CN105457097A - 一种可注射矿化胶原骨修复材料及制备方法 - Google Patents
一种可注射矿化胶原骨修复材料及制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105457097A CN105457097A CN201510769628.2A CN201510769628A CN105457097A CN 105457097 A CN105457097 A CN 105457097A CN 201510769628 A CN201510769628 A CN 201510769628A CN 105457097 A CN105457097 A CN 105457097A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- collagen
- injectable
- mineralized collagen
- bone renovating
- collapsibility
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/02—Inorganic materials
- A61L27/12—Phosphorus-containing materials, e.g. apatite
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/14—Macromolecular materials
- A61L27/20—Polysaccharides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
- A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
- A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
- A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/404—Biocides, antimicrobial agents, antiseptic agents
- A61L2300/406—Antibiotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
- A61L2300/418—Agents promoting blood coagulation, blood-clotting agents, embolising agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
- A61L2430/02—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of bones; weight-bearing implants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
- Dermatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供了一种可注射矿化胶原骨修复材料及制备方法,这种骨修复材料包括:矿化胶原、胶原、钙磷盐颗粒、抗溃散剂。上述材料的制备步骤包括:1、矿化胶原粉的制备;2、溶解抗溃散剂;3、溶胀胶原;4、共混;5、灌模冻干;6、交联,以及可选步骤7、研磨筛分。所述骨材料能和自体血液、骨髓、生理盐水等混合,揉捏后,可很好的塑形,成为面团状,有很好的粘结性、可注射性、抗溃散性。所述材料可通过注射或者开放手术的方式植入到骨缺损部位,有良好的生物相容性,促进新骨生成,可用于非承重部位骨缺损,钉道,拔牙窝,椎间融合器内部填充,自体骨碎片粘结,预制成型骨材料缝隙补充材料。所述骨材料能够搭载抗生素药物,并起到缓释效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料领域,涉及一种人工骨修复材料,具体涉及一种可用于人体的可注射矿化胶原骨修复材料及制备方法。
技术背景
人体天然骨组织主要由以胶原为主的有机成分和以羟基磷灰石为主的无机成分构成,其中胶原呈现规则排列的多级结构,并为羟基磷灰石提供了矿化模板,从而形成有序排列的矿化胶原复合体。模仿天然骨的成分及结构制造生物活性骨修复材料,将为修复部位提供与天然骨相似的微环境,有利于骨细胞的贴附、增殖,促进骨缺损的修复。
目前可降解的骨修复材料大多是预制成型的,比如颗粒,圆柱、立方体等,这种材料不可以注射,不可以任意塑形,不能完全将不规则骨缺损部位填充。在修复形状不规则的骨缺损时,应用预制成形的材料进行填充可能会因修复材料与缺损形状不适合而留有死腔,从而造成骨不愈合或延迟愈合。具有可塑形能力的骨材料可根据骨缺损的形状任意塑形,有效填充骨缺损区域,达到骨修复目的。目前存在的能降解的可注射骨修复材料抗溃散能力差,在遇到血液时强度明显降低,溃散现象明显,不利于手术的操作及骨修复。
发明内容
针对上述现有产品技术的不足,本发明提供一种可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料。该材料具有钙磷盐和胶原分子自组装而成的化学组成和结构,从而具备与人体天然骨组织相似的仿生矿化结构。该材料含有抗溃散剂,具有良好的抗溃散性,该材料含有胶原,胶原有止血功能,有加速组织修复功能,产品对骨细胞的生长起到明显的促进作用,产品可降解具有骨传导作用。本发明还提供了制备这种可注射矿化胶原骨修复材料的方法,以及这种可注射矿化胶原骨修复材料在药物装载和缓释方面的应用。
