CN103071185A - 一种仿生腱鞘膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种仿生腱鞘膜，所述仿生腱鞘膜为双层结构，包括纤维层和滑膜层，其中，纤维层的组成材料包括可降解高分子材料，且不含有透明质酸（HA）或其金属盐；滑膜层的组成材料可降解高分子材料，还包括HA或其金属盐。该仿生腱鞘膜的滑膜层含有HA或其金属盐，能实现HA或其金属盐的控制释放，模拟生物腱鞘内层分泌HA的功能，为肌腱提供长效润滑作用的环境，促进肌腱内源性愈合，提高肌腱愈合质量，改善肌腱术后功能；纤维层主要充当物理屏障，减少腱周组织粘连，预防外源性愈合。而且生物可降解高分子材料可自行降解，无毒、无免疫原性，生物相容性好，提高疗效，减少副作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种仿生材料，尤其涉及一种仿生腱鞘膜及其制备方法。
背景技术
肌腱粘连是临床常见疾患，由于缺乏有效的粘连防治措施，常常使治疗陷入“粘连-松解-再粘连”的恶性循环，严重影响了患者的肢体功能。在肌腱和周围组织之间放置防粘连膜具有一定减少肌腱粘连的作用，但是它们不具有促进肌腱愈合和滑动的功能。此外，由于材料或结构的原因，包裹肌腱后只能起到物理阻隔作用，可能出现的排异以及干扰肌腱愈合等现象严重影响肌腱功能的恢复。因此，寻找合适的防粘连膜材料和结构，负载防粘连药物，通过药物的不断释放促进肌腱愈合，达到防止肌腱粘连的目的，具有重要意义。
早期应用的防粘连膜多采用非生物材料（如硅橡胶）制成，但存在组织反应大、排异明显、无通透性、影响肌腱的内源性愈合与需二期手术取出等不足，严重时可因为阻隔了肌腱的营养而使其发生变性。因此，目前这种材料构成的防粘连膜已基本不用。近年来，由可降解高分子材料制成的防粘连膜已经问世，在这一类物质中，既有天然的高分子材料，如纤维素衍生物、透明质酸、几丁质及其衍生物等，也有合成的高分子聚合物，如聚乳酸（polylactic acid，PLA）、聚己内酯（polycaprolactone，PCL）、聚羟基乙酸及它们的共聚物等。
目前，研究较多的防粘连膜以单层纳米纤维膜为主。纳米结构的薄膜孔隙率高且孔径小，能够阻止细胞长入的同时允许营养物质的渗透，并且通过控制纳米材料的亲水角抑制细胞粘附，从而达到肌腱愈合的要求[7]。静电纺工艺是近年来广泛应用的制备组织工程纳米纤维的技术，其设备相对简单、操作性强，且易于控制材料的化学组分和物理性能。目前已有超过100种不同高分子聚合物成功地通过该方法实现了纳米纺丝，包括聚乳酸及透明质酸（hyaluronic acid，HA）。Yang等应用静电纺丝的方法以聚乳酸为主要材料制备了单层的纳米电纺纤维膜，发现这种结构不仅具有物理阻隔作用，还能抑制细胞或组织在膜表面粘附，但是其不能促进肌腱的滑动。然而，李新松等发明了一种可吸收纤维增强多层膜材料（申请号02138480.0），此种膜包含三层结构，中间一层是可吸收纤维网或布，上下两层是可吸收高分子材料多孔结构，可以阻止细胞通过，和包含润滑肌腱的物质，但是材料比较复杂且制造过程比较繁琐，而且三层膜紧紧贴附在一起在一定程度上减少了营养物质的渗透，而且三层膜紧紧贴附在一起在一定程度上减少了营养物质的渗透，离临床应用尚有较远的距离。理想的防粘膜不仅要有效地起到阻隔腱周组织的作用，还要通过材料的复合或药物的负载达到促进肌腱组织愈合的目的，并为肌腱提供长效润滑作用的环境。
抗炎类、去纤维蛋白类药物乃至抗代谢药都具有防止肌腱粘连的作用，但这些药物在防止肌腱粘连的同时会对肌腱的内在愈合速度和质量产生影响，甚至有全身毒副作用，使其在临床上的应用受到限制。作为一种天然的线性大分子酸性粘多糖，透明质酸广泛存在于正常滑液中，也是腱鞘滑液的主要组成成分，对肌腱营养物质的渗透和维持肌腱在腱鞘内的滑动有积极作用。作为药物载体和助剂，在临床上透明质酸已被广泛应用于关节疾病的治疗、眼科手术、烫伤治疗、预防术后粘连等。体内实验证实，在屈肌腱损伤修复与肌腱粘连松解术中应用透明质酸钠，可以减少肌腱的粘连，临床效果明显。Tuncay等将鼠的肌腱横行切断后重新缝合，再将透明质酸注射于肌腱修复部位的腱周组织，发现实验组肌腱愈合好，周围粘连较对照组明显减轻。黄汉伟等人对透明质酸防治损伤肌腱粘连的作用进行了研究，发现高分子透明质酸能够促进肌腱内源性愈合、提高肌腱愈合质量、减少与周围组织的粘连、改善肌腱术后功能，同时对肌腱周围组织无明显副作用。除机械屏障外，透明质酸钠还具有明显抑制白细胞的趋化、减少纤维蛋白的渗出和肉芽组织的形成的特性。但是，由于透明质酸钠的体内存留时间较短，机械强度及稳定性差，难以保证其在体内的长期存留以达到防粘连的持续效应。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供了一种仿生腱鞘膜，具有双层结构，滑膜层能长时间释放HA或其金属盐，为肌腱提供长效润滑作用的环境，促进肌腱内源性愈合，纤维层能有效减少肌腱与周围组织的粘连，防止外源性愈合。
本发明提供了一种仿生腱鞘膜，所述仿生腱鞘膜为双层结构，包括纤维层和滑膜层，其中：
所述纤维层的组成材料包括可降解高分子材料，并且不含有透明质酸或其金属盐；
所述滑膜层的组成材料包括可降解高分子材料；还包括透明质酸或其金属盐，所述滑膜层中透明质酸或其金属盐和可降解高分子材料的质量比为1:（1-1000）。
优选地，所述纤维层的厚度为10-1000μm，所述滑膜层的厚度为10-1000μm。
优选地，所述纤维层的厚度为80μm，所述滑膜层的厚度为150μm。
优选地，所述纤维层纤维直径为0.1-10μm，所述滑膜层纤维直径为0.1-10μm。
优选地，所述可降解高分子材料可以选自羟基羧酸均聚物、几种羟基羧酸的共聚物、羟基羧酸与多元醇共聚物、聚羟基羧酸与聚多元醇共混物、聚酯、聚磷酸酯、聚碳酸酯或聚酸酐等中的一种或几种。
其中，羟基羧酸优选为α-羟基羧酸，所述α-羟基羧酸指的是所述羧酸中，至少有一个羟基位于与羧基相邻的碳原子上，分子结构为R1-C(R2)(OH)-COOH，其中R1选自H或C-C10的烷基，更优选为H或C1-C5的烷基，更优选为H或C1-C3的烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基等，R1最优选为甲基（即α-羟基羧酸为乳酸）。本领域技术人员能够理解的是，本发明所述羟基羧酸也可以用内酯替代，如己内酯替代羟基己酸，由于本发明中，内酯与羟基羧酸所起作用相同，因此，内酯也包括在本发明羟基所述的范围内。
其中，所述多元醇优选为二元醇，如乙二醇、丙二醇，本领域技术人员能够理解的是，本发明所述二元醇也可以用环氧化合物替代，如环氧乙烷替代乙二醇、环氧丙醇替代丙二醇，由于本发明中，环氧烷化合物与多元醇所起作用相同，因此，环氧烷化合物也包括在本发明羟基所述的范围内。
优选地，所述可降解高分子材料的具体举例如聚乳酸、聚己内酯、乳酸与乙二醇共聚物、乳酸与羟基乙酸共聚物、乳酸与己内酯共聚物，最优选为聚己内酯。
优选地，所述可降解高分子材料分子量为20KDa-200KDa。
本发明还提供了一种上述仿生腱鞘膜的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，制备纤维层溶液：将可降解高分子材料溶解于有机溶剂中形成混合溶液，控制有机溶剂质量为可降解高分子材料质量的2-50倍；
步骤2，制备滑膜层溶液：将透明质酸或其金属盐完全溶解在水中制得透明质酸或其金属盐凝胶，控制水的质量为透明质酸质量的10-50倍；将可降解高分子材料溶解于有机溶剂中形成混合溶液A，再将透明质酸或其金属盐凝胶与混合溶液A混合制得滑膜层溶液，控制滑膜层溶液中可降解高分子材料的含量小于或等于99.9wt%，可降解高分子材料的质量为透明质酸或其金属盐质量的1-1000倍；
步骤3，分别将纤维层溶液和滑膜层溶液制成纤维层和滑膜层，并且将纤维层和滑膜层复合得到双层结构的仿生腱鞘膜。
优选地，步骤2中，控制滑膜层溶液中可降解高分子材料的含量为1-90wt%。
优选地，步骤2中，控制滑膜层溶液中可降解高分子材料的含量为10-40wt%。
优选地，步骤2中所述有机溶剂至少包括水溶性溶剂。
优选地，步骤2中将透明质酸凝胶、混合溶液A和水溶性溶剂混合，制得滑膜层溶液。
优选地，所述水溶性溶剂为醇类或酸类等有机溶剂中的一种或多种。
醇类有机溶剂的例子包括：甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、叔丁醇、甘油、丁二醇、戊二醇、乙二醇单甲醚、乙二醇单乙醚、乙二醇单丁醚、三氟乙醇、六氟异丙醇等。
酸类有机溶剂的例子包括：甲酸、乙酸、三氟乙酸等。
优选地，所述水溶性溶剂选自三氟乙酸、乙酸、三氟乙醇、六氟异丙醇、甲醇、乙醇、正丁醇、异丙醇等中的一种或多种。
优选地，步骤1中所述有机溶剂可以为甲醇、乙醇、正丁醇、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、四氢呋喃、异丙醇、三氟乙醇或六氟异丙醇等中的一种或几种。
优选地，步骤3为纤维层溶液和滑膜层溶液分别以静电纺丝的方法进行纺丝得到纤维层和滑膜层，并且将纤维层和滑膜层复合得到双层结构的仿生腱鞘膜。
优选地，步骤3为：相继对纤维层溶液和滑膜层溶液以静电纺丝的方法进行纺丝得到双层结构的仿生腱鞘膜。
优选地，步骤3为：相继对滑膜层溶液和纤维层溶液以静电纺丝的方法进行纺丝得到双层结构的仿生腱鞘膜。
优选地，所述可降解高分子材料可以选自羟基羧酸均聚物、几种羟基羧酸的共聚物、羟基羧酸与多元醇共聚物、羟基羧酸与多元酸共聚物、聚酯、聚磷酸酯、聚碳酸酯或聚酸酐等中的一种或几种。
其中，羟基羧酸优选为α-羟基羧酸，所述α-羟基羧酸指的是所述羧酸中，至少有一个羟基位于与羧基相邻的碳原子上，分子结构为R1-C(R2)(OH)-COOH，其中R1选自H或C-C10的烷基，更优选为H或C1-C5的烷基，更优选为H或C1-C3的烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基等，R1最优选为甲基（即α-羟基羧酸为乳酸）。
其中，所述多元醇优选为二元醇，如乙二醇、丙二醇，本领域技术人员能够理解的是，本发明所述二元醇也可以用环氧化合物替代，如环氧乙烷替代乙二醇、环氧丙醇替代丙二醇。
优选地，所述可降解高分子材料的具体举例如聚乳酸、聚己内酯、乳酸与乙二醇共聚物、乳酸与羟基乙酸共聚物、乳酸与己内酯共聚物，最优选为聚己内酯。
优选地，所述可降解高分子材料分子量为20KDa-200KDa。
优选地，步骤3中，静电纺工艺参数条件为：电压20-40kV，流速0.01-0.1mL/min，接受台离喷丝头的距离10-20cm。
本发明提供的仿生腱鞘膜模拟生物腱鞘结构，为双层结构，包括纤维层和滑膜层。滑膜层含有HA或其金属盐，能实现HA或其金属盐的控制释放，模拟生物腱鞘内层分泌HA的功能，为肌腱提供长效润滑作用的环境，促进肌腱内源性愈合，提高肌腱愈合质量，改善肌腱术后功能；纤维层主要充当物理屏障，减少腱周组织粘连，预防外源性愈合。而且生物可降解高分子材料可自行降解，本制剂无毒、无免疫原性，生物相容性好，提高疗效，减少副作用，在临床上具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1-3所得仿生腱鞘膜的扫描电镜图；
图2为实施例1-3所得仿生腱鞘膜的体外药物释放实验结果图；
图3为实施例1-3所得仿生腱鞘膜的体外细胞实验增生结果图；
图4为实施例1-3所得仿生腱鞘膜的体外细胞实验形态图；
图5为实施例1-3所得仿生腱鞘膜的体外细胞实验细胞活性图；
图6为实施例3所得仿生腱鞘膜的动物实验整体观察结果图；
图7为实施例3所得仿生腱鞘膜的动物实验的组织切片图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，以更好地理解本发明。
实施例1
称取2.4gPLC溶于7g四氢呋喃溶液中，制得纤维层溶液。
称取0.1gHA完全溶解在1.5g水中形成透明质酸凝胶，同时称取2.4gPLC溶于7g四氢呋喃溶液中；将透明质酸凝胶加入到PCL的四氢呋喃溶液，使用漩涡混合器混合，然后加入2.5g六氟异丙醇，使用漩涡混合器混合，制得滑膜层溶液（HA占HA和PLC总量的4%）。
相继对纤维层溶液和滑膜层溶液以静电纺丝的方法进行纺丝得到双层结构的仿生腱鞘膜（PCL-HA4%），其中，静电纺工艺参数条件为：电压30kV，流速为0.04mL/min，接受台离喷丝头的距离为15cm。
实施例2
称取2.3gPLC溶于7g四氢呋喃溶液中，制得纤维层溶液。
称取0.2gHA完全溶解在3g水中形成透明质酸凝胶，同时称取2.3gPLC溶于7g四氢呋喃溶液中；将透明质酸凝胶加入到PCL的四氢呋喃溶液，使用漩涡混合器混合，然后加入2.5g六氟异丙醇，使用漩涡混合器混合，制得滑膜层溶液（HA占HA和PLC总量的8%）。
相继对纤维层溶液和滑膜层溶液以静电纺丝的方法进行纺丝得到双层结构的仿生腱鞘膜（PCL-HA8%），其中，静电纺工艺参数条件为：电压30kV，流速为0.04mL/min，接受台离喷丝头的距离为15cm。
实施例3
称取2.2gPLC溶于7g四氢呋喃溶液中，制得纤维层溶液。
称取0.3gHA完全溶解在4.5g水中形成透明质酸凝胶，同时称取2.3gPLC溶于7g四氢呋喃溶液中；将透明质酸凝胶加入到PCL的四氢呋喃溶液，使用漩涡混合器混合，然后加入2.5g六氟异丙醇，使用漩涡混合器混合，制得滑膜层溶液（HA占HA和PLC总量的12%）。
相继对纤维层溶液和滑膜层溶液以静电纺丝的方法进行纺丝得到双层结构的仿生腱鞘膜（PCL-HA12%），其中，静电纺工艺参数条件为：电压30kV，流速为0.04mL/min，接受台离喷丝头的距离为15cm。
实施例4
称取2.2gPLC溶于7g四氢呋喃溶液中，制得纤维层溶液。
称取0.23gHA完全溶解在4.5g水中形成透明质酸凝胶，同时称取2.3gPLC溶于7g四氢呋喃溶液中；将透明质酸凝胶加入到PCL的四氢呋喃溶液，使用漩涡混合器混合，然后加入2.5g六氟异丙醇，使用漩涡混合器混合，制得滑膜层溶液。
相继对纤维层溶液和滑膜层溶液以静电纺丝的方法进行纺丝得到双层结构的仿生腱鞘膜，其中，静电纺工艺参数条件为：电压30kV，流速为0.04mL/min，接受台离喷丝头的距离为15cm。
实施例5
称取2.4gPLC溶于7g四氢呋喃溶液中，制得纤维层溶液。
称取0.17gHA完全溶解在4.5g水中形成透明质酸凝胶，同时称取2.3gPLC溶于7g四氢呋喃溶液中；将透明质酸凝胶加入到PCL的四氢呋喃溶液，使用漩涡混合器混合，然后加入2.5g六氟异丙醇，使用漩涡混合器混合，制得滑膜层溶液。
相继对纤维层溶液和滑膜层溶液以静电纺丝的方法进行纺丝得到双层结构的仿生腱鞘膜，其中，静电纺工艺参数条件为：电压30kV，流速为0.04mL/min，接受台离喷丝头的距离为15cm。
对照例
参照实施例1的制备工艺，制备双层结构膜，其不同之处置于，滑膜层中不含HA，即纤维层与滑膜层均为PLC的仿生腱鞘膜。
扫描电镜（SEM）观察对照例（PLC-HA0%）和实施例1-3所得仿生腱鞘膜，结果如图1所示，HA被成功地封装到PLC中，纤维大小均一，形成无规相互连接的结构，纤维层直径约为3.66±0.57μm，对照组和实施例1-3的滑膜层直径分别为3.89 ± 0.59、3.42 ± 0.62、2.99±0.54和2.86 ± 0.71μm。横断面SEM观察结果（图1A）表明，滑膜层厚度约为150μm，纤维层约为80μm。
实施例1-3所得仿生腱鞘膜各取100mg建立体外药物释放模型，结果如图2所示。实施例1-3所得仿生腱鞘膜初期突释分别为65.8、79.6和88.6%。实施例1-3所得仿生腱鞘膜具有相同最终释放累积百分率，14天内分别释放HA约397μg、798μg和1191μg。
取对照例和实施例1-3所得仿生腱鞘膜进行体外细胞增生实验，结果如图3所示，随着滑膜层中HA含量的增加，细胞生长更好。观察细胞形态，如图4所示，纤维层上细胞面积明显低于其他样品，表明纤维层阻止细胞粘连，而且随着滑膜层中HA含量的增加，细胞面积增大。测试细胞活性，结果如图5所示，PLC纤维中HA含量越多，死/活细胞率越低，表明HA利于细胞粘连与增生。
进行动物实验，将对照例（PCL）和实施例3（PLC-HA12%）所得仿生腱鞘膜用于肌腱损伤，防治肌腱周围组织粘连，实验结果如图6和7所示。图6中，空白组（control）出现严重腱周粘连，需要锐器剥离来分离；对照例组（PCL）粘连区域可以通过钝器剥离来分离，但检测到疏松纤维组织束；实施例3组（PLC-HA12%）没有出现腱周粘连。图7中，空白组（control）腱周组织和肌腱之间布满了纤维组织束；对照例组（PCL）在腱周组织和肌腱边界处观察到疏松纤维组织束；实施例3组（PLC-HA12%）未出现腱周粘连。结果表明，实施例3所得仿生腱鞘膜能有效地减少腱周组织粘连，预防外源性愈合。
将实施例1、2、4、和5所得仿生腱鞘膜进行动物实验，结果与实施例3类似，均能有效地减少腱周组织粘连，预防外源性愈合。
扫描电镜（SEM）观察实施例4和5所得仿生腱鞘膜，结果与实施例1-3类似；将实施例4和5所得仿生腱鞘膜进行体外细胞增生实验，结果也表明HA利于细胞粘连与增生。
综上，可以看出，本发明提供的仿生腱鞘膜模拟生物腱鞘为双层结构，包括纤维层和滑膜层。滑膜层含有HA或其金属盐，能实现HA或其金属盐的控制释放，模拟生物腱鞘内层分泌HA的功能，为肌腱提供长效润滑作用的环境，促进肌腱内源性愈合，提高肌腱愈合质量，改善肌腱术后功能；纤维层主要充当物理屏障，减少腱周组织粘连，预防外源性愈合。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (12)
1.一种仿生腱鞘膜，其特征在于，所述仿生腱鞘膜为双层结构，包括纤维层和滑膜层，其中：
所述纤维层的组成材料包括可降解高分子材料，并且不含有透明质酸或其金属盐；
所述滑膜层的组成材料包括可降解高分子材料；还包括透明质酸或其金属盐，所述滑膜层中透明质酸或其金属盐和可降解高分子材料的质量比为1:（1-1000）。
2.根据权利要求1所述仿生腱鞘膜，其特征在于，所述纤维层的厚度为10-1000μm，所述滑膜层的厚度为10-1000μm。
3.根据权利要求2所述仿生腱鞘膜，所述纤维层的厚度为80μm，所述滑膜层的厚度为150μm。
4.根据权利要求1所述仿生腱鞘膜，其特征在于，所述纤维层纤维直径为0.1-10μm，所述滑膜层纤维直径为0.1-10μm。
5.根据权利要求1所述仿生腱鞘膜，其特征在于，所述可降解高分子材料选自聚羟基羧酸、乳酸-乙醇酸共聚物、乳酸-乙二醇共聚物、乳酸-己内酯共聚物、聚己内酯、聚磷酸酯、聚碳酸酯或聚酸酐中的一种或几种。
6.根据权利要求5所述仿生腱鞘膜，其特征在于，所述可降解高分子材料为聚己内酯。
7.根据权利要求1、5或6所述仿生腱鞘膜，其特征在于，所述可降解高分子材料分子量为20KDa-200KDa。
8.一种如权利要求1所述仿生腱鞘膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，制备纤维层溶液：将可降解高分子材料溶解于有机溶剂中形成混合溶液，控制有机溶剂质量为可降解高分子材料质量的2-50倍；
步骤2，制备滑膜层溶液：将透明质酸或其金属盐完全溶解在水中制得透明质酸或其金属盐凝胶，控制水的质量为透明质酸质量的10-50倍；将可降解高分子材料溶解于有机溶剂中形成混合溶液A，再将透明质酸或其金属盐凝胶与混合溶液A混合制得滑膜层溶液，控制滑膜层溶液中可降解高分子材料的含量小于或等于99.9wt%，可降解高分子材料的质量为透明质酸或其金属盐质量的1-1000倍；
步骤3，分别将纤维层溶液和滑膜层溶液制成纤维层和滑膜层，并且将纤维层和滑膜层复合得到双层结构的仿生腱鞘膜。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述有机溶剂至少包括水溶性溶剂。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤2中将透明质酸或其金属盐凝胶、混合溶液A和水溶性溶剂混合，制得滑膜层溶液。
11.根据权利要求9或10所述的制备方法，其特征在于，所述水溶性溶剂为醇类或酸类有机溶剂中的一种或多种。
12.根据权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述水溶性溶剂选自三氟乙酸、乙酸、三氟乙醇、六氟异丙醇、甲醇、乙醇、正丁醇和异丙醇中的一种或多种。
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