CN103100113A - 人工骨-软骨复合物及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人工骨—软骨复合物及其制造方法。本发明涉及一种人工骨—软骨复合物，其通过含有胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和磷酸钙的结合层将含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料层与含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料层结合而形成。

Description

人工骨-软骨复合物及其制造方法

技术领域

本发明涉及以生物体软骨成分为原料的富有弹性的人工软骨与人工骨强力结合形成的人工骨—软骨复合物，及其制造方法。 

背景技术

在变形性关节病、关节风湿病等的骨关节疾病中，组织随着时间被破坏，关节软骨组织极其缺乏修复能力。因此，作为骨关节疾病的治疗，除了药物疗法，人工关节置换术被使用开来。以为了骨缺损·破坏治疗用而开发的羟磷灰石为主要成分的人工骨具有高的骨亲和性和类似于骨的刚性，通过将其植入·填充入骨折、骨肿瘤等与骨相关的疾病中的骨缺损部位发挥良好的治疗效果。 

一方面，尽管可对于关节滑动（可动）面中的关节软骨组织的高度变性·破坏实施金属人工关节置换术，但是最近开发了在结构和功能上都与生物体软骨近似的软骨的再生技术。由于在伴随高度关节变性·破坏的病变中，不只是软骨组织，涉及到从软骨下骨层至关节附近的骨组织的病变的情况很多，因此需要不仅含有软骨还要含有其下层的骨组织的再生·再造。 

美国专利申请公开号2009/0311221公开了一种自我组织化的糖胺聚糖/蛋白聚糖/胶原蛋白复合物的制造方法，其具有以下工序：（a）混合糖胺聚糖和蛋白聚糖，制备糖胺聚糖-蛋白聚糖聚集体的工序，和（b）将胶原蛋白混合入上述糖胺聚糖-蛋白聚糖聚集体中的工序。 

美国专利第7,153,938公开了一种制造多孔磷灰石/胶原蛋白交联复合物的方法，该方法将含有磷灰石/胶原蛋白复合材料和胶原蛋白的分散物凝胶化，通过冷冻干燥制成多孔体后，通过将多孔体中的胶原蛋白交联，使该多孔磷灰石/胶原蛋白交联复合材料以与生物体骨相同的机制被体内吸收，同时具有高的骨生成能力，能够用于人工骨等。 

日本专利公开号2009-268494公开了使由糖胺聚糖、蛋白聚糖和胶 原蛋白形成的软骨样复合物与人工骨接触，以人工骨作为基础使软骨样复合物自我组织化，由此来制造软骨样复合物和人工骨融合的人工骨·软骨一体型生物材料的方法，其记载了通过在人工骨上使软骨构成成分自我组织化，使胶原蛋白纤维不仅结合于多孔性羟磷灰石人工骨的表面，还结合于孔结构的内部。然而，通过日本专利公开号2009-268494记载的方法制备的生物材料，仅仅由于软骨样复合物侵入缠绕人工骨的气孔内部，而具有从人工骨剥离的可能性。因此，需要进一步的改进。 

日本专利公开号2011-36320公开了一种植入用多层软骨块，其由将孔隙率低的多孔明胶层与孔隙率高的多孔明胶层层积形成，其能够限制血液流入孔隙率低的多孔明胶层，然而软骨细胞进入孔隙率高的多孔明胶层，因此促进软骨细胞的生长，能够达到软骨缺损部的早期修复的目的。但是，日本专利公开号2011-36320中记载的植入用多层软骨块是由孔隙率不同的两种多孔明胶层形成的，没有作为人工软骨和人工骨结合所形成的复合材料的功能。 

美国专利申请公开号2009/0022771公开了含有无机材料和有机材料的复合物的生物体材料的制备方法，其具有以下工序：（1）制备含有液体载体、无机材料和有机材料的第一浆体组合物的工序，（2）制备含有液体载体、有机材料和任选的无机材料的第二浆体组合物的工序，（3）在注入第一浆体组合物之前或之后将第二浆体组合物注入模具中的工序，（4）在将液体载体转化为数个固体结晶或粒子的温度下，将注入模具的浆体冷却的工序，（5）优选通过升华和/或蒸发将至少部分的固体结晶或粒子除去，制得含有无机材料和有机材料的多孔复合物材料的工序，和（6）从模具中取出多孔复合物材料的工序。美国专利申请公开号2009/0022771记载了，第一浆体组合物含有胶原蛋白、磷酸钙和糖胺聚糖的三成分共沉淀物，第二浆体组合物含有胶原蛋白和糖胺聚糖的二成分共沉淀物、胶原蛋白和磷酸钙的二成分共沉淀物、或胶原蛋白、糖胺聚糖和磷酸钙的三成分的共沉淀物。然而，美国专利申请公开号2009/0022771中记载的方法，由于以浆体的状态将两种不同组成的材料层积，因此得到的复合物材料是两种浆体基本上均一混合的混合物，不能形成人工软骨和人工骨相结合的结构。 

发明内容

[发明目的] 

因此，本发明的目的是提供人工软骨强力结合于人工骨形成的人工骨—人工软骨复合物，及其制造方法。 

[发明要点] 

鉴于上述目的专心研究的结果，本发明人发现通过在交界处形成第一复合材料层和第二复合材料层相互混合形成的结合层，将含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料层与含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料层结合，从而得到了第一复合材料层与第二复合材料层强力结合的，适合作为人工骨—软骨复合物的材料，想到了本发明。 

即，本发明的人工骨—软骨复合物的特征在于其通过含有胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和磷酸钙的结合层，将含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料层与含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料层结合而形成。 

所述第一复合材料层优选含有15~95质量%的胶原蛋白、4.9~70质量%的蛋白聚糖和0.1~20质量%的透明质酸。 

所述第二复合材料层优选为多孔磷灰石/胶原蛋白复合物。 

在第二复合材料层中的磷灰石/胶原蛋白的比例优选为8/2～2/8（质量比）。 

本发明的人工骨—软骨复合物优选经过交联处理。 

一种制造通过含有胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和磷酸钙的结合层将含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料层与含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料层结合形成的人工骨—软骨复合物的本发明的方法，其特征在于具有以下工序：（1）制备含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料的工序，（2）制备含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料的工序，（3）将第一复合材料与第二复合材料层积的工序，和（4）将得到的层积物冷冻干燥的工序。 

优选在层积第一复合材料和/或第二复合材料的工序之前或之后进行离心分离处理。 

优选在冷冻干燥工序前使层积物凝胶化。 

优选第一复合材料为凝胶状，第二复合材料为浆体状或凝胶状。 

附图说明

图1为显示本发明的人工骨—软骨复合物中人工软骨和人工骨的交界处的电子显微镜照片。 

具体实施方式

[1]人工骨-软骨复合物 

（A）整体结构 

本发明的人工骨—软骨复合物是将含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料层与含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料层结合形成的，其在第一复合材料层和第二复合材料层的交界处具有含有胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和磷酸钙的结合层。第一复合材料层即具有所谓的人工软骨的功能，第二复合材料层即具有所谓的人工骨的功能。由于结合层的第一复合材料和第二复合材料相互扩散，其组成连续变化，因此没有明确的界限。本发明的说明书中，将通过第一材料和第二材料通过扩散而混合的部分称为结合层。 

因此，结合层是第一复合材料和第二复合材料混合而组成的，即具有由胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和磷酸钙形成的组成，越接近第一复合材料层，就越接近由胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸形成的第一复合材料的组成，越接近第二复合材料层，就越接近由胶原蛋白和磷酸钙形成的第二复合材料的组成。 

通过具有这样的第一复合材料层和第二复合材料层混合的结合层，使得第一复合材料层和第二复合材料层强力地结合，即使是植入病患部位也不易剥离。 

可以根据人工骨—软骨复合物的使用部位适当地决定人工骨—软骨复合物的尺寸和形状，以及第一复合材料层和第二复合材料层的尺寸比。一般地，第一复合材料层优选具有约1mm～2cm的厚度，第二复合材料层优选具有约5mm～10cm的厚度。各个形状可以为圆柱形、长方体等，没有特别地限定。另外，第一复合材料层与第二复合材料 层的形状可以相同也可以不同。 

（B）第一复合材料层 

第一复合材料层含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸，具有所谓的人工软骨的功能。第一复合材料层优选含有15~95质量%的胶原蛋白、4.9~70质量%的蛋白聚糖和0.1~20质量%的透明质酸。通过胶原蛋白形成作为软骨组织骨架的网状结构，进一步物理地和/或化学地形成透明质酸和蛋白聚糖的交联，能够保持充足的水分，得到具有软骨特有的弹性的人工软骨（第一复合材料层）。第一复合材料层中的胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的量更优选分别为45~65质量%、20~40质量%和1.5~5质量%。在该范围内的情况下，人工软骨特别适合作为关节软骨。 

胶原蛋白的含量不足15质量%的情况下，由于插入生物体时的膨胀率大，很难使人工软骨适合软骨缺损部，且由于膨胀使孔隙率降低。胶原蛋白含量超过95质量%的情况时，人工软骨的着色变大。蛋白聚糖含量不足4.9质量%的情况时，人工软骨的弹性下降，作为软骨的性能下降。蛋白聚糖含量超过70质量%的情况时，由于膨胀尺寸的变化大，人工软骨的孔隙率下降。透明质酸含量不足0.1质量%的情况时，人工软骨的弹性下降，作为软骨的性能下降，同时人工软骨表面的润滑性（低摩擦性）下降。透明质酸含量超过20质量%的情况时，大大超过了生物体软骨中所含有的比例，由于人工软骨成为与生物体软骨不同成分的材料，根据适用部位，确保胶原蛋白和蛋白聚糖的合意的含有比例变得困难。 

作为胶原蛋白，没有特别地限定，可以使用从动物等提取的物质。并且作为来源的动物的种类、组织部位、年龄等也没有特别地限定。一般地，可以使用从哺乳动物（例如牛、猪、马、兔子、老鼠等）或鸟类（例如鸡等）的皮肤、骨、软骨、肌腱、脏器等得到的胶原蛋白。还可以使用从鱼类（例如鳕鱼、比目鱼、蝶鱼、鲑鱼、鳟鱼、金枪鱼、鲭鱼、红鲷鱼、沙丁鱼、鲨鱼等）的皮、骨、软骨、鳍、鳞、脏器等得到的胶原样蛋白。另外，胶原蛋白的提取方法没有特别地限定，可以使用一般的提取方法。也可以使用合成胶原蛋白或通过基因重组技术得到的胶原蛋白代替从动物组织中提取出的胶原蛋白。 

糖胺聚糖是由氨基糖与糖醛酸或半乳糖结合得到的二糖的重复结构形成的酸性多糖的一种。本发明中使用的透明质酸是糖胺聚糖的一种，除了透明质酸的糖胺聚糖，还可以使用例如硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、肝素等，优选使用透明质酸。 

蛋白聚糖是在一个作为核心的蛋白质上结合一条或多条糖胺聚糖链的物质。作为蛋白聚糖没有特别地限定，可以举例聚集蛋白聚糖、多功能蛋白聚糖、神经蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、饰胶蛋白聚糖、双链蛋白聚糖、丝甘蛋白聚糖、基底膜聚糖、多配体聚糖、磷脂酰肌醇聚糖、基膜聚糖、角膜蛋白聚糖等，但是优选聚集蛋白聚糖。 

蛋白聚糖的来源没有特别地限定，根据复合物的使用目的，可以从哺乳动物（人类、牛、猪等）、鸟类（鸡等）、鱼类（鲨鱼、鲑鱼等）、甲壳类（螃蟹、虾等）等的各种动物来源中适当地选择。特别地，当将本发明的人工骨—软骨复合物用作人类软骨缺损或变性的治疗时，则优选从人免疫原性低的来源中选择。 

人工软骨中的胶原蛋白的定量法，可以举例UV吸收测定法、HPLC法等。透明质酸的定量法，可以举例咔唑硫酸法、利用透明质酸结合性蛋白质的抑制法、HPLC法等。蛋白聚糖的定量法，可以举例比色定量法（使用色素DMMB）、HPLC法等。 

优选对人工软骨实施交联处理。交联处理可以通过物理的或化学的方法进行。并且，人工软骨优选通过γ射线处理等方法灭菌处理。 

人工软骨的孔隙率优选50~99%，更优选60~99%。人工软骨的平均气孔径优选1～1000μm，更优选50～800μm。 

（C）第二复合材料层 

第二复合材料层含有胶原蛋白和磷酸钙，具有所谓的人工骨的功能。第二复合材料层优选为多孔磷灰石/胶原蛋白复合物。多孔磷灰石/胶原蛋白复合物由于被湿润形成可以变形的海绵状体，能够易于适用于复杂形状的病患部位。另外，第二复合材料层经时被自体骨取代。 

多孔磷灰石/胶原蛋白复合物由数个磷灰石/胶原蛋白复合物纤维层形成。所述纤维层为具有约10～500μm厚度的板状，以随机的方向和随机的层数重叠。磷灰石/胶原蛋白复合物纤维聚集而成的柱状物分散在纤维层之间。当微观看时，由于纤维层的重叠方向仅由分散的柱 状物支撑，一方面认为该方向的磷灰石/胶原蛋白多孔体比较脆弱，而另一方面认为在该层方向上具有强度。但是，如上所述，由于纤维层的重叠是随机的，宏观来看，纤维层的重叠方向是平均的，强度的各向异性并不大。 

通过柱状物分散在纤维层之间，气孔基本上形成板状。基本上成板状的气孔的厚度为纤维层的约0.5~10倍。当将该多孔磷灰石/胶原蛋白复合物埋入生物体内时，由于血管和比较大的蛋白质等容易进入基本上成板状的气孔中，因此认为能促进骨的形成。 

多孔磷灰石/胶原蛋白复合物中的磷灰石/胶原蛋白的比例优选8/2～2/8（质量比），特别优选约8/2（质量比）。多孔磷灰石/胶原蛋白复合物的孔隙率优选为70～99％，更优选80～97％。多孔磷灰石/胶原蛋白复合物的平均气孔径优选1～1000μm，更优选100～700μm。 

（D）结合层 

第一复合材料层和第二复合材料层的交界处具有含有胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和磷酸钙的结合层。如图1中所示，结合层具有将第一复合材料层和第二复合材料层混合的组成，两个复合材料层强力地结合。优选所述结合层具有厚度，该厚度具有使第一复合材料层和第二复合材料层不剥离的实用的强度。具体地，所述结合层的厚度优选1～3000μm，更优选1～2000μm，最优选1～1000μm。 

[2]制造方法 

制造人工骨—软骨复合物的本发明的方法具有以下工序：（1）制备含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料的工序，（2）制备含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料的工序，（3）将第一复合材料和第二复合材料层积的工序，和（4）将得到的层积物冷冻干燥的工序。 

优选在层积工序之前或之后进行离心分离处理第一复合材料和/或第二复合材料。优选在冷冻干燥层积物之前进行凝胶化。第一复合材料优选为凝胶状，第二复合材料优选为浆体状或凝胶状。 

（A）第一复合材料的制备 

按照混合后含有15~95质量%的胶原蛋白、4.9~70质量%的蛋白聚糖和0.1~20质量%的透明质酸的组成将作为人工软骨原料的胶原蛋 白、蛋白聚糖和透明质酸混合可得到第一复合材料。优选使用将胶原蛋白以0.1~20质量%的浓度预先溶解于水或稀盐酸（约5~50mM的浓度）中的物质。优选使用将蛋白聚糖以0.1~20质量%的浓度预先溶解于无菌水（注射用水等）中的物质。优选使用将透明质酸以0.1~20质量%的浓度预先溶解于无菌水（注射用水等）中的物质。 

在进行（a-1）分别制备透明质酸和胶原蛋白的混合物以及蛋白聚糖和胶原蛋白的混合物，而后混合的第一混合方法、或（a-2）将胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸同时混合的第二混合方法之后，（b）将得到的混合物冷冻干燥（第一冷冻干燥），由此可以制备第一复合材料。在第一冷冻干燥工序之后，还可以进行将得到的冷冻干燥物粉碎的工序，将粉碎后的冷冻干燥物分散于水中的工序，和将得到的分散物再次冷冻干燥的工序（第二冷冻干燥工序）。 

（1-1）第一混合方法 

第一混合方法具有以下工序：（a）制备由透明质酸和胶原蛋白形成的第一组合物的工序，（b）制备由蛋白聚糖和胶原蛋白形成的第二组合物的工序，（c）将第一组合物和第二组合物混合的工序。 

（a）第一和第二组合物的制备 

在制备第一组合物的工序中，按照透明质酸/胶原蛋白的质量比优选为10000：1～1：10000、更优选为5000：1～1：5000、最优选为15：1～1：15，将透明质酸水溶液和胶原蛋白水溶液混合。优选在3～25℃进行透明质酸水溶液和胶原蛋白水溶液的混合。 

在制备第二组合物的工序中，按照蛋白聚糖/胶原蛋白的质量比优选为10000：1～1：10000、更优选为5000：1～1：5000、最优选为10：1～1：10，将蛋白聚糖水溶液和胶原蛋白水溶液混合。优选在3～25℃进行蛋白聚糖水溶液和胶原蛋白水溶液的混合。 

由于透明质酸水溶液和胶原蛋白水溶液的混合（第一组合物的制备）以及蛋白聚糖水溶液和胶原蛋白水溶液的混合（第二组合物的制备）不需要特别高的剪切，因此可以使用通常使用的搅拌器、混合器等器具进行。为了能够分别得到透明质酸和胶原蛋白的均一混合物，以及蛋白聚糖和胶原蛋白的均一混合物，优选在3～25℃进行约1秒~3分钟的混合。 

（b）第一和第二组合物的混合 

按照混合后含有15~95质量%的胶原蛋白、4.9~70质量%的蛋白聚糖和0.1~20质量%的透明质酸的组成确定第一组合物和第二组合物的混合比。优选使用均质机、溶解器等的器具，通过具有剪切力的方法进行第一和第二组合物的混合。例如，在使用均质机的情况中，优选以1,000～12,000rpm的转速，进行30秒~3分钟的搅拌重复2~5次。优选混合时的样品保持在约3～25℃。通过将分别制备的第一和第二组合物混合，能够促进软骨合成的进行。 

（1-2）第二混合方法 

在第二混合方法中，按照含有15~95质量%的胶原蛋白、4.9~70质量%的蛋白聚糖和0.1~20质量%的透明质酸的组成，同时混合胶原蛋白水溶液、蛋白聚糖水溶液和透明质酸水溶液。 

优选使用均质机、溶解器等的器具，施加剪切力混合胶原蛋白水溶液、蛋白聚糖水溶液和透明质酸水溶液。例如，在使用均质机的情况中，优选以1,000～12,000rpm的转速，进行30秒~3分钟的搅拌重复2~5次。优选在3～25℃进行胶原蛋白水溶液、蛋白聚糖水溶液和透明质酸水溶液的混合。 

（2）第一冷冻干燥 

将通过第一混合方法或第二混合方法得到的混合物置于热传导性好的容器（金属托盘）中，于－80℃～－60℃冷冻过夜一晚。对于冷冻后的混合物，以隔板温度约－50℃～－5℃（优选－40℃～－5℃）进行约10小时~10天的抽真空直至混合物的水分（冰）基本上被除去来进行第一干燥工序，将隔板温度升高至约20～40℃（优选25～40℃）另进行3~24小时的抽真空来进行第二干燥工序。由此，通过使温度经过两个阶段的变化的冷冻干燥，甚至除去了结合水，可以得到更加干燥的具有优良保存性的冷冻干燥物。 

（3）粉碎 

用磨粉机等的固体粉碎器粉碎得到的冷冻干燥物。粉碎方法没有特别地限定，但是优选使冷冻干燥物的温度不要过高来进行粉碎。 

（4）分散 

按照3~20质量%的浓度将粉碎后的冷冻干燥物与水或生理盐水混 合，使用均质机等的器具，以3～25℃和1,000～15,000rpm的条件，进行30秒~3分钟×1~5次的分散处理，得到第一复合材料。 

（5）凝胶化 

根据需要可以使分散物（第一复合材料）凝胶化。优选将第一复合材料置于培养皿等容器中盖上盖子，于30～40℃静置1~5小时，进行凝胶化。 

（B）第二复合材料的制备 

（1）组成 

第二复合材料为含有由磷灰石/胶原蛋白复合物形成的纤维的浆体，以胶原蛋白、磷酸或其盐和钙盐为原料得到。作为胶原蛋白没有特别地限定，可以使用从动物等提取出来的物质。另外，来源动物的种类、组织部位、年龄等没有特别地限定。一般地，可以使用从哺乳动物（例如牛、猪、马、兔子和老鼠）或鸟类（例如鸡）的皮肤、骨、软骨、肌腱、脏器等得到的胶原蛋白。另外，也可以使用从鱼类（例如鳕鱼、比目鱼、蝶鱼、鲑鱼、鳟鱼、金枪鱼、鲭鱼、红鲷鱼、沙丁鱼、鲨鱼）的皮、骨、软骨、鳍、鳞、脏器等得到的胶原蛋白样蛋白。并且，胶原蛋白的提取方法也没有特别地限定，可以使用一般的提取方法。可以使用合成胶原蛋白或通过基因重组技术得到的胶原蛋白代替从动物组织中提取的胶原蛋白。 

作为磷酸或其盐（下面简称为“磷酸(盐)”），可以举例为磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和磷酸二氢钾。并且，作为钙盐可以举例碳酸钙、醋酸钙和氢氧化钙。优选将磷酸盐和钙盐分别以均一的水溶液或水混悬液的状态添加。 

通过使用的磷灰石原料（磷酸(盐)和钙盐）和胶原蛋白的质量比，能够控制第二复合材料中的磷灰石/胶原蛋白的质量比。因此，基于目标磷灰石/胶原蛋白复合物纤维的含有比例适当地决定使用的磷灰石原料和胶原蛋白的质量比。磷灰石原料/胶原蛋白的质量比优选为9/1～6/4，特别优选为约8/2。 

（2）制备 

制备胶原蛋白和磷酸(盐)的水溶液（简称“胶原蛋白/磷酸(盐)水溶液”），和钙盐的水溶液或水混悬液。在胶原蛋白/磷酸(盐)水溶液中， 胶原蛋白的浓度优选为0.1～1.2质量%，特别优选为约0.85质量%，磷酸(盐)的浓度优选为约50～250mM。钙盐水溶液（或水混悬液）的浓度优选为约200～600mM。优选将胶原蛋白以低浓度的磷酸水溶液状态加入磷酸(盐)水溶液中，制备胶原蛋白/磷酸(盐)水溶液。在胶原蛋白的磷酸水溶液中，优选胶原蛋白的浓度为0.5～1.5质量%，磷酸的浓度为10～30mM。 

（3）合成 

向优选为钙盐水溶液（或水混悬液）的0.5~2倍，更优选为0.8~1.2倍，特别地与钙盐水溶液（或水混悬液）基本等量的水中（约40℃），同时滴加胶原蛋白/磷酸(盐)水溶液和钙盐水溶液（或水混悬液），由此合成磷灰石/胶原蛋白复合物纤维。通过滴加条件（温度、滴加速度、搅拌速度等）能够控制磷灰石/胶原蛋白复合物纤维的长度。滴加速度优选为约10～50ml/min、搅拌优选为约50～300rpm。 

在滴加中，为了将钙离子浓度维持在3.75mM以下，且将磷酸离子浓度维持在2.25mM以下，优选将反应溶液的pH保持在8.9~9.1。钙离子和/或磷酸离子的浓度超过上述范围时，阻碍磷灰石/胶原蛋白复合物的自我组织化。本发明说明书中的“自我组织化”是指沿着胶原蛋白纤维羟磷灰石（具有磷灰石结构的磷酸钙）进行生物体骨的特有的定向，即指羟磷灰石的C轴沿着胶原蛋白纤维定向。通过上述滴加的条件，磷灰石/胶原蛋白复合物纤维能够以作为多孔体原料的合适的1mm以下的长度自我组织化。 

滴加结束后，将成为浆体状的磷灰石/胶原蛋白复合物纤维的分散物冷冻干燥。以－10℃以下的冷冻状态抽真空，通过迅速使其干燥进行冷冻干燥。 

（4）分散物的制备 

向磷灰石/胶原蛋白复合物纤维中加入水、磷酸水溶液等，搅拌，制备糊状的分散物。该分散物所含有的液体的含量优选为80~99体积%，更优选为90~97体积%。也就是说，复合物纤维的含量优选为1～20体积%，更优选为3～10体积%。优选预先使磷灰石/胶原蛋白复合物纤维附着水蒸气。在这种情况中，需要减去磷灰石/胶原蛋白复合物纤维上附着的水蒸气的量来确定添加的水的量。 

制造的多孔体的孔隙率P（%）取决于分散物中磷灰石/胶原蛋白复合物纤维与液体的体积比，其通过下式（1）表示： 

P=Y／(X＋Y)×100···(1) 

其中，X表示分散物中磷灰石/胶原蛋白复合物纤维的体积、Y表示分散物中液体的体积。因此，能够根据添加的液体的量控制多孔体的孔隙率P。由于通过在添加液体后搅拌分散物，磷灰石/胶原蛋白复合物纤维被切断，纤维长度的分布幅度增大，因此增加了制造的多孔体的强度。 

向磷灰石/胶原蛋白复合物纤维的分散物中添加作为粘合剂的胶原蛋白，进一步搅拌。相对于磷灰石/胶原蛋白复合物纤维100质量%，胶原蛋白添加量优选为1~10质量%，更优选为3~6质量%。与磷灰石/胶原蛋白复合物纤维的情况相同，优选以将胶原蛋白以溶解于磷酸水溶液的状态添加。胶原蛋白/磷酸(盐)水溶液中的胶原蛋白和磷酸(盐)的浓度没有特别地限定，但实际上优选胶原蛋白的浓度为0.8～0.9质量%（例如0.85质量%），优选磷酸(盐)的浓度为15~25mM（例如20mM）。 

由于通过胶原蛋白/磷酸(盐)水溶液的添加，使分散物成为了酸性，因此优选添加氢氧化钠水溶液将pH调至6.8~7.6，更优选将pH调至7.0~7.4，特别优选将pH调至约7。通过将分散物的pH调至6.8~7.6，能够促进作为粘合剂的胶原蛋白的纤维化。 

向分散物中添加磷酸缓冲液（PBS）的约2.5~10倍的浓缩液并搅拌，优选使离子强度与PBS相同（约0.2~0.8）。通过使分散物的离子强度增大，能够促进作为粘合剂而添加的胶原蛋白的纤维化。 

由此，能够得到浆体状的磷灰石/胶原蛋白复合材料（第二复合材料）。另外，可以省略粘合剂的添加、pH调节、和离子强度调节之一或全部省略。可以通过在35～43℃保持0.5~3.5小时，使浆体状的磷灰石/胶原蛋白复合物凝胶化。 

（C）第一复合材料和第二复合材料的层积 

使得到的凝胶状的第一复合材料和浆体状或凝胶状的第二复合材料在容器中层积，而不要打乱两者的界面。第一和第二复合材料的层积顺序没有特别地限定，但是优选预先将第二复合材料加入容器中， 不打乱界面，在其上面加入第一复合材料而进行层积。 

将两种复合材料依次加入容器中时，为了使界面平坦，优选进行离心分离处理。例如，以容器中加入构成下层的一种复合材料的状态进行第一次离心分离处理，使该种复合材料的表面平坦。然后，将构成上层的另一种复合材料加入容器中，层积两层，以这样的状态进行第二次离心分离处理。由此，能够得到两种复合材料层的界面平坦的层积物。可以省略第一次离心分离处理和第二次离心分离处理之一。 

（D）凝胶化 

通过在预定的温度保持得到的层积物，在凝胶化层积物的同时，构成第一复合材料和第二复合材料的成分（胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和磷酸钙）相互扩散。其结果，形成了连续变化的结合层，该结合层具有由胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和磷酸钙形成的组成，并且该组成随着接近第一复合材料层蛋白聚糖和透明质酸变多（接近于第一复合材料层的组成），而随着接近第二复合材料层磷酸钙变多（接近于第二复合材料层的组成）。为了凝胶化和形成结合层，优选保持温度为35～43℃，更优选为35～40℃。为了使分散物充分凝胶化而形成结合层，优选保持时间为0.5～3.5小时，更优选为1～3小时。 

（E）第二冷冻干燥 

冷冻干燥凝胶化的层积物，就得到人工骨—软骨复合物。在冷冻时，优选将装有层积物的容器置于不锈钢托盘内放置的网状隔板上。优选预先在2～10℃冷藏凝胶化的层积物1~24小时之后进行冷冻。冷冻温度优选为－100～0℃，更优选为－90～－10℃，最优选为－80～－20℃。冷冻温度不足－100℃时，冷冻干燥后的多孔磷灰石/胶原蛋白复合物层（第二复合材料层）的气孔径变得过小。冷冻温度超过0℃时，不能冷冻。优选冷冻时间为12～48小时。 

对于冷冻后的层积物，以隔板温度为约－50℃～－5℃（优选－40℃～－5℃）进行约3天~1周的抽真空直至层积物的水分（冰）基本上全被除去来进行第一干燥工序，保持抽真空的状态将隔板温度升高至约20～40℃（优选25～40℃），另进行3~24小时的第二干燥工序。由此，通过使温度经过两个阶段变化的冷冻干燥，除去了甚至是结合水，能够得到更干燥的具有优良的保存性的冷冻干燥物。 

（F）交联和灭菌处理 

为了在提高人工骨—软骨复合物的机械强度的同时能够在插入体内时被长时间地保持，优选交联处理冷冻干燥后的多孔层积物。作为交联处理可以使用γ射线、紫外线、电子束、热脱水等的物理交联方法，或使用交联剂、缩合剂的化学交联方法进行。作为化学交联方法，例如可以举例，将冷冻干燥物后的多孔层积物浸渍于交联剂溶液中的方法，使含有交联剂的蒸气作用于冷冻干燥后的多孔层积物的方法，以及向第一复合材料和第二复合材料的水溶液或分散物添加交联剂的方法。 

在这些方法中，本发明优选热脱水交联法。热脱水交联法可以通过将冷冻干燥后的多孔层积物在100～160℃和0～100hPa的真空烘箱中保持10~30小时进行。 

优选将这样得到的人工骨-软骨复合物通过紫外线、γ射线、电子束、干燥加热等灭菌处理。特别地，优选通过照射25kGy以下的γ射线灭菌。 

通过实施例进一步详细说明本发明，本发明并不限定于此。 

实施例1 

（1）第一复合材料的制备 

将胶原蛋白溶解于5mM盐酸中，制备1质量%浓度的胶原蛋白水溶液。另将蛋白聚糖溶解于注射用水中，制备1质量%浓度的蛋白聚糖水溶液，并且，将透明质酸溶解于注射用水中，制备0.1质量%浓度的透明质酸水溶液。另外，这些制备全部在4℃进行。 

以1:1（质量比）混合胶原蛋白水溶液和蛋白聚糖水溶液，用混合器搅拌得到混合液A。同样地，以1:1（质量比）混合胶原蛋白水溶液和透明质酸水溶液，用混合器搅拌得到混合液B。以2:1（质量比）混合混合液A和B，用均质机以10,000rpm的转速，30秒的间隔，进行3次每次1分钟的搅拌。另外，将样品的温度保温在5℃进行搅拌。 

对于得到的混合物，按照下述顺序进行第一冷冻干燥。即，将混合物灌浆于托盘中，于-80℃冷冻19小时，然后于隔板温度-5℃进行10天的抽真空来进行第一干燥。通过该第一干燥，基本除去混合物的所有水分（冰）。继续保持抽真空的状态下，将隔板温度升高至25℃， 另进行3小时的第二干燥，得到冷冻干燥物。 

将得到的冷冻干燥物用磨粉机粉碎后，按照10.7质量%的浓度将粉碎后的冷冻干燥物与生理盐水混合，用均质机，以10,000rpm的条件，进行3次每次1分钟的分散（间隔：1分钟）。另外，于5℃保温进行通过均质机的分散。 

用自转·公转搅拌机（シンキ一社製、あわとり練太郎ARE-250）将得到的分散物搅拌1分钟，去除分散物中含有的气泡，得到凝胶状的胶原蛋白/蛋白聚糖/透明质酸复合材料（第一复合材料）。 

（2）第二复合材料的制备 

向120mM的磷酸水溶液42ml中加入350g胶原蛋白/磷酸水溶液（胶原蛋白浓度：0.57质量%，磷酸浓度：20mM）并搅拌，制备被称为“液I”的胶原蛋白/磷酸水溶液。另外，制备200ml 400mM的氢氧化钙水混悬液（液II）。向反应容器中加入200ml纯净水，加热至38℃。向该反应容器的纯水中分别以约30ml/分钟的速度同时滴加胶原蛋白/磷酸水溶液（液I）和氢氧化钙水混悬液（液II），同时以200rpm搅拌反应溶液，制备含有磷灰石/胶原蛋白复合物纤维的浆体。调节滴加速度使反应溶液的pH保持在8.9~9.1。于－30℃冷冻干燥生成的磷灰石/胶原蛋白复合物纤维的浆体。磷灰石/胶原蛋白复合物纤维的长度大部分在1mm以下，磷灰石/胶原蛋白的质量比为8/2。 

向2重量份的冷冻干燥后的磷灰石/胶原蛋白复合物纤维中加入13重量份的生理盐水并搅拌，制成糊状分散物。于37.5℃将分散物静置2小时，然后进一步于5℃静置使其凝胶化，得到凝胶状的磷灰石/胶原蛋白复合材料（第二复合材料）。 

（3）层积物的制备 

向细胞培养用多孔板（体积：3.4ml）中加入3g凝胶状磷灰石/胶原蛋白复合材料（第二复合材料），以3,000rpm的转数（约1200G）于4℃进行5分钟的离心分离处理。在离心分离后的第二复合材料上缓慢地负载凝胶状的胶原蛋白/蛋白聚糖/透明质酸复合材料（第一复合材料），以3,000rpm的转数（约1200G），于4℃进行1分钟的离心分离处理。 

（4）凝胶化和冷藏 

通过于37.5℃将得到的层积物静置1小时使之凝胶化后，于5℃冷藏2小时。 

（5）第二冷冻干燥 

将冷藏后的层积物与容器一起置于放置在不锈钢托盘内的网状隔板上，于－60℃进行17小时的冷冻，然后以隔板温度为－5℃进行6天抽真空的第一干燥。通过该第一干燥，基本上除去层积物的所有水分（冰）。继续保持抽真空的状态将隔板温度升高至25℃，另进行4小时的第二干燥，得到冷冻干燥物。 

（6）交联和灭菌 

于真空烘箱中以110℃的条件热脱水交联冷冻干燥物20小时后，照射25kGy辐射能量的γ射线进行灭菌处理，得到在含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料层上层积含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料层形成的人工骨—软骨复合物。 

图1是显示得到的人工骨—软骨复合物的第一复合材料层与第二复合材料层的交界处（结合层）的电子显微镜照片。图1的上部分是第一复合材料层，其具有人工软骨的功能，下部分是第二复合材料层，其具有人工骨的功能。由于该交界处没有观察到明确的界限，因此认为第一和第二复合材料相互扩散，形成含有胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和磷酸钙的结合层。另外，可以确认，在交界处以外第一复合材料或第二复合材料单独存在。 

将人工骨—软骨复合物浸渍于水中进行真空脱气时，第一复合材料和第二复合材料在交界处不能剥离，可知第一和第二复合材料层强力地结合在了一起。 

[发明效果] 

由于本发明的人工骨—软骨复合物的含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料层（人工软骨）层与含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料层（人工骨）层显著地强力地结合在一起，因此作为人工骨—软骨复合物，特别能够适合填充于施加高的压力的破损部位。通过本发明的方法能够简便地、重现性良好地制造由高强度结合的人工软骨与人工骨形成的人工骨—软骨复合物。 

Claims (9)

1.一种人工骨—软骨复合物，其特征在于通过含有胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和磷酸钙的结合层将含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料层与含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料层结合而形成。

2.根据权利要求1所述的人工骨—软骨复合物，其特征在于所述第一复合材料层含有15~95质量%的胶原蛋白、4.9~70质量%的蛋白聚糖和0.1~20质量%的透明质酸。

3.根据权利要求1所述的人工骨—软骨复合物，其特征在于所述第二复合材料层为多孔磷灰石/胶原蛋白复合物。

4.根据权利要求3所述的人工骨—软骨复合物，其特征在于所述第二复合材料层中磷灰石/胶原蛋白的比例为8/2～2/8（质量比）。

5.根据权利要求1~4任一项所述的人工骨—软骨复合物，其特征在于所述人工骨—软骨复合物经过交联处理。

6.一种人工骨—软骨复合物的制造方法，所述人工骨—软骨复合物通过含有胶原蛋白、蛋白聚糖、透明质酸和磷酸钙的结合层将含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料层与含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料层结合而形成，其特征在于，所述方法具有以下工序：1）制备含有胶原蛋白、蛋白聚糖和透明质酸的第一复合材料的工序，2）制备含有胶原蛋白和磷酸钙的第二复合材料的工序，3）将所述第一复合材料与所述第二复合材料层积的工序，和4）将得到的层积物冷冻干燥的工序。

7.根据权利要求6所述的人工骨—软骨复合物的制造方法，其特征在于在层积工序之前或之后将所述第一复合材料和/或所述第二复合材料离心分离处理。

8.根据权利要求6所述的人工骨—软骨复合物的制造方法，其特征在于在冷冻干燥工序前使所述层积物凝胶化。

9.根据权利要求6~8任一项所述的人工骨—软骨复合物的制造方法，其特征在于所述第一复合材料为凝胶状，所述第二复合材料为浆体状或凝胶状。

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