本发明的第一方面,提供了一种可注射矿化胶原骨修复材料,该材料有极高的孔隙率,良好的吸水抗溃散性能。这种材料包括矿化胶原粉、胶原、钙磷盐颗粒、抗溃散剂。所述的这种骨修复材料中总体的胶原与钙磷无机盐的比例为3∶7-7∶3;所述的这种骨修复材料中矿化胶原粉的含量为材料总质量的30-70%;钙磷盐颗粒的含量为5-30%;胶原含量为15-50%;抗溃散剂的含量为2-15%。
所述的胶原为提取自牛跟腱的I型胶原蛋白,所述的钙磷盐为羟基磷灰石、α-磷酸三钙、β-磷酸三钙、磷酸四钙、磷酸八钙、无定形磷酸钙中的一种或几种,钙元素和磷元素的摩尔比为1/1~2/1。。
所述的抗溃散剂可以为多糖、透明质酸钠、壳聚糖、海藻酸钠、聚乙烯醇、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠的一种或者几种的配合使用。
本发明的第二方面,提供了本发明的第一方面所述可注射矿化胶原骨修复材料的制备方法,具体步骤包括:
步骤1、矿化胶原粉的制备,具体包括:
步骤1.1、将胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中的任何一种,配制成胶原的酸溶液,其中胶原浓度为5.0×10-5~5.0×10-3g/mL;
步骤1.2、持续搅拌步骤1.1所得溶液,缓慢滴加含钙离子的溶液,钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子0.01~0.16mol;
步骤1.3、持续搅拌步骤1.2所得溶液,缓慢滴加含磷酸根离子的溶液,磷酸根离子的加入量与步骤1.2中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P=1/1~2/1;
步骤1.4、持续搅拌步骤1.3所得溶液,缓慢滴加NaOH溶液至混合体系pH=6~8,当pH=5~6时,混合体系开始出现沉淀,当pH=7时,混合体系出现白色悬浊液;
步骤1.5、将步骤1.4所得混合体系静置24~120小时,分离出沉淀并洗去杂质离子,随后进行冷冻干燥,研磨后获得矿化胶原材料粉体备用。
步骤2、溶解抗溃散剂,具体包括:
步骤2.1、将抗溃散剂放在真空干燥箱中50-55℃干燥至恒重,放于干燥器皿中待用;
步骤2.2、将步骤2.1中抗溃散剂准确称量,其中抗溃散剂的含量为2-15%;将称量好的抗溃散剂放入装有纯化水的玻璃容器中,纯化水的体积为抗溃散剂质量的80-150倍,搅拌溶解6-24小时;
步骤3、溶胀胶原,将称量好的胶原加入到步骤2.2中已经溶解抗溃散剂的玻璃容器中,其中胶原含量为15-50%,搅拌溶胀18-72小时;
步骤4、共混搅拌,具体步骤包括:
步骤4.1、将步骤1中矿化胶原粉,加入到步骤3中的玻璃容器中,其中矿化胶原粉的含量为材料总质量的30-70%;
步骤4.2、将钙磷盐颗粒适量加入到步骤4.1的玻璃容器中,其中钙磷盐的含量为5-30%;
步骤4.3、将上述混合物搅拌分散24-72小时;
步骤4.4、用真空泵抽真空,以排出混合溶液中的气泡;
步骤5、灌模及冷冻干燥,具体步骤包括:
步骤5.1、量取一定量步骤4.4获得的共混液填入模具中并铺平;
步骤5.2、将灌模后的共混液进行充分冷冻干燥,获得片状材料。
步骤6、片状材料的交联,具体包括:
步骤6.1、配制0.005-0.25wt%的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂;
步骤6.2、将步骤5.2获得的片状材料浸泡于步骤6.1配制的交联剂溶液中24-72小时,进行交联;
步骤6.3、将步骤6.2获得的片状材料从交联剂溶液中取出,置于层析柱中,以流动的纯水洗涤48-72小时,以除去残留的交联剂,使用离心机把材料表面和内部的纯水中分离出去;
步骤6.4、将步骤6.3获得的片状材料进行真空干燥或者冷冻干燥,获得交联的片状可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料。
步骤6.5、将步骤6.4所获得干燥片状材料包装并辐照灭菌后即为无菌的可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料。
至此已经完成片状可注射矿化胶原骨修复材料的制备,在实际应用中可根据需要选择如下可选步骤,制备粉末状可注射矿化胶原骨修复材料。
步骤7(可选步骤)、研磨筛分步骤,具体包括:
步骤7.1、将上述步骤6.4所得块状材料放到玛瑙研钵中研磨,过筛,材料颗粒粒径为1.0mm以下。
步骤7.2、将上述研磨过筛后的材料在真空干燥器中干燥至恒重,包装并辐照灭菌后即为无菌的粉末状可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料。
本发明的第三方面,提供了本发明的第一方面所述可注射矿化胶原骨修复材料在药物装载和缓释方面的应用。
装载药物具体方法包括:
抗生素与所述可注射矿化胶原骨修复材料按质量1∶20比例配制,在23±1℃和相对湿度不低于40%的无菌条件下,将抗生素含量为2%-8%g/ml的抗生素生理盐水溶液或灭菌注射用水溶液与可注射矿化胶原骨修复材料浸润混合并反复揉捏2分钟,直至产品具有粘性,制成载抗生素组织工程骨试件。
药物的装载效率和释放特性可通过以下实验进行检测:
抗生素体外洗提实验:取已制备的载抗生素可注射矿化胶原骨修复材料,选取合适的时间点进行体外洗提,用微生物检测法测定上清液抗生素抑菌圈,用游标卡尺测量抑菌圈直径,求均值。
