CN108273139B - 一种掺杂石墨烯的仿生复合支架材料及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于组织工程支架材料领域，提供一种掺杂石墨烯的仿生复合支架材料及其构建方法。首先制备Cs乙酸溶液、GP水溶液、Gel水溶液、石墨烯悬液，在将Cs乙酸溶液与GP水溶液混合制备Cs/GP溶液A；将Gel水溶液加入Cs/GP溶液A中制备Cs/GP/Gel溶液B；最后，将石墨烯悬液加入到Cs/GP/Gel溶液B中制备Cs/GP/Gel/Gr溶液C，将其转移到低温模具中，进行低温冷冻干燥及后续处理后，得到仿生软骨复合支架材料。仿生软骨复合支架材料中壳聚糖Cs、β‑甘油磷酸钠GP、明胶Gel、石墨烯Gr的质量比为1:(5～20):(1～5):(0.02～0.08)。本发明工艺简单、易控，制造成本较低，所制得的支架产品孔径较均匀，孔道结构相互贯通，具有优异的仿生效果。

Description

一种掺杂石墨烯的仿生复合支架材料及其构建方法
技术领域
本发明属于组织工程支架材料领域，特别涉及一种由壳聚糖、β-甘油磷酸钠、明胶、石墨烯构建组织工程仿生软骨复合支架材料的方法。
背景技术
正常关节的骨软骨组织结构主要由透明软骨、软骨钙化层和软骨下骨三部分组成。关节软骨因在各种活动中使用量巨大，极易在创伤及急慢性炎症中导致损伤，多现为软骨磨损、撕裂、断裂和粉碎性损伤等。关节假体置换为目前有效的治疗方法之一，但该方法不仅价格昂贵，且存在并发症危险。此外，关节软骨极脆弱且自身修复能力低下，软骨组织自身无血液供应，营养主要来自周围关节滑液的滋润，一旦出现病变或缺损，软骨下骨层常伴随发生硬化等退行病变，逐步恶化并导致运动功能障碍。软骨组织工程是一种新型、高效的软骨组织缺损的修复方法，其关键步骤之一，是制备出无毒、可降解、生物相容性好、具有软骨诱导性、具有可塑性、适宜机械强度、三维孔隙结构的组织工程生理分层支架材料。但几乎没有一种单一材料能够同时满足以上所有功能，因此将不同种类、具有互补特性的材料按照一定比例和方式进行复合，协同发挥每一种材料的优点和功能，构建适宜的软骨修复材料是研究趋势。
壳聚糖(Chitosan，Cs)是天然的高分子聚合物，结构与软骨基质糖氨多糖相似，降解产物为氨基葡萄糖单体，对人体无不良反应，具有良好的生物相容性、生物降解性、无毒性和免疫原性，而且具有抗菌、止血、消炎、促进伤口愈合等功能，能够促进生物组织细胞的粘附、增殖、分化，是常见的软骨组织工程的支架材料。β-甘油磷酸钠(Sodiumβ-GlycerolPhosphate，GP)在医疗上广泛用于人静脉营养的磷补充剂和各种磷缺乏症状，以满足人体每天对磷元素的需要。磷元素参与骨质的形成，以磷脂形式参与细胞膜的组成，同时磷与许多代谢中的酶活性有关，在能量代谢中的作用至关重要。明胶(Gelatin，Gel)是一种天然高分子材料，其结构与生物体组织结构相似，具有优良的生物相容性、生物活性和可降解性，普遍应用于临床医学、医药工业中，明胶基复合材料用作组织工程支架材料和信号分子载体是目前生物材料的研究热点之一。石墨烯是由单层碳原子紧密堆积成的二维蜂窝状晶格结构的碳质材料，由于其特殊的纳米结构以及优异的光、电、磁、力学等物理和化学性质，使其在电子学、光学、磁学、生物医学、传感器等诸多领域显示出了优越性和巨大的应用潜能。专利CN103480343 A“一种氧化石墨烯多孔复合材料及其制备方法”，公开了一种以氧化石墨烯、海藻酸钠、明胶为原料制备的多孔复合材料，所得多孔复合材料机械性能好、组织结构规整、孔隙率高及生物相容性好。专利CN105268026 A“一种壳聚糖/氧化石墨烯/纳米羟基磷灰石三维多孔复合支架材料的制备方法”，通过羧基化氧化石墨烯与掺杂纳米羟基磷灰石的壳聚糖进行共价交联反应来改善三维多孔支架的力学性能和生物活性，所制备的支架材料能作为细胞培养支架用于骨组织损伤修复。专利CN105688285 A“一种石墨烯材料涂覆壳聚糖三维支架的制备方法”，将壳聚糖支架浸泡在不同浓度的氧化石墨烯分散液中，通过氧化石墨烯片层吸附在壳聚糖支架孔壁上，进而形成具有不同还原程度氧化石墨烯涂层的壳聚糖支架。专利CN106581768 A“一种用于心肌修复的组织工程支架的制备方法”，以氧化石墨烯、壳聚糖为原料，制备出能够有利于心肌细胞之间传导电信号的、可望应用于心肌组织工程的支架材料。但将壳聚糖、β-甘油磷酸钠、明胶、石墨烯四种材料复合用于软骨组织工程仿生修复支架材料的研究则未见相关报道。
基于上述四种材料的优点和研究现状，本发明以壳聚糖、β-甘油磷酸钠、明胶、石墨烯为原料，协同发挥每一种材料的优点与功能，调控原料的配方比例，采用一定的工艺条件和冷冻干燥技术制备仿生软骨复合支架材料，并将骨髓间充质干细胞(Bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)接种于复合支架材料上以构建细胞-支架材料复合物，对BMSCs在支架材料上的分布、黏附、铺展、细胞外基质分泌情况进行检测，以验证复合支架材料的生物相容性，为将来临床应用奠定科学基础。因此本发明构建一种生物相容性高的壳聚糖/β-甘油磷酸钠/明胶/石墨烯仿生软骨复合支架材料，用于软骨组织修复领域具有十分重要的意义。
