降低；二是Leonardo E.Millon等将BC悬浮液，与PVA溶液混匀后冻融交联，复合材料的弹性模量可达到7.5MPa；三是将BC湿膜直接浸入不同浓度的PVA溶液，渗透平衡后冻融交联，如万怡灶等制备了0.3mm厚度的BC/PVA复合膜，其BC含量12-27%，采用拉伸法测得的杨氏模量可达63Mpa，用于角膜。另有万同等用采用此法制备BC含量1~2%，PVA含量1~15%的复合材料，拉伸模量约为8MPa左右。根据现有资料，天然半月板的拉伸模量在10MPa以上，而关节软骨的拉伸模量5-50MPa。现有BC/PVA复合材料还不能满足临床实际应用。
发明内容
本发明的目的之一是克服现有技术存在的缺陷，提供一种BC/PVA复合材料的制备方法，即将BC湿膜直接浸泡于高浓度PVA溶液中，渗透平衡后进行冻融交联。
本发明的另一目的是提供上述制备所得的BC/PVA复合材料，其在湿态下的压缩模量大幅提高，可达60MPa左右。在此基础上，本发明制备了BC/PVA/PVP复合材料，进一步提高材料的力学强度，并降低材料的摩擦系数，同时结合MRI或者CT，及三维重建，光敏树脂固化成型技术，实现了个体化组织置换物的制备。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种细菌纤维素/聚乙烯醇复合材料的制备方法，包括如下步骤：
（1）医用细菌纤维素湿膜块的制备
接种木醋杆菌（Acetobacter xylinum）到种子培养液振荡培养，再接种到发酵培养基发酵培养，得到医用细菌纤维素膜，然后经纯化处理后，再采用脱水的方式制备细菌纤维素含量0.05~2%质量分数的细菌纤维素湿膜块；
（2）高分子溶液的配制
在高温95~130℃，高压0.05~0.15MPa的条件下，配制质量浓度20~40%的聚乙烯醇水溶液，静置过夜去除气泡，制得的溶液为高分子溶液Ⅰ；
或者在上述配制聚乙烯醇水溶液的过程中加入聚乙烯基吡咯烷酮，其中聚乙烯基吡咯烷酮的质量浓度0.5~15%，制得的溶液为高分子溶液Ⅱ；
或者在高分子溶液Ⅰ中还加入模拟体液，制得的溶液为高分子溶液Ⅲ；
（3）细菌纤维素湿膜块浸渍高分子溶液
将细菌纤维素湿膜块裁成所需尺寸，浸泡于所配制的高分子溶液Ⅰ或Ⅱ中1~10天，保温80~105℃；取出充分渗透平衡的复合膜块Ⅰ或Ⅱ，清除表面多余的溶液待用；
或者将上述复合膜块Ⅰ或Ⅱ部分浸泡于高分子溶液Ⅲ中，控制浸泡高度不超过2mm，浸泡4~72h，取出充分渗透平衡的复合膜块Ⅲⅰ或Ⅲii，清除表面多余的溶液待用；
（4）冻融交联
将步骤（3）制得的复合膜块Ⅰ、Ⅱ、Ⅲⅰ或Ⅲⅱ于-30~-20℃/15~25℃反复冻融，4~10次，物理交联形成复合材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲⅰ或Ⅲii。
优选地，步骤（1）所述振荡培养的条件为180rpm、培养16~18h；发酵培养的条件为接种量10%（质量份数），静置培养3~20d。
优选地，步骤（1）所述医用细菌纤维素膜的纯化处理：
将步骤（1）制得的细菌纤维素膜，用自来水冲洗去除培养基，然后用去离子水浸泡至水无色透明，然后用0.1%~3%质量分数的十二烷基磺酸钠溶液浸泡2~4次，每12~24h更换十二烷基磺酸钠溶液一次；0.05M~1M氢氧化钠溶液浸泡2~4次，每12~24h更换一次氢氧化钠溶液，超声波60min，超纯水浸泡2~6次，每12~24h更换超纯水一次。
优选地，所述聚乙烯基吡咯烷酮分子量8000~200000，聚乙烯醇分子量85000~186000。
优选地，步骤（4）得到的复合材料Ⅰ或Ⅱ部分浸泡于模拟体液中，控制浸泡高度不超过2mm，浸泡4~72h。
优选地，所述高分子溶液Ⅰ中聚乙烯醇的质量浓度为28~40%。
上述方法制备的复合材料，其压缩模量为30MPa以上。优选地，该材料的压缩模量为50~60MPa。
上述复合材料用于制备半月板或软骨组织的替换物，或制备半月板或软骨组织的修复制品。
优选地，所述半月板替换物或修复制品的制备：电子计算机X射线断层扫描技术或者核磁共振成像扫描半月板得到其断层扫描图片，使用Mimics14.0软件进行三维重建，并在Magics10.11软件中基于重建后的外轮廓设计模板，采用光敏树脂光固化成型，制得半月板模具，将步骤（3）制得的复合膜块Ⅰ或Ⅱ压入上述模具，按照步骤（4）进行冻融交联，以制备半月板替换物或修复制品。
优选地，所述软骨替换或修复制品的制备：电子计算机X射线断层扫描技术或者核磁共振成像扫描软骨得到其断层扫描图片，使用Mimics14.0软件进行三维重建，并在Magics10.11软件中基于重建后的外轮廓设计模板，采用光敏树脂光固化成型，制得软骨模具，将步骤（3）制得的复合膜块Ⅰ、Ⅱ、Ⅲⅰ或Ⅲⅱ压入上述模具，按照步骤（4）进行冻融交联，以制备成复合材料Ⅰ或Ⅱ，或软骨替换物或修复制品Ⅲⅰ或Ⅲii，所述复合材料Ⅰ或Ⅱ部分浸泡于模拟体液中，控制浸泡高度不超过2mm，浸泡4~72h，制备成软骨替换物或修复制品Ⅰ或Ⅱ。
本发明与现有技术相比具有如下优点：
1、优化天然细菌纤维素的纯化处理步骤，进一步去除杂质提高细胞相容性，细胞毒性实验结果见图1。
2、制备不同质量含量的细菌纤维素湿膜块，同时保证最大程度上其晶体结构不破坏，结晶度不降低，XRD结果见图2。
3、制备高浓度PVA（醇解度99%以上）溶液，由于高浓度PVA溶液粘度极高，通常的95℃加热搅拌法无法制备浓度在20%以上的PVA溶液，本发明通过高温高压法，制备高浓度PVA溶液，其浓度可达40%。
4、通过反复冻融交联制备高含量PVA的PVA/BC复合水凝胶（电镜照片见图3），PVA与BC复合，可极大提高BC的力学强度，其中PVA含量越高，复合材料的力学强度越高，本发明制备的PVA/BC复合系列材料，当PVA浓度达到20%时，压缩模量达到30MPa以上，尤其是PVA浓度达到28%时，压缩模量达到50MPa以上，（实验结果见图4），可满足软骨、半月板等承重型组织的力学强度需要。
5、PVA/BC复合材料降低了BC的亲水性，有利于细胞粘附，提高粘附性细胞的增殖能力（细胞实验见图5）。
6、在PVA/BC复合材料中增加PVP复合，除了可进一步提高复合材料的力学强度外，可降低复合材料的摩擦系数。
7、联合MRI（Magnetic Resonance Imaging，MRI）或CT技术(electroniccomputer X-ray tomography technique，CT)、三维重建技术，及光敏树脂光固化成型技术，制造个体化的半月板模具。
8、采用个体化的半月板模具，制备个体化BC/PVA/PVP半月板替换物，结果见图6，使其在临床应用中不仅在力学性能上接近天然组织，外形上也最大限度的与天然组织匹配。
9、采用模拟体液对复合水凝胶进行可控部分矿化，形成层渐的BC/PVA/PVP/HA结构，从而满足修复复合材料与软骨下骨层的牢固结合。
附图说明
图1为实施例1中BC改良纯化法提高材料细胞相容性的效果图。
图2为实施例1中低温脱水法对BC结晶度影响的XRD图。
图3为实施例1条件下，不同PVA浓度制得的PVA/BC复合材料的SEM照片（A：BC；B：5%PVA；C：1%PVA/BC；D：20%PVA/BC；E：30%PVA/BC；F：40%PVA/BC）。
图4为实施例1条件下，不同PVA浓度制得的PVA/BC复合材料的压缩模量结果图，PVA/BC复合材料的压缩模量与PVA在复合材料中的含量基本正相关，随着PVA的实际含量增加而增加。
图5为实施例1制得的PVA/BC复合材料的细胞相容性结果图。
图6为实施例7制得的PVA/BC复合材料的个体化半月板替换物图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
实施例1
一种BC/PVA复合材料的制备方法，具体步骤如下：
1医用细菌纤维素膜制备
培养基成分：酵母粉：10g，蛋白胨：6g，MgSO4：0.2g，CaCl2：0.1g，葡萄糖：20g，椰汁1000ml，灭菌后加入10ml无水乙醇。
培养方法：接种木醋杆菌到种子培养液，180rpm震荡培养18h后，以10%的比例接种发酵培养基，静置培养20d。
2医用天然细菌纤维素产品的纯化处理
发酵所得的细菌纤维素膜，用自来水冲洗去除培养基，然后用去离子水浸泡至水无色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更换SDS液一次；0.1M氢氧化钠溶液浸泡4次，每12更换一次氢氧化钠溶液，超声波60min，超纯水浸泡6次，每12h更换超纯水一次。
如图1所示，采用L929细胞株（小鼠成纤维细胞株）检测经过改良纯化处理与常规纯化处理的样品BC的体外细胞相容性，并以多孔组织培养板作为对照。由实验结果，同样实验条件下，BC样品经过改良纯化处理步骤后细胞增殖能力与细胞培养孔板接近，比常规纯化处理的样品BC有较大的提高，说明改良纯化步骤可有效提高BC的细胞相容性。
3细菌纤维素湿膜块的制备
采用低温（37℃）脱水法（烘干24h），制备细菌纤维素质量分数为0.1%的细菌纤维素湿膜块。
如图2所示，低温脱水法比冻干法结晶峰位置几乎没有改变，峰形更尖锐，衍射相对强度更高，说明此法制备的BC样品晶体结构不变，结晶度相对更高一些。
4高分子溶液的配制
采用高温（126℃）高压法（0.15MPa），配制PVA溶液，静置过夜去除气泡，所制得的PVA溶液浓度为40%，PVA分子量（146000～186000）。
5细菌纤维素浸渍高分子溶液
将细菌纤维素湿膜块裁成1cm×1cm×0.8cm，浸泡于所配制的PVA溶液5天，保温80℃。取出充分渗透平衡的BC/PVA膜块，清除表面多余的溶液待用。
6冻融交联
将步骤5制备的BC/PVA膜块于-20℃/25℃反复冻融8次，物理交联形成复合材料BC/PVA。
如图3所示，BC与PVA复合后，PVA在低含量时，附着于BC纤维(如图3C)；PVA含量高时，PVA填充于整个BC纤维网络中（如图3D，3E，3F）。
如图4所示，PVA/BC复合材料的压缩模量与PVA在复合材料中的含量基本正相关，随着PVA的实际含量增加而增加。
如图5所示，通过采用L929细胞株（小鼠成纤维细胞株）在PVA/BC复合材料与BC样品的细胞的细胞增殖能力，检测PVA/BC复合材料的细胞相容性，以多孔组织培养板作为对照。PVA/BC复合材料的细胞增殖能力相对BC纯样品更高，有更好的细胞相容性。
实施例2
一种BC/PVA/PVP复合材料的制备方法，具体步骤如下：
1医用细菌纤维素膜制备
培养基成分：酵母粉：10g，蛋白胨：6g，MgSO4：0.2g，CaCl2：0.1g，葡萄糖：20g，椰汁1000ml，灭菌后加入10ml无水乙醇。
培养方法：接种木醋杆菌到种子培养液，180rpm震荡培养18h后，以10%的比例接种发酵培养基，静置培养20d。
2医用天然细菌纤维素产品的纯化处理
发酵所得的细菌纤维素膜，用自来水冲洗去除培养基，然后用去离子水浸泡至水无色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更换SDS液一次；0.1M氢氧化钠溶液浸泡4次，每12更换一次氢氧化钠溶液，超声波60min，超纯水浸泡6次，每12h更换超纯水一次。
3细菌纤维素湿膜块的制备
采用低温（37℃）烘干法，烘干24h，制备细菌纤维素质量分数为0.1%的细菌纤维素湿膜块。
4高分子溶液的配制
采用高温（110℃）法，高压法（0.08MPa），可配制PVA/PVP混合的水溶液，静置过夜去除气泡。配制所得PVA/PVP混合的水溶液，其中PVA浓度30%，PVA分子量（85000~124000），PVP浓度5%，PVP分子量（45000~50000）。
5细菌纤维素浸渍高分子溶液
将细菌纤维素湿膜块裁成1cm×1cm×0.8cm，浸泡于所配制的PVA/PVP混合溶液5天，保温80℃。取出充分渗透平衡的BC/PVA/PVP膜块，清除表面多余的溶液待用。
6冻融交联
将步骤5制备的BC/PVA/PVP膜块于-20℃/25℃反复冻融，8次，物理交联形成复合材料BC/PVA/PVP。
实施例3
聚乙烯醇/细菌纤维素/羟基磷灰石一体化软骨修复制品的制备
1医用细菌纤维素膜制备
培养基成分：酵母粉：10g，蛋白胨：6g，MgSO4：0.2g，CaCl2：0.1g，葡萄糖：20g，椰汁1000ml，灭菌后加入10ml无水乙醇。
培养方法：接种木醋杆菌到种子培养液，180rpm震荡培养16h后，以10%的比例接种发酵培养基，静置培养10d。
2医用天然细菌纤维素产品的纯化处理
发酵所得的细菌纤维素膜，用自来水冲洗去除培养基，然后用去离子水浸泡至水无色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更换SDS液一次；0.1M氢氧化钠溶液浸泡4次，每12h更换一次氢氧化钠溶液，超声波60min，超纯水浸泡6次，每12h更换超纯水一次。
3细菌纤维素湿膜块的制备
采用低温（37℃）烘干法，烘干24h，制备细菌纤维素质量分数为0.1%的细菌纤维素湿膜块。
4高分子溶液的配制
采用高温（110℃）高压法（0.08MPa），配制PVA的水溶液，静置过夜去除气泡。所制得的PVA溶液浓度为40%，PVA分子量（89000~98000）。
5细菌纤维素浸渍高分子溶液
将细菌纤维素湿膜裁成2cm×3cm×0.8cm，浸泡于所配制的PVA溶液中，7天，保温96℃。取出充分渗透平衡的BC/PVA膜，清除表面多余的高分子溶液待用。
6压模
将步骤5得到的BC/PVA膜压入个体化猪软骨模具中成型。
上述个体化猪软骨模具的制备过程为：MicroCT扫描猪软骨得到其断层扫描图片，使用Mimics14.0进行三维重建，并在Magics10.11中基于重建后的外轮廓设计模板。采用光敏树脂光固化成型猪软骨模具。
7冻融交联
将步骤6得到的BC/PVA成型膜于~20℃/25℃反复冻融8次，物理交联形成BC/PVA复合材料。
8矿化
将步骤7得到的BC/PVA复合材料，置于模拟体液SBF中，控制模拟体液的高度不超过2mm，矿化1天，得到BC/PVA/HA猪的软骨替换物。
上述的模拟体液SBF配方：NaCl 8.035g，NaHCO30.355g，KCl 0.225g，K2HPO4.3H2O 0.231g,MgCl2.6H2O6.311g，1M HCl 0.39ml,无水CaCl20.292g，无水Na2SO40.072g，三（羟甲基）氨基甲烷（tris）6.118g，1MHCl 5ml。
本实施例所制备的聚乙烯醇/细菌纤维素复合水凝胶，力学强度最高可达到60MPa左右，基本上可以匹配人体关节软骨所需。采用模拟体液对复合水凝胶进行部分矿化（控制矿化层厚度），使其形成层渐的羟基磷灰石结构，从而满足复合修复材料与软骨下骨层的牢固结合。
实施例4
聚乙烯醇/细菌纤维素/羟基磷灰石一体化软骨修复制品的制备
1医用细菌纤维素膜制备
培养基成分：酵母粉：10g，蛋白胨：6g，MgSO4：0.2g，CaCl2：0.1g，葡萄糖：20g，椰汁1000ml，灭菌后加入10ml无水乙醇。
培养方法：接种木醋杆菌到种子培养液，180rpm震荡培养18h后，以10%的比例接种发酵培养基，静置培养15d。
2医用天然细菌纤维素产品的纯化处理
发酵所得的细菌纤维素膜，用自来水冲洗去除培养基，然后用去离子水浸泡至水无色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更换SDS液一次；0.1M氢氧化钠溶液浸泡4次，每12h更换一次氢氧化钠溶液，超声波60min，超纯水浸泡6次，每12h更换超纯水一次。
3细菌纤维素湿膜块的制备
采用低温（37℃）烘干法，烘干24h，制备不同细菌纤维素含量0.1%的细菌纤维素湿膜块。
4高分子溶液的配制
采用高温（110℃）高压法（0.08MPa），配制PVA的水溶液，静置过夜去除气泡。配制所得的PVA溶液浓度为40%，PVA分子量（89000~98000）。
模拟体液SBF配方（1倍浓度）：NaCl 8.035g，NaHCO30.355g，KCl 0.225g，K2HPO4.3H2O 0.231g,MgCl2.6H2O6.311g，1M HCl 0.39ml,无水CaCl20.292g，无水Na2SO40.072g，三（羟甲基）氨基甲烷（tris）6.118g，1MHCl 5ml。
配制PVA/SBF混合溶液：将40%浓度的PVA溶液与2倍浓度的SBF溶液，等比例混合，搅拌均匀，静置过夜去除气泡，得到单倍浓度的PVA/SBF混合液。配制所得PVA/SBF混合液，其中PVA浓度为20%，PVA分子量（89000~98000），SBF为1倍浓度。
5细菌纤维素浸渍高分子溶液
将细菌纤维素湿膜裁成2cm×3cm×0.8cm，浸泡于所配制的PVA溶液中，7天，保温96℃。
取出与PVA溶液充分渗透平衡的BC/PVA膜，清除表面多余的高分子溶液。
将上述的BC/PVA膜，置于PVA/SBF混合溶液中，控制混合液的高度不超过2mm，浸泡1天，得到BC/PVA/HA膜块。
6压模
将步骤5得到的BC/PVA/HA膜块压入个体化软骨模具中成型。
上述个体化猪软骨模具的制备过程为：MicroCT扫描猪软骨得到其断层扫描图片，使用Mimics14.0进行三维重建，并在Magics10.11中基于重建后的外轮廓设计模板。采用光敏树脂光固化成型猪软骨模具。
7冻融交联
将BC/PVA/HA成型膜于~20℃/25℃反复冻融，8次，物理交联形成BC/PVA/HA猪的软骨替换物。
本实施例所制备的聚乙烯醇/细菌纤维素复合水凝胶，力学强度基本可以匹配人体关节软骨所需，采用模拟体液对复合水凝胶进行部分矿化（控制矿化层厚度），使其形成层渐的羟基磷灰石结构，从而满足复合修复材料与软骨下骨层的牢固结合。
实施例5
聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷基酮/细菌纤维素/羟基磷灰石一体化软骨修复制品的制备
1医用细菌纤维素膜制备
培养基成分：酵母粉：10g，蛋白胨：6g，MgSO4：0.2g，CaCl2：0.1g，葡萄糖：20g，椰汁1000ml，灭菌后加入10ml无水乙醇。
培养方法：接种木醋杆菌到种子培养液，180rpm震荡培养18h后，以10%的比例接种发酵培养基，静置培养20d。
2医用天然细菌纤维素产品的纯化处理
发酵所得的细菌纤维素膜，用自来水冲洗去除培养基，然后用去离子水浸泡至水无色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更换SDS液一次；0.1M氢氧化钠溶液浸泡4次，每12h更换一次氢氧化钠溶液，超声波60min，超纯水浸泡6次，每12h更换超纯水一次。
3细菌纤维素湿膜块的制备
采用低温（37℃）烘干法，烘干24h，制备细菌纤维素质量分数为1%的细菌纤维素湿膜块。
4高分子溶液的配制
采用高温（110℃）高压法（0.08MPa），配制PVA/PVP混合的水溶液，静置过夜去除气泡。
配制所得PVA/PVP混合的水溶液，其中PVA浓度30%，PVA分子量（89000~98000），PVP浓度1%，PVP分子量（45000~50000）。
5细菌纤维素浸渍高分子溶液
将细菌纤维素湿膜裁成2cm×3cm×0.8cm，浸泡于所配制的PVA/PVP混合溶液中，7天，保温96℃。
取出与PVA/PVA混合高分子溶液充分渗透平衡的BC/PVA/PVP膜，清除表面多余的高分子溶液待用。
6压模
将步骤5得到的BC/PVA/PVP膜压入个体化猪软骨模具中成型。
上述个体化猪软骨模具的制备过程为：MicroCT扫描猪软骨得到其断层扫描图片，使用Mimics14.0进行三维重建，并在Magics10.11中基于重建后的外轮廓设计模板。采用光敏树脂光固化成型猪软骨模具。
7冻融交联
将步骤6得到的BC/PVA/PVP成型膜于~20℃/25℃反复冻融8次，物理交联形成BC/PVA/PVP复合材料。
8矿化
将步骤7得到的BC/PVA/PVP复合材料，置于模拟体液SBF中，控制模拟体液的高度不超过2mm，矿化1天，得到BC/PVA/PVP/HA猪的软骨替换物。
上述的模拟体液SBF配方：NaCl 8.035g，NaHCO30.355g，KCl 0.225g，K2HPO4.3H2O 0.231g,MgCl2.6H2O6.311g，1M HCl 0.39ml,无水CaCl20.292g，无水Na2SO40.072g，三（羟甲基）氨基甲烷（tris）6.118g，1MHCl 5ml。
本实施例所制备的聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷基酮/细菌纤维素复合水凝胶，力学强度基本可以匹配人体关节软骨所需，采用模拟体液对复合水凝胶进行部分矿化（控制矿化层厚度），使其形成层渐的羟基磷灰石结构，从而满足复合修复材料与软骨下骨层的牢固结合。
实施例6
聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷基酮/细菌纤维素/羟基磷灰石一体化软骨修复制品的制备
1医用细菌纤维素膜制备
培养基成分：酵母粉：10g，蛋白胨：6g，MgSO4：0.2g，CaCl2：0.1g，葡萄糖：20g，椰汁1000ml，灭菌后加入10ml无水乙醇
培养方法：接种木醋杆菌到种子培养液，180rpm震荡培养18h后，以10%的比例接种发酵培养基，静置培养20d。
2医用天然细菌纤维素产品的纯化处理
发酵所得的细菌纤维素膜，用自来水冲洗去除培养基，然后用去离子水浸泡至水无色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更换SDS液一次；0.1M氢氧化钠溶液浸泡4次，每12h更换一次氢氧化钠溶液，超声波60min，超纯水浸泡6次，每12h更换超纯水一次。
3细菌纤维素湿膜块的制备
采用低温（37℃）烘干法，烘干24h，制备不同细菌纤维素含量1%的细菌纤维素湿膜块。
4高分子溶液的配制
采用高温（110℃）高压法（0.08MPa），配制PVA的水溶液；PVA浓度为40%，PVA分子量（89000~98000）；
采用高温（110℃）高压法（0.08MPa），配制PVA/PVP混合的水溶液，静置过夜去除气泡；配制所得PVA/PVP混合的水溶液，其中PVA浓度为30%，PVA分子量（89000~98000），PVP浓度为3%，PVP分子量（45000~50000）；
模拟体液SBF配方（1倍浓度）：NaCl 8.035g，NaHCO30.355g，KCl 0.225g，K2HPO4.3H2O 0.231g,MgCl2.6H2O6.311g，1M HCl 0.39ml,无水CaCl20.292g，无水Na2SO40.072g，三（羟甲基）氨基甲烷（tris）6.118g，1MHCl 5ml；
配制PVA/SBF混合溶液：将40%的PVA溶液与2倍浓度的SBF溶液，等比例混合，搅拌均匀，静置过夜去除气泡，得到单倍浓度的PVA/SBF混合液。配制所得PVA/SBF混合液，其中PVA浓度为20%，PVA分子量（89000~98000），SBF为1倍浓度；
5细菌纤维素浸渍高分子溶液
将细菌纤维素湿膜裁成2cm×3cm×0.8cm，浸泡于所配制的PVA/PVP混合的水溶液中，7天，保温96℃。
取出充分渗透平衡的BC/PVA/PVP膜，清除表面多余的高分子溶液。
将上述的BC/PVA/PVP膜，置于PVA/SBF混合溶液中，控制混合液的高度不超过2mm，浸泡1天，得到BC/PVA/PVP/HA膜块。
6压模
将步骤5得到的BC/PVA/PVP/HA膜块压入个体化软骨模具中成型。
上述个体化猪软骨模具的制备过程为：MicroCT扫描猪软骨得到其断层扫描图片，使用Mimics14.0进行三维重建，并在Magics10.11中基于重建后的外轮廓设计模板。采用光敏树脂光固化成型猪软骨模具。
7冻融交联
将BC/PVA/PVP/HA成型膜于~20℃/25℃反复冻融，8次，物理交联形成BC/PVA/PVP/HA猪的软骨替换物。
本实施例所制备的聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷基酮/细菌纤维素复合水凝胶，力学强度基本可以匹配人体关节软骨所需，采用模拟体液对复合水凝胶进行部分矿化（控制矿化层厚度），使其形成层渐的羟基磷灰石结构，从而满足复合修复材料与软骨下骨层的牢固结合。
实施例7
结合MicroCT扫描，制备聚乙烯醇/聚乙烯吡咯烷基酮/细菌纤维素复合水凝胶半月板替换物
1医用细菌纤维素膜制备
培养基成分：酵母粉：10g，蛋白胨：6g，MgSO4：0.2g，CaCl2：0.1g，葡萄糖：20g，椰汁1000ml，灭菌后加入10ml无水乙醇。
培养方法：接种木醋杆菌到种子培养液，180rpm震荡培养18h后，以10%的比例接种发酵培养基，静置培养20d。
2医用天然细菌纤维素产品的纯化处理
发酵所得的细菌纤维素膜，用自来水冲洗去除培养基，然后用去离子水浸泡至水无色透明。然后用3%的SDS浸泡4次，每12h更换SDS液一次；0.1M氢氧化钠溶液浸泡4次，每12h更换一次氢氧化钠溶液，超声波60min，超纯水浸泡6次，每12h更换超纯水一次。
3细菌纤维素湿膜块的制备
采用低温烘干法，37℃烘干24h，采用低温（37℃）烘干法，烘干24h，制备细菌纤维素质量分数为0.1%的细菌纤维素湿膜块。
4高分子溶液的配制
采用高温（110℃）高压法（0.08MPa），配制PVA/PVP混合的高分子水溶液，静置过夜去除气泡。
配制所得PVA/PVP混合的高分子水溶液，其中PVA浓度为30%，PVA分子量（89000~98000），PVP浓度为1%，PVP分子量（45000~50000）
5细菌纤维素浸渍高分子溶液
将细菌纤维素湿膜裁成所需尺寸，浸泡于所配制的适当浓度的PVA/PVP混合溶液中，3天，保温96℃。
取出充分渗透平衡的BC/PVA/PVP膜，清除表面多余的高分子溶液待用。
6压模
将步骤5得到的BC/PVA/PVP膜压入半月板模具中成型
上述个体化猪半月板模具的制备过程为：MicroCT扫描猪半月板得到其断层扫描图片，使用Mimics14.0进行三维重建，并在Magics10.11中基于重建后的外轮廓设计模板。采用光敏树脂光固化成型半月板模具。
7冻融交联
将成型的BC/PVA/PVP膜块于-20℃/25℃反复冻融，8次，物理交联形成猪的半月板BC/PVA/PVP复合替换物。
实验测得新鲜成年猪内侧半月板的压缩模量在前后角部分较高，约为40-50MPa，体部较弱，约为15-30Mpa；上述实施例制备的材料最大压缩模量能达到60MPa以上，足以匹配人体半月板的要求。
Claims (7)
1.一种细菌纤维素/聚乙烯醇复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）医用细菌纤维素湿膜块的制备
接种木醋杆菌（Acetobacter xylinum）到种子培养液振荡培养，再接种到发酵培养基发酵培养，得到医用细菌纤维素膜，然后经纯化处理后，再采用脱水的方式制备细菌纤维素含量0.05～2%质量分数的细菌纤维素湿膜块；
（2）高分子溶液的配制
在高温95～130℃，高压0.05～0.15MPa的条件下，配制质量浓度20～40%的聚乙烯醇水溶液，静置过夜去除气泡，制得的溶液为高分子溶液Ⅰ；
或者在上述配制聚乙烯醇水溶液的过程中加入聚乙烯基吡咯烷酮，其中聚乙烯基吡咯烷酮的质量浓度0.5～15%，制得的溶液为高分子溶液Ⅱ；
或者在高分子溶液Ⅰ中还加入模拟体液，制得的溶液为高分子溶液Ⅲ；
（3）细菌纤维素湿膜块浸渍高分子溶液
将细菌纤维素湿膜块裁成所需尺寸，浸泡于所配制的高分子溶液Ⅰ或Ⅱ中1～10天，保温80～105℃；取出充分渗透平衡的复合膜块Ⅰ或Ⅱ，清除表面多余的溶液待用；
或者将上述复合膜块Ⅰ或Ⅱ部分浸泡于高分子溶液Ⅲ中，控制浸泡高度不超过2mm，浸泡4～72h，取出充分渗透平衡的复合膜块Ⅲⅰ或Ⅲii，清除表面多余的溶液待用；
（4）冻融交联
将步骤（3）制得的复合膜块Ⅰ、Ⅱ、Ⅲⅰ或Ⅲii于-30～-20℃/15～25℃反复冻融，4～10次，物理交联形成复合材料Ⅰ、Ⅱ、Ⅲⅰ或Ⅲii。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述医用细菌纤维素膜的纯化处理：
将步骤（1）制得的细菌纤维素膜，用自来水冲洗去除培养基，然后用去离子水浸泡至水无色透明，然后用0.1%～3%质量分数的十二烷基磺酸钠溶液浸泡2～4次，每12～24h更换十二烷基磺酸钠溶液一次；0.05M～1M氢氧化钠溶液浸泡2～4次，每12～24h更换一次氢氧化钠溶液，超声波60min，超纯水浸泡2～6次，每12～24h更换超纯水一次。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述聚乙烯基吡咯烷酮分子量8000～200000，聚乙烯醇分子量85000～186000。
4.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤（4）得到的复合材料Ⅰ或Ⅱ部分浸泡于模拟体液中，控制浸泡高度不超过2mm，浸泡4～72h。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述高分子溶液Ⅰ中聚乙烯醇的质量浓度为28～40%。
6.根据权利要求1～5任意一项方法制备的复合材料，其特征在于，该材料的压缩模量为30MPa以上。
7.根据权利要求6所述的复合材料，其特征在于，该材料的压缩模量为50～60MPa。
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