ES2248817T3 - Procedimiento de preparacion de particulas reticuladas de polimeros hidrosolubles, las particulas obtenidas y su utilizacion. - Google Patents
Procedimiento de preparacion de particulas reticuladas de polimeros hidrosolubles, las particulas obtenidas y su utilizacion.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN PROCEDIMIENTO DE PREPARACION DE PARTICULAS POLIMERICAS HIDROSOLUBLES, RETICULADAS, MEDIANTE LA COMBINACION DE UNA DISOLUCION POLIMERICA ACUOSA, QUE COMPRENDE UN POLIMERO HIDROSOLUBLE, ESPECIALMENTE UN POLISACARIDO, UN MEDIO ACUOSO, Y UN MEDIO OLEOSO, PARA FORMAR UNA EMULSION DE GOTITAS DEL POLIMERO HIDROSOLUBLE; Y MEDIANTE LA ADICION A DICHA EMULSION, DE UN AGENTE RETICULANTE, CAPAZ DE RETICULAR EL POLIMERO HIDROSOLUBLE, PARA FORMAR PARTICULAS POLIMERICAS HIDROSOLUBLES, RETICULADAS. SE DESCRIBEN ASIMISMO LAS PARTICULAS ASI CONSTITUIDAS Y LAS DISPERSIONES ACUOSAS DE LAS MISMAS. ASIMISMO, SE PRESENTA UN METODO CONSISTENTE EN ADMINISTRAR A UN PACIENTE NECESITADO DE TRATAMIENTO, UNA SUSPENSION ACUOSA DE PARTICULAS POLIMERICAS HIDROSOLUBLES.
Description
Procedimiento de preparación de partículas
reticuladas de polímeros hidrosolubles, las partículas obtenidas y
su utilización.
Preparaciones para aumentar el tejido corporal, y
procesos para formar dichas preparaciones, que comprenden
dispersiones acuosas de partículas poliméricas solubles en
agua.
Esta invención se refiere a la preparación de
preparaciones de partículas poliméricas solubles en agua, para usar
en la preparación de medicamentos.
Las dispersiones acuosas de partículas
poliméricas solubles en agua son difíciles de fabricar. Es
particularmente difícil controlar el tamaño y la forma de la
partícula y que dichas partículas sean reproducible. Las
dispersiones acuosas de partículas poliméricas solubles en agua que
han estado disponibles anteriormente a esa invención en general no
son satisfactorias. Anteriormente, dichas partículas generalmente
se preparaban añadiendo un agente de reticulación a una solución
acuosa de polímero con agitación. La agitación sirve para degradar
el polímero de reticulación para obtener el tamaño de partícula
deseado. Para degradar los polímeros reticulados y de reticulación,
se necesita una fuerza mecánica suficiente para provocar la cizalla
y la ruptura de la integridad de la partícula. Este método de
agitación-reticulación en contracorriente da una
distribución indeseablemente amplia de tamaños y formas de
partícula y produce fragmentos de partícula indeseables.
Adicionalmente, hay una variabilidad sustancial en las poblaciones
de partículas resultantes entre cada uno de los experimentos de
producción.
Un aspecto particularmente indeseable de la
población de partículas heterogéneas producidas por este método es
que es difícil o imposible "limpiar" o fraccionar la población
heterogénea para producir una población homogénea de partículas que
tengan el mismo tamaño y forma. Una población homogénea de
partículas es particularmente deseable cuando las partículas tienen
que suministrarse por inyección a través de una aguja de una
jeringuilla de pequeño calibre.
Otros procesos para preparar dispersiones acuosas
de partículas poliméricas reticuladas solubles en agua implican
métodos que son de naturaleza patentada. Dichas partículas, sin
embargo no están disponibles en las cantidades requeridas y sus
parámetros físicos no son adecuados para la aplicación o sus
propiedades no pueden variarse sistemáticamente. Además, no hay
disponible un intervalo completo de composiciones y tamaños del
polímero.
Las partículas solubles en agua tienen diversas
utilidades. Hay tres tipos básicos de polímeros basados en agua:
(a) Polímeros en solución - estos comprenden
dispersiones de moléculas poliméricas individuales. La viscosidad de
la solución depende del peso molecular y de la concentración del
polímero; cuanto mayor sea el peso molecular y la concentración,
mayor será la viscosidad de la solución. La viscosidad de la
solución limita el uso de estos polímeros en solución a pequeños
pesos moleculares y pequeñas concentraciones. Esto es especialmente
cierto cuando el uso implica el suministro de partículas mediante
inyección a través de la aguja de una jeringuilla de pequeño
calibre.
(b) Látex - estos comprenden dispersiones
coloidales de partículas poliméricas, comprendiendo cada una
cientos o miles de moléculas poliméricas. La viscosidad del látex
depende de las interacciones entre las partículas coloidales y es
independiente del peso molecular del polímero. Por lo tanto, los
látex a menudo combinan bajas viscosidades con altas concentraciones
poliméricas. Además, el mecanismo y cinética de polimerización en
emulsión favorece la preparación de polímeros de alto peso
molecular con rápidas velocidades de polimerización. Las
dispersiones acuosas de polímeros solubles en agua reticulados
pueden prepararse por emulsión inversa o polimerización en
suspensión inversa de mezclas monoméricas que contienen un monómero
de reticulación, por ejemplo una mezcla de acrilamida y
mutilen-bis-acrilamida. Sin
embargo, este método se limita a polímeros que puedan prepararse por
polimerización de cadena radicálica. Sigue habiendo una necesidad
para preparar partículas de polímeros solubles en agua que se
deriven de fuentes naturales.
(c) Polímeros reducibles en agua o dispersables
en agua - estos polímeros tienen un grado de dispersión intermedio
entre el de los polímeros en solución y el de los látex. La
viscosidad de estas muestras intermedias depende de los grados
relativos de carácter de polímero en solución y polímero de látex.
Como en el caso de los látex, este método se limita a polímeros que
puedan prepararse por polimerización de cadena radicálica.
Los polisacáridos son biopolímeros de origen
natural que existen en un estado líquido altamente viscoso en los
tejidos animales, donde reaccionan fácilmente con proteínas para
formar glucosaminoglicanos o proteoglicanos.
Las partículas biocompatibles y no biodegradables
que son no citotóxicas, no carcinógenas, no inflamatorias, no
pirógenas y no inmunógenas son necesarias para proporcionar una
solución a la necesidad existente desde hace mucho tiempo y no
satisfecha de una composición mejorada útil para aumentar el tejido
blando para tratar anormalidades congénitas, defectos adquiridos o
defectos cosméticos.
Las poblaciones homogéneas de dichas partículas
serían particularmente útiles para aumentar los tejidos blandos por
implante quirúrgico o, preferiblemente, por suministro al sitio
deseado por inyección convencional a través de la aguja de una
jeringuilla de pequeño calibre.
Sería particularmente deseable usar dichas
partículas para tratar la incontinencia urinaria y el reflujo
vesicouretral, para corregir arrugas y otros defectos de la piel o
para servir como composición general de aumento o sustitución de un
material estructural en tejidos blandos o duros tales como mamas,
labios, pene, hueso, cartílago y tendón.
No hay informes en la bibliografía hasta ahora de
cómo preparar microesferas de gel hidrófilo correspondiente de
alginato sódico y hialuronato sódico.
Por lo tanto, existe una necesidad de
dispersiones acuosas de partículas poliméricas solubles en agua de
una distribución de tamaño relativamente estrecha con
características físicas definidas y de un proceso para preparar
dicha dispersión y recuperar las partículas en cualquier cantidad
deseada a un coste razonable.
El documento
US-A-4124705 describe un agente para
administración intravascular, estando compuesto el agente por una
suspensión de partículas de polisacárido con una distribución de
tamaño adecuada para bloquear los vasos sanguíneos más finos del
cuerpo. Las partículas son útiles en métodos de realización de
diagnóstico y se asocian con un agente de diagnóstico. Las
partículas se preparan emulsionando una solución de almidón en un
disolvente orgánico usando un estabilizador de emulsión. El
disolvente orgánico puede ser de cloruro de etileno. La
epiclorhidrina está presente como agente de reticulación. Las
partículas tienen un tamaño de partícula generalmente en el
intervalo de 1 a 200 \mum y preferiblemente en un estado hinchado
con agua que presenta una distribución de tamaño en un intervalo de
5 a 150 \mum.
El documento
EP-A2-256293 describe partículas de
alcohol polivinílico reticuladas porosas usadas para un medio
cromatográfico y preparadas dispersando una solución acuosa de una
mezcla de alcohol polivinílico y una sal en un disolvente orgánico,
permitiendo que se forme un gel espontáneamente a partir de la
dispersión, y haciendo reaccionar el gel con un agente de
reticulación. Las condiciones de proceso se ajustan para
suministrar tamaños de partículas en los que el tamaño medio esta
en un intervalo de 20 a 1000 \mum. Las partículas son generalmente
esféricas.
El documento
EP-A1-555980 describe un método para
preparar partículas esféricas finas de un producto polimérico
reticulado soluble en agua, comprendiendo el método el secado por
pulverización y poner en solución acuosa una mezcla del polímero
soluble en agua y un aditivo tal como un alcohol polihídrico o un
oligosacárido. La utilidad descrita de las partículas es como
aditivos y aglutinantes para cosméticos como medicinas, alimentos y
similares. Las partículas son generalmente esféricas y el documento
se refiere a la tarea de producir partículas de un polímero soluble
en agua que sean verdaderamente esféricas.
Está invención pretende proporcionar:
i. un proceso para la preparación de dispersiones
acuosas de partículas poliméricas solubles en agua que no tienen los
problemas de la técnica anterior;
ii. un proceso para la preparación de
dispersiones acuosas de partículas poliméricas solubles en agua de
una distribución de tamaños estrecha;
iii. partículas poliméricas solubles en agua que
tienen una forma sustancialmente uniforme;
iv. un proceso para la preparación de
dispersiones acuosas de partículas poliméricas solubles en agua en
las que las partículas recuperadas tienen una distribución en tamaño
de manera que la gran mayoría de partículas tienen un tamaño menor
de 212 micrómetros.
El proceso de la invención comprende añadir una
preparación de partículas poliméricas solubles en agua reticuladas
que pueden obtenerse añadiendo una solución polimérica acuosa, que
comprende un polímero soluble en agua seleccionado entre ácido
hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano, sulfato
de queratano, celulosa, quitina, quitosano, agarosa, carragenanos,
curdlano, dextranos, emulsano, gelanos, xantanos, poli(óxido de
etileno), poli(alcohol vinílico),
poli(N-vinil pirrodilona), proteínas (tales
como albúmina de suero bovino y gamma globulina humana),
glucoproteínas (proteínas a las que se unen cadenas de
carbohidratos), pectidoglicanos (cadenas de heteroglicanos que
comprenden unidades alternadas de
N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido
N-acetilmurámico (MurNAc unidos a diversos
péptidos), proteoglicanos (proteínas a las que se unen las cadenas
de glucosaminoglicano), lipopolisacáridos o combinaciones de los
mismos y un medio acuoso, a una base oleosa que contiene un agente
de emulsión de agua en aceite, agitar la mezcla para formar una
emulsión que contiene gotas poliméricas y reticular las gotas
poliméricas in situ mediante un agente de reticulación dando
como resultado la formación de partículas poliméricas reticuladas.
La invención se refiere adicionalmente a una preparación de
partículas poliméricas que puede obtenerse por este proceso. La
invención proporciona también el uso de una preparación de
partículas solubles en aguas reticuladas donde al menos el 80% de
las partículas son esféricas, para la preparación de un medicamento
para tratar un defecto seleccionado entre incontinencia urinaria,
reflujo de vesicoureteral, insuficiencia glótica, influjo
gastroesofágeo, y defectos de la piel, de un medicamento que sirve
como material estructural para curado de heridas o un medicamento
para el aumento de tejido blando, y de un material de implante
tisular.
También es ventajoso que las partículas
poliméricas solubles en agua de la invención pueden usarse como
vehículo para suministrar fármacos encapsulados y otros medicamentos
in vivo. Otra ventaja es que las partículas poliméricas son
inyectables y por tanto se administran de manera fácil y barata al
paciente.
Adicionalmente las partículas tienen otros usos
tales como en cementos y adhesivos, espesantes de pinturas de
látex, sustitutos para celulosa microcristalina, medios nutrientes
y sustitutos para geles de agar con tamaños de gel mejor
definidos.
La presente invención se refiere a un proceso
para la preparación de partículas poliméricas (hidrófilas) solubles
en aguas reticuladas, estando formadas las partículas poliméricas
mediante el proceso, y dispersiones acuosas y dispersiones
farmacéuticamente aceptables de las partículas poliméricas. La
invención se refiere también a usos de las partículas poliméricas
para la preparación de medicamentos.