发明内容
单一或复合壳聚糖、β-甘油磷酸钠、明胶所制备的水凝胶在组织工程领域已得到充分的认可和广泛的研究，但是目前将这几种原料与石墨烯复合制作成软骨仿生支架材料，并研究复合支架材料上的细胞生长行为还未见报道。针对这些研究的匮乏，本发明提出了一种掺杂石墨烯的仿生复合支架材料的构建方法，制备具有良好生物相容性和物化特性的壳聚糖/β-甘油磷酸钠/明胶/石墨烯仿生软骨复合支架材料，以支持BMSCs的体外增殖和功能实现，研究探讨石墨烯的掺杂对支架材料上的细胞生长行为的影响，是本发明的主要目的。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种掺杂石墨烯的仿生软骨复合支架材料的构建方法，包括以下步骤：
(1)将壳聚糖Cs粉末加入浓度为0.1mol/L的乙酸溶液中，在40～60℃条件下，磁力搅拌2～4h使其均匀溶解，得到Cs乙酸溶液，其中，Cs乙酸溶液中的壳聚糖浓度为20～30g/L；将Cs乙酸溶液以1000rpm转速离心0.5～1h，脱气、脱渣。
(2)将β-甘油磷酸钠GP粉末加入到去离子水中，室温下磁力搅拌30～60min使其均匀溶解，得到浓度为1000～3000g/L的GP水溶液。
(3)将明胶Gel颗粒加入到去离子水中，40～60℃条件下，磁力搅拌30～60min使其均匀溶解，得到浓度为60～80g/L的Gel水溶液。
(4)将石墨烯Gr粉末加入去离子水中，超声分散处理40～60min，获得均匀稳定的褐色的石墨烯悬液，其中，石墨烯悬液中Gr浓度为2～10g/L。
(5)室温下，将步骤(1)制备得到的Cs乙酸溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加步骤(2)制备的GP溶液，充分搅拌30～60min后制备成Cs/GP溶液A。滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败。所述的Cs乙酸溶液和GP水溶液的体积比为3:1～18:1。
(6)室温下，将步骤(3)制备的Gel水溶液加入到步骤(5)制备得到的Cs/GP溶液A中，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液B。所述的Cs/GP溶液A与Gel水溶液的体积比为1:1～3:1。
(7)室温下，将步骤(4)制备的石墨烯悬液加入到步骤(6)制备的Cs/GP/Gel溶液B中，在磁力搅拌器上快速搅拌进行均匀混合，超声波振荡器中进一步超声分散30～60min以使石墨烯分散均匀，并去除气泡，得到Cs/GP/Gel/Gr溶液C。所述的Cs/GP/Gel/Gr溶液C中石墨烯悬液的含量为5～20％v/v。
(8)将步骤(7)中制备的Cs/GP/Gel/Gr溶液C迅速的全部转移到低温模具中，以防止石墨烯团聚沉淀而出现相分离；并取出盛有样品的低温模具，将其在-20～-40℃条件下预冻20～30h后，转移至冷冻干燥机中冷冻干燥20～40h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层；然后将支架预产物浸置于Na2HPO4溶液中洗涤4～6h，后置于无水甲醇中6～12h以将溶剂萃取干净；最后将材料于-20～-40℃条件下预冻成型，冷冻干燥机中继续干燥20～40h，得到Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料。
所述的冷冻干燥温度均为-40～-60℃，所述的Na2HPO4溶液浓度为0.1mol/L。
所述的Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料中壳聚糖Cs、β-甘油磷酸钠GP、明胶Gel、石墨烯Gr的质量比为1:(5～20):(1～5):(0.02～0.08)。Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料孔径较均匀，孔道相互贯通，孔径大部分介于50～200μm之间，孔隙率74.81～85.42％，吸水率250.28～424.27％，弹性模量为0.545～9.268MPa。
所述的Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料中壳聚糖Cs、β-甘油磷酸钠GP、明胶Gel的质量比为1:(5～20):(1～5)。Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料的孔道分布与Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料的类似，孔径较均匀，孔道相互贯通，孔隙率76.20～87.64％，吸水率325.12～538.42％，弹性模量为0.108～4.825MPa。
上述方案中的掺杂石墨烯的仿生软骨复合支架材料的构建方法，所制备的Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料，对骨髓间充质干细胞表现出良好的生物学性能，石墨烯的掺杂有利于骨髓间充质干细胞生长行为的进行，故所制备的材料可望用于软骨组织工程领域。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点和有益效果：
(1)本发明选用壳聚糖、β-甘油磷酸钠、明胶、石墨烯制备仿生软骨复合支架材料，实现材料功能优势互补。以壳聚糖为基体保证支架的吸水性、生物相容性和降解性；复合β-甘油磷酸钠来提供磷元素，从而保证骨质、细胞膜的形成，保证代谢中各种酶的活性；复合明胶以保证支架的生物相容性、生物活性和可降解性，促进细胞在支架上的黏附和增殖；通过掺杂石墨烯调节仿生软骨复合支架材料的亲疏水性能，为细胞提供更多的附着位点、增大细胞黏附率，同时显著提高细胞在支架材料孔壁上的铺展效果，为支架材料的生物相容性提供了简单可行的保障。
(2)本发明制备工艺简单、易控，制造成本较低，所制得的支架产品孔径较均匀，孔道结构相互贯通，大孔直径在200μm左右，能够为细胞提供足够的增殖空间并适宜于实体软骨组织的生成和发育；小孔直径在50μm左右，小孔的存在能够增强支架的传质能力并为细胞提供更丰富的附着位点，很好的模拟了真实软骨结构，具有优异的仿生效果。
(3)本发明通过调节仿生软骨复合支架材料中四种原料的配方配比，来调控仿生软骨复合支架材料的孔隙率、吸水率和机械性能等，获得了孔隙率高、吸水率高、生物相容性好、结构稳定的仿生软骨复合支架材料。扫描电镜、吸水率、孔隙率、机械强度测试和细胞相容性实验检测，证明了该仿生软骨复合支架材料能够满足软骨组织工程对于支架材料的需求，并且石墨烯的掺杂会使仿生软骨复合支架材料上细胞的生长行为更好。
附图说明
图1为本发明壳聚糖/β-甘油磷酸钠/明胶/石墨烯仿生软骨复合支架材料电镜图。
Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料(Cs/GP/Gel/Gr质量比1:6.7:1.6:0.037，实施例5)：(a1)×100，(a2)×200，(a3)×400；Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料(Cs/GP/Gel质量比1:6.7:1.6，实施例2)：(b1)×200，(b2)×400，(b3)×800。
图2为掺杂石墨烯前后，骨髓间充质干细胞在复合支架材料上的分布及活性：Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料(Cs/GP/Gel/Gr质量比1:6.7:1.6:0.037，实施例5)：(a1)Calcein-AM染色，×100；(a2)PI染色，×100，(a3)Hochest染色，×100。Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料(Cs/GP/Gel质量比1:6.7:1.6，实施例2)：(b1)Calcein-AM染色，×200；(b2)PI染色，×200；(b3)Hochest染色，×200。
图3为骨髓间充质干细胞-Cs/GP/Gel/Gr复合支架材料(Cs/GP/Gel/Gr质量比1:6.7:1.6:0.037，实施例5)复合物的扫描电镜图——24h：(a1)×800；(a2)×800，(a3)×1600；48h：(b1)×800；(b2)×800；(b3)×1600。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明做进一步说明。但本发明并不限于下述实施例，在不脱离前后所述宗旨的范围内，所有基于本发明基本思想的修改和变动，都属于本发明请求保护的技术范围内。
实施例1 Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料(Cs/GP/Gel质量比1:15.2:3.7)制备(作为对比例)
称取2.2g的壳聚糖粉末，加入到100mL、0.1mol/L的乙酸溶液中，40℃下、磁力搅拌2h使其混合均匀。以1000rpm转速离心0.5h，使壳聚糖乙酸溶液脱气、脱渣。称取20.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到20mL的去离子水中，室温下磁力搅拌30min使其均匀溶解。称取6.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，40℃下、磁力搅拌30min使其混合均匀。室温下，将制得的壳聚糖乙酸溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖乙酸溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为3:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为1:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌，超声波振荡器中进一步超声分散40min以使溶液分散均匀，并脱除气泡，制备成Cs/GP/Gel溶液。将Cs/GP/Gel溶液迅速浇注在低温模具中，将盛有样品的低温模具在-20℃冰箱中预冻20h，然后转移至冷冻干燥机中-40℃冻干40h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将支架预产物浸置于Na2HPO4溶液中洗涤4h，置于无水甲醇中6h将溶剂萃取干净；最后将材料置于-20℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-40℃下继续干燥40h，得到Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料。