抗生素体内释放实验:在无菌条件下,将体内各组试件分别埋入大鼠右股肌袋内,于埋入后不同时间点,取植入试件及其周围3mm肌肉组织,进行离心,取上清。用微生物检测法测定上清液中抗生素抑菌圈,用游标卡尺测量抑菌圈直径,求均值。
抑菌实验:在90mmM-H琼脂平板上接种标准金黄色葡萄球菌ATCC259230.5麦氏,贴入3个直径6mm的无菌滤纸,每片滤纸加入抗生素洗提液10μL,每个时间段提取液6个样品,37℃下培养24小时,然后用游标卡尺测量抑菌环的直径,求均值。
本发明的可注射矿化胶原骨修复材料与自体血液、生理盐水、灭菌注射用水的配合质量比例为1∶1-1∶4。所述材料的孔隙率为85-98%。可用于非承重部位骨缺损、钉道、拔牙窝、骨不连、椎间融合器内部填充、自体骨碎片粘结材料,还可作为预制成型骨材料缝隙补充材料。
实施本发明,可以制备出具有高孔隙率的可注射抗溃散骨修复材料。该材料具有胶原和钙磷盐等人体天然骨组织的主要成分,且钙磷盐和胶原分子自组装成与天然骨中类似的微观结构,在成分和结构上均为骨细胞的贴附和增殖提供了极佳的微环境。并可定量装载抗生素及其它药物。总之,本发明所提供的可注射矿化胶原骨修复材料,具有良好的粘结性能,抗溃散,可降解,有良好的生物相容性,可以搭载抗生素,不产生热量,对抗生素耐温没有要求,填补了目前临床上的空白,具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为根据本发明的第二方面,可注射矿化胶原骨修复材料的制备方法工艺流程图。
图2为根据本发明的第一方面,制备的可注射矿化胶原骨修复材料的扫描电镜图。
图3a为根据本发明的第一方面,制备的粉末状可注射矿化胶原骨修复材料。
图3b为可注射矿化胶原骨修复材料与自体血液混合揉捏。
图3c为可注射矿化胶原骨修复材料与自体血液混合挤出性能。
图4a为根据本发明的第一方面,制备的片状可注射矿化胶原骨修复材料。
图4b为可注射矿化胶原骨修复材料与生理盐水混合揉捏。
图4c为可注射矿化胶原骨修复材料与生理盐水混合后挤出。
图5a为根据本发明的第一方面,制备的可注射矿化胶原骨修复材料,并根据本发明的第三方面搭载亚胺培南、盐酸万古霉素两种抗生素的体外释放对金葡菌抑菌环直径/时间曲线。
图5b为载两种抗生素体内局部组织释放对金葡菌抑菌环直径时间曲线。
具体实施方式
为了更好的说明本发明的内容,下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1,可注射/抗溃散/矿化胶原骨修复材料的制备
图1所示为本发明可注射矿化胶原骨修复材料的制备方法工艺流程图。根据图1所示步骤,可注射矿化胶原骨修复材料的制备方法为:
步骤1.1、将1克胶原溶于2L浓度为0.5mol/L的醋酸溶液,配制成胶原的酸溶液;
步骤1.2、持续搅拌步骤1.1所得溶液,缓慢滴加100mL浓度为1mol/L的CaCl2溶液;
步骤1.3、持续搅拌步骤1.2所得溶液,缓慢滴加100mL浓度为0.6mol/L的Na2HPO4溶液;
步骤1.4、持续搅拌步骤1.3所得溶液,缓慢滴加1mol/L的NaOH溶液至混合体系pH=7;
步骤1.5、将步骤1.4所得混合体系静置72小时,分离出沉淀,并用纯化水离心洗涤5次,洗去杂质离子,随后进行冷冻干燥,研磨后获得矿化胶原材料粉体备用。
步骤2.1、将羟丙基甲基纤维素在真空干燥箱中55℃干燥至恒重,放于干燥器皿中待用;
步骤2.2、称量步骤2.1中羟丙基甲基纤维素1克,将其放入装有100ml纯化水的玻璃容器中,搅拌溶解12小时;
步骤3、将2克胶原加入到步骤2.2中已经溶解羟丙基甲基纤维素的玻璃容器中搅拌溶胀48小时;
步骤4.1、将步骤1-5中矿化胶原粉6克,加入到步骤3中的玻璃容器中;
步骤4.2、将羟基磷灰石颗粒1克加入到步骤4.1的玻璃容器中;
步骤4.3、将上述混合物搅拌分散72小时;
步骤4.4、用真空泵抽真空,以排出混合溶液中的气泡;
步骤5.1、将步骤4.4获得的共混液填入合适的模具中并铺平;
步骤5.2、将灌模后的共混液进行充分冷冻干燥,获得片状材料。
步骤6.1、配制0.02wt%的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂;
步骤6.2、将步骤5.2获得的片状材料浸泡于步骤6.1配制的交联剂溶液中60小时,进行交联;
步骤6.3、将步骤6.2获得的片状材料从交联剂溶液中取出,置于层析柱中,以流动的纯水洗涤48小时,以除去残留的交联剂,使用离心机3000r/min把材料表面和内部的纯水中分离出去;
步骤6.4、将步骤6.3获得的片状材料进行冷冻干燥,获得交联的片状可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料。
步骤7.1、将上述步骤6.4所得块状材料放到玛瑙研钵中研磨,过筛,材料颗粒粒径为1.0mm以下。
步骤7.2、将上述研磨过筛后的材料在真空干燥器中干燥至恒重,包装并辐照灭菌后即为无菌的可注射矿化胶原骨修复材料。
图2为所制得的可注射矿化胶原骨修复材料的扫描电镜图。由电镜图可知,所述可注射矿化胶原骨修复材料有较高的孔隙率,并且能够很好的贯通,对于新骨的生长有利。
将上述所制备材料与人体血液按照质量比1∶3混合,揉捏成面团状,并可以放入注射器顺利挤出。经检测所得材料的孔隙率为90%,在生理盐水中能够保持7天不发生溃散现象。
图3a为制备的粉末状可注射矿化胶原骨修复材料。
图3b为可注射矿化胶原骨修复材料与自体血液混合揉捏。
图3c为可注射矿化胶原骨修复材料与自体血液混合挤出性能。
实施例2,片状可注射矿化胶原骨修复材料的制备
首先,制备矿化胶原粉,具体步骤如下:
步骤1.1、将1克胶原溶于4L浓度为0.25mol/L的醋酸溶液,配制成胶原的酸溶液;
步骤1.2、持续搅拌步骤1.1所得溶液,缓慢滴加60mL浓度为0.1mol/L的CaCl2溶液;
步骤1.3、持续搅拌步骤1.2所得溶液,缓慢滴加30mL浓度为0.12mol/L的Na2HPO4溶液;
步骤1.4、持续搅拌步骤1.3所得溶液,缓慢滴加0.5mol/L的NaOH溶液至混合体系pH=7;
步骤1.5、将步骤1.4所得混合体系静置72小时,分离出沉淀并洗去杂质离子,随后进行冷冻干燥,研磨后获得矿化胶原材料粉体备用。
然后,制备片状可注射矿化胶原骨修复材料,具体步骤如下:
步骤2.1、将羧甲基纤维素在真空干燥箱中55℃干燥至恒重,放于干燥器皿中待用;
步骤2.2、称量步骤2.1中羧甲基纤维素0.8克,将其放入装有120ml纯化水的玻璃容器中,搅拌溶解8小时;
步骤3、将4克胶原加入到步骤2.2中已经溶解羧甲基纤维素的玻璃容器中搅拌溶胀72小时;
步骤4.1、将步骤1-5中矿化胶原粉4克,加入到步骤3中的玻璃容器中;
步骤4.2、将β-TCP颗粒1.2克加入到步骤4.1的玻璃容器中;
步骤4.3、将上述混合物搅拌分散48小时;
步骤4.4、用真空泵抽真空,以排出混合溶液中的气泡;
步骤5.1、将步骤4.4获得的共混液填入合适的模具中并铺平;
步骤5.2、将灌模后的共混液进行充分冷冻干燥,获得片状材料。
步骤6.1、配制0.05wt%的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂;
步骤6.2、将步骤5.2获得的片状材料浸泡于步骤6.1配制的交联剂溶液中72小时,进行交联;
步骤6.3、将步骤6.2获得的片状材料从交联剂溶液中取出,置于层析柱中,以流动的纯水洗涤72小时,以除去残留的交联剂,使用离心机3000r/min把材料表面和内部的纯水中分离出去;
步骤6.4、将步骤6.3获得的片状材料进行真空干燥,获得交联的片状可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料。
步骤6.5、将步骤6.4所获得干燥片状材料包装并辐照灭菌后即为无菌的可注射矿化胶原骨修复材料。
将上述所制备的骨材料与生理盐水按照1∶2的比例,进行揉捏混合知道混合均匀,成面团状,经检测材料的孔隙率为95%,材料的可注射性好,能够顺利的挤出,并且在模拟体液的环境下能保持7天不发生溃散现象。
图4a为制备的片状可注射矿化胶原骨修复材料。
图4b为可注射矿化胶原骨修复材料与生理盐水混合揉捏。
图4c为可注射矿化胶原骨修复材料与生理盐水混合后挤出。
实施例3,可注射矿化胶原骨修复材料的制备及其载药应用
首先,按照实施例1中步骤1-1~1-5制备矿化胶原粉。
然后,制备片状可注射矿化胶原骨修复材料。具体步骤如下:
步骤2.1、将羧甲基纤维素钠在真空干燥箱中50℃干燥至恒重,放于干燥器皿中待用;
步骤2.2、称量步骤2.1中羧甲基纤维素钠1.2克,将其放入装有100ml纯化水的玻璃容器中,搅拌溶解18小时;
步骤3、将4.5克胶原加入到步骤2.2中已经溶解羧甲基纤维素钠的玻璃容器中搅拌溶胀72小时;
步骤4.1、将步骤1-5中矿化胶原粉3.8克,加入到步骤3中的玻璃容器中;
步骤4.2、将羟基磷灰石颗粒0.5克加入到步骤4.1的玻璃容器中;
步骤4.3、将上述混合物搅拌分散60小时;
步骤4.4、用真空泵抽真空,以排出混合溶液中的气泡;
步骤5.1、将步骤4.4获得的共混液填入合适的模具中并铺平;
步骤5.2、将灌模后的共混液进行充分冷冻干燥,获得片状材料;
步骤6.1、配制0.08wt%的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂;
步骤6.2、将步骤5.2获得的片状材料浸泡于步骤6.1配制的交联剂溶液中72小时,进行交联;
步骤6.3、将步骤6.2获得的片状材料从交联剂溶液中取出,置于层析柱中,以流动的纯水洗涤72小时,以除去残留的交联剂,使用离心机3000r/min把材料表面和内部的纯水中分离出去;
步骤6.4、将步骤6.3获得的片状材料进行真空干燥,获得交联的片状可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料;
步骤6.5、将步骤6.4所获得干燥片状材料包装并辐照灭菌后即为无菌的可注射矿化胶原骨修复材料。
对该可注射矿化胶原骨修复材料进行载药和药物释放研究。抗生素与骨修复材料的比例为质量比1∶20,抗生素选择为亚胺培南、盐酸万古霉素,进行体内体外释放实验。
装载药物具体方法为:
抗生素与所述可注射矿化胶原骨修复材料按1∶20比例配制,体外实验每组6个试件,体内实验每组18个试件。将各组在23±1℃和相对湿度不低于40%的无菌条件下,将亚胺培南注射液50mg/1ml;盐酸万古霉素注射液50mg/1ml;分别加入所述可注射矿化胶原骨修复材料1g反复揉捏2分钟,直至产品具有粘性,制成直径6±1mm,高12±1mm体外载抗生素组织工程骨试件和直径6±1mm,高6±1mm体内载抗生素组织工程骨试件。
为了检测药物的装载效率和释放特性,进行以下测试:
抗生素体外洗提实验:分别取已制备的载抗生素可注射矿化胶原骨修复材料各6枚,分别置入40ml烧杯并加入10mlPBS(pH7.4)缓冲液浸泡,保持温度在37±1℃。于4小时、1天、3天、1周、2周、3周、4周、5周时间点吸取浸出液放入试管内。取样时,先以顺时针和逆时针方向搅动浸泡液各10次,每次每个烧杯中取样200μL。每个试件用10mLPBS缓冲液清洗,再换10mL新鲜体液浸没。所取样品冷冻保存于-50℃的冰箱内待测。先将样品解冻,用微生物检测法测定上清液中亚胺培南和万古霉素抑菌圈,用游标卡尺测量抑菌圈直径,求均值。
抗生素体内释放实验:在无菌条件下,将体内各组试件分别埋入各组大鼠右股肌袋内,于埋入后第4小时、1天、3天、5天、7天、10天六个时问点、每组随机选6只大鼠取材,取植入试件及其周围3mm肌肉组织,按1∶2比例加入缓冲液pH=7.8匀浆,10000r/min,离心10min,取上清。同时间点采用大鼠眼眶取血方法取血1.0ml,10000r/min,离心10min,取上清。-50℃保存待测。用微生物检测法测定上清液中亚胺培南和万古霉素抑菌圈,用游标卡尺测量抑菌圈直径,求均值。
抑菌实验:在90mmM-H琼脂平板上接种标准金黄色葡萄球菌ATCC259230.5麦氏,贴入3个直径6mm的无菌滤纸,每片滤纸加入抗生素洗提液10μL,每个时间段提取液6个样品,37℃下培养24小时,然后用游标卡尺测量抑菌环的直径,求均值。
本研究中计量数据均以平均值±标准差表示,采用SPSS17.0统计程序包(SPSS公司,美国)以双因素方差分析方法进行统计分析和组间比较,p<0.05为相差显著。
实验结果为:
体外释放抑菌环变化:应用载抗生素可注射矿化胶原骨修复材料进行抗生素体外洗脱,观察其对标准金黄色葡萄球菌ATCC25923抑菌环变化,如图5a,结果显示,可注射矿化胶原骨修复材料搭载抗菌素亚胺培南的抑菌环均显著大于搭载万古霉素组(p<0.05)。
体内局部组织释放抑菌环变化:应用载抗生素可注射矿化胶原骨修复材料进行抗生素局部组织洗提,观察其对标准金黄色葡萄球菌ATCC25923抑菌环变化,如图5b,结果与体外释放抑菌效果相似,载亚胺培南可注射矿化胶原骨修复材料局部组织释放抑菌效果最好,5天后抑菌环直径为9.17±2.97mm(>7mm),仍能有效抑菌,相差显著(p<0.05)。
结果表明本发明所述的可注射矿化胶原骨修复材料有良好的可塑型性,对抗生素没有耐热的要求,能够起到很好的载药缓释作用。
对照例
步骤1.1、将1克胶原溶于4L浓度为0.25mol/L的醋酸溶液,配制成胶原的酸溶液;
步骤1.2、持续搅拌步骤1.1所得溶液,缓慢滴加60mL浓度为0.1mol/L的CaCl2溶液;
步骤1.3、持续搅拌步骤1.2所得溶液,缓慢滴加30mL浓度为0.12mol/L的Na2HPO4溶液;
步骤1.4、持续搅拌步骤1.3所得溶液,缓慢滴加0.5mol/L的NaOH溶液至混合体系pH=7;
步骤1.5、将步骤1.4所得混合体系静置72小时,分离出沉淀并洗去杂质离子,随后进行冷冻干燥,研磨后获得矿化胶原材料粉体备用。
对照例不加入抗溃散剂,因此不需要步骤2,直接进入步骤3;
步骤3、将2克胶原溶于含有100ml纯化水的玻璃容器中,搅拌溶胀48小时;
步骤4.1、将步骤1中矿化胶原粉6克,加入到步骤3中的玻璃容器中;
步骤4.2、羟基磷灰石颗粒2克加入到步骤4.1的玻璃容器中;
步骤4.3、将上述混合物搅拌分散48小时;
步骤4.4、用真空泵抽真空,以排出混合溶液中的气泡;
步骤5.1、将4.4获得的共混液填入到相应的模具中并铺平;
步骤5.2、将灌模后的共混液进行充分冷冻干燥,获得片状材料。
步骤6.1、配制0.1wt%的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂;
步骤6.2、将步骤5.2获得的片状材料浸泡于步骤6.1配制的交联剂溶液中36小时,进行交联;
步骤6.3、将步骤6.2获得的片状材料从交联剂溶液中取出,置于层析柱中,以流动的纯水洗涤48小时,以除去残留的交联剂,使用离心机3000r/min把材料表面和内部的纯水中分离出去;
步骤6.4、将步骤6.3获得的片状材料进行真空干燥,获得交联的片状可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料。
步骤6.5、将步骤6.4所获得干燥片状材料包装并辐照灭菌后即为无菌的可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料。
所得材料按照1∶2的比例与生理盐水混合,材料明显松散,揉捏面团效果不好,放入模拟体液中很快溃散。
Claims (10)
1.一种可注射矿化胶原骨修复材料,其特征在于,该材料包括矿化胶原、胶原、钙磷盐颗粒、抗溃散剂。
2.权利要求1所述的可注射矿化胶原骨修复材料,其特征在于,这种骨修复材料中总体的胶原与钙磷盐的质量比为3∶7-7∶3。
3.权利要求1所述的可注射矿化胶原骨修复材料,其特征在于,其中矿化胶原粉的含量为材料总质量的30-70%;其中钙磷盐的质量份数含量为5-30%;其中胶原质量份数含量为15-50%;其中抗溃散剂的质量份数含量为2-15%。
4.权利要求1所述的可注射矿化胶原骨修复材料,其特征在于,所述的胶原为提取自牛跟腱的I型胶原蛋白,所述的钙磷盐为羟基磷灰石、α-磷酸三钙、β-磷酸三钙、磷酸四钙、磷酸八钙、无定形磷酸钙中的一种或几种,钙元素和磷元素的摩尔比为1/l~2/l。
5.权利要求1所述的可注射矿化胶原骨修复材料,其特征在于,其中抗溃散剂包括羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素及钠盐、透明质酸钠、多糖、壳聚糖、海藻酸钠、聚乙烯醇等的一种或者几种的配合使用。
6.根据权利要求1的一种可注射矿化胶原骨修复材料,其特征在于:使用时与自体血液、生理盐水、灭菌注射用水中的一种或者几种的混合液,混合揉捏调制使用,揉捏时间为1-5分钟,配合质量比例为1∶1-1∶4。
7.一种可注射矿化胶原骨修复材料的制备步骤,其特征在于包括以下步骤:1)、矿化胶原粉的制备,2)、溶解抗溃散剂,3)、溶胀胶原,4)、共混,5)、灌模冻干,6)、交联,其具体步骤包括:
步骤1、矿化胶原粉的制备,具体包括:
步骤1.1、将胶原溶于盐酸、硝酸或醋酸中的任何一种,配制成胶原的酸溶液,其中胶原浓度为5.0×10-5-5.0×10-3g/mL;
步骤1.2、持续搅拌步骤1.1所得溶液,缓慢滴加含钙离子的溶液,钙离子的加入量为每克胶原对应加入钙离子0.01-0.16mol;
步骤1.3、持续搅拌步骤1.2所得溶液,缓慢滴加含磷酸根离子的溶液,磷酸根离子的加入量与步骤1.2中钙离子加入量的摩尔比为Ca/P=1/l-2/l;
步骤1.4、持续搅拌步骤1.3所得溶液,缓慢滴加NaOH溶液至混合体系pH=6-8,当pH=5-6时,混合体系开始出现沉淀,当pH=7时,混合体系出现白色悬浊液;
步骤1.5、将步骤1.4所得混合体系静置24-120小时,分离出沉淀并洗去杂质离子,随后进行冷冻干燥,研磨后获得矿化胶原材料粉体备用;
步骤2、溶解抗溃散剂,具体包括:
步骤2.1、将抗溃散剂放在真空干燥箱中50-55℃干燥至恒重,放于干燥器皿中待用;
步骤2.2、将步骤2.1中抗溃散剂准确称量,其中抗溃散剂的质量含量为2-15%;将称量好的抗溃散剂放入装有纯化水的玻璃容器中,纯化水的体积为抗溃散剂质量的80-150倍,搅拌溶解6-24小时;
步骤3、溶胀胶原,将称量好的胶原加入到步骤2.2中已经溶解抗溃散剂的玻璃容器中,其中胶原质量含量为15-50%,搅拌溶胀18-72小时;
步骤4、共混搅拌,具体步骤包括:
步骤4.1、将步骤1中矿化胶原粉,加入到步骤3中的玻璃容器中,其中矿化胶原粉的含量为材料总质量的30-70%;
步骤4.2、将钙磷盐颗粒加入到步骤4.1的玻璃容器中,其中钙磷盐的含量为材料总质量的5-30%;
步骤4.3、将上述混合物搅拌分散24-72小时;
步骤4.4、用真空泵抽真空,以排出混合溶液中的气泡;
步骤5、灌模及冷冻干燥,具体步骤包括:
步骤5.1、量取一定量步骤4.4获得的共混液填入模具中并铺平;
步骤5.2、将灌模后的共混液进行充分冷冻干燥,获得片状材料;
步骤6、片状材料的交联,具体包括:
步骤6.1、配制0.005-0.25wt%的戊二醛的乙醇溶液作为交联剂;
步骤6.2、将步骤5.2获得的片状材料浸泡于步骤6.1配制的交联剂溶液中24-72小时,进行交联;
步骤6.3、将步骤6.2获得的片状材料从交联剂溶液中取出,置于层析柱中,以流动的纯水洗涤48-72小时,以除去残留的交联剂,使用离心机把材料表面和内部的纯水中分离出去;
步骤6.4、将步骤6.3获得的片状材料进行真空干燥或者冷冻干燥,获得交联的片状可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料;
步骤6.5、将步骤6.4所获得干燥片状材料包装并辐照灭菌后即为无菌的可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料。
8.根据权利要求7的一种可注射矿化胶原骨修复材料的制备步骤,其特征在于还包括以下步骤:
步骤7、研磨筛分,具体包括:
步骤7.1、将权利要求6的步骤6.4所得块状材料进行研磨和过筛,材料颗粒粒径为1.0mm以下;
步骤7.2、将上述研磨过筛后的材料在真空干燥器中干燥至恒重,包装并辐照灭菌后即为无菌的可注射抗溃散矿化胶原骨修复材料。
9.一种可注射矿化胶原骨修复材料搭载抗生素的方法,其特征在于:
抗生素与所述可注射矿化胶原骨修复材料按质量1∶20比例配制,在23±1℃和相对湿度不低于40%的无菌条件下,将抗生素含量为2%-8%g/ml的抗生素生理盐水溶液或灭菌注射用水溶液与可注射矿化胶原骨修复材料浸润混合并反复揉捏2分钟,直至产品具有粘性,制成载抗生素组织工程骨试件。
10.权利要求9所述的一种可注射矿化胶原骨修复材料搭载抗生素的方法,其特征在于,搭载的抗生素包括亚胺培南、盐酸万古霉素、妥布霉素、庆大霉素中的一种或几种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510769628.2A CN105457097A (zh) | 2015-11-12 | 2015-11-12 | 一种可注射矿化胶原骨修复材料及制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201510769628.2A CN105457097A (zh) | 2015-11-12 | 2015-11-12 | 一种可注射矿化胶原骨修复材料及制备方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN105457097A true CN105457097A (zh) | 2016-04-06 |
Family
ID=55595537
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201510769628.2A Pending CN105457097A (zh) | 2015-11-12 | 2015-11-12 | 一种可注射矿化胶原骨修复材料及制备方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN105457097A (zh) |
Cited By (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105997859A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-10-12 | 上海建华精细生物制品有限公司 | 小关节治疗用纳米注射液及其制备方法 |
CN107929812A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-04-20 | 天津医科大学口腔医院 | 一种仿生矿化胶原支架的制备方法 |
CN107952115A (zh) * | 2016-10-17 | 2018-04-24 | 北京湃生生物科技有限公司 | 一种仿生生物矿化人工骨修复材料及其制备方法与应用 |
CN108245704A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-07-06 | 重庆医科大学附属永川医院 | 一种骨科医用粘合材料及其制备方法与使用方法 |
CN109734935A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-05-10 | 广西紫荆生物科技有限公司 | 一种生物医用可注射凝胶材料及其制备方法和用途 |
CN111068101A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-28 | 天新福(北京)医疗器材股份有限公司 | 用于制备可吸收生物修复骨蜡的材料与方法及应用 |
CN112023120A (zh) * | 2020-09-10 | 2020-12-04 | 湖北联结生物材料有限公司 | 一种可注射预灌装骨修复颗粒及其制备方法和应用 |
CN114010838A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-02-08 | 中国人民解放军总医院第八医学中心 | 一种复合材料仿生骨及其制备方法 |
CN114732958A (zh) * | 2022-05-09 | 2022-07-12 | 洛阳理工学院 | 一种仿生胶原矿化骨粉及其制备方法 |
CN115554467A (zh) * | 2022-11-10 | 2023-01-03 | 奥精医疗科技股份有限公司 | 一种颅骨修复材料及其制备方法 |
CN116832219A (zh) * | 2023-08-29 | 2023-10-03 | 常州邦莱医疗科技有限公司 | 一种人工骨修复材料及其制备方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102764455A (zh) * | 2012-07-20 | 2012-11-07 | 清华大学 | 一种抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料及其制备方法 |
CN103800946A (zh) * | 2014-01-28 | 2014-05-21 | 北京奥精医药科技有限公司 | 矿化胶原复合骨粘合及填充材料 |
CN104096268A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-10-15 | 北京奥精医药科技有限公司 | 一种矿化胶原人工骨膜及其制备方法 |
-
2015
- 2015-11-12 CN CN201510769628.2A patent/CN105457097A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102764455A (zh) * | 2012-07-20 | 2012-11-07 | 清华大学 | 一种抗感染矿化胶原-硫酸钙骨修复材料及其制备方法 |
CN103800946A (zh) * | 2014-01-28 | 2014-05-21 | 北京奥精医药科技有限公司 | 矿化胶原复合骨粘合及填充材料 |
CN104096268A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-10-15 | 北京奥精医药科技有限公司 | 一种矿化胶原人工骨膜及其制备方法 |
Cited By (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105997859A (zh) * | 2016-07-08 | 2016-10-12 | 上海建华精细生物制品有限公司 | 小关节治疗用纳米注射液及其制备方法 |
CN107952115A (zh) * | 2016-10-17 | 2018-04-24 | 北京湃生生物科技有限公司 | 一种仿生生物矿化人工骨修复材料及其制备方法与应用 |
WO2018072679A1 (zh) * | 2016-10-17 | 2018-04-26 | 张自强 | 一种仿生生物矿化人工骨修复材料及其制备方法与应用 |
CN107929812B (zh) * | 2017-11-24 | 2020-12-25 | 天津医科大学口腔医院 | 一种仿生矿化胶原支架的制备方法 |
CN107929812A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-04-20 | 天津医科大学口腔医院 | 一种仿生矿化胶原支架的制备方法 |
CN108245704A (zh) * | 2018-02-06 | 2018-07-06 | 重庆医科大学附属永川医院 | 一种骨科医用粘合材料及其制备方法与使用方法 |
CN109734935A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-05-10 | 广西紫荆生物科技有限公司 | 一种生物医用可注射凝胶材料及其制备方法和用途 |
CN111068101A (zh) * | 2019-12-16 | 2020-04-28 | 天新福(北京)医疗器材股份有限公司 | 用于制备可吸收生物修复骨蜡的材料与方法及应用 |
CN111068101B (zh) * | 2019-12-16 | 2021-10-26 | 天新福(北京)医疗器材股份有限公司 | 用于制备可吸收生物修复骨蜡的材料与方法及应用 |
CN112023120A (zh) * | 2020-09-10 | 2020-12-04 | 湖北联结生物材料有限公司 | 一种可注射预灌装骨修复颗粒及其制备方法和应用 |
CN114010838A (zh) * | 2021-11-15 | 2022-02-08 | 中国人民解放军总医院第八医学中心 | 一种复合材料仿生骨及其制备方法 |
CN114732958A (zh) * | 2022-05-09 | 2022-07-12 | 洛阳理工学院 | 一种仿生胶原矿化骨粉及其制备方法 |
CN115554467A (zh) * | 2022-11-10 | 2023-01-03 | 奥精医疗科技股份有限公司 | 一种颅骨修复材料及其制备方法 |
CN115554467B (zh) * | 2022-11-10 | 2024-01-30 | 奥精医疗科技股份有限公司 | 一种颅骨修复材料及其制备方法 |
CN116832219A (zh) * | 2023-08-29 | 2023-10-03 | 常州邦莱医疗科技有限公司 | 一种人工骨修复材料及其制备方法 |
CN116832219B (zh) * | 2023-08-29 | 2023-12-22 | 常州邦莱医疗科技有限公司 | 一种人工骨修复材料及其制备方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105457097A (zh) | 一种可注射矿化胶原骨修复材料及制备方法 | |
US10143774B2 (en) | Porous polysaccharide scaffold comprising nano-hydroxyapatite and use for bone formation | |
Link et al. | Bone response and mechanical strength of rabbit femoral defects filled with injectable CaP cements containing TGF-β1 loaded gelatin microparticles | |
Pereira et al. | Injectable gellan-gum/hydroxyapatite-based bilayered hydrogel composites for osteochondral tissue regeneration | |
WO2019048697A1 (en) | MACROPOROUS AND MICROPOROUS COMPOSITE CRYOGEL BIOMATERIAL FOR USE IN BONE REGENERATION | |
Wang et al. | Synthesis and characterization of collagen‐chitosan‐hydroxyapatite artificial bone matrix | |
US20220323639A1 (en) | Phosphocalcic cement composition comprising blood | |
KR101381108B1 (ko) | 말뼈를 이용한 나노 세라믹 골시멘트 및 이의 제조 방법 | |
JP5456031B2 (ja) | 血液と二相性リン酸カルシウムセラミック粒子との組合せ | |
EP3964216B1 (en) | Novel treatment approach by targeted delivery of bioactive molecules bio modulated ceramics | |
US20100233269A1 (en) | Mineralized polymer particles and the method for their production | |
CN103100113A (zh) | 人工骨-软骨复合物及其制造方法 | |
KR101473447B1 (ko) | 말뼈를 이용한 나노 세라믹 골시멘트 및 이의 제조 방법 | |
CN104470550A (zh) | 作为骨移植替代物的含有部分脱乙酰壳多糖的自硬化生物活性接合剂组合物 | |
JP5307025B2 (ja) | ポリマー・マトリックスを有する生成物を生成する方法、その生成物からなるインプラント、およびそれらの使用 | |
DE60029492T2 (de) | Verformbare Knochen-Zusammensetzung zum Füllen von Knochendefekten | |
Antoniac et al. | The influence of the ceramic phase on the structure of resorbable biocomposites based on collagen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160406 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |