CN1251768C - 全天然体外成型硬组织修复材料制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是将猪骨于800-1050℃下煅烧，保温2-20h，冷至制粉，按粉体与水之比为1∶(1-100)，将粉体加入水中，搅拌后超声分散；按壳聚糖∶苹果酸∶蒸馏水为1∶(1-10)∶(1-100)的质量比，将壳聚糖溶于含3～8个碳原子的二元有机酸的水中溶液，按壳聚糖∶羟基磷灰石为(1∶1)～(1∶4)的质量比，将壳聚糖溶液加至羟基磷灰石悬浮液，搅拌并超声分散，将0.1%-40%的无机碱的水溶液滴到天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物中并搅拌，将其调节到6.0以上；搅拌下按壳聚糖∶交联剂为(1∶1)～(5∶1)的质量比，向天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物中滴加交联剂的水溶液，使其交联，得交联后的天然羟基磷灰石/壳聚糖复合沉淀物，经洗涤、干燥后即为体外成型硬组织修复材料。

Description

全天然体外成型硬组织修复材料制备方法

                     技术领域

本发明涉及一种制备硬组织修复材料的方法，尤其涉及一种全天然体外成型硬组织修复材料制备方法。

                     背景技术

临床上每年由有大量的病人因外伤、肿瘤和其他疾病所造成的硬组织缺损，需要大量组织替代材料进行修复，组织器官缺损的修复问题已成为人类保健过程中发生最频繁、最具破坏性和费用最高的问题之一，硬组织修复材料也是国内外医学临床需求最大的修复材料之一，因此新型硬组织替代材料开发市场前景广阔。

传统的金属材料、陶瓷材料等生物活性低，难以降解，植入体内后长期效果不理想，因此利用生物相容性更好，能够降解的天然生物材料，开发更能适应人体生理需要的新型硬组织修复材料，对于人民身体健康和国民经济的发展具有重要的意义，是今后生物材料研究领域的重要方向。

人体骨骼是由纳米羟基磷灰石和胶原通过自组装形成的无机/有机复合材料。作为骨骼主要无机成分，羟基磷灰石具有良好的生物相容性，安全无毒，植入体内后还能传导骨骼生长。1976年，日本青木与美国Jarcho分别合成了羟基磷灰石，开创了羟基磷灰石生物医学材料研究和应用的新领域；1980年东京齿科医科大学开始将羟基磷灰石人工齿根应用于临床。目前，羟基磷灰石的陶瓷材料、金属涂层材料和与有机物的复合材料已成为临床上最重要的牙齿、骨骼等硬组织修复用材料。然而，在自然界中广泛存在的天然羟基磷灰石材料(如动物骨)至今却没有得到充分的开发和利用。众所周知，生物材料越接近人体，越容易为人体所接受。天然生物材料是经历了亿万年进化，由生物过程形成的材料，如生物矿物骨，牙，贝壳和结构蛋白胶原纤维，蚕丝等等，在分子组成、微观结构等方面具有某些传统人工合成材料无法模拟的特点。天然羟基磷灰石由于在组成和结构上更接近于人体的骨骼成分，与人工合成羟基磷灰石材料相比，有望获得更高的生物活性。因此，本发明选择来自动物体的天然羟基磷灰石作为开展研究的基础材料。

由于纯的羟基磷灰石应用于硬组织置换还存在一些弱点，如骨诱导作用弱、脆性大、加工困难、颗粒型羟基磷灰石不容易成形等，而且从仿生学的角度出发，硬组织修复修复用材料也应该包含有机和无机成分。自80年代以来，国内外研究者对人工合成羟基磷灰石进行了多种复合和改性，研究方向有与无机生物材料的复合、有机高分子生物材料的复合、与天然生物材料的复合，以及与生物体自身材料的复合。近年来，国内外研究者已经开始研究羟基磷灰石与壳聚糖复合材料，如Yamaguchi等人用共沉淀法制备了均匀的羟基磷灰石/壳聚糖纳米复合材料。

壳聚糖是天然生物多糖，广泛存在于虾、蟹等动物外壳中。壳聚糖尽管不是人体内的成分，但却具有优良的生物相容性，由壳聚糖制作的外科手术可吸收缝合线、医用敷料和人工皮肤已经获得临床应用。Muzzarelli等人发现壳聚糖及其衍生物可以刺激硬组织尤其是骨组织的恢复和再生，因此本发明将羟基磷灰石和壳聚糖通过化学交联进行复合以获得理想的硬组织修复用材料。

                      技术内容

本发明提供一种能够提高制得产物力学性能、生产成本低且骨修复性能更好的全天然体外成型硬组织修复材料制备方法。

本发明是一种用于硬组织修复的全天然体外成型硬组织修复材料制备方法，

第一步：先将新鲜的食用猪骨煮沸，冷却后去除附着其上的肌肉和骨髓并干燥，再将干燥的猪骨置于800-1050℃温度下煅烧，在该温度下保温2-20h后，冷至室温，收集煅烧后的骨块，然后，粉碎煅烧后的猪骨，将其制成粉体，即得天然羟基磷灰石粉体，按天然羟基磷灰石粉体与水之比为1∶(1-100)，将天然羟基磷灰石粉体加入水中，搅拌后再超声分散，得天然羟基磷灰石的悬浮液；

第二步：按照壳聚糖∶苹果酸∶蒸馏水为1∶(1-10)∶(1-100)的质量比，将壳聚糖溶解于含3～8个碳原子的二元有机酸的水中溶液，得壳聚糖溶液，然后，按照壳聚糖∶羟基磷灰石为(1∶1)～(1∶4)的质量比，将壳聚糖溶液加入羟基磷灰石的悬浮液，搅拌并超声分散，使其混合均匀，将质量百分比浓度为0.1％-40％的无机碱的水溶液滴加到上述天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物中并搅拌，当PH值上升到6.0～14.0时，停止滴加氢氧化钠溶液，继续搅拌2h，当PH值仍然保持在6.0以上则停止搅拌，否则再滴加氢氧化钠溶液，将其调节到6.0以上；

第三步：在1000-3000r/min速度下搅拌天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物，按照壳聚糖∶交联剂为(1∶1)～(5∶1)的质量比，向天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物中滴加交联剂的水溶液，交联剂为碳原子个数在8以下、含2个活性醛基的交联剂，待交联剂滴完以后继续搅拌2-20小时，使其交联，得交联后的天然羟基磷灰石/壳聚糖复合沉淀物，该天然羟基磷灰石/壳聚糖复合沉淀物经洗涤、干燥后即为体外成型硬组织修复材料。

本发明可以在猪骨煅烧前，用铁锤对猪骨进行预粉碎，在猪骨煅烧后，用球磨机将猪骨制成粉体。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1.生物相容性好：我们采用GB/T 16886-ISO 10993中推荐的细胞生长抑制法(MTT比色法)，对复合材料的主要成分(天然羟基磷灰石和壳聚糖)和天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料样品的细胞相容性进行了评价，并用倒置相差显微镜对材料浸提液对细胞形态的影响进行了观察。结果发现：用天然羟基磷灰石、壳聚糖和天然羟基磷灰石/壳聚糖复合材料浸提液培养的细胞增殖率分别为84％、82％和89.9％，毒性评级均为0级，细胞形态与阴性对照组相似。体外细胞试验初步证明，复合材料具有良好的生物相容性；

2.骨修复性能好：通过天然羟基磷灰石材料对三种血浆蛋白(纤维蛋白原FiB、白蛋白Alb、免疫球蛋白IgG)的吸附试验发现，天然羟基磷灰石对三种血浆蛋白的吸附量为：IgG＞FiB＞Alb。根据吸附蛋白的种类与材料的凝血性能的关系：即纤维蛋白原的吸附有利于凝血，而白蛋白的吸附抑制凝血，天然羟基磷灰石对纤维蛋白原的吸附量大于白蛋白的吸附量，即天然羟基磷灰石具有良好的凝血性能；根据骨折愈合的血肿机化机制，血肿机化形成的凝血块内含多种骨诱导物质，有良好的骨传导作用，有利于骨骼缺损的修复，因此，我们所制备的材料具有较好的骨修复性能；

3.力学性能好：用本发明方法制得的复合材料质地致密，力学性能明显提高，在骨修复过程中可以保持羟基磷灰石中钙离子与磷离子持续、平稳、缓慢地从壳聚糖基质中释放；

4.多种用途：可用于骨科，齿科，颌面外科，颅脑外科和整形外科等

5.生产成本低：本发明提出的从猪骨中提取天然羟基磷灰石的方法在国内原材料来源丰富，价格低廉；生产工艺简单，不需特殊的设备，成本低廉。Sol-Gel法生产500g产品的原料费用为85元，而采用本发明工艺，生产500g的产品原料费用只需10元；在生产操作费用上，每生产500g产品，Sol-Gel法工艺将比本发明工艺多消耗电力5000度。

6.产能高：常用的Sol-Gel法用3L的反应器要花费一周的时间才能生产出20g的羟基磷灰石，而采用本发明工艺一天就可以生产500g的产品；

7.绿色环保，无“三废”排放：人工合成的方法生产羟基磷灰石会产生大量富含磷的废水，而本发明提出的从猪骨中提取天然羟基磷灰石的方法能把昔日在屠宰场当作废物处的动物骨、牙变成临床大量需要的生物医用材料。

                          附图说明

图1是本发明提取天然羟基磷灰石工艺操作步骤图例。

图2是本发明制备工艺路线图。

                           实施例

实施例1本发明是一种用于硬组织修复的全天然体外成型硬组织修复

材料制备方法：

第一步：先将新鲜的食用猪骨煮沸，冷却后去除附着其上的肌肉和骨髓并干燥，再将干燥的猪骨置于800-1050℃温度下煅烧，在该温度下保温2-20h后，冷至室温，收集煅烧后的骨块，然后，粉碎煅烧后的猪骨，将其制成粉体，即得天然羟基磷灰石粉体，按天然羟基磷灰石粉体与水之比为1∶(1-100)，将天然羟基磷灰石粉体加入水中，搅拌后再超声分散，得天然羟基磷灰石悬浮液；

第二步：按照壳聚糖∶苹果酸∶蒸馏水1∶(1-10)∶(1-100)的比例，将壳聚糖溶解于含3～8个碳原子的二元有机酸的水溶液中，例如：可溶解于苹果酸、戊二酸或己二酸，得壳聚糖溶液，然后，按照壳聚糖∶羟基磷灰石为(1∶1)～(1∶4)的比例，将壳聚糖溶液中加入羟基磷灰石的悬浮液，搅拌并超声分散，使其混合均匀，将质量百分比浓度为0.1％-40％的无机碱(如氢氧化钠)的水溶液滴加到上述天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物中并搅拌，当PH值上升到6.0～14.0时，停止滴加氢氧化钠溶液，继续搅拌，当PH值仍然保持在6.0以上则停止搅拌，否则再滴加氢氧化钠溶液，将其调节到6.0以上；

第三步：在1000-3000r/min速度下搅拌天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物，按照壳聚糖∶交联剂为(1∶1)～(5∶1)的质量比，向天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物中滴加交联剂的水溶液，交联剂为碳原子个数在8以下、含2个活性醛基的交联剂，例如：交联剂可采用戊二醛、丁二醛或己二醛，待交联剂滴完以后继续搅拌2-20小时，使其交联，得交联后的天然羟基磷灰石/壳聚糖复合沉淀物，该天然羟基磷灰石/壳聚糖复合沉淀物经洗涤、干燥后即为体外成型硬组织修复材料。本实施例在猪骨煅烧前，用铁锤对猪骨进行预粉碎，在猪骨煅烧后，用球磨机将猪骨制成粉体。

实施例2首先从健康的食用猪骨中提取出天然羟基磷灰石，然后将天然羟基磷灰石和壳聚糖进行复合，得到天然硬组织修复用材料，具体操作如下：

1.猪骨的清洗：将新鲜的食用猪煮沸，冷却后用竹筷去除附着的肌肉和骨髓，处理干净后，置于烘箱中彻底干燥。

2.猪骨的煅烧：将干燥的猪骨砸碎，分装到陶瓷坩锅中，置于电炉内，关好炉门，设定温度在800-1050℃之间，打开电炉的电源开关，当温度升到设定温度后再保温2-20h，等到炉膛温度降到室温后，取出坩锅，收集煅烧后的骨块。

3.煅烧骨块的粉碎：将煅烧后的骨块用粉碎机粉碎，然后用用球磨机球磨，制得天然的羟基磷灰石粉体；

4.用分析天平称量一定量的天然羟基磷灰石粉体，加入适量的蒸馏水，搅拌后再超声分散，放置备用；

5.用分析天平称量一定量的壳聚糖，加入适量的蒸馏水，搅拌并加入苹果酸，使壳聚糖完全溶解；

6.向上述壳聚糖溶液中加入羟基磷灰石的悬浮液，使壳聚糖∶羟基磷灰石的比例在1∶1到1∶4的范围内，高速搅拌并超声分散，使其混合均匀；

7.配置成0.1％-40％的氢氧化钠溶液，将其滴加到上述天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物中，当PH值上升到6.0～14.0时，可形成大量的沉淀，此时停止滴加氢氧化钠溶液，继续搅拌，当PH值仍然保持在6.0以上则停止搅拌，否则用少量的氢氧化钠溶液调节到6.0以上；

8.按照壳聚糖∶交联剂(如戊二醛)为(1∶1)～(5∶1)的比例在高速搅拌的状态下缓慢滴加戊二醛溶液，滴完以后继续搅拌2-20小时，使其充分交联，可得交联后的天然羟基磷灰石/壳聚糖复合沉淀；

9.将上述沉淀过虑，用蒸馏水反复洗涤，将复合沉淀离心后干燥，即为体外成型硬组织修复材料。

实施例3本实施例利用健康猪骨经高温煅烧制备天然羟基磷灰石材料，再经粉碎和机械球磨制备微米级粉体，用蒸馏水分散后加入壳聚糖溶解的苹果酸溶液中，再经搅拌和超声分散，制得分散均匀的天然羟基磷灰石/壳聚糖混合液；在高速搅拌的情况下向混合液中滴加5％的氢氧化钠溶液，调节PH值到8.0，再滴加一定量的戊二醛溶液，经充分交联后制得均匀分散的天然羟基磷灰石/壳聚糖复合沉淀，用蒸馏水将沉淀反复洗涤，直到洗涤液呈中性，再经离心，在模具中干燥成型，可制得力学性能优良的复合材料。经测试，复合材料浸渍液的PH值稳定在7.2，扫描电镜观察表明该复合材料质地致密，两相紧密结合，体外细胞实验证明该复合材料具有良好的细胞相容性，植入体内后有一定的膨胀性，可与骨缺损紧密结合，力学性能优良。

Claims (2)

1、一种用于硬组织修复的全天然体外成型硬组织修复材料制备方法，其特征在于：

第一步：先将新鲜的食用猪骨煮沸，冷却后去除附着其上的肌肉和骨髓并干燥，再将干燥的猪骨置于800-1050℃温度下煅烧，在该温度下保温2-20h后，冷至室温，收集煅烧后的骨块，然后，粉碎煅烧后的猪骨，将其制成粉体，即得天然羟基磷灰石粉体，按天然羟基磷灰石粉体与水的质量比为1∶(1-100)，将天然羟基磷灰石粉体加入水中，搅拌后再超声分散，得天然羟基磷灰石悬浮液；

第二步：按照壳聚糖∶有机酸∶蒸馏水为1∶(1-10)∶(1-100)的质量比，将壳聚糖溶解于含3～8个碳原子的二元有机酸的水溶液中，得壳聚糖溶液，然后按照壳聚糖∶羟基磷灰石为(1∶1)～(1∶4)的质量比，将壳聚糖溶液加入羟基磷灰石的悬浮液，搅拌并超声分散，使其混合均匀，将质量百分比浓度为0.1％-40％的无机碱的水溶液滴加到上述天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物中并搅拌，当PH值上升到6.0～14.0时，停止滴加氢氧化钠溶液，继续搅拌使之均匀，当PH值仍然保持在6.0以上则停止搅拌，否则再滴加氢氧化钠溶液，将其调节PH到6.0以上；

第三步：在1000-3000r/min速度下搅拌天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物，按照壳聚糖∶交联剂为(1∶1)～(5∶1)的质量比，向天然羟基磷灰石/壳聚糖混合物中滴加交联剂的水溶液，交联剂为碳原子个数在8以下、含2个活性醛基的交联剂，待交联剂滴完以后继续搅拌2-20小时，使其交联，得交联后的天然羟基磷灰石/壳聚糖复合沉淀物，该天然羟基磷灰石/壳聚糖复合沉淀物经洗涤、干燥后即为体外成型硬组织修复材料。

2、根据权利要求1所述的全天然体外成型硬组织修复材料制备方法，其特征在于在猪骨煅烧前，用铁锤对猪骨进行预粉碎，在猪骨煅烧后，用球磨机将猪骨制成粉体。

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