实施例2 Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料(Cs/GP/Gel质量比1:6.7:1.6)制备(作为对比例)
称取2.5g的壳聚糖粉末，加入到100mL、0.1mol/L的乙酸溶液中，50℃下、磁力搅拌3h使其混合均匀。以1000rpm转速离心0.5h，使壳聚糖乙酸溶液脱气、脱渣。称取24.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到16mL的去离子水中，室温下磁力搅拌40min使其均匀溶解。称取7.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，50℃下、磁力搅拌40min使其混合均匀。室温下，将制得的壳聚糖乙酸溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖乙酸溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为9:1。室温下，按照Cs/GP溶液与明胶溶液的体积比为2:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌，超声波振荡器中进一步超声分散50min以使溶液分散均匀，并脱除气泡，制备成Cs/GP/Gel溶液。将Cs/GP/Gel溶液浇注在低温模具中，将盛有样品的低温模具在-20℃冰箱中预冻30h，然后转移至冷冻干燥机中-50℃干燥30h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将支架预产物浸置于Na2HPO4溶液中洗涤5h，置于无水甲醇中9h将溶剂萃取干净；最后将材料置于-20℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-50℃下继续干燥30h，得到Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料。
实施例3 Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料(Cs/GP/Gel质量比1:6.7:1.0)制备(作为对比例)
称取3.0g的壳聚糖粉末，加入到100mL、0.1mol/L的乙酸溶液中，50℃下、磁力搅拌4h使其混合均匀。以1000rpm转速离心1h，使壳聚糖乙酸溶液脱气、脱渣。称取30.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到10mL的去离子水中，室温下磁力搅拌60min使其均匀溶解。称取8.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，60℃下、磁力搅拌器60min使其混合均匀。室温下，将制得的壳聚糖乙酸溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌60min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为15:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为3:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌，超声波振荡器中进一步超声分散40min以使溶液分散均匀，并去除气泡，制备成Cs/GP/Gel溶液。将Cs/GP/Gel溶液迅速浇注到低温模具中，将盛有样品的低温模具在-40℃冰箱中预冻20h，然后转移至冷冻干燥机中-60℃干燥20h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将支架预产物浸置于Na2HPO4溶液中洗涤6h，置于无水甲醇中12h将溶剂萃取干净；最后将材料置于-40℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-60℃下继续干燥20h，得到Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料。
实施例4 Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料(Cs/GP/Gel/Gr质量比1:15.2:3.7:0.027)制备
称取2.2g的壳聚糖粉末，加入到100mL、0.1mol/L的乙酸溶液中，40℃下、磁力搅拌2h使其混合均匀。以1000rpm转速离心0.5h，使壳聚糖乙酸溶液脱气、脱渣。称取20.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到20mL的去离子水中，室温下磁力搅拌30min使其均匀溶解。称取6.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，40℃下、磁力搅拌30min使其混合均匀。将0.02g的石墨烯Gr粉末放入10mL去离子水中超声分散40min，获得均匀稳定的褐色石墨烯悬液。室温下，将制得的壳聚糖乙酸溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖乙酸溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为3:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为1:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液。室温下，按照石墨烯悬液添加量为总体积的10％的比例向Cs/GP/Gel溶液中加入石墨烯悬液，在磁力搅拌器上快速搅拌进行均匀混合，超声波振荡器中进一步超声分散40min以使石墨烯分散均匀，并脱除气泡，得到Cs/GP/Gel/Gr溶液。将Cs/GP/Gel/Gr溶液迅速浇注到低温模具中，以防止石墨烯团聚沉淀而出现相分离。将盛有样品的模具在-20℃冰箱中预冻20h后，转移至冷冻干燥机中-40℃冷冻干燥40h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将支架预产物浸置于Na2HPO4溶液中洗涤4h，置于无水甲醇中6h将溶剂萃取干净；最后将材料置于-20℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-40℃下继续干燥40h，得到Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料。
实施例5 Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料(Cs/GP/Gel/Gr质量比1:6.7:1.6:0.037)制备
称取2.5g的壳聚糖粉末，加入到100mL、0.1mol/L的乙酸溶液中，50℃下、磁力搅拌3h使其混合均匀。以1000rpm转速离心0.5h，使壳聚糖乙酸溶液脱气、脱渣。称取24.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到16mL的去离子水中，室温下磁力搅拌40min使其均匀溶解。称取7.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，50℃下磁力搅拌40min使其混合均匀。将0.05g的石墨烯Gr粉末放入10mL去离子水中超声分散50min，获得均匀稳定的褐色石墨烯悬液。室温下，将制得的壳聚糖乙酸溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为9:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为2:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液。室温下，按照石墨烯悬液添加量为总体积的10％的比例向Cs/GP/Gel溶液中加入石墨烯悬液，在磁力搅拌器上快速搅拌进行均匀混合，超声波振荡器中进一步超声分散50min以使石墨烯分散均匀，并脱除气泡，得到Cs/GP/Gel/Gr溶液。将Cs/GP/Gel/Gr溶液迅速浇注到低温模具中，以防止石墨烯团聚沉淀而出现相分离。将盛有样品的低温模具在-20℃冰箱中预冻30h，然后转移至冷冻干燥机中-50℃干燥30h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将支架预产物浸置于Na2HPO4溶液中洗涤5h，置于无水甲醇中9h将溶剂萃取干净；最后将材料置于-20℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-50℃下继续干燥30h，得到Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料。
实施例6 Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料(Cs/GP/Gel/Gr质量比1:6.7:1.0:0.053)制备
称取3.0g的壳聚糖粉末，加入到100mL、0.1mol/L的乙酸溶液中，50℃下、磁力搅拌4h使其混合均匀。以1000rpm转速离心1h，使壳聚糖乙酸溶液脱气、脱渣。称取30.0g的β-甘油磷酸钠粉末，加入到10mL的去离子水中，室温下磁力搅拌60min使其均匀溶解。称取8.0g的明胶颗粒，加入到100mL的去离子水中，60℃下磁力搅拌60min使其混合均匀。将0.10g的石墨烯Gr粉末放入10mL去离子水中超声分散处理60min，获得均匀稳定的褐色石墨烯悬液。室温下，将制得的壳聚糖溶液在磁力搅拌器上快速搅拌，搅拌过程中缓慢的逐滴滴加β-甘油磷酸钠溶液，充分搅拌30min，制备成Cs/GP溶液，滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败，壳聚糖溶液和β-甘油磷酸钠溶液的体积比为15:1。室温下，按照Cs/GP溶液与Gel溶液的体积比为3:1的比例向Cs/GP溶液中加入Gel溶液，磁力搅拌器上快速搅拌制备成Cs/GP/Gel溶液。室温下，按照石墨烯悬液添加量为总体积的10％的比例向Cs/GP/Gel溶液中加入石墨烯悬液，在磁力搅拌器上快速搅拌进行均匀混合，超声波振荡器中进一步超声分散60min以使石墨烯分散均匀，并脱除气泡，得到Cs/GP/Gel/Gr溶液。将Cs/GP/Gel/Gr溶液迅速浇注到低温模具中，以防止石墨烯团聚沉淀而出现相分离。将盛有样品的模具在-40℃冰箱中预冻20h后，转移至冷冻干燥机中-60℃冷冻干燥20h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层。然后将支架预产物浸置于Na2HPO4溶液中洗涤6h，置于无水甲醇中12h将溶剂萃取干净；最后将材料置于-40℃冰箱中预冻成型，冷冻干燥机中-60℃下继续干燥20h，得到Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料。
实施例7 Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料(以Cs/GP/Gel/Gr质量比1:6.7:1.6:0.037为例，实施例5)、Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料(以Cs/GP/Gel质量比1:6.7:1.6为例，实施例2)的性能测试
(1)支架形貌电镜观察
用薄刀片将支架材料切成1mm×1mm的薄片，用导电胶固定在载物台上，用氮气吹扫样品表面，吹去表面杂质，真空喷金，置于钨灯丝扫描电子显微镜下观察支架形貌。
结果表明，掺杂石墨烯的支架材料为优异的三维多孔结构，孔径大部分介于50～200μm之间，最大孔径在200μm左右，其孔道相互贯通，连贯性较好，孔壁呈灰黑色、多褶皱且观察不到石墨烯片层，与对照组无异，这是由于石墨烯是以纳米尺度连续均匀地分散于材料的孔壁上，并不会改变支架材料本身的孔道分布。放大观察后发现，在大孔的孔壁上有直径在50μm左右的微孔结构，这些微孔结构能够提高支架材料的传质性能，有利于营养物质和代谢废物的传递，为细胞提供平衡的生长环境，并为细胞提供更丰富的附着位点。因此，在满足电磁特性、较好的亲疏水性能等的前提下，适宜掺杂量的石墨烯支架材料拥有较好的孔道结构，能够为细胞在支架材料上的黏附、增殖等提供更大的比表面积，从而为细胞提供良好的附着位点，有利于细胞的长入和营养物质的传递，也有助于材料自身的降解，适宜于实体软骨组织的生长和发育。
(2)支架孔隙率测试
采用比重瓶法测量支架材料的孔隙率。将支架用薄刀片切成边长为0.5cm的均匀立方体，将比重瓶装满无水乙醇，称重为W1，将质量为WS的样品浸入乙醇中，真空脱除支架中的气泡，使材料完全被无水乙醇浸润，然后再加满乙醇，称重为W2。将浸满无水乙醇的支架样品从无水乙醇中取出，剩余的无水乙醇与比重瓶称重为W3。测试温度下乙醇密度为ρ。由此可求得，样品支架本身体积为VS＝(W1-W2+WS)/ρ，样品支架孔体积为VP＝(W2-W3–WS)/ρ。支架材料的孔隙率可用如下公式计算。
Figure BDA0001576324230000091
结果表明，Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料的孔隙率为85.42％，而Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料的孔隙率为83.11％，但是从统计学上看两者并无显著性差异，这是由于两种材料的制备工艺、所用原料、配方比例等都相同，唯一区别在于是否掺杂石墨烯，而石墨烯是以纳米尺度连续均匀地分散于材料的孔壁上，并不会改变支架材料本身的孔道分布。
(3)支架吸水率测试
取一小块支架材料，在干燥条件下称其质量为m1，置于24孔板中，向孔中注入没过支架的磷酸盐缓冲溶液，将支架置于真空干燥箱中抽取气泡使其下沉。在37℃环境中浸泡一段时间，用镊子轻轻夹取支架，注意不要用力以避免支架中水分流失，用吸水纸擦去支架外表面水分，分析天平称重，记为m2。材料的吸水率可通过如下公式计算而得。
Figure BDA0001576324230000092
结果表明，Cs/GP/Gel仿生软骨支架材料的吸水率为427.98％，在相同的配比下，Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨支架材料的吸水率有了较大的降低，为315.18％，这是由于石墨烯属于疏水性的材料，掺杂石墨烯会略微降低支架材料的亲水性能；以上结果表明，在满足电磁特性的前提下，虽然掺杂石墨烯的支架材料的吸水能力较未掺杂石墨烯的支架材料的吸水能力略有降低，但是仍然保持相对较高的亲水性能，这完全能够满足细胞在支架材料表面的黏附等行为。
(4)支架弹性模量测试
利用万能实验机测定支架材料的弹性模量与强度，样品规格为5mm×5mm×5mm，支架上下截面要尽量平整，以避免表面凸起造成的压力异常，实验前确保加载装置力线垂直于支架材料表面。根据其结果绘制支架的负荷位移图，支架材料的位移控制加载速度为1mm/min。根据所获得的数据计算复合支架的弹性模量，公式如下：
Figure BDA0001576324230000101
式中，E为弹性模量，单位为MPa；F1、F2为线性段(弹性形变段)开始前后的压力负荷，单位为N；a、b、h分别代表试样材料的长、宽和高，单位为mm；x1、x2代表支架材料在压力负荷下的位移，单位为mm。
结果表明，Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨支架材料的弹性模量为9.268MPa，Cs/GP/Gel仿生软骨支架材料的弹性模量为4.825MPa。掺杂石墨烯的支架材料的弹性模量要高于相同配比的未掺杂石墨烯的支架材料的弹性模量，说明石墨烯的加入会提升材料的机械性能。这是由于石墨烯的机械性能非常好，而且石墨烯以纳米尺度均匀镶嵌在材料的孔壁中，能够为材料的孔壁提供更大的支撑力，对材料的孔壁起到了加固作用。
实施例8 Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料(以Cs/GP/Gel/Gr质量比1:6.7:1.6:0.037为例，实施例5)、Cs/GP/Gel仿生软骨复合支架材料(以Cs/GP/Gel质量比1:6.7:1.6为例，实施例2)的细胞相容性检测
本发明从70～120g的SD大鼠股骨中提取原代骨髓间充质干细胞，3天之后细胞已经完全贴壁，但是含有红细胞等杂细胞；第7天细胞已经基本铺满培养瓶瓶底，出现叠层生长现象，可以进行传代。经传代之后，红细胞等杂细胞明显减少；P3代细胞在8天之后基本铺满培养瓶瓶底，其生长状态良好，呈三角形、多边形和长梭形，细胞之间存在突触相连，且具有良好的增殖能力和多向分化能力，观察不到红细胞等杂细胞，这表明，经过传代之后，骨髓间充质干细胞仍然保持着良好的增殖能力，而且得到纯化。因此，所提取的原代骨髓间充质干细胞具有旺盛的生命力，可以用于后续实验以接种到材料上。
骨髓间充质干细胞-支架复合物的体外构建：将复合支架切成长宽都为0.5cm，厚度为1mm的薄片，放入6孔板中用95％乙醇浸泡12h，将其放在超净工作台中，紫外线照射12h，浸泡结束后，换用含有磷酸盐缓冲溶液浸泡6h，再换用少量含有1％双抗的完全培养基浸润支架1h，确保支架沉底，弃去培养基后风干支架至半干状态，准备接种。消化骨髓间充质干细胞制成细胞悬液，利用血球计数板调整细胞密度为106cells/mL，根据支架大小，向支架正反面上分别均匀滴加5μL细胞悬液，将其放入24孔板中，加入100μL的完全培养基，随后将该孔板置于培养箱(37℃，5％CO2)中培养，待细胞贴壁后，补加1mL的完全培养基，定期置于显微镜下观察，视细胞生长情况决定是否换液，以备后续进行相关检测。
待细胞-复合支架材料复合培养物培养24h、48h后，取出复合物置于孔板中，室温下，用2.5％戊二醛固定24h，用PBS冲洗两次，再依次使用浓度为50％、70％、90％、100％、100％的酒精进行梯度脱水，每级脱水时间都为30min，室温下自然干燥，表面喷金，最后置于扫描电镜中，选取合适的放大倍数观察复合支架材料上细胞粘附及细胞外基质分泌情况。细胞-支架材料复合物的扫描电镜观察发现，骨髓间充质干细胞在掺杂石墨烯的复合支架材料上的生长状态要明显好于未掺杂石墨烯的复合支架材料上的生长状态，24h时细胞已经黏附在支架材料的孔壁上，48h时观察到细胞已经基本完全铺展在支架材料的孔壁上，细胞间存在细胞突触的连接，而未掺杂石墨烯的支架材料上的细胞在48h时刚呈现出铺展的趋势。这是因为石墨烯以纳米尺度镶嵌在支架材料的孔壁上，而且石墨烯是疏水性的物质，能够适当调节支架材料的亲疏水性能，为细胞在支架材料上的黏附和铺展提供一个良好的接触角区间，从而加速细胞在支架材料上的黏附、铺展等生长行为的进行。
用手术镊子将在孔板中培养48h的仿生软骨支架-细胞复合物取出，移至另一个24孔板中，进行Dead/Live荧光染色以观察细胞在软骨仿生支架中的生长情况，亦即考察仿生支架的生物相容性。
支架材料-细胞复合物中细胞的Dead/Live荧光染色检测：配置Calcein-Hochest-PI染色液(2μL Calcein储备液，5μL Hochest储备液，1μL PI储备液溶解在1mL PBS中)；PBS冲洗支架材料两次，加入染色液，染色液加入量以覆盖支架材料为宜；饱和湿度培养箱(37℃、5％CO2)中孵育30min，PBS冲洗后，移至荧光显微镜下观察。对比掺杂石墨烯前后BMSCs在支架材料上48h的分布及活性差异，可以发现，Calcein-AM染色中，细胞在掺杂石墨烯的支架材料上均匀分布，细胞大量存活且具有良好的活性，PI染色中有极少数的死细胞，Hochest染色中有大量被深染的细胞核。这表明，掺杂石墨烯的支架材料上的细胞数量和生长状态要好于未掺杂石墨烯的支架材料上的细胞数量和生长状态，这是因为适宜的石墨烯掺杂会导致细胞黏附率的增大，一般而言，细胞膜具有亲水性，故亲水性材料的表面更易于细胞黏附，但是细胞的黏附需要蛋白介导，这就要求支架材料具有适当的疏水性。石墨烯是疏水性的物质，适量的石墨烯均匀掺杂进支架材料会适当降低支架材料的亲水性，同时为细胞提供了更多的附着位点，从而导致细胞黏附率的增大，进而促进细胞在支架材料孔壁上铺展等生长行为的进行。因此，适宜的石墨烯掺杂会使支架材料更适合细胞的粘附生长，Cs/GP/Gel/Gr复合支架材料更适合于用作仿生软骨支架材料。

Claims (9)

1.一种掺杂石墨烯的仿生软骨复合支架材料的构建方法，其特征在于以下步骤：
(1)将壳聚糖Cs粉末加入乙酸溶液中，在40～60℃条件下，磁力搅拌，得到浓度为20～30g/L的Cs乙酸溶液，将Cs乙酸溶液离心处理进行脱气、脱渣；
(2)将β-甘油磷酸钠GP粉末加入去离子水中，室温下磁力搅拌，得到浓度为1000～3000g/L的GP水溶液；
(3)将明胶Gel颗粒加入去离子水中，40～60℃条件下，磁力搅拌，得到浓度为60～80g/L的Gel水溶液；
(4)将石墨烯Gr粉末加入去离子水中，超声分散处理后获得均匀稳定的褐色的石墨烯悬液，其中，石墨烯悬液中Gr浓度为2～10g/L；
(5)室温下，将步骤(2)制备的GP水溶液逐滴到步骤(1)制备得到的Cs乙酸溶液中，搅拌后制备成Cs/GP溶液A；滴加过程中观察溶液无明显絮状物质出现，否则视为失败；
(6)室温下，将步骤(3)制备的Gel水溶液加入到步骤(5)制备得到的Cs/GP溶液A中，搅拌后制备成Cs/GP/Gel溶液B；
(7)室温下，将步骤(4)制备的石墨烯悬液加入到步骤(6)制备的Cs/GP/Gel溶液B中，搅拌均匀后进行超声分散后，得到Cs/GP/Gel/Gr溶液C；所述的Cs/GP/Gel/Gr溶液C中石墨烯悬液的含量为5～20％v/v；
(8)将步骤(7)中制备的Cs/GP/Gel/Gr溶液C全部转移到低温模具中，防止石墨烯团聚沉淀而出现相分离；并将低温模具在-20～-40℃条件下预冻20～30h后，转移至冷冻干燥机中冷冻干燥20～40h，冷冻干燥结束后打碎模具，取出支架预产物，去除表面致密层；然后将支架预产物浸置于Na2HPO4溶液中洗涤4～6h，后置于无水甲醇中6～12h以将溶剂萃取干净；最后将材料于-20～-40℃条件下预冻成型，冷冻干燥机中继续干燥20～40h，得到Cs/GP/Gel/Gr仿生软骨复合支架材料。
2.根据权利要求1所述的一种掺杂石墨烯的仿生软骨复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述的Cs乙酸溶液和GP水溶液的体积比为3:1～18:1。
3.根据权利要求1或2所述的一种掺杂石墨烯的仿生软骨复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤(6)中所述的Cs/GP溶液A与Gel水溶液的体积比为1:1～3:1。
4.根据权利要求1或2所述的一种掺杂石墨烯的仿生软骨复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤(8)中所述的冷冻干燥温度均为-40～-60℃，所述的Na2HPO4溶液浓度为0.1mol/L。
5.根据权利要求3所述的一种掺杂石墨烯的仿生软骨复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤(8)中所述的冷冻干燥温度均为-40～-60℃，所述的Na2HPO4溶液浓度为0.1mol/L。
6.根据权利要求1或2或5所述的一种掺杂石墨烯的仿生软骨复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述的搅拌时间为30～60min；步骤(7)中所述的超声分散时间为30～60min。
7.根据权利要求3所述的一种掺杂石墨烯的仿生软骨复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述的搅拌时间为30～60min；步骤(7)中所述的超声分散时间为30～60min。
8.根据权利要求4所述的一种掺杂石墨烯的仿生软骨复合支架材料的构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述的搅拌时间为30～60min；步骤(7)中所述的超声分散时间为30～60min。
9.采用权利要求1-8任一所述的构建方法得到的仿生软骨复合支架材料，其特征在于，所述的仿生软骨复合支架材料中壳聚糖Cs、β-甘油磷酸钠GP、明胶Gel、石墨烯Gr的质量比为1:(5～20):(1～5):(0.02～0.08)；仿生软骨复合支架材料孔径较均匀，孔道相互贯通，孔径大部分介于50～200μm之间，孔隙率74.81～85.42％，吸水率250.28～424.27％，弹性模量为0.545～9.268MPa。
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