CN114028612B - 一种聚合物微球/小肠粘膜下层复合材料、其制备方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于软组织填充材料技术领域，具体涉及一种聚合物微球/小肠粘膜下层复合材料、其制备方法及其用途。针对现有的软组织填充材料产品中的不足，本发明的技术方案是将小肠粘膜下层作为软组织填充材料或在制备复合软组织填充材料中的用途，或小肠粘膜下层与聚合物材料联合使用作为软组织填充材料的用途。本发明还提供聚合物材料和小肠粘膜下层基质粉末的组合物作为软组织填充材料，其中聚合物材料优选为聚己内酯微球。上述软组织填充材料具有良好的组织相容性和生物活性，能够快速血管化，为成纤维细胞合成并分泌胶原创造条件，促进软组织修复重塑，具有较长的降解时间，可实现长期填充。

Description

一种聚合物微球/小肠粘膜下层复合材料、其制备方法及其 用途
技术领域
本发明属于软组织填充材料技术领域，具体涉及一种聚合物微球/小肠粘膜下层复合材料、其制备方法及其用途。
背景技术
由于自然衰老、光氧化以及创伤等因素造成的各种皱纹和软组织缺损影响着每个人，随着审美标准的不断提高，人们对这种类型软组织缺损的防治越来越重视。目前，大量文献指出，皮肤老化和皱纹形成与胶原蛋白结构和功能的改变密不可分，在人类真皮中，胶原蛋白约占蛋白质的90％，长期的光氧化作用会上调基质金属蛋白酶(MMPs)亚家族，MMP-1，引发皮肤中I 型、II型和III型胶原的降解。因此，胶原蛋白的流失是造成这种类型软组织缺失的的主要原因。
现有技术中软组织填充材料常用于辅助伤口的愈合与针对软组织缺损导致的皮肤老化和皱纹，二者的区别在于前者是用于由溃疡、烧伤、烫伤等创伤因素所导致的软组织缺损修复，是通过减少出血，防止感染等辅助作用来促进创面自身愈合。后者是针对因衰老和光氧化等因素导致的皮下软组织缺损，为非创面的修复。
针对创面的修复作用，中国专利文献“CN201410440422.0促血管化小肠粘膜下层温敏材料及其制备方法”提供的小肠粘膜下层温敏材料是一种小肠粘膜下层经过酶解、酸溶、冷冻干燥、打粉或剪碎成絮状、灭菌后得到的基质材料，将其与含有NaOH的磷酸盐缓冲液或生理盐水的溶解液混合形成的溶液具有良好的可注射性，37℃可形成稳定凝胶，不需交联聚合，该温敏材料体内外实验均证实具有促进血管化作用。该材料能够缓释生长因子和促血管化，而其对衰老和光氧化等因素导致的皮下软组织缺损的作用目前尚未见到报道。
针对软组织缺损导致的皮肤老化和皱纹，通常的修复方式是在缺损部位注射各类的软组织填充材料以发挥增强的作用。理想的软组织填充材料应当具有良好的理化特性和生物学功能(Gold,at al.J Cosmet Dermatol.2018.& Varga,et al.Plast SurgNurs.2019.)，包括：1)具有较长的体积维持时间，避免频繁的注射带来的各类并发症；2)具有良好的生物相容性，即免疫兼容，；3)具有促血管化作用，为动员细胞浸润创造条件，发挥组织修复重建的作用； 4)能够刺激胶原的沉积，延长填充时间。
根据软组织填充材料的使用寿命和发挥填充作用的时间，可将其分为短效填充材料、半永久性填充材料和永久性填充材料三大类。短效软组织填充材料主要以胶原和玻尿酸为主，是目前应用最为广泛的一类，此类产品的缺陷在于降解过快，通常经过3个月到6个月的时间完全被组织吸收，每隔一段时间需要重新注射，无疑增加了并发症发生的风险。半永久性填充材料和永久性填充材料主要是以一些高分子化合物以微粒或微球复合于一些载体中，延长软组织增强的功效。目前，应用的半永久性填充剂或永久性填充材料主要包括
Figure RE-GDA0003455613200000021
和
Figure RE-GDA0003455613200000022
等产品，但是这些产品也存在不足。其中，
Figure RE-GDA0003455613200000023
于2004年获批用于治疗人类免疫缺陷病毒(HIV) 引发的面部脂肪萎缩，2009年被批准用于鼻唇沟填充，该产品由150mg的聚左旋乳酸(PLLA)微粒(粒径为40-63μm)，CMC凝胶载体以及无热原性甘露醇组成，其降解产物显酸性，可能会引发持续的局部炎性反应。
Figure RE-GDA0003455613200000024
于2006年获FDA批准用于中重度鼻唇沟填充和治疗由HIV引起的面部脂肪萎缩，其主要成分包含70％的羧甲基纤维素(CMC)凝胶和30％粒径为25-45μm的羟磷灰石钙(CaHA)微球，尽管关于
Figure RE-GDA0003455613200000025
注射后引发的并发症鲜有报道，然而对于可能引起的结节尚无有效的逆转剂或酶，需要注射5-氟尿嘧啶或固醇类药物来消除(Lee,et al.CLINPLAST SURG,2016.)。
Figure RE-GDA0003455613200000026
是一种包含30％聚己内酯(PCL)微球和70％CMC凝胶的半永久性填充材料，目前已包含四种亚产品，使用寿命在1-4年之间，此类产品的优点是具有较长的体积维持时间，填充后皱纹和皮肤老化的现象不易发生反弹，该产品受限于生物活性较低，功能有限。(Galadari,et al.J COSMET DERMATOL-US,2015)。
Figure RE-GDA0003455613200000027
(早期名称为
Figure RE-GDA0003455613200000028
)是2007年获FDA 批准上市的一种永久性填充材料，其主要成分包含20％的粒径为30-50μm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)微球和80％牛胶原凝胶，其中的胶原成分会在 2周左右完全降解，被新生的结缔组织所取代进而包裹微球，由于PMMA不可降解，因而可实现永久性填充。但是PMMA微球的不可降解性使其存在引发肉芽肿的风险(Lemperle,etal.AESTHET PLAST SURG,2010.)。由于现有产品的上述潜在的风险及不足，仍然需要研发新的软组织填充材料。
发明内容
针对现有的软组织填充产品存在的风险及不足，包括玻尿酸和胶原降解时间较快，不利于体积的长期维持；PLLA微粒的产品中间降解产物显酸性可能会引起长期的局部无菌性炎性反应；CaHA及PCL微球的产品不具有生物活性而难以促进软组织修复且功能有限；PMMA微球的产品由于不可降解而存在潜在的肉芽肿风险。本发明拟开发一种新型、功能性软组织填充材料以克服现有填充材料的不足。
小肠粘膜下层作为皮肤软组织填充材料或在制备复合皮肤软组织填充材料中的用途。
优选的，软组织填充材料的使用方式为以针剂的形式皮下注射至皱纹或皮肤老化现象的部位。
优选的，所述软组织填充材料用于面部皮肤。
优选的，软组织填充材料的针剂置于37℃或注射到体内后，形成小肠粘膜下层凝胶。
优选的，小肠粘膜下层为猪小肠粘膜下层。
优选的，小肠粘膜下层制成小肠粘膜下层基质粉末或基质粉末的溶液使用。
本发明还提供小肠粘膜下层与聚合物材料联合使用作为皮肤软组织填充材料或在制备复合皮肤软组织填充材料中的用途。
优选的，软组织填充材料的使用方式为以针剂的形式皮下注射至皱纹或皮肤老化现象的部位。
优选的，所述软组织填充材料用于面部皮肤。
优选的，软组织填充材料的针剂置于37℃或注射到体内后，形成小肠粘膜下层凝胶包裹聚合物材料的复合材料。
优选的，所述小肠粘膜下层制成小肠粘膜下层基质粉末或基质粉末的溶液使用。
优选的，小肠粘膜下层与聚合物材料联合使用的方法是将聚合物材料粉末和小肠粘膜下层基质粉末组成粉体混合物或将所述粉体混合物溶于溶剂形成复合溶液。
优选的，聚合物材料是聚合物微球。
优选的，所述聚合物材料是聚己内酯微球，所述聚己内酯微球的粒径为 25-75μm，所述聚己内酯微球的分子量为50-300kDa。优选为150-300kDa。
优选的，小肠粘膜下层为猪小肠粘膜下层。
本发明还提供一种聚合物材料/小肠粘膜下层组合物，它是由如下重量份的原料制成：
聚合物材料50-150份；
小肠粘膜下层基质粉末30份。
优选的，它是由聚合物材料和小肠粘膜下层基质粉末组成的粉体混合物或所述粉体混合物溶于溶剂形成的复合溶液。
优选的，溶剂为pH＝12～14的PBS溶液。
优选的，碱为NaOH或KOH。
优选的，复合溶液中聚合物材料的质量体积百分比为5％-15％。
优选的，聚合物材料是聚合物微球。
优选的，聚合物微球是聚己内酯微球。
优选的，聚己内酯微球的粒径为25-75μm；和/或，所述聚己内酯微球的分子量为50-300kDa。优选为150-300kDa。
优选的，聚己内酯微球是通过O/W乳化溶剂挥发法在膜乳化器中制备得到，其具体过程为：
(1)将聚己内酯聚合物溶于二氯甲烷后，在膜乳化器中被PVA水溶液带走，得到乳液；
(2)得到的乳液过夜搅拌使二氯甲烷挥发；
(3)经过步骤(2)处理的乳液经离心、过滤、彻底清洗并冷冻干燥后即得聚己内酯微球。
优选的，小肠粘膜下层基质粉末为猪小肠粘膜下层的基质粉末。
优选的，小肠粘膜下层基质粉末的制备方法是：
取小肠粘膜下层，经脱脂、脱细胞、去垢剂处理、病毒灭活、冷冻干燥、打粉、酶解消化、冷冻干燥、打粉、灭菌后即得小肠粘膜下层基质粉末。
针对现有软组织填充产品生物活性低，难以促进组织修复重塑等问题，本发明提供的技术方案中，将小肠粘膜下层(SIS)单独或作为复合材料中的一种成分用作衰老和光氧化等因素导致的皮下软组织缺损的修复。采用本发明的技术方案后，SIS凝胶是一种以胶原为主要成分的生物活性材料，富含多种生长因子，已被证实能促进血管化，这进一步为成纤维细胞增殖及合成胶原创造条件，此外，有研究证实，SIS凝胶还能诱导巨噬细胞向M2型极化，从而表现出促进组织修复再生的潜能。
另一方面，优选方案中选择聚合物材料聚己内酯(PCL)微球与小肠粘膜下层(SIS)形成的组合物作为软组织填充材料，由于PCL微球的降解性能可控，使得软组织填充材料注射后能够维持9个月至4年的稳定性，且PCL 微球可刺激细胞合成新胶原从而保证填充的效果，避免皮肤老化和皱纹的反弹。
因此，将SIS凝胶与PCL微球结合后可实现二者的优势互补，制备得到一种新型、功能性的复合软组织填充材料。可见，采用上述技术方案，使得软组织填充材料植入后具有良好的组织相容性，较长的体积维持时间，能够快速血管化，诱导巨噬细胞极化，促进胶原沉积和组织修复重塑。并且，SIS 凝胶与PCL微球均能够安全作用于人体，目前未见任何并发症的报道。显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为实施例1中SIS经不同步骤脱细胞处理后相关细胞生长因子保留情况(A，B，C，D)及SIS凝胶中bFGF，TGF-β1和VEGF的免疫荧光染色(E)。
图2为实施例1中胶原凝胶(A，C)和SIS凝胶(B，D)植入大鼠皮下经3和7天后的新血管形成情况以及新生血管数的统计分析(E)。
图3为实施例2中各种分子量PCL微球的SEM及粒径分析。50kDa PCL 微球(A，B，C)，150kDa PCL(D，E，F)，300kDa PCL(G，H，I)。
图4为实验例1中复合材料的保存形式，临用前为一种针剂。
图5为实验例1中复合材料的温敏特性和可注射性探究。单纯SIS溶液 (A)，加入PCL微球后(B)，37℃中孵育30分钟后(C)。复合溶液可通过26G针头实现可注射性(D)，注射到大鼠皮下1小时后可形成完整的 PCL微球/SIS凝胶复合材料(E)。
图6为实验例2中三种软组织填充材料的SEM形貌。SIS凝胶(A)和 PCL微球/SIS凝胶复合填充材料(B)。
图7为实验例3中不同分子量的PCL微球/SIS凝胶复合材料在脂肪酶溶液中的降解情况。经不同时间降解后，材料的大体图(A)，降解前后复合材料的SEM形貌(B)和不同降解时间下材料质量保留率的统计结果(C)。
图8为实验例4中NIH-3T3细胞接种在填充材料表面经5天后的活/死细胞染色。细胞分别接种在单纯的SIS凝胶(A)，50kDa-PCL微球/SIS凝胶复合材料(B)，150kDa-PCL微球/SIS凝胶复合材料(C)，300kDa-PCL 微球/SIS凝胶复合材料(D)。其中，比例尺为100μm。
图9为实验例5中人脐带静脉内皮细胞(HUVECs)接种在材料表面经 2天培养后的眀场照片。细胞分别接种在单纯的胶原凝胶(A)，SIS凝胶(B) 和PCL微球/SIS凝胶复合材料(C)上。其中，比例尺为100μm。
图10为实验例6中Raw 264.7巨噬细胞接种在材料表面经1天培养后的免疫荧光照片。分别对巨噬细胞Arg1(A，B，C)和iNOS(D，E，F)两个标志物进行免疫荧光染色。其中，比例尺为100μm。
图11为实验例7中单纯SIS凝胶(A，B，C，D)和PCL微球/SIS凝胶复合材料(E，F，G，H)皮下植入经1，4，8和24周后的大体图及填充材料的存留情况。
图12为实验例7中单纯SIS凝胶(A，C)和PCL微球/SIS凝胶复合填充材料(B，D)植入大鼠皮下经24周后的超声影像图。
图13为实验例7中为SIS凝胶(A1，A2，C1，C2，E1，E2，G1，G2) 和PCL微球/SIS凝胶复合材料(B1，B2，D1，D2，F1，F2，H1，H2)皮下注射经1，2，4和8周后的H&E染色。
图14为实验例7中SIS凝胶和PCL微球/SIS凝胶复合材料皮下注射经2， 4，8和24周后的Masson染色。
图15为实验例7中胶原凝胶(A)，SIS凝胶(B)和PCL微球/SIS凝胶复合材料(C)皮下植入经7天后的CD31/αSMA免疫共染色。
图16为实验例7中胶原凝胶(A，D)，SIS凝胶(B，E)和PCL微球 /SIS凝胶复合材料(C，F)皮下植入经3天和7天后的CD86/CD206免疫共染色。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本申请的技术方案作进一步说明。
实施例1SIS凝胶
本实施例所用的SIS凝胶通过如下方法制备：
1)预处理：取4小时内屠宰的猪小肠，将新鲜的猪小肠用自来水冲洗后截为10cm长短，用钝性机械刮除浆膜层和肌肉层，然后用去离子水冲洗振荡数次，得到猪小肠粘膜下层膜(SIS)。
2)脱脂、脱细胞、去垢剂处理和病毒灭活：将猪小肠粘膜下层膜(SIS) 在体积比为1:1的甲醇和氯仿的混合液中浸泡过夜；用0.05％的胰酶和0.05％乙二酸四乙酸(EDTA)溶液在37℃下振荡浸泡12h；用含0.5％十二烷基磺酸钠(SDS)的生理盐水溶液室温振荡浸泡4h；用含0.1％过氧乙酸和20％乙醇的溶液中浸泡20分钟灭活病毒。最后用去离子水彻底冲洗得SIS薄膜，经冷冻干燥后密封保存。
3)SIS消化方法：冻干的SIS薄膜用低温球磨仪研磨为粉末，过80目筛，将得到的SIS微粉加入到1mg/mL的胃蛋白酸溶液(0.01M HCl)中 (W/V＝10:1)，室温下摇床上振荡48小时左右，直至消化液变为澄清均一粘稠的溶液。进一步冷冻干燥，成为可溶性的SIS基质。
4)SIS凝胶的制备：将上述SIS基质用低温球磨仪进行研磨得到小肠粘膜下层基质粉末，研磨频率25Hz，时间8分钟，随后进行分装，环氧乙烷灭菌。使用前将灭菌后的可溶性小肠粘膜下层基质粉末重悬于含NaOH的PBS 无菌溶液中，混合均匀后，置于37℃孵箱孵育，30分钟后即可形成凝胶。
为了证实经本方法制备得到的SIS凝胶仍然保留了重要的促血管生成因子，通过ELISA和免疫荧光的方式进行鉴定。实验方法为：100mg不同处理步骤的SIS样本在冷PBS溶液中经反复研磨后离心，收集上清液用于 ELISA检测，根据ELISA试剂盒(R&D Systems)的检测说明书对各个样本进行酶联免疫测试，由标准曲线计算得到样本中生长因子的含量。研究表明，尽管经过不同处理步骤后，SIS膜中的部分生长因子的含量会受到一定的损失，但最终仍然保留了大量的生长因子。为了更直观看到SIS凝胶中生长因子的保留情况，通过免疫荧光染色的方式对SIS凝胶中的bFGF，TGF-β1和 VEGF这三种促血管生长因子进行定性检测。染色方法为：将制备好的SIS 凝胶置于低温切片机中冰冻，然后切成8μm厚切片，用4％的多聚甲醛固定 5min，PBS清洗三遍，每次清洗10min，分别用TGF-β1、VEGF和bFGF(1:50稀释)抗体4℃孵育过夜，次日恢复室温后，孵育荧光二抗(1:200稀释)，清洗三遍后用正置荧光显微镜观察采图。
结果如图1所示，SIS凝胶中仍然具有这些生长因子(绿色部分)
进一步验证SIS凝胶中富含多种促血管生成作用的生长因子，是否使得其具有体内诱导血管化的作用。实验方法为：将灭菌后的SIS凝胶植入到SD 大鼠皮下，经3天和7天后取材，组织标本经多聚甲醛固定、石蜡包埋、切片、脱蜡复水和抗原修复等处理后进行抗鼠CD31免疫组化染色。
结果如图2所示，SIS凝胶能显著诱导宿主血管生成(箭头所指棕色部分及图2E)，表明SIS凝胶具有促进血管化的生物学活性，这种特性对于后续的软组织填充开发具有重要的意义，有助于填充部位的血管化，促进成纤维细胞的生长，合成新的胶原。
实施例2 PCL微球/小肠粘膜下层复合材料
本实施例中小肠粘膜下层基质粉末的制备方法与实施例1相同
本实施例中PCL微球的制备方法为：
PCL微球是通过O/W乳化溶剂挥发法并用膜乳化器制备得到，具体包含以下步骤：
1)水相(W)和油相(O)的配制方法：8g的聚乙烯醇溶于400mL去离子水中，在300rmp的磁力搅拌，80℃水浴条件下进行溶解，配制成浓度为2％的连续相(即W相)，于常温冷却。0.6g分子量为50-300kDa的PCL 聚合物于4℃溶解在30mL的二氯甲烷中，制备得到浓度为2％的分散相(即 O相)。
2)PCL微球的制备：将直径为10μL的微孔膜管安装于膜乳化器上，一端放置搅拌速度为400rmp的W相，将O相上样至机器进料口，在压强为 0.08-0.012M的条件下，O相经微孔膜管装置被W相带走，得聚己内酯乳液。将乳液在室温下搅拌过夜，使二氯甲烷挥发，经离心洗涤，500目和200目筛网过筛，可得到粒径在25-75μm之间的聚己内酯微球。图3中展示了本实施例中合成的三种分子量的SEM图及PCL微球的粒径分布。
本实施例中PCL微球/小肠粘膜下层复合材料的制备方法为：
1)分别称量50-150mg的聚己内酯微球与30mg小肠粘膜下层基质粉末混合，混合后于冰上分别加入含NaOH的PBS溶液(pH＝12-14)至1mL，分别配成微球体质量体积百分比为5％-15％的混合溶液。
2)于37℃孵箱放置或体内注射一段时间后，小肠下层粘膜基质形成凝胶后将微球包裹形成聚己内酯/小肠粘膜下层凝胶复合填充材料。
为了进一步说明本发明的技术方案,下面通过实验例说明本发明的有益效果。以下实验例中，采用的PCL微球/小肠粘膜下层复合材料均通过实施例2的方法制备得到。
实验例1
图4展示了实施例2的PCL微球/小肠粘膜下层复合材料的保存方法，为一种针剂形式。
为了进一步研究PCL微球/小肠粘膜下层复合材料的温敏特性和可注射性。图5(A)和图5(B)分别展示了小肠粘膜下层基质溶液和加入PCL微球后的复合材料的物态，二者均为液态，能够通过26G针头实现可注射性。而在37℃中孵育30分钟后，复合材料凝固，形成PCL微球/SIS凝胶复合材料。对应的，SIS溶液和加入PCL微球后注射到大鼠皮下1小时内可形成完整的PCL微球/SIS凝胶复合材料(如图5(E)所示)。
本实验例表明，本发明提供的PCL微球/小肠粘膜下层复合材料能够作为注射剂使用。
实验例2
本实验例进一步研究实施例2的PCL微球/小肠粘膜下层复合材料的微观形貌。图6给出了SIS凝胶和PCL微球/SIS凝胶复合材料的SEM表征结果。其中，图6(A)为SIS凝胶，图6(B)为PCL微球/SIS凝胶复合材料。
实验例3
本实验例进一步评价实施例2的PCL微球/小肠粘膜下层复合材料在脂肪酶溶液中的体外降解行为。实验方法为：按照实施例1和实施例2的制备方法，制备不同分子量的PCL微球/SIS凝胶复合材料于安剖瓶中，凝胶后，加入1ml含60U的脂肪酶溶液，在37℃和60rmp转速的条件下进行降解实验，分别于降解1天，3天，5天，7天，10天，14天后收样，冻干后称重和SEM观察。
图7给出了复合材料经降解前后的大体图、微观形貌及质量损失率，其中，图7(A)为单纯的SIS凝胶和不同分子量的PCL微球/SIS凝胶复合材料在脂肪酶溶解中经不同时间降解后的大体图，图7(B)为材料降解前后的 SEM图，图7(C)为各组材料质量损失率的统计结果。
从图7(A)-(C)中可以看到，降解10天时，最低分子量的PCL微球 /SIS凝胶复合材料的质量下降最为明显，质量降低至原来的28.95±2.87％，而150kDa-PCL/SIS(38.7±0.91％)和300kDa-PCL/SIS(42.17±2.68％)无差异，且这两个组在所有观测的时间点内，未发现显著性差异。
以上结果表明，150kDa-PCL/SIS和300kDa-PCL/SIS具有更低的降解速度，是更优的软组织填充材料的选择。
实验例4
本实验例进一步研究实施例2的PCL微球/小肠粘膜下层复合材料的细胞相容性。实验方法为：按照实施例1和实施例2的制备方法，将无菌的SIS 凝胶和PCL/SIS凝胶复合材料制备于48孔板中。生长状态良好的NIH-3T3 成纤维细胞经胰酶消化、离心收集、重悬和计数后接种至完全凝胶化的材料上，接种密度为5000个/孔，在标准细胞培养培养孵箱中(37℃，5％CO2) 培养5天。利用钙黄绿素-AM/PI复合染液进行活/死细胞染色，用激光共聚焦显微镜观察细胞在材料上的生长情况。
图8给出了NIH-3T3成纤维细胞接种在材料表面培养5天后的活/死细胞染色结果。其中，图8(A)为细胞接种在单纯的SIS凝胶，图8(B)为细胞接种在50kDa PCL微球/SIS凝胶复合材料，图8(C)为细胞接种在150kDa PCL微球/SIS凝胶复合材料，图8(D)300kDa PCL微球/SIS凝胶复合材料，图中比例尺均为100μm。
结果显示所有材料上的细胞均表现出较高的活性，证实PCL微球/SIS凝胶复合材料具有良好的细胞相容性。
实验例5
本实验例进一步研究实施例2的PCL微球/小肠粘膜下层复合材料对人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)成管作用的影响。实验方法为：按照实施例1和实施例2的制备方法，将无菌的胶原凝胶，SIS凝胶和PCL/SIS凝胶复合材料制备于24孔板中，以单纯的胶原凝胶作为对照，将HUVECs以每孔3×104的密度接种于三组材料上，培养2天后于普通眀场显微镜下观察细胞的形态。
图9给出了HUVECs接种在材料表面经2天培养后的眀场图像。其中，图9(A)为细胞接种在胶原凝胶上，图9(B)为细胞接种在单纯的SIS凝胶上，图9(C)为细胞接种在PCL微球/SIS凝胶复合材料上。图中比例尺均为100μm。
结果显示，与单纯的SIS凝胶相似，PCL/SIS凝胶复合材料也能够促进HUVECs管腔样结构的形成，表明具有诱导血管化的潜能。
实验例6
本实验例研究实施例2的PCL微球/小肠粘膜下层复合材料对Raw 264.7 巨噬细胞极化功能的影响以进一步证实其生物活性。实验方法为：按照实施例1和实施例2的的制备方法，将无菌的胶原凝胶，SIS凝胶和PCL/SIS凝胶复合材料制备于24孔板中，将Raw264.7巨噬细胞以每孔5×104的密度接种于三组材料上培养2天，通过细胞免疫荧光的手段对巨噬细胞Arg 1和 iNOS进行染色，染色步骤如下：弃原培养液，使用4％的多聚甲醛固定30min，1.5％Triton溶液室温破膜10分钟，10％的山羊血清室温封闭30min，分别在不同孔中加入一抗：Arg 1和iNOS(1:200)，4℃过夜，次日37℃复温1h， PBS洗2～3次，分别加入一种山羊抗小鼠IgG二抗(1:250)，激发波长分别 488nm(Arg 1，显绿色)和594nn(iNOS，显红色)，37℃孵育2h，孵育完成后PBS洗涤2～3次，最后用激光共聚焦显微镜采图分析。
图10给出了Raw264.7细胞接种在材料表明经过1天培养后的iNOS(M1 型巨噬细胞标记)和Arg 1(M2巨噬细胞标记)的免疫荧光染色结果。其中，图10(A，B，C)分别为巨噬细胞接种在胶原凝胶，SIS凝胶及PCL微球/SIS 凝胶复合材料上的Arg 1免疫荧光染色，图10(D，E，F)分别为巨噬细胞接种在胶原凝胶，SIS凝胶及PCL微球/SIS凝胶复合材料上的iNOS染色。图中比例尺为100μm。
结果显示，PCL微球/SIS复合材料能够诱导巨噬细胞向M2型极化(绿色)，具有促进组织再生的作用。
实验例7
本实验例研究实施例2的PCL微球/小肠粘膜下层复合材料皮下注射至小鼠体内后的变化情况。实验方法为：向大鼠皮下注射400μL上述填充材料，经一段时间后进行大体观察，影像学及组织学观察。
图11展示了材料皮下植入经1，4，8，24周后的大体图，可以看到， PCL微球/SIS凝胶复合材料注射后24周内有效地维持了其体积，延长了材料整体的降解时间，而单纯的胶原凝胶和SIS凝胶的发生了显著的降解。
图12展示了单纯的SIS凝胶(A，C)和PCL微球/SIS凝胶复合填充材料(B，D)植入大鼠皮下经半年后的超声影像图。结果发现，PCL微球/SIS 凝胶复合填充材料能够较好地维持体积，单纯的SIS凝胶被完全吸收，而复合材料组仍能检测出回声信号。
以上实验表明，在SIS凝胶中加入PCL微球后，能够显著提高其稳定性，有利于PCL微球/SIS凝胶复合材料在皮下长时间维持形状和体积不变，并发挥持续的填充作用。
图13展示了SIS凝胶(A1，A2，C1，C2，E1，E2，G1，G2)和PCL 微球/SIS凝胶复合材料(B1，B2，D1，D2，F1，F2，H1，H2)皮下注射经 1，2，4，8周后的H&E染色。研究发现，植入一周时，两种填充材料均表现出轻度炎性反应，到了2周时，炎性反应明显减弱，随着时间延长，炎性逐渐降低，到8周时，未见明显的炎性细胞浸润。同时，观察到SIS凝胶在 4周内发生不同程度的降解，到4周时，难以与周围组织相区别，而PCL微球/SIS凝胶复合材料仍然保留在原位。此外，在观察的4个时间节点中，PCL 微球/SIS凝胶复合填充材料中的微球未发生向周围组织流失的现象，均匀分布在填充位点。以上实验证实，PCL微球/SIS凝胶复合材料具有良好的组织相容性，皮下植入后能够锚定在注射位置，未见流失，同时具有更长的降解时间。
图14展示了SIS凝胶和PCL微球/SIS凝胶复合材料皮下注射经2，4，8， 24周后的Masson染色。结果显示，8和24周时，在复合材料组中，PCL微球周围有明显的胶原纤维束生成(图11(F，H)中的蓝色纤维部分)，提示复合材料具有潜在的促进胶原生成的作用，同时新形成的胶原纤维将PCL微球包裹在原位而实现长期的体积维持。
图15展示了材料皮下植入经7天后的CD31/αSMA免疫荧光染色。结果显示，与单纯的SIS凝胶类似，PCL微球/SIS凝胶复合材料仍然具有诱导宿主血管生成的作用。图中比例尺均为100μm。
图16展示了材料皮下植入经3天和7天后的CD86/CD206免疫荧光染色。结果显示，PCL微球/SIS凝胶复合材料能够诱导巨噬细胞向M2型极化，表现出组织修复再生的潜能。
本实验例证明了，本发明的PCL微球/小肠粘膜下层复合材料皮下注射至小鼠体内后，能够长时间维持形状和体积不变，发挥持续的填充作用；且其具有良好的组织相容性，皮下植入后能够锚定在注射位置，未见流失，同时具有更长的降解时间；同时其能够发挥良好的诱导宿主血管生成及诱导巨噬细胞向M2型极化的作用，表现出促进组织修复再生的潜能。
从以上实施例和实验例可以看到，SIS凝胶中富含生长因子，能够有效促进血管化并调节巨噬细胞向M2型极化，因而十分有利于促进组织修复； SIS凝胶中加入PCL微球后，能够显著提高其稳定性，有利于维持凝胶材料的形状和体积，动物实验结果表明，PCL微球/SIS凝胶复合材料植入后具有较长时间的体积维持作用，不向周围组织发生流失，同时具有促进组织修复再生的潜能；且SIS的溶液中加入PCL微球后仍然具有可注射性和温敏固化的特性，使得PCL微球/小肠粘膜下层复合材料非常适合作为软组织填充材料进行注射使用，具有良好的组织相容性和潜在的促组织再生作用。

Claims (4)

1.一种聚己内酯微球/小肠粘膜下层复合材料，其特征在于，它是按照如下方法制备而成的：1）分别称量50-150 mg的聚己内酯微球与30 mg小肠粘膜下层基质粉末混合，混合后于冰上分别加入含NaOH的pH=12-14的PBS溶液至1mL，分别配成微球体质量体积百分比为5%-15%的混合溶液；
2）小肠粘膜下层基质于37℃形成凝胶后将微球包裹形成聚己内酯/小肠粘膜下层凝胶复合填充材料；
所述聚己内酯微球的粒径为25-75 μm，所述聚己内酯微球的分子量为150-300 kDa。
2.按照权利要求1所述的复合材料，其特征在于：聚己内酯微球是通过O/W乳化溶剂挥发法在膜乳化器中制备得到，其具体过程为：
（1）将聚己内酯聚合物溶于二氯甲烷后，在膜乳化器中被PVA水溶液带走，得到乳液；
（2）得到的乳液过夜搅拌使二氯甲烷挥发；
（3）经过步骤（2）处理的乳液经离心、过滤、彻底清洗并冷冻干燥后即得聚己内酯微球。
3.一种聚己内酯微球/小肠粘膜下层复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）分别称量50-150 mg的聚己内酯微球与30 mg小肠粘膜下层基质粉末混合，混合后于冰上分别加入含NaOH的pH=12-14的PBS溶液至1mL，分别配成微球体质量体积百分比为5%-15%的混合溶液；
2）小肠粘膜下层基质于37℃形成凝胶后将微球包裹形成聚己内酯/小肠粘膜下层凝胶复合填充材料；
所述聚己内酯微球的粒径为25-75 μm，所述聚己内酯微球的分子量为150-300 kDa。
4.按照权利要求3所述制备方法，其特征在于：聚己内酯微球是通过O/W乳化溶剂挥发法在膜乳化器中制备得到，其具体过程为：
（1）将聚己内酯聚合物溶于二氯甲烷后，在膜乳化器中被PVA水溶液带走，得到乳液；
（2）得到的乳液过夜搅拌使二氯甲烷挥发；
（3）经过步骤（2）处理的乳液经离心、过滤、彻底清洗并冷冻干燥后即得聚己内酯微球。
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