La presente invención proporciona partículas
biocompatibles y no biodegradables que son sustancialmente no
citotóxicas, no carcinógenas, no inflamatorias, no pirógenas y no
inmunógenas y que carecen de otras respuestas humorales o celulares
no deseadas. Deseablemente las partículas poseen también una
estabilidad a largo plazo suficiente de tamaño, forma, rigidez y
composición para tener utilidad como materiales de implante. Como
característica deseable adicional de las partículas de la invención,
útil para propósitos de implante es que son relativamente inertes y
no se degradan rápidamente in vivo. Una característica
particularmente ventajosa las partículas de la invención es que son
fácilmente inyectables. Deseablemente las partículas poliméricas
solubles en agua reticuladas preparadas de acuerdo con la invención
son de un tamaño sustancialmente homogéneo y generalmente de un
tamaño menor de 212 \mum de diámetro y al menos el 80% de las
partículas son esféricas. Más deseablemente al menos el 90% de las
partículas son esféricas. Aún más deseablemente al menos el 80% de
las partículas están dentro de una desviación típica de la media o
del tamaño medio de las partículas. Dichas partículas proporcionan
una solución a la necesidad que se tiene desde hace tiempo y no
satisfecha de una composición mejorada útil para tratamientos
médicos tales como aumento de tejido blando para tratar
anormalidades congénitas, defectos adquiridos o defectos
cosméticos.
Los ejemplos de defectos congénitos que pueden
tratarse con las partículas de la invención incluyen sin limitación
microsomia hemifacial, hipoplasia malar y zigomática, hipoplasia
mamaria unilateral, pectus excavatum, agenesia pectoral e
incompetencia velofaríngea secundaria.
Los ejemplos de defectos adquiridos incluyen, sin
limitación, defectos post-quirúrgicos,
post-traumáticos y post-infecciosos
tales como cicatrices profundas, atrofia subcutánea, acné,
esclerodermia lineal con atrofia subcutánea, deformidad de nariz en
forma de silla de montar, enfermedad de Romberg y parálisis
unilateral de las cuerdas vocales.
Los efectos cosméticos incluyen sin limitación
líneas de ceño glaberal, arrugas nasolabiales, arrugas geográficas
circumorales, mejillas hundidas e hipoplasia mamaria.
Las poblaciones homogéneas de partículas
producidas mediante el proceso de la invención son útiles para
aumentar el tejido blando que implica el suministro al sitio de
implante deseado por inyección convencional a través de la aguja de
una jeringuilla de pequeño calibre (tal como una aguja de calibre
20, 21 o 22) aunque son útiles también para implante quirúrgico y
otros métodos de suministro tales como endoscópicamente.
Un uso deseable de las partículas de la invención
es para tratar la incontinencia urinaria, el reflujo vesicular, la
insuficiencia glótica y el reflujo gastroesofágico y para corregir
arrugas y otros defectos de la piel o para servir como composición
de aumento o sustitución o como material estructural en tejidos
blandos o duros tales como labios, pene, hueso, cartílago y tendón.
Cuando las partículas de la invención se administran a un paciente
para servir como material estructural, las partículas facilitan la
migración e infiltración de fibroblastos y células relacionadas.
Los grandes espacios libres en la microesfera de la presente
invención, particularmente microesferas de polisacáridos, permite
que las células se infiltren en y a través de la perla.
Adicionalmente, la gran área superficial de las microesferas
promueve la unión y el crecimiento de células de infiltración.
Además, el material estructural se degrada gradualmente y lo
absorbe el hospedador. Opcionalmente, cuando las microesferas de la
presente invención se usan como material estructural, los agentes
bioactivos pueden reticularse, acoplarse o unirse de otra manera
usando métodos bien conocidos en la técnica para proporcionar
estímulos celulares localizados. Los ejemplos de dichos agentes
bioactivos incluyen factores de crecimiento y citoquinas tales como
el factor de crecimiento de fibroblástico, factor de crecimiento
endotelial, interleuquinas, factor de crecimiento derivado de
plaquetas, factor de necrosis tisular, hormonas, pépticos de
adhesión celular, etc. En consecuencia, cuando se usan las
microesferas de la presente invención como material estructural, se
facilita la colonización del sito por las células.
Un característica particularmente ventajosa de la
invención es que los parámetros de proceso tales como la composición
de la fase oleosa empleada, los agentes de emulsión seleccionados,
la temperatura, el pH, el tiempo de reticulación y lavado pueden
ajustarse y controlarse de manera precisa en la síntesis a pequeña
escala y duplicarse fácilmente y de manera reproducible cuando se
aumenta de escala para ejecuciones de producción completa para
conseguir micropartículas de alta calidad que tiene características
deseables tales como tamaño y forma sustancialmente uniforme,
estabilidad física y química excelente y propiedades elásticas que
permiten la extrusión fácil a través de agujas de jeringuilla de
pequeño calibre.
El proceso de preparación de particular
poliméricas solubles en agua reticuladas comprende disolver un
polímero soluble en agua o tampón acuoso para proporcionar la
concentración deseada de polímero en solución. La solución que
contiene polímero acuoso se añade después en una cantidad adecuada
para proporcionar la concentración deseada del polímero soluble en
agua, a una fase oleosa que incluye una agente de emulsión de agua
en aceite. La mezcla se agita para formar una emulsión que contiene
gotas poliméricas. Las gotas poliméricas se reticulan in situ
mediante un agente de reticulación dando como resultado la
formación de partículas poliméricas reticuladas. Después de la
reticulación, el polímero en emulsión oleosa se invierte después en
un exceso de agua para proporcionar una dispersión acuosa de
partículas poliméricas reticulada. Las partículas se recuperan
después a partir de la dispersión acuosa.
El polímero soluble en agua se selecciona entre
ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatano,
sulfato de queratano, celulosa, quitina, quitosano, agarosa,
carragenanos, curdlano, dextranos, emulsano, gelanos, xantanos,
poli(óxido de etileno), poli(alcohol vinílico),
poli(N-vinil pirrolidona), proteínas (tales
como albúmina de suero bovino y gamma globulina humana),
glucoproteínas (proteínas a las que se une las cadenas de
carbohidratos), peptidoglicanos (cadenas de heteroglicanos que
comprenden unidades alternadas de
N-acetiglucosamina (GlcNAc) y ácido
N-acetilmurámico (MurNAc) unidas a diversos
péptidos), proteoglicanos (proteínas a las que se unen las cadenas
de glicosaminoglicanos), lipopolisacáridos o combinaciones de los
mismos. En general, las soluciones con viscosidades tan altas como
10^{4}-10^{5} cps pueden degradarse en gotas por
el método habitual de emulsión.
Deseablemente las partículas de la invención se
forman un único polímero soluble en agua.
El ácido hialurónico y el alginato sódico son
polisacáridos que son biocompatibles y biodegradables en tejido
humano y son no citotóxicos, no carcinógenos, no inflamatorios, no
pirógenos y no inmunógenos; por lo tanto en forma de microesferas de
gel, son buenos candidatos para el suministro de fármacos.
Diversos agentes de reticulación se hallarán
satisfactorios. El más deseable dependerá del polímero soluble en
agua particular usado. Es importante que el polímero soluble en agua
y el agente de reticulación tengan ambos grupos funcionales
reactivos entre sí. La selección de un agente de reticulación
apropiado pueden conseguirla fácilmente los especialistas en la
técnica. Los ejemplos de agentes de reticulación que se encontrarán
satisfactorios incluyen
pentaeritritol-tris-[beta(N-aziridinil)-propionato],
divinilsulfona, glutaraldehído, ácido p-tolueno
sulfónico, carbodiimidas, diepóxidos, persulfato amónico. También
puede usarse calcio en algunos casos. Por ejemplo, el ión calcio se
sabe que reticula polímeros solubles en agua que contienen grupos
carboxilo. Independientemente de esto, esta reacción forma enlaces
iónicos, en lugar de enlaces covalentes. Los enlaces iónicos pueden
degradarse mediante un cambio en las condiciones externas por
ejemplo mediante agentes quelantes. Por otro lado, los enlaces
covalentes son estables en presencia de los agentes de quelantes.
Por lo tanto, el agente de reticulación más preferido para usar en
la práctica de la invención es uno que forme enlaces covalentes con
el polímero soluble en agua, en lugar de enlaces iónicos.
El agente de reticulación se añade
necesariamente, en algunos casos, a la solución polimérica acuosa
antes de la emulsión como se aclarará posteriormente en este
documento. En otros casos sin embargo el agente de reticulación
puede añadirse a la dispersión de gotas solubles en agua en la fase
oleosa. En algunos casos, el agente de reticulación puede añadirse
incluso a la emulsión invertida. El orden de adicción del agente de
reticulación dependerá no sólo del polímero particular y del agente
de reticulación elegido, si no también de la velocidad de la
reacción de reticulación. Una consideración importante es que la
velocidad de reticulación no sea tal que sea competitiva con la
emulsión. Deseablemente la reacción de reticulación es
suficientemente lenta para permitir la emulsión completa de las
fases acuosa y oleosa. Opcionalmente, el agente de reticulación
puede añadirse a la solución polimérica acuosa, y el pH de la
solución ajustarse para ralentizar adecuadamente la velocidad de
reticulación antes de que dicha solución se añada y se emulsione con
la fase oleosa. Posteriormente, el pH se ajusta para proporcionar la
velocidad de reacción de reticulación deseada.
En algunos casos, puede ser deseable añadir un
catalizador para iniciar la reacción de reticulación. Esto dependerá
en alguna medida del polímero soluble en agua particular
seleccionado así como del agente de reticulación. La selección de
cualquier catalizador particular, en cualquier caso pueden
realizarla los especialistas en la técnica. Los ejemplos de
catalizadores que pueden usarse en la práctica de la invención
incluyen ácido p-tolueno sulfónico y ácido
clorhídrico. Puede ser deseable, en algunos casos proporcionar calor
como catalizador.
La fase oleosa (es decir la fase de disolvente no
acuoso) puede ser cualquier líquido hidrófobo inerte que se pueda
separar fácilmente de la dispersión de partículas solubles en agua.
Los que se encontrarán adecuados en la práctica de la invención
incluyen tolueno, o-xileno e isooctano; sin embargo,
en general puede usarse cualquier hidrocarburo como fase líquida
oleosa. Es preocupante, sin embargo, que el agente de reticulación
no sea soluble en la fase oleosa. La solución de polímero soluble
en agua no debería ser soluble o miscible con el hidrocarburo usado
como fase oleosa. Deseablemente, el hidrocarburo debería ser
también sustancialmente puro aunque pueden usarse mezclas de
hidrocarburos. Deseablemente, el hidrocarburo en sustancialmente no
volátil. Se cree que los especialistas en la técnica pueden elegir
un hidrocarburo adecuado para usar en la práctica de la invención.
Aunque no es crítico para la invención descrita en este documento,
el hidrocarburo elegido, desde un punto de vista práctico, debería
ser de bajo coste.
Para emulsionar la fase polimérica soluble en
agua en la fase oleosa para dar una emulsión de agua en aceite, se
usa un agente emulsionante de tipo agua en aceite en la cantidad de
aproximadamente 0,010 a aproximadamente 10,0% de la fase oleosa.
Puede usarse cualquier agente emulsionante de agua en aceite usado
habitualmente en la práctica de la invención, por ejemplo, hexadecil
ftalato sódico, monoestearato de sorbitano, jabones metálicos y
similares. Independientemente de esto, lo bien que trabaje el
emulsionante en cualquier caso particular depende de la solución
polimérica a emulsionar, de la composición de la fase oleosa y de
los medios de emulsión. El emulsionante debe funcionar para
estabilizar el sistema de agua en disolvente de la invención
suficientemente para permitir la reticulación controlada de los
polímeros hidrófilos para producir partículas que sean
sustancialmente homogéneas en forma y tamaño, es decir
aproximadamente el 80% de las partículas están dentro de una
desviación típica del tamaño medio, y al menos aproximadamente el
95% de las partículas son esféricas. Los emulsionantes deseables
tienen valores bajos de HLB (equilibrio hidrófilo lipófilo),
generalmente valores de HLB de menos de aproximadamente 8,
preferiblemente menos de aproximadamente 6 es decir, son
emulsionantes de agua en aceite. Los especialistas en la técnica
pueden determinar fácilmente qué emulsionante de agua en aceite
usar en cualquier caso dado.
La reacción de reticulación se controla en algún
grado por los reactivos particulares implicados como la
concentración de los reactivos y el pH. La proporción del peso de
polímeros solubles en agua a la de agente de reticulación dependerá
del polímero particular usado así como del agente de reticulación.
Esta proporción puede variar de aproximadamente 0,2 a
aproximadamente 200, preferiblemente de aproximadamente 1 a
aproximadamente 10. La extensión de reticulación de las gotas
poliméricas generalmente se controla mediante un tiempo especificado
a temperatura ambiente. En cualquier caso particular, el tiempo de
reacción más adecuado pueden determinarlo fácilmente los
especialistas de la técnica. En algunos casos la reacción de
reticulación puede detenerse por adicción de un alcohol tal como
metanol o isopropanol, los grupos hidroxilo de dichos reaccionantes
con los grupos funcionales del agente de reticulación. El pH puede
ajustarse como se desee, usando por ejemplo una base tal como
hidróxido amónico, o un ácido tal como ácido acético o
clorhídrico.
La extensión de agitación deseada de la emulsión
durante la formación de las gotas dependerá no solo de los reactivos
implicados en cualquier caso particular sino también del tamaño de
las partículas deseadas. Por ejemplo, como resultará evidente
posteriormente en este documento, agente emulsionante SPAN 60 que
contiene tolueno, es decir monoestearato de sorbitano que tiene un
HLB de 4,7, que esta disponible en ICI Americas, puede usarse para
preparar partículas de tamaño microscópico, por ejemplo de un
diámetro de 50 micrómetros, o partículas de tamaño submicroscópico,
por ejemplo un diámetro de 0,2 micrómetros, de acuerdo con la
concentración de SPAN 60 y la agitación. Una baja concentración de
SPAN 60 con agitación vigorosa dará partículas de mayor tamaño; una
elevada concentración con agitación vigorosa dará partículas más
pequeñas. Pueden usarse diferentes tipos de equipo de agitación y
mezcla como entenderán los especialistas en la técnica para obtener
partículas de un tamaño deseado. Deseablemente, la agitación usada
para agitar los reactivos y partículas resultantes de los mismos es
suficiente para mezclar completamente los reactivos, aunque menos de
la que genera fuerzas de tensión mecánica resultante en cizalla.
La separación de las partículas reticuladas de la
fase acuosa puede conseguirse mediante diversos procedimientos
conocidos. Generalmente, después de la inversión de las partículas
poliméricas en una fase acuosa, la capa oleosa se separa de la fase
acuosa, por ejemplo por sedimentación, dejando una dispersión de
partículas de polímero reticuladas. Después, las partículas
poliméricas solubles en agua reticuladas se separan de la fase
acuosa por filtración, después de lo cual las partículas se lavan y
se deshidratan con metanol. Las partículas después se secan. Esto
puede realizarse simplemente extendiendo las partículas sobre una
superficie plana; sin embargo, en el caso de una operación a escala
industrial las partículas pueden secarse en un secador de lecho
fluidizado usado convencionalmente para dicho propósito.
El tamaño de las partículas resultantes de la
practica de la invención, bastante ventajosamente, puede variar en
un amplio intervalo de tamaños, tanto microscópicos como
submicroscópicos de acuerdo con el tamaño medio de gota de la
emulsión, que depende de la composición, tipo y concentración de
emulsionante así como del procedimiento y condiciones de
emulsión.
Las partículas pueden ser microcápsulas,
microesferas o perlas. Las microcápsulas se definen como partículas
poliméricas que contienen una o más composiciones encapsuladas.
Deseablemente, las composiciones encapsuladas son fármacos, tales
como, aunque sin limitación, antígenos, anticuerpos, factores de
crecimiento, inhibidores, antibióticos, oligonucleótidos
antisentido, composiciones antivirales, composiciones
anticancerosas, agentes terapéuticos y otras composiciones para
administrar a un paciente o para suministrar a un sitio específico
en un paciente. Las microcápsulas son suficientemente grandes para
observarlas simple vista. Las microesferas por otro lado son
partículas mucho menores que generalmente no contienen materiales
encapsulados además, pueden requerir microscopía óptica para ser
vistas. Las perlas son partículas con forma esférica que son
suficientemente grandes para observarlas a simple vista. El límite
de visibilidad de las perlas está en el intervalo de
60-100 micrómetros.
Deseablemente, las partículas poliméricas de la
invención son menores de 212 micrómetros de diámetro, más
deseablemente menores de 150 micrómetros de diámetro.
Ventajosamente, las partículas formadas son sustancialmente
homogéneas en tamaño y forma. Otra característica deseable de las
partículas poliméricas solubles en agua de la invención es que
cuando se dispersan en agua y se inyectan a través de agujas de
jeringuilla hipodérmica de calibre 20 o calibre 22, se forma una
hebra vermiforme. La inyectabilidad es una característica
importante de las microesferas solubles en agua cuando las
partículas se usan para suministrar fármacos o para terapia.
La invención se entenderá adicionalmente a la luz
de los siguientes ejemplos no limitantes:
Este ejemplo muestra la preparación de una
dispersión acuosa de partículas solubles en agua reticuladas de
alginato sódico en forma de microesferas. La fórmula se muestra en
la Tabla I a continuación:
| Ingrediente | Partes en Peso |
| Agua | 100,00 |
| Polímero soluble en agua de alginato sódico | 7,0 |
| Hidróxido amónico al 30% ajustado a un pH de 10-11 | 18 gotas |
| Tolueno | 100,0 |
| Emulsionante SPAN 60 | 1,00 |
| Agente de reticulación XAMA-7 | 4,00 |
| Agente de deshidratación de isopropanol | 100,00 |
El hidróxido amónico se añadió a una solución
acuosa al 5% de alginato sódico que contenía agentes reticulante
XAMA-7
pentaeritritol-tris-[beta-(N-aziridinil)-propionato]
para ajustar el pH a pH 11. Con este agente de reticulación, este
ajuste de pH es crítico para evitar la reticulación prematura. La
solución acuosa se emulsiona después en una fase continua de
tolueno usando un emulsionante de agua en aceite SPAN 60 para dar
una emulsión de agua en aceite o dispersión de gotas de alginato
sódico acuoso que contenían el agente de reticulación. Una vez
formada la emulsión y conseguida la distribución de tamaño de gota
deseado, se añadió una pequeña cantidad de ácido acético para
disminuir el pH a 7-8. Las gotas de alginato sódico
reticulan rápidamente a este pH tan bajo. La dispersión de polímero
reticulado en solución en aceite se invirtió después en un exceso de
agua después de lo cual la fase oleosa se separó de la dispersión
acuosa para dar una dispersión acuosa de microesferas de alginato
sódico reticulado.
El emulsionante y las condiciones de agitación se
seleccionaron para dar el tamaño de gota deseado (y por lo tanto el
tamaño de partícula polimérica deseado). Esta distribución de tamaño
se controló, no solo por el emulsionante usado sino también por el
tipo e intensidad de agitación usados para preparar la emulsión de
agua en aceite. Los resultados de estos experimentos se muestran en
la Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
| N^{o} de experimento | S-48 | S-49 | S-50 | S-51 | S-52 | S-53 | S-54 |
| pH inicial* | 8 | 10-11 | 10-11 | 10-11 | 10-11 | 10-11 | 10-11 |
| pH final** | 8 | 7-8 | 7-8 | 7-8 | 7-8 | 7-8 | 7-8 |
| Velocidad de agitación (rpm) | 1000 | 900 | 800 | 800 | 1200 | 1000 | 1000 |
| Tamaño de microesfera (%) | |||||||
| >250 \mum | 13,5 | 7,1 | 7,4 | 5,1 | 3,9 | 8,9 | 12,3 |
| 212-250 \mum | 4,1 | 2,3 | 8,8 | 4,2 | 3,8 | 2,1 | 2,8 |
| 150-212 \mum | 11,7 | 11,6 | 23,5 | 14,7 | 11,8 | 26,9 | 8,3 |
| <150 \mum | 70,3 | 79,0 | 60,3 | 70,1 | 80,6 | 82,2 | 76,6 |
| * después de la adición de hidróxido amónico | |||||||
| ** después de la adición de ácido acético |
La Tabla II muestra la distribución de tamaño de
microesferas poliméricas conseguida en diversas condiciones.
Sustancialmente todas las partículas serán esféricas, con esferas
más pequeñas fuera del tamaño o partículas con formas irregulares.
Por lo tanto, los datos de la Tabla II demuestran que las partículas
de alginato sódico reticuladas que tienen una forma esférica y un
diámetro menor de 150 \mum pueden prepararse de manera
reproducible usando el agente de reticulación XAMA-7
ajustando el pH del alginato sódico con hidróxido de amonio a pH 11,
formando la emulsión de agua en aceite y disminuyendo posteriormente
el pH a 7-8 con ácido acético para iniciar la
reticulación rápida de los polímeros en las gotas para formar
partículas poliméricas.
Se usaron cinco tipos de matraces de reacción y
agitadores en la práctica de la invención. El primero, denominado
A, comprende un matraz de fondo redondo de un litro equipado con un
agitador de media luna de politetrafluoroetileno TEFLON. El
segundo, denominado B está compuesto por una caldera de dos litros
equipada con un agitador de turbina de acero inoxidable y seis
tabiques deflectores formando un ángulo ligeramente en la dirección
contraria a la de la rotación del líquido. El tercero, denominado C,
fue similar al B, aunque de capacidad de medio litro y sin los
tabiques deflectores. El cuarto, denominado D fue similar al C,
aunque equipado con un Ensayador de Agitación
Glas-Col GKH para controlar la velocidad de emulsión
en lugar de variar las cargas impuestas por la emulsión. El quinto,
denominado E, fue similar al D, aunque equipado con un Ensayador de
Agitación Glas-Col GKH y un eje de turbina de acero
inoxidable. Este matraz de reacción C se usó en los experimentos
S-48 a S-54 mostrados en la Tabla
II.
En otro experimento, se dispersaron 50 g de agua
que contenían 2,25 g de alginato sódico disuelto y 0,25 g de
metilcelulosa Methocel K4M (5% p/p alginato sódico/methocel K4M) en
75,0 g de isooctano que contenía 1,5 g de SPAN 85 (trioleato de
sorbitano, HLB 1,8, ICI Americas) en la caldera C de medio litro y
se agitó (aproximadamente 1000 rpm) durante aproximadamente 10
minutos. Después, se añadieron 5,0 g de agua que contenían 1,0 g de
TWEEN 85 (trioleato de sorbitano etoxilado, HLB 11,0, ICI Americas),
y la dispersión se agitó durante 5 minutos más. Para reticular las
gotas formadas por la dispersión, se añadió una cantidad
equivalente del agente de reticulación XAMA-7 o su
solución acuosa, y se dejó reaccionar con las gotas de polímero
dispersas durante 180 minutos. Después, se añadieron 25 ml de
isopropanol para deshidratar y endurecer las microesferas
reticuladas. La agitación se continuó durante 10 minutos, después de
lo cual la mezcla se separó en una capa de sobrenadante transparente
y una capa opaca, blanca de microesferas que sedimentó. La
filtración de las microesferas resultó difícil; por lo tanto, la
capa sobrenadante se decantó y las microesferas sedimentadas se
lavaron 2 veces con agitación durante una noche en un vaso de
precipitados con 200 ml de isopropanol. Las microesferas se
filtraron después sobre papel de filtro sin dificultad y se secaron
a temperatura ambiente.
Este ejemplo demuestra el efecto del control del
pH sobre la reticulación de las gotas poliméricas solubles en agua
en la formación de microesferas adecuadas para el suministro de
fármacos. 100 g de una solución acuosa que contenía 7,00 g de
alginato sódico y 4,0 g de agente de reticulación
XAMA-7 se mezclaron con 18 gotas de amonio acuoso
al 30% para ajustar el pH a 11. Esta solución se dispersó después
en 100 g de tolueno que contenían 1,00 g de SPAN 60 en el matraz
agitado C de 0,5 litros usando el agitador de turbina de acero
inoxidable durante 30 minutos a aproximadamente 1000 rpm. La
formación de tamaño de gota microscópica del polímero soluble en
agua en la emulsión de agua en aceite se controló por microscopía
óptica mientras que la emulsión se agitaba. Cuando la emulsión se
juzgó satisfactoria, se añadió suficiente ácido acético para hacer
disminuir el pH de la fase acuosa a 7-8. Esta
mezcla se agitó después durante aproximadamente 4-5
horas a temperatura ambiente para permitir que
XAMA-7 reticulara las gotas de alginato sódico para
formar microesferas. Después, la capa líquida acuosa se separó por
decantación. Las microesferas se lavaron después dos veces con
aproximadamente 200 ml de metanol por
sedimentación-decantación, después se filtraron y se
secaron a 75ºC.
Todas las microesferas obtenidas, cuando se
dispersaron en agua y se inyectaron a través de una jeringuilla
hipodérmica, formaron hebras vermiformes lo que indicaba que las
microesferas eran adecuadas para el suministro de fármacos.
Se prepararon otras dispersiones de alginato
sódico usando la fórmula mostrada en la Tabla III a continuación
para determinar la distribución de tamaño de partícula:
| Ingrediente | Partes en Peso |
| Agua | 150,00 |
| Polímero de alginato sódico soluble en agua | 10,50 |
| pH (controlado mediante la adición de hidróxido amónico al 30%) | 10-11 |
| Tolueno | 150,00 |
| Emulsionante SPAN 60 | 1,50 |
| Agente de reticulación XAMA-7 | 6,00 |
| pH (controlado mediante la adición de ácido acético al 10%) | 7-8 |
| Agente de deshidratación de isopropanol | 150,00 |
161 g de una solución acuosa que contenía 10,50 g
de alginato sódico se mezclaron con suficiente amoniaco acuoso al
30% para ajustar el pH a 10-11. Esta solución se
dispersó en 150 g de tolueno que contenía 1,50 g de SPAN 60 en el
matraz con agitador D con capacidad de 0,5 litros usando el agitador
de turbina de acero inoxidable, como se ha descrito anteriormente,
durante 30 minutos a 1000 rpm. El tamaño de gota se controló por
microscopía óptica mientras que se agitaba la emulsión. Cuando se
consideró satisfactorio, se añadió suficiente ácido acético al 10%
para disminuir el pH de la fase acuosa a 7-8. Esta
mezcla se agitó después durante 6 horas a temperatura ambiente para
permitir que XAMA-7 reticulara las gotas de
alginato sódico. Después de la reticulación, se añadieron 150 g de
isopropanol para deshidratar las perlas. La agitación se continúo
durante 30 minutos más. Posteriormente, la capa líquida se separó
por decantación. Las microesferas se lavaron 2 veces con
aproximadamente 200 ml de metanol por
sedimentación-decantación, después se filtraron y se
secaron a 75ºC.
Las distribuciones de tamaño para las
microesferas obtenidas en cada caso se dan en la Tabla IV.
\vskip1.000000\baselineskip
| N^{o} de Experimento | S-56 | S-57 | S-58 |
| Matraz de reacción | E | E | E |
| Tiempo de reacción (h) | 6 | 6 | 6 |
| Velocidad de agitación (rpm) | 1000-800 | 800 | 1000 |
| Tamaño de la microesfera (%) | |||
| \hskip0.5cm a. >250 \mum | 10,6 | 6,4 | 6,4 |
| \hskip0.5cm b. 212-250 \mum | 3,1 | 4,5 | 1,8 |
| \hskip0.5cm c. 150-212 \mum | 7,0 | 15,4 | 9,3 |
| \hskip0.5cm d. <150 \mum | 79,0 | 73,6 | 82,6 |
| Morfología esférica de las microesferas | |||
| \hskip0.5cm Antes de pH 7-8* | Buena | Buena | Buena |
| \hskip0.5cm Después de pH 7-8** | Buena | Buena | Buena |
| \hskip0.5cm Partículas pequeñas*** | ++ | + | ++ |
| \hskip0.5cm Partículas irregulares**** | ++ | ++ | + |
| * después de la adición de hidróxido amónico | |||
| ** después de la adición de ácido acético | |||
| *** +- pocas partículas; ++ - más partículas |
Todas las microesferas obtenidas en estos
experimentos, cuando se dispersaron en agua y se inyectaron a través
de una jeringuilla hipodérmica, formaron las hebras vermiformes
deseables.
Este ejemplo es para mostrar el efecto del agente
de reticulación a diversas concentraciones en la solución
polimérica acuosa sobre la formación de microesferas.
Se encontraron tres problemas en los primeros
experimentos con el sistema de reticulación XAMA-7:
(1) la distribución de microesferas fue más ancha que lo deseado;
(2) la proporción de alginato sódico en el polímero reticulado era
demasiado baja y la del agente de reticulación
XAMA-7 era demasiado alta; (3) las microesferas
tendrían a agregarse.
Para investigar la reacción de alginato
sódico/agente de reticulación XAMA-7, la reacción
se realizó en solución acuosa sin el sistema de emulsión. Estas
reacciones se realizaron en pequeños viales de vidrio; el alginato
sódico y el agente de reticulación XAMA-7 se
mezclaron juntos en el vial. El tiempo de gelificación se considero
como el tiempo después de la mezcla en el que el gel no fluía más
cuando el vial de muestra se ponía boca abajo.
En general, la solución de alginato
sódico/XAMA-7 se hizo progresivamente más viscosa
hasta que finalmente formó un gel casi sólido que no fluiría cuando
el vial de muestra se ponía boca abajo. De acuerdo con el
fabricante, el agente de reticulación XAMA-7
reacciona rápidamente con grupos carboxilo o hidroxilo a pH 7 aunque
mucho más lentamente a pH 11 por lo tanto, el tiempo necesario para
la gelificación en una solución acuosa de alginato sódico se midió
a pH 7. Se usó el mismo pH en los experimentos en los que se usó
agua o isopropanol en ausencia de alginato sódico.
Los resultados de estos experimentos se muestran
a continuación en la Tabla V.
\vskip1.000000\baselineskip
| Alginato sódico al 2,0% en agua | |||||
| Nº de Exper. | Agua | Sodio | Alginato | XAMA-7* | Tiempo de Gelificación |
| (g) | (g) | (%) | (g) | (h) | |
| 1 | 2,0 | 0,04 | 2,0 | 0,20 | 1,0 |
| 2 | 2,0 | 0,04 | 2,0 | 0,10 | 1,5 |
| 3 | 2,0 | 0,04 | 2,0 | 0,05 | >24 |
| Alginato sódico sin agua | |||||
| Nº de Exper. | Agua | Sodio | Alginato | XAMA-7* | Tiempo de Gelificación |
| (g) | (g) | (%) | (g) | (h) | |
| 4 | 2,0 | - - - - | - - - - | 0,20 | 2,7 |
| 5 | 2,0 | - - - - | - - - - | 0,10 | 48 |
| 6 | 2,0 | - - - - | - - - - | 0,05 | >48 |
| Agua con metanol, sin alginato sódico | |||||
| Nº de Exper. | Agua | Metanol | XAMA-7* | Tiempo d Gelificación | |
| (g) | (g) | (%) | (g) | (h) | |
| 7 | 2,0 | 0,20 | 10,0 | 0,20 | 12 |
| 8 | 2,0 | 0,20 | 10,0 | 0,10 | >12 |
| 9 | 2,0 | 0,20 | 10,0 | 0,05 | >24 |
| Agua con isopropanol, sin alginato sódico | |||||
| Nº de Exper. | Agua | Isopropanol | XAMA-7* | Tiempo de Gelificación | |
| (g) | (%) | (g) | (h) | ||
| 10 | 2,0 | 0,20 | 10,0 | 0,20 | 15 |
| 11 | 2,0 | 0,20 | 10,0 | 0,10 | >15 |
| 12 | 2,0 | 0,20 | 10,0 | 0,05 | No reacciona |
| * en forma de solución al 5% |
\newpage
Los resultados mostrados en la Tabla V confirman
que XAMA-7 es un agente de reticulación activo.
Reaccionó con los grupos carboxilo e hidroxilo del alginato sódico y
en ausencia de alginato sódico, reaccionó con agua o consigo mismo
para dar tiempos de gelificación casi tan cortos. Reaccionó también
con el isopropanol usado para detener la reacción o el metanol usado
para lavar las microesferas.
El orden de reactividad con el agente de
reticulación se observa a partir de la Tabla que es alginato sódico
(grupos carboxilo), seguido de agua, metanol e isopropanol. La
reacción secundaria del agente de reticulación con agua formó
grupos hidroxilo que podrían estabilizar las microesferas. También,
el agente de reticulación XAMA-7 reaccionó con el
isopropanol usado para detener la reacción y el metanol usado para
lavar las microesferas, y permitió por lo tanto que las
microesferas se separaran del medio.
La proporción original del peso de alginato
sódico/agente de reticulación XAMA-7 en la solución
acuosa era de 0,4. Esta proporción, se descubrió que era demasiado
baja; de hecho, las microesferas resultantes de dicha proporción
estaban compuestas por poli(XAMA-7)
reticulado con el polímero de alginato sódico, en lugar de lo
contrario. Por lo tanto, se considera importante reducir la
concentración del agente de reticulación XAMA-7 en
la solución acuosa respecto a la de alginato sódico.
A cada uno de los cuatro viales se añadieron 2,0
g de agua, 1,0 g de solución de alginato sódico al
2,0-5,0% y 0,05 g de agente de reticulación
XAMA-7 como solución al 5% a pH 7. La proporción de
alginato sódico/agente de reticulación XAMA-7 se
aumentó de 0,4 a 1,0.
Estas reacciones investigaron en soluciones
acuosas sin el sistema de emulsión. Los resultados de estos
experimentos se dan en la siguiente Tabla VI:
\vskip1.000000\baselineskip
| Nº de Experimento | Solución de Alginato Sódico | XAMA-7* | NaAlg/XAMA-7 | Tiempo de Gelificación | |
| (g) | (%) | (g) | Proporción | (h) | |
| 2-7-1 | 1,0 | 2,0 | 0,05 | 0,4 | 5,0 |
| 3-7-1 | 1,0 | 3,0 | 0,05 | 0,6 | 5,0 |
| 4-7-1 | 1,0 | 4,0 | 0,05 | 0,8 | 2,5 |
| 5-7-1 | 1,0 | 5,0 | 0,05 | 1,0 | 1,0 |
| * en forma de solución al 5% |
Las propiedades de las microesferas reticuladas
variaron con la proporción de alginato sódico/agente de reticulación
XAMA-7. Esto se demostró mediante el comportamiento
de las microesferas cuando se dispersaron en agua y se forzaron a
pasar a través de la aguja de una jeringuilla hipodérmica.
El aumento de la concentración de alginato sódico
al 5%, como se observa en la Tabla VI disminuyó el tiempo de
gelificación de 5 horas a 1 hora. La mayor viscosidad de la solución
de alginato sódico al 5% hizo difícil sin embargo mezclarlo con la
solución de agente de reticulación. Independientemente de ello, la
viscosidad aún era suficientemente baja para realizar los
experimentos en el laboratorio.
Este ejemplo muestra el efecto correspondiente de
aumento de la concentración de alginato sódico a una concentración
constante de agente de reticulación XAMA-7 a pH 8.
Estas reacciones, igual que las del ejemplo 6, se investigaron en
soluciones acuosas sin el sistema de emulsión. Los datos se muestran
en la Tabla VII.
| Nº de Experimento | Solución de Alginato Sódico | XAMA-7* | Na Alg/XAMA-7 | Tiempo de Gelificación | |
| (g) | (%) | (g) | Proporción | (h) | |
| 2-8-1 | 1,0 | 2,0 | 0,05 | 0,4 | 3,0 |
| 3-8-1 | 1,0 | 3,0 | 0,05 | 0,6 | 3,0 |
| 4-8-1 | 1,0 | 4,0 | 0,05 | 0,8 | 1,5 |
| 5-8-1 | 1,0 | 5,0 | 0,05 | 1,0 | 1,5 |
| * en forma de solución al 5% |
Los resultados, como se observa a partir de la
Tabla VII, son similares a los de pH 7 (ejemplo 6), excepto que la
velocidad de gelificación fue ligeramente más lenta. El aumento de
la concentración de alginato sódico del 2,0% al 5,0% hizo disminuir
el tiempo de gelificación de 3 horas a 1,2 horas.
Este ejemplo es para demostrar el efecto de la
concentración del agente de reticulación y el pH a mayores
concentraciones de alginato sódico. Estas reacciones, como en el
ejemplo 6, se investigaron sin el sistema de emulsión. Los
resultados se dan en la Tabla VIII.
Efecto de la Concentración y el
pH de XAMA-7 a Mayor Concentración de Alginato
Sódico
Alginato Sódico al 6% en 2,0 g de
Agua
| Nº de Experimento | Solución de Alginato | XAMA-7 | NaAlg/XAMA-7 | Tiempo de Gelificación | |
| sódico | |||||
| pH | (g) | (g) | Proporción | (min) | |
| 6-6-1 | 6,0 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | 41* |
| 6-6-2 | 6,0 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | 41* |
| 6-6-3 | 6,0 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | 82* |
| 6-6-4 | 6,0 | 2,0 | 0,04 | 3,0 | >240** |
Alginato Sódico al 7% en 2,0 g
de
Agua
| Nº de Experimento | Solución de Alginato | XAMA-7 | NaAlg/XAMA-7 | Tiempo de Gelificación | |
| sódico | |||||
| pH | (g) | (g) | (min) | ||
| 7-7-1 | 7,0 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | 11*** |
| 7-7-2 | 7,0 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | 11*** |
| 7-7-3 | 7,0 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | 30**** |
| 7-7-4 | 7,0 | 2,0 | 0,04 | 3,0 | >30**** |
| 7-8-1 | 8,0 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | 30 |
| 7-8-2 | 8,0 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | 50 |
| 7-8-3 | 8,0 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | 180 |
| 7-8-4 | 8,0 | 2,0 | 0,04 | 3,0 | >480 |
| 7-9-1 | 9,0 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | 30 |
| 7-9-2 | 9,0 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | 50 |
| 7-9-3 | 9,0 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | 180 |
| 7-9-4 | 9,0 | 2,0 | 0,04 | 3,0 | >480 |
| 7-10-1 | 10,0 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | 45 |
| Nº de Experimento | Solución de Alginato | XAMA-7 | NaAlg/XAMA-7 | Tiempo de Gelificación | |
| sódico | |||||
| pH | (g) | (g) | (min) | ||
| 7-10-2 | 10,0 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | 180 |
| 7-10-3 | 10,0 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | - - - |
| 7-10-4 | 10,0 | 2,0 | 0,04 | 3,0 | >480 |
| 7-11-1 | 11,0 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | >48 |
| 7-11-2 | 11,0 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | >48 |
| 7-11-3 | 11,0 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | >48 |
| 7-11-4 | 11,0 | 2,0 | 0,04 | 3,0 | - - - |
| * se hizo turbio en 5 minutos, blanco opaco en 30 minutos. | |||||
| ** se hizo turbio en 30 minutos, blanco opaco en 60 minutos. | |||||
| *** se hizo turbio en 3 minutos, blanco opaco en 6 minutos. | |||||
| **** se hizo turbio y blanco opaco en 12 minutos. | |||||
| XAMA-7 se añadió en forma de solución al 5% |
La Tabla VIII muestra el efecto de las
concentraciones y pH del agente de reticulación
XAMA-7 a concentraciones de alginato sódico del 6,0
y del 7,0%. El pH se varió de 6,0 a 11,0. Generalmente, los tiempos
de gelificación aumentaron con el aumento de pH, por ejemplo de 11
minutos a pH 7 a más de 48 horas a pH 11. Los tiempos de
gelificación a pH 6 fueron mayores que los de a pH 7. En general,
como se observa a partir de la Tabla VIII, el tiempo de
gelificación aumentó con la disminución la concentración de
XAMA-7 a un pH dado, por ejemplo de 11 minutos a
0,10 gramos de agente de reticulación XAMA-7 a más
de 30 minutos para 0,04 gramos de agente de reticulación
XAMA-7.
En la Tabla IX se muestra el efecto de la
concentración del agente de reticulación XAMA-7 a
valores de pH que varían de 6,4 a 11,0 para una concentración de
alginato sódico al 6,0%.
Concentración de la
Concentración y el pH de XAMA-7 a una Concentración
de Alginato Sódico del 6%
Alginato Sódico al 6% en 2,0 g de
Agua
| Nº de Experimento | Solución de Alginato | XAMA-7 | NaAlg/XAMA-7 | Tiempo de Gelificación | |
| sódico | |||||
| pH | (g) | (g) | Proporción | (min) | |
| 6-6-1 | 6,0 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | 41* |
| 6-6-2 | 6,0 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | 41* |
| 6-6-3 | 6,0 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | 82* |
| 6-6-4 | 6,0 | 2,0 | 0,04 | 3,0 | >240** |
| 6-6-1 | 6,4 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | 96* |
| 6-8-1 | 8,0 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | 96** |
| 6-9-1 | 9,0 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | 125** |
| 6-10-1 | 10,0 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | - - - |
| 6-11-1 | 11,0 | 2,0 | 0,10 | 1,2 | *** |
| * se hizo turbio en 6 minutos, blanco opaco en 25 minutos. | |||||
| ** se hizo turbio en 9 minutos, blanco opaco en 25 minutos. | |||||
| *** reacción muy lenta |
| Nº de Experimento | Solución de Alginato | XAMA-7 | NaAlg/XAMA-7 | Tiempo de Gelificación | |
| sódico | |||||
| pH | (g) | (g) | Proporción | (min) | |
| 6-6-2 | 6,4 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | 200* |
| 6-8-2 | 8,0 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | 200* |
| 6-9-2 | 9,0 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | 200** |
| 6-10-2 | 10,0 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | >200*** |
| 6-11-2 | 11,0 | 2,0 | 0,08 | 1,5 | **** |
| * se hizo blanco opaco en 42 minutos, formó un gel inmóvil | |||||
| ** se hizo blanco opaco en 42 minutos, el gel fluyó lentamente | |||||
| *** se hizo blanco opaco en 42 minutos, el gel fluyó lentamente | |||||
| **** líquido transparente después de 200 minutos. |
| Nº de Experimento | Solución de Alginato | XAMA-7 | NaAlg/XAMA-7 | Tiempo de Gelificación | |
| sódico | |||||
| pH | (g) | (g) | Proporción | (min) | |
| 6-6-3 | 6,4 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | 260* |
| 6-8-3 | 8,0 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | 260* |
| 6-9-3 | 9,0 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | 260** |
| 6-10-3 | 10,0 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | >260*** |
| 6-11-3 | 11,0 | 2,0 | 0,06 | 2,0 | **** |
| * se hizo blanco opaco en 45 minutos | |||||
| ** se hizo blanco opaco en 45 minutos, el gel fluyó lentamente | |||||
| *** el gel fluyó fácilmente | |||||
| **** líquido transparente después de 260 minutos. | |||||
| 6-6-4 | 6,4 | 2,0 | 0,04 | 3,0 | 300* |
| 6-8-4 | 8,0 | 2,0 | 0,04 | 3,0 | 300* |
| 6-9-4 | 9,0 | 3,0 | 0,04 | 3,0 | 300* |
| 6-10-4 | 10,0 | 2,0 | 0,04 | 3,0 | >300* |
| 6-11-4 | 11,0 | 2,0 | 0,04 | 3,0 | ** |
| * fluyó cuando se invirtió | |||||
| ** permaneció como líquido transparente | |||||
| XAMA-7 se añadió en forma de solución al 5% |
Las reacciones investigadas en el Ejemplo 9 se
realizaron en soluciones acuosas sin el sistema de emulsión y se
realizaron como se describe en el Ejemplo 6.
A pH constante, el tiempo de gelificación
generalmente aumentó con la disminución de la concentración de
XAMA-7, por ejemplo de aproximadamente 100 minutos
a 0,10 g de XAMA-7 a aproximadamente 200 minutos a
0,08 g y de aproximadamente 260 minutos a 0,06 g a aproximadamente
300 minutos a 0,04 g.
A una concentración dada del agente de
reticulación XAMA-7 el tiempo de gelificación
generalmente aumentó con el aumento de pH, aunque el aumento no fue
grande. Independientemente de esto, ninguna de las muestras gelificó
en un tiempo razonable a pH 11. Todas las muestras dieron el tiempo
de gelificación más corto a un pH de 6,4 a 8,0.
Estos resultados demuestran que la reacción entre
el alginato sódico y el agente de reticulación
XAMA-7 puede controlarse por la concentración de los
reactivos así como por el pH.
Se realizaron otros experimentos de reticulación
en solución usando diferentes agentes de reticulación y diferentes
polímeros solubles en agua. Los resultados se muestran en la
siguiente Tabla X.
| Polímero | Glutaraldehído | XAMA-7 | Divinil sulfona | Borato |
| pH 2 | pH 2 | pH 10 | pH 8-9 | |
| PVA | 0,10/0,10 | 0,10/0,10 | no soluble | 0,10/0,10 |
| precipitado | transparente | transparente | flotadores | |
| CS | 0,20/0,20 | 0,20/0,10 | 0,20/0,20 | 0,10/0,10 |
| transparente | precipitó un gel | transparente | transparente | |
| ligero | ||||
| 0,40/1,0 | 0,40/1,0 | |||
| precipitado | precipitado | |||
| 0,20/0,10 | ||||
| pH 7 | ||||
| opaco | ||||
| SA | 0,20/0,20 pH 4 | 0,10/0,10 | 0,20/0,20 | 0,10/0,10 |
| opaco | pH 7 | transparente | transparente | |
| precipitado | ||||
| 0,20/0,50 | 0,40/0,10 | |||
| pH 7 | muy gelificado | |||
| muy gelificado | ||||
| PVA = poli(alcohol vinílico) | ||||
| CS = sulfato de condroitina | ||||
| SA = alginato sódico | ||||
| Borato = ácido bórico H_{3}BO_{3} |
En la Tabla X anterior, el primer número hace
referencia al peso del polímero y el segundo número al peso de
agente de reticulación en gramos, por ejemplo "0,10/0,10" en la
columna superior izquierda debajo de donde pones Glutaraldehído se
refiere a una muestra que comprende 0,10 g de poli(alcohol
vinílico) es decir PVA, y 0,10 g de glutaraldehído.
15 ml de la solución polimérica que contenía la
cantidad indicada se mezclaron con la cantidad indicada de agente
de reticulación a temperatura ambiente. El pH se ajustó al valor
indicado en la Tabla con ácido sulfúrico o hidróxido sódico. La
formación de una estructura gelificada visible se consideró como
evidencia de que había ocurrido la reticulación.
Los datos muestran que el glutaraldehído (pH 2)
reticuló el poli(alcohol vinílico) y el alginato sódico
(SA). El SA sin embargo reticuló en un mayor grado que el PVA. El
glutaraldehído falló a la hora de reticular el sulfato de
condroitina (CS). Con XAMA-7, el CS dio un gel a la
proporción 0,20/0,20, un gel más rígido a la proporción 0,40/0,10 y
un gel opaco a la proporción 0,20/0,10 a pH 7. En el caso del
alginato sódico, se dieron geles más fuertes a pH 7 a ambas
proporciones 0,10/0,10 y 0,20/0,50.
La divinil sulfona era insoluble en el
poli(alcohol vinílico acuoso) en pH 10 y no de un gel. Con
el sulfato de condroitina no se dio gel a la proporción 0,20/0,20,
pero se dio un gel a la proporción 0,40/0,10. El alginato sódico no
dio gel a la proporción 0,20/0,20; sin embargo se formo un gel a la
proporción 0,40/0,10.
El agente de reticulación borato a pH
8-9 dio estructuras que flotaron en la parte
superior de la muestra en el caso de poli(alcohol vinílico).
No reticuló el sulfato de condroitina o el alginato sódico.
Otros agentes de reticulación ensayados incluyen
las carbodiimidas y los agentes de reticulación epóxido. Estas
investigaciones como en el ejemplo anterior se realizaron sin el
sistema de emulsión. Los resultados de los experimentos se muestran
en la siguiente Tabla XI:
| Cabodiimida, pH 4 | Epóxido, pH 10 | |||
| Polímero | CHME-CDI | DMAPE-CDI | ECH | BDEP |
| PVA | 0,10/0,10 | 0,10/0,10 | 0,10/0,10 | 0,10/0,10 |
| transparente | transparente | transparente | transparente | |
| CS | 0,18/0,18 | 0,20/0,20 | 0,20/0,20 | |
| transparente | transparente | transparente | ||
| 0,36/0,18 | 0,40/1,0 | 0,20/0,20 | ||
| transparente | precipitado | |||
| 0,18/0,18/0,05 | ||||
| precipitado | ||||
| 0,18/0,09/0,05 | 0,18/0,09/0,06 | |||
| precipitado | precipitado | |||
| SA | 0,18/0,18 | 0,18/0,09 | 0,20/0,20 | 0,20/0,20 |
| transparente | transparente | transparente | transparente | |
| 0,18/0,09 | 0,18/0,18 | 0,40/0,05 | ||
| transparente | transparente | transparente | ||
| 0,18/0,09/0,06 | 0,18/0,09/0,06 | |||
| opaco, | opaco, | |||
| gelificado | gelificado | |||
| CHME-CDI = 1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)carbodiimida | ||||
| DMAPE-CDI = 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida | ||||
| ECH = epiclorhidrina | ||||
| BDEP = 1,3-butadieno epóxido |
15 ml de la solución polimérica que contenía las
cantidades indicadas de polímeros se mezclaron con los agentes de
reticulación a temperatura ambiente. El primer número designa el
peso en gramos del polímero; el segundo número designa los gramos
de agente de reticulación. Cuando aparece un tercer numero, es el
peso en gramos de dicloruro de
1,5-diaminopentano.
El pH se ajustó con ácido sulfúrico o hidróxido
sódico a 4 para las carbodiimidas y a 10 para los agentes de
reticulación epóxido. La formación de una estructura gelificada
visible se tomó como evidencia de que había ocurrido la
reticulación.
Como puede observarse a partir de la Tabla 11, el
poli(alcohol vinílico) dio soluciones transparentes con
pesos iguales (0,10 g) de la
1-ciclohexil-3-(2-morfolinoaril)
carbodiimida (CHME-CDI),
1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida
(DMAPE-CDI), epiclorhidrina (ECH), y
1,3-butadieno diepóxido (BDEP), que indica que los
grupos hidroxilo del poli(alcohol vinílico) no son
suficientemente activos para reaccionar con cualquiera de estos
agentes de reticulación.
El sulfato de condroitina dio soluciones
transparentes con pesos iguales (0,18 g) del polímero y
1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)
carbodiimida, y cuando el peso del polímero se dobló a 0,36 g, lo
que indicaba que no había ocurrido reticulación significativa.
Cuando se añadieron 0,05 g de diclorhidrato de
1,5-diaminopentano junto con 0,18/0,18 o 0,18/0,09 g
de polímero/carbodiimida, la muestra precipito indicando que había
ocurrido reticulación. Se observo una reticulación similar con la
1-(3-dimetilamino-propil)-3-etilcarbodiimida.
El 1,3-butadieno diepóxido no dio reticulación a
las proporciones usadas. La epiclorhidrina dio reticulación a la
proporción de 0,40/1,0 pero no a la proporción 0,20/0,20.
El alginato sódico no reticuló con pesos iguales
(0,10 g) del polímero y
1-(3-dimetilaminopropinil)-3-etil-carbodiimida,
ni cuando el peso de reticulante se redujo a la mitad (0,09 g); sin
embargo, después de la adición de 0,06 g de diclorhidrato de
1,5-diaminopentano, la muestra se reticuló a un gel
opaco. Los resultados fueron similares con
1-ciclohexil-3-(2-morfolinoetil)
carbodiimida. Pesos iguales (0,20 g de epiclorhidrina y
1,3-butadieno diepóxido dieron soluciones
transparentes, incluso cuando la cantidad de alginato sódico se
aumentó a 0,40 g y la de epiclorhidrina se redujo a 0,05 g, lo que
indicaba que no había ocurrido reticulación.
Las microesferas de gel de alginato sódico se
prepararon usando un proceso de emulsión inversa. La Tabla XII a
continuación da diversas fórmulas usadas en el proceso de emulsión
inversa.
Típicamente, 0,60 g de alginato sódico disueltos
en 30,0 g de agua se emulsionaron en 30,0 g de tolueno que
contenían 0,30 g de SPAN 60, un emulsionante de agua en aceite
(1,0% en peso).
Las muestras se pusieron en botellas de vidrio de
113,4 gramos (4 onzas) y se agitaron a mano para formar las
emulsiones inversas de solución acuosa de alginato sódico en
tolueno. El agente de reticulación XAMA-7 se añadió
a continuación a cada botella. Las botellas se taparon después y se
voltearon de un extremo a otro durante 24 horas a 25ºC. Durante
este tiempo, el agente de reticulación XAMA-7
reaccionó con el alginato sódico y se formaron microesferas. Una
vez completada la reacción, se añadió exceso de metanol para
deshidratar las microesferas de alginato sódico que se filtraron
después de la fase acuosa y se lavaron 3 veces con metanol. Las
microesferas recuperadas y lavadas se secaron después en un horno
durante 24 horas a 75ºC.
| N^{o} de Experimento | S-01 | 02 | 03 | 04 | 04B | 06 | 07 | 08 |
| Alginato sódico (g) | 0,60 | 0,60 | 0,60 | 0,60 | 0,60 | 0,00 | 0,90 | 1,2 |
| Agua (g) | 30,0 | 30,0 | 30,0 | 30,0 | 30,0 | 30,0 | 30,0 | 30,0 |
| Tolueno (g) | 30,0 | 30,0 | 30,0 | 30,0 | 30,0 | 30,0 | 30,0 | 30,0 |
| Span 60 (g) | 0,30 | 0,30 | 0,30 | 0,30 | 0,30 | 0,30 | 0,30 | 0,30 |
| XAMA-7 (g) | 1,42 | 1,78 | 2,37 | 3,56 | 3,56 | 3,56 | 2,37 | 3,56 |
| \hskip0.9cm (ml) | 3,00 | 1,20 | 1,50 | 2,00 | 3,00 | 3,00 | 2,00 | 3,00 |
Los experimentos S-04 y
S-04B, que usaron las mayores concentraciones de
agente de reticulación dieron microesferas esféricas con una amplia
distribución de tamaños. Las microesferas fueron estables y
resistieron el secado a 75ºC durante una noche sin distorsionarse.
La reacción de reticulación se juzgó que estaba esencialmente
completa a partir del balance gravimétrico de materia, por ejemplo
en el caso de experimento S-04B, el peso original de
alginato sódico más el de agente reticulación XAMA-7
fue de 4,16 g, comparado con 4,02 g para el peso recuperado de las
microesferas. Las muestras de las microesferas se pusieron en
portaobjetos de microscopio, se lavaron con metanol para retirar el
SPAN 60, y se examinaron por microscopía óptica. Todas las
microesferas eran esferas bien definidas, incluso después de la
absorción de agua. Las microesferas del experimento S.04 se
hincharon y absorbieron un 63,6% de agua.
La concentración del agente de reticulación
XAMA-7 aumentó a una concentración constante de
alginato sódico en los experimentos S-01,
S-02, S-03, y S-04.
Generalmente, la microscopía óptica mostró que se obtuvieron
microesferas tanto grandes como pequeñas. Las microesferas más
grandes parecían tener aún apariencia arrugada y solo aquellas del
experimento S-0,4 parecían ser esféricas. Estos
resultados se interpretaron como el resultado de la reacción del
agente de reticulación XAMA-7 con el alginato sódico
para dar microesferas gelificadas.
La concentración de alginato sódico se aumentó a
una concentración de agente de reticulación XAMA-7
constante (alta) en el experimento S-07 y el
experimento S-08. Estos experimentos produjeron
perlas que tenían una forma más esferoidal que esférica. La razón
para la producción de perlas esferoidales no se sabe realmente; sin
embargo, las posibles reacciones incluyen la reticulación no
uniforme de las gotas de emulsión inversas originales o la
coagulación parcial de las perlas reticuladas.
En contraste, en el Experimento
S-06, el agente de reticulación
XAMA-7 pero no el alginato sódico, no dio perlas.
Dio en lugar de ello una emulsión que desapareció en 30 minutos
después de reposar. Aparentemente, el alginato sódico aunque estaba
presente sólo en una pequeña concentración, es necesario para la
formación de una red reticulada en estas condiciones. La
condensación del agente de reticulación XAMA-7 por
sí mismo no da aparentemente una estructura reticulada similar.
La Tabla XIII da las fórmulas y resultados para
emulsiones inversas de alginato sódico de mezclas de metilcelulosa
METHOCEL K4M usando el agente de reticulación
XAMA-7.
Típicamente, 50,0 g de agua que contenía 2,25 g
de alginato sódico disuelto y 0,25 g de metilcelulosa (5% p/p de
alginato sódico/metilcelulosa) se dispersaron en 75,0 g de
isooctano que contenía 1,5 g de SPAN 85 en la caldera C de medio
litro, descrita anteriormente, y se agitaron durante 10 minutos.
Después 5,0 g de agua que contenía 1,0 g de TWEEN 85, emulsionante
soluble en agua de propósito general (un derivado de
polioxiletileno de éster parcial de ácido graso de anhídrido de
sorbitol) se añadió la dispersión ya la dispersión se agitó durante
5 minutos. Una cantidad equivalente del agente de reticulación
XAMA-7 o sus soluciones acuosas se añadieron a la
dispersión. El agente de reticulación se dejo reaccionado después
con las gotas de polímero dispersas durante 180 minutos mientras que
se agitaba, para reticular las gotas. Después, se añadieron 25 ml de
isopropanol para deshidratar y endurecer las microesferas formadas.
La agitación se continuó durante 10 minutos más, después de lo cual
la mezcla se separó en una capa de sobrenadante transparente y capa
blanca, opaca de microesferas que sedimentó. La filtración de las
microesferas resultó difícil; por lo tanto, la capa sobrenadante se
decantó y las microesferas sedimentadas se lavaron 2 veces con
agitación durante una noche en un vaso de precipitados con 200 ml
de isopropanol. Después, las microesferas se filtraron fácilmente
sobre papel de filtro y se secaron durante una noche a temperatura
ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
| N^{o} de Experimento | WA-02 | WA-03 | WA-04 | WA-05 | WA-06 | WA-07 |
| Fase acuosa (g) | ||||||
| Alginato sódico | 2,25 | 2,25 | 2,25 | 2,25 | 2,25 | 2,5 |
| Methocel K4M | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 | 0,25 |
| Agua | 50,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 | 50,0 |
| Fase oleosa (g) | ||||||
| Isooctano | 75,0 | 75,0 | 75,0 | 75,0 | 75,0 | 75,0 |
| Span 85 | 1,50 | 1,50 | 1,50 | 1,50 | 1,50 | 1,50 |
| Emulsionante (g) | ||||||
| Tween 85 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| Agua | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 | 5,0 |
| Agente de reticulación (ml) | ||||||
| XAMA-7 | 11,3 | 10,0 | 9,0 | 9,0 | 6,5 | 11,3 |
| Agua | 50,0 | 50,0 | - - - | - - - | - - - | - - - - |
| Matraz de reacción | C | C | C | C | C | C |
| N^{o} de Experimento | WA-02 | WA-03 | WA-04 | WA-05 | WA-06 | WA-07 |
| Tiempo de Reacción (min) | 180 | 120 | 180 | 180 | 180 | 180 |
| Tamaño de microesfera (%) | ||||||
| \hskip0.5cm a.>250 \mum | 0,0 | 28,9 | 6,0 | 5,4 | 11,5 | 11,6 |
| \hskip0.5cm b. 250-212 \mum | 0,0 | 1,5 | 1,4 | 0,0 | 0,0 | 2,9 |
| \hskip0.5cm c. 212-150 \mum | 5,0 | 2,9 | 3,0 | 1,8 | 2,6 | 7,2 |
| \hskip0.5cm d.<150 \mum | 93,8 | 66,6 | 90,5 | 92,5 | 86,0 | 75,0 |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos experimentos demuestran que las perlas de
alginato sódico reticulado/Methocel K4M de diámetros en general
menores de 150 micrómetros pueden prepararse de manera reproducible
usando isooctano como fase continua, SPAN 85 como agente
emulsionante y XAMA-7 como agente de
reticulación.
En este ejemplo, se usaron iones calcio
divalentes para reticular el alginato sódico para obtener una
comparación con el agente de reticulación
XAMA-7.
Primero, hace aproximadamente 20 años, se usó
cloruro cálcico para reticular el alginato sódico (M. Kiestan y C.
Burke, Biotechnol. Bioeng. 19, 387-97 (1977)); se
inyecto una solución acuosa de alginato sódico al
2-4% en una solución acuosa de cloruro cálcico al
2% para formar grandes perlas de alginato sódico hidrófilas
reticuladas. Este proceso no fue una emulsión en el sentido habitual
de la palabra, sino que en lugar de ello se produjeron microesferas
por la reticulación de alginato sódico por iones calcio en la
interfaz entre el alginato sódico acuoso y las fases cloruro
cálcico. En general, este método dio microcápsulas con una amplia
distribución de tamaños de 10-2000 micrómetros de
diámetro. Sin embargo, fue difícil preparar microesferas más
pequeñas de 0,1-200 micrómetros de diámetro.
Para este ejemplo, se prepararon microesferas de
alginato sódico por emulsión inversa y se reticularon con iones
calcio de acuerdo con el método usado por Wan et al., Proc.
NUS-JPS Seminar on Recent Developments in
Pharmaceutics and Pharmaceutical Technology, 1990, pág.
243-55; ibid., J. Microencapsulation 9(3),
209-16 (1992), para encapsular fármacos. Las
descripciones en estas publicaciones se incorporan en su totalidad
a este documento como referencia.
La Tabla XIV a continuación da las fórmulas y
resultados para estas emulsiones inversas usando fluoruro cálcico
como agente de reticulación. Típicamente, 50,0 g de solución acuosa
que contenía 2,25 g de alginato sódico disuelto y 0,25 g de
METHOCEL K4M (5% p/p de alginato sódico/METHOCEL K4M) se dispersó en
75,0 g de isooctano que contenía 1,5 g de SPAN 85 en diferentes
matraces de reacción y se agitó a 1000 rpm durante 10 minutos.
Después, 5,0 g de solución acuosa que contenía 1,0 g de TWEEN 85 se
añadieron y la dispersión se agitó durante otros 5 minutos. 25 g de
solución de cloruro cálcico al 8% p/p se añadió y se dejo
reaccionar con las gotas de polímero dispersas durante 60 minutos.
Las microesferas se deshidrataron después usando el método
desarrollado por Ismail et al (N. Ismail, M. S. Harris, y J.
R. Nixon), J. Microencapsulation 1(1), 9-19
(1984); cuya descripción completa se incorpora a este documento como
referencia, para deshidratar las microcápsulas de
gelatina-goma arábiga, es decir agitando durante 10
minutos en 25 ml de isopropanol, filtrando, lavando 2 veces con
agitación durante una noche en un vaso de precipitados con 200 ml de
isopropanol, filtrando de nuevo y secando a temperatura ambiente
durante una noche.
\vskip1.000000\baselineskip
| N^{o} de Experimento | W-04 | W-06 | W-07 | W-10 | |
| Fase acuosa (g) | |||||
| Alginato sódico | 4,50 | 9,00 | 9,00 | 2,25 | |
| Methocel K4M | 0,50 | 1,00 | 1,00 | 0,25 | |
| Agua | 100,0 | 200,0 | 200,0 | 50,0 | |
| Fase oleosa (g) | |||||
| Isooctano | 150,0 | 300,0 | 300,0 | 75,0 | |
| Span 85 | 3,0 | 6,0 | 6,0 | 1,5 | |
| Emulsionante (g) | |||||
| Tween 85 | 2,0 | 4,0 | 4,0 | 1,0 | |
| Agua | 10,0 | 20,0 | 20,0 | 5,0 | |
| Agente de reticulación | |||||
| CaCl_{2} ac. al 8% (ml) | 50,0 | 100,0 | 100,0 | 25,0 | |
| Tiempo de Adición (min) | 10 | 20 | 20 | 60 | |
| Agente de deshidratación (ml) | |||||
| Isopropanol | 50,0 | 100,0 | 100,0 | 25,0 | |
| Matraz de Reacción | A | B | B | C | |
| Tiempo de Reacción (min) | 35 | 45 | 45 | 90 | |
| Tamaño de microesfera (%) | |||||
| \hskip0.5cm a. >250 \mum | 30,5 | 6,2 | 11,2 | 5,60 | |
| \hskip0.5cm b. 250-212 \mum | 3,3 | 0,72 | 2,2 | 0,0 | |
| \hskip0.5cm c. 212-150 \mum | 29,0 | 1,7 | 5,4 | 0,0 | |
| \hskip0.5cm d. <150 \mum | 34,0 | 91,4 | 81,4 | 91,7 |
Los resultados de estos experimentos demuestran
que el primer experimento en el matraz de reacción A dio una amplia
distribución de tamaño de microesferas. Sólo aproximadamente un
tercio de las partículas fueron más pequeñas de 150 micrómetros de
diámetro.
Los experimentos en los matraces de reacción B y
C dieron una distribución más estrecha de tamaños y una mayor
proporción de microesferas mayores de 150 micrómetros de diámetro.
Por lo tanto, la mayoría de microesferas reticuladas con cloruro
cálcico fueron menores de 150 micrómetros de diámetro.
El tamaño, forma y características superficiales
de estas microesferas se vieron afectados en gran medida por la
velocidad de agitación, velocidad de adición de la solución de
cloruro cálcico y la forma del matraz de reacción y del mezclador.
Un tiempo de adición de 60 ó 20 minutos para la solución acuosa de
cloruro cálcico, generalmente dio microesferas que fueron menores de
150 micrómetros de diámetro.
El uso del matraz de reacción A (matraz de fondo
redondo con una cuchilla agitadora de media luna de
politetrafluoroetileno Teflón) y un tiempo de adición más corto dio
menos microesferas más pequeñas de 150 micrómetros de diámetro y
más microesferas de un diámetro mayor de 250 micrómetros. Los
matraces de reacción B y C dieron ambos aproximadamente un 90% de
las microesferas menores de 150 micrómetros de diámetro y por esa
razón se prefieren respecto al recipiente al matraz de reacción A.
Por lo tanto, el uso de cloruro cálcico como agentes de
reticulación dio como resultado la producción de microesferas con un
tamaño de partícula menor de 150 micrómetros de diámetro y una
distribución de tamaños más estrecha como de acuerdo con la
velocidad de agitación.
A modo de comparación, la mayoría de microesferas
reticuladas con el agente de reticulación XAMA-7 y
preparadas en el matraz de reacción fueron menores también de 150
micrómetros de diámetro. El tamaño, forma y características
superficiales de estas microesferas se vieron afectados también en
gran medida por la velocidad de agitación y la forma del matraz de
reacción y el agitador. Por lo tanto, puede observarse que los
resultados para el ión calcio como agente de reticulación son
bastantes paralelos a los del agente de reticulación
XAMA-7. La adición del ión calcio sin embargo es
diferente de la adición del agente de reticulación
XAMA-7 que, para los mejores resultados, requiere la
variación de pH de 11 antes y durante la emulsión a pH
7-8 después de la emulsión para conseguir el tamaño
de partícula deseado.
En este experimento, se determinó la capacidad de
las microesferas para pasar a través de una jeringuilla de calibre
20 ó 22. Generalmente, las microesferas se dispersaron en agua y se
dejaron hinchar.
Después, la dispersión acuosa se cargó en una
jeringuilla hipodérmica y se forzó a través de la aguja. Las
dispersiones acuosas con proporciones bajas de alginato
sódico/XAMA-7 no pudieron extruirse, mientras que
aquellas proporciones mayores de alginato
sódico/XAMA-7 dieron dispersiones que podrían
extruirse en hebras vermiformes. Generalmente es deseable para la
dispersión acuosa de microesferas que sean extruibles a través de
una jeringuilla para formar una hebra larga vermiforme.
En este ejemplo, el sistema de emulsión
alginato/tolueno/SPAN 60 se usó para mostrar el efecto del pH sobre
la variación de la velocidad de reticulación, mientras se
controlaba la emulsión. Si la reticulación es demasiado rápida, la
emulsión no podría dar un tamaño de gota suficientemente pequeño
antes de que la viscosidad de la fase acuosa aumente a un valor
demasiado grande para la dispersión.
Por lo tanto, las emulsiones se realizaron a un
pH relativamente alto tal como un pH 11; después, una vez formada la
emulsión, el pH se disminuyó a 7. Este enfoque permite un tiempo
abundante para realizar la emulsión, proporciona reticulación rápida
una vez formada una emulsión deseable.
La Tabla XV a continuación da las fórmulas para
estos experimentos y los resultados obtenidos:
| N^{o} de Experimento | S-35 | S-36 | S-37 | S-38 | S-39* | S-40 | S-42 |
| Fase acuosa (g) | |||||||
| Alginato sódico | 7,0 | 7,0 | 7,0 | 7,0 | 7,0 | 7,0 | 7,0 |
| Agua | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Fase oleosa (g) | |||||||
| Tolueno | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| SPAN 60 | 1,5 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 2,0 | 2,0 |
| pH (usando NH4OH) | 6,6 | 10,0 | 9,0 | 9,0 | 9,0 | 9,0 | 6,4 |
| XAMA-7 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 |
| pH (usando HCl ac.) | - - | 7,0 | - - - | - - - | - - - | - - - | - - - |
| Matraz de Reacción | C | C | C | C | C | C | C |
| Tiempo de Reacción (h) | 5,0 | 4,0 | 3,0 | 4,5 | 4,5* | 4,0 | 4,5 |
| Velocidad de Agitación (rpm) | 1100 | 1100 | 1300 | 1000-1300 | 1000 | 1200 | 1300-1500 |
| Agente de deshidratación (ml) | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Isopropanol | |||||||
| Tamaño de microesfera (%) | |||||||
| \hskip0.5cm a. >250 \mum | 14,4 | 27,4 | 0,83 | 4,89 | 1,87 | 4,28 | - - - - |
| \hskip0.5cm b. 212-250 \mum | 7,4 | 10,1 | 2,0 | 1,99 | 1,74 | 12,6 | - - - |
| \hskip0.5cm c. 150-212 \mum | 21,7 | 22,7 | 14,5 | 8,69 | 36,1 | 15,0 | - - - - |
| \hskip0.5cm d. <150 \mum | 56,5 | 39,9 | 81,4 | 84,5 | 60,3 | 66,8 | - - - - |
| * 20 g de cloruro cálcico al 8% después de 2 horas de reacción |
\vskip1.000000\baselineskip
En el experimento S-36, el 37% de
las microesferas formadas fueron mayores de 212 micrómetros y el
40% fueron menores de 150 micrómetros. Es deseable un porcentaje
mayor de microesferas mayores de 150 micrómetros; sin embargo, las
microesferas de esta muestra se agregaron. En este caso, el pH
original de 10 se disminuyó por adición de ácido clorhídrico. Se
formó un precipitado blanco, que se atribuyó a la precipitación de
ácido algínico debido al ácido clorhídrico.
En el experimento S-37, el pH de
la solución acuosa de alginato al 7,0% se ajustó de 6,6 a 9,0 con
hidróxido de amonio. De manera similar, el pH de los experimentos
S-37 y S-40 se ajustó a 9,0. En el
experimento S-40, las concentraciones de tolueno y
SPAN 60 se aumentaron para potenciar la emulsión; sin embargo, esta
mayor concentración de la fase oleosa también resultó en
agregación.
A modo de comparación, a una concentración menor
es decir alginato sódico al 5%; a pH 7, un tiempo de gelificación
de una hora es posible. (Véase el ejemplo Nº
5-7-1, Tabla VI).
Como se probó que el agente de reticulación
XAMA-7 era algo soluble en tolueno, se decidió no
usarlo en el sistema tolueno/SPAN 60 en los siguientes
experimentos. Por lo tanto, se sustituyó por otro sistema que usaba
isooctano como fase orgánica y mezcla de emulsionante SPAN 85/TWEEN
85. La Tabla XVI da las fórmulas y resultados para estos
experimentos.
| N^{o} de Experimento | W-20 | W-21 | W-23 | W-30 | |
| Fase acuosa (g) | |||||
| Alginato sódico | 2,25 | 2,25 | 4,50 | 4,50 | |
| METHOCEL K4M | 0,25 | 0,25 | 0,50 | 0,50 | |
| Agua | 50 | 50 | 50 | 50 | |
| Fase oleosa (g) | |||||
| Isooctano | 75 | 75 | 150 | 150 | |
| SPAN 85 | 1,5 | 1,5 | 3,0 | 3,0 | |
| Emulsionante (g) | |||||
| TWEEN 85 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 2,0 | |
| Agua | 5,0 | 7,0 | 7,0 | 1,0 | |
| Agente de reticulación (g) | |||||
| XAMA-7 | - - - | 1,5 | 5,0 | - - - | |
| CaCl2 solución al 8% | 25 | 10 | - - - | 50 | |
| Matraz de Reacción | C | C | C | E | |
| Tiempo de Reacción (h) | 4,5 | 4,5 | 4,5 | 3,0 | |
| Velocidad de Agitación (rpm) | 2000-2500 | 1100-1500 | 1000-1500 | 1000 | |
| Agente de deshidratación (ml) | |||||
| Isopropanol | 25 | 25 | 70 | 100 | |
| Tamaño de microesfera (%) | |||||
| \hskip0.5cm a. >250 \mum | 0 | 10,3 | - - - - | 0 | |
| \hskip0.5cm b. 212-250 \mum | 0 | 3,0 | - - - - | 2,5 | |
| \hskip0.5cm c. 150-212 \mum | 0 | 9,4 | - - - - | 5,0 | |
| \hskip0.5cm d. <150 \mum | 100 | 77,3 | - - - - | 92,5 |
\vskip1.000000\baselineskip
Como se observa en la Tabla XVI, el experimento
W-23 dio un resultado típico de estos experimentos.
Los tamaños de gota se comprobaron por microscopía óptica en cada
etapa. Las gotas del tamaño deseado (menores de 150 micrómetros) se
observaron en todas las etapas hasta la adición de isopropanol, que
se pretendió para detener la reacción de reticulación. Esta adición
aumentó la viscosidad hasta el punto en el que se hizo difícil
agitar la mezcla de reacción después de 20 minutos, en dicho punto
la mezcla pareció coagularse. Cuando se diluyó con agua, la mezcla
mostró la presencia de microesferas.
La Tabla XVI muestra los resultados de
utilización de un agente de reticulación que comprende una mezcla
de cloruro de calcio/XAMA-7. El experimento
W-21 demuestra que en dicha mezcla de agente de
reticulación da como resultado el 77% de las microesferas que son
menores de 150 micrómetros. Sin embargo, muchas de las microesferas
no eran esféricas y tenían una forma alargada.
En contraste, la mayor velocidad de agitación del
experimento W-20, junto con el uso de cloruro
cálcico como único agente de reticulación, dio un 100% de
microesferas menores de 150 micrómetros. Independientemente de esto,
hubo algo de agregación.
Generalmente, como puede concluirse a partir de
los experimentos W-20 y W-21, el
tamaño, la forma y la distribución de tamaños de las microesferas se
determinaron mediante la velocidad de agitación y el diseño del
matraz de reacción y el agitador así como el agente de dispersión.
En estos dos experimentos, así como en el experimento
W-23, la velocidad de agitación varió entre los
experimentos debido a que el motor no fue capaz de mantener una
velocidad constante, cuando la carga varió durante la emulsión y
reticulación. Esta variación en el intervalo de velocidades de
agitación se muestra en la Tabla XVI para los experimentos
W-20, W-21 y
W-22.
Este experimento se repitió usando un agitador
eléctrico de velocidad de constante. Los resultados se muestran en
el experimento W-30 en la Tabla XVI. Como puede
observarse a partir del experimento W-30, cuando la
velocidad de agitación permanece constante, independientemente de
la carga, las microesferas de alginato sódico reticulado/METHOCEL
K4M, predominantemente tenía un diámetro de menos de 150
micrómetros que cuando se usaba ión calcio como agente de
reticulación con isooctano como fase continua y TWEEN 85 como agente
emulsionante.
La diferencia principal entre el ión calcio y el
agente de reticulación XAMA-7 es que los iones
calcio forman enlaces iónicos, mientras que el agente de
reticulación XAMA-7 forma enlaces covalentes. Los
enlaces iónicos están influidos por el electrolito en el medio
circundante y pueden disolverse si la composición del medio cambia
suficientemente. En contraste, los enlaces covalentes es improbable
que se vean afectados por los cambios en el medio. Por lo tanto, los
experimentos se realizaron para determinar la estabilidad relativa
de las microesferas reticuladas con enlaces iónicos y covalentes. La
Tabla XVII da los resultados de estos experimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
| Nº de Experimento | A | B | A-1 | A-2 |
| Agente de reticulación | CaCl_{2} | XAMA-7 | CaCl_{2} | CaCl_{2} |
| Preparación de Experimento | W-30d | S-58d | W-30d | W-30d |
| Microesferas (g) | 0,15 | 0,15 | 0,15 | 0,15 |
| Solución de EDTA al 5% (g) | 5,0 | 5,0 | 5,0 | - - - - |
| Solución salina al 2% (g) | 5,0 | 5,0 | - - - - | 5,0 |
| 18 horas a temperatura | Algo de | Algo de | ||
| ambiente; | disgregación | disgregación | ||
| sin agitación | ||||
| 18 horas más a temperatura | Las perlas casi se | Sin | Las perlas casi | Sin |
| ambiente; | disgregaron a un | disgregación | se disgregaron a | disgregación |
| con agitación | líquido viscoso | un líquido viscoso | ||
| \begin{minipage}[t]{155mm} La preparación de los experimentos X-30d y S-58d se refiere a la fracción de microesferas de los experimentos W-30 y S-58 que fueron menores de 150 micrómetros\end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Las microesferas reticuladas con cloruro cálcico
(Experimento W-30d) y XAMA-7
(Experimento X-58d) se pusieron en solución de ácido
etilendiaminoacético al 5% (EDTA) y solución salina acuosa al 2%
(NaCl) y se dejó reposar durante 18 horas sin agitación. Las
microesferas se reticularon con cloruro cálcico y comenzaron a
disgregarse, mientras que las reticuladas con XAMA-7
permanecieron estables sin distorsión.
Después de 18 horas más a temperatura ambiente
con agitación, las microesferas se reticularon con cloruro cálcico
continuaron disgregándose, mientras que las reticuladas con
XAMA-7 permanecieron integras sin distorsión.
En experimentos diferentes, usando la solución de
EDTA y la solución salina sola, las microesferas se reticularon con
cloruro cálcico disgregado en la solución de EDTA pero no en la
solución salina. Por lo tanto, son los agentes calcio que se
complejan mediante el EDTA que da como resultado la degradación de
la reticulación y la disolución de las microesferas. La solución
salina no tuvo dicho efecto.
En contraste, las microesferas reticuladas con
XAMA-7 no mostraron disgregación en solución de
EDTA o solución salina en las mismas condiciones. Estos resultados
demuestran que los enlaces covalentes resultantes del agente de
reticulación XAMA-7 fueron más estables que los
enlaces iónicos resultantes de la reticulación con cloruro
cálcico.
En este ejemplo, se prepararon dispersiones
acuosas de partículas reticuladas de albúmina de suero bovino.
1,0 g de albúmina de suero bovino se disolvió en
tampón acetato sódico 0,1 M (pH 7,8) y se añadieron 0,5 g de
glutaraldehído para determinar si el agente de reticulación
reticularía el suero bovino; la acción de reticulación ocurrió
inmediatamente tras la adición del glutaraldehído.
Después, se disolvieron 1,0 g de albúmina de
suero bovino en 8 g de solución tampón y 2,0 g de glutaraldehído al
25% se añadieron después de la emulsión en 20,0 g de
o-xileno que contenía PLURONIC L92 al 5%, un
emulsionante copolímero de bloque de óxido de propileno/óxido de
etileno no iónico disponible en el mercado de BASF, que tiene un HLB
de 1,0-7,0. El agente de reticulación se dejó
reaccionar con las gotas de albúmina de suero bovino emulsionadas
durante 4 horas a temperatura ambiente. La emulsión se invirtió
después en 400 ml de agua que contenía el agente humectante AEROSOL
A-102 al 0,5% (alcohol disódico etoxilado semi éster
de ácidos sulfosuccínico) disponible en American Cyanamid Co.
En este ejemplo, 3,0 g de albúmina de suero
bovino en 15,0 g de solución tampón (acetato sódico al pH 7,8) se
emulsionaron en 60 g de o-xileno que contenía
TETRONIC 1102 al 5%, un emulsionante de agua en aceite disponible en
el mercado (BASF), HLB 6,5, que comprende etilendiamina
tetrasustituida con copolímeros de bloque de óxido de
propileno/óxido de etileno con 20 moles de óxido de propileno y 10
moles de óxido de etileno. Esta emulsión se sometió posteriormente a
ultrasonidos con un aparato de Ultrasonidos Branson (coeficiente de
utilización del 50%; posición 7; 1 minuto). Posteriormente, se
añadieron 6,0 g de solución acuosa de glutaraldehído al 25% para
reticular las gotas de albúmina de suero bovino en la dispersión de
agua en aceite.
El resultado fue una dispersión submicroscópica
de partículas de albúmina de suero bovino reticuladas dispersas en
la fase continua de o-xileno.
6 gramos de albúmina de suero bovino en 15 g de
tampón (acetato sódico pH 7,8) se emulsionaron en 60 g de
o-xileno que contenía emulsionante PLURONIC L92 y se
reticularon con 8 g de solución acuosa de glutaraldehído al 25%
después de la emulsión. Esta dispersión de agua en aceite de
partículas reticuladas de albúmina de suero bovino se invirtió
después en 400 ml de TRITON X-405 al 0,5% que
contenía agua, un tensioactivo de octilfenoxi polietoxi etanol
disponible en el mercado (Union Carbide; HLB 17,9).
El resultado de la inversión fue una dispersión
de partículas de albúmina de suero bovino reticuladas dispersas en
agua. La fase continua de o-xileno y la fase acuosa
fueron inmiscibles y se separaron fácilmente una de la otra.
Posteriormente, la actividad coloidal de las dispersión de
partículas en agua se ensayó como se describe a continuación.
La dispersión acuosa de partículas reticuladas de
albúmina de suero bovino se lavó con tampón y después se centrifugó
dos veces en una centrifuga de laboratorio Sorvall convencional.
Posteriormente, la dispersión acuosa se ensayo para estabilidad en
solución acuosa de cloruro sódico. La dispersión mostró una buena
estabilidad en cloruro sódico 0,15 M, se formó un pequeño coagulo en
solución 0,30 M, más coagulo en solución 0,60 M y floculó en
solución 0,90 M. Estos resultados indican que la dispersión de
albúmina de suero bovino es un coloide lipófilo en lugar de un
coloides lipófilo, que generalmente tiene concentraciones de
coagulación críticas de aproximadamente 0,5 molar para cationes
monovalentes. La microscopía de transmisión mostró que el tamaño de
partícula reticulada es de aproximadamente 5 a aproximadamente 8
micrómetros.
El efecto de la concentración de reticulación en
la preparación de dispersiones acuosas de partículas reticuladas de
albúmina de suero bovino se determinó variando la concentración de
glutaraldehído.
Se emulsionaron 10 g de albúmina de suero bovino
al 20% en 30 g de o-xileno que contenía TETRONIC
1102 al 5% aproximadamente. La emulsión se sometió a ultrasonidos
(posición 5; 90 segundos), y el glutaraldehído se añadió a una
concentración del 5, 10, 15 ó 20% p/p, basado en la albúmina de
suero bovino. El agente de reticulación en cada una de las
emulsiones se dejó reaccionar después durante 12 horas a
temperatura ambiente. Después, las emulsiones se invirtieron en 200
ml de agua que contenía TRITON X-405 al 1%. El
o-xileno se retiró por destilación del azeótropo
o-xileno/agua. Las dispersiones se limpiaron después
cada una de ellas por sustitución de suero con agua que contenía 50
ppm de formaldehído (para evitar el crecimiento bacteriano) y se
examinaron por microscopía de transmisión electrónica. En la
sustitución de suero, la dispersión o látex se confina en una celda
con una membrana semipermeable, y se bombea agua pura (o una
solución) a través de la celda para sustituir literalmente el suero
con el agua (o disolución). El efecto neto es retirar y disolver el
material en la fase acuosa así como cualquier tensioactivo
absorbido sobre las partículas. Las membranas nucleoporo que tienen
un tamaño de poro submicroscópico remarcadamente uniforme se usan.
La solución de separación es suficientemente buena para retirar el
tensioactivo absorbido soluto cuantitativamente. Cada una de las
dispersiones comprendía partículas poliméricas discretas
dispersas
en agua.
en agua.
En este ejemplo se realizaron tres experimentos
para obtener dispersiones acuosas de partículas de
gamma-globulina humana reticuladas. En primer lugar
se determinó la velocidad de reticulación de gamma globulina humana.
Se disolvió 1 g de gamma-globulina humana en 10,5 g
de agua, y esta solución se mezcló después con soluciones acuosas de
glutaraldehído al 6% y 12% en peso, basado en el peso de
gamma-globulina. La reticulación ocurrió en 30
segundos después de la adición del agente de reticulación.
Después, 1 g de gamma o globulina humana en 10 g
de agua se emulsionó en 30 g de o-xileno que
contenía 1,5 g de TETRONIC 1102. Esta dispersión de agua en aceite
de gotas de gamma-globulina humana se mezcló después
con 0,24 g de solución de glutaraldehído al 25%. Esta dispersión,
cuando se invirtió en 400 ml de AEROSOL A-102 al
0,5% que contenía agua, coaguló.
7,8 g de solución acuosa de
gamma-globulina humana al 10% se emulsionaron en 15
g de o-xileno que contenía 0,75 g de TETRONIC 1102.
Esta emulsión se sometió posteriormente a ultrasonidos y como en el
caso anterior y 0,17 g de glutaraldehído al 25% se añadieron. La
emulsión se invirtió después en 150 g de agua que contenía 0,75 g de
AEROSOL A-102.
20 g de solución acuosa de
gamma-globulina humana al 10% se emulsionaron en 60
g de o-xileno que contenía 3 g de TETRONIC 1102,
después de lo cual la emulsión se sometió a ultrasonidos, como se ha
descrito anteriormente. Durante este tiempo se añadieron 0,8 g de
glutaraldehído (solución acuosa al 25% para reticular la gotas de
gamma-globulina humana formadas por la emulsión. La
emulsión se invirtió después en 400 ml de agua que contenía 2 g de
AEROSOL A-102.
Cada una de las tres dispersiones anteriores,
cuando se examinaron bajo el microscopio electrónico o el
microscopio óptico, comprendían partículas poliméricas reticuladas
de gamma-globulina humana en una dispersión
acuosa.
En este experimento, se disolvió 1 g de
gamma-globulina humana y 9 g de agua y después se
emulsionó en 30 g de o-xileno que contenía 1,5 g de
TETRONIC 1102. La emulsión se sometió a ultrasonidos como se ha
descrito anteriormente, es decir, posición 5; 1 minuto. Después,
0,6 g de solución de glutaraldehído al 15% se añadieron y la
muestra se volteo de un extremo a otro durante 12 horas a
temperatura ambiente en una botella cerrada. La emulsión se invirtió
después en 300 ml de agua que contenía 3 g de TRITON
X-405. El o-xileno se separó después
a temperaturas por debajo de 20ºC para evitar la agregación de las
partículas. La dispersión acuosa cuando se limpió por sustitución
del suero de una manera convencional, contenía agregados de
partículas de gamma-globulina humanas, que se
atribuyó al pH bajo.
En cualquier caso, después de la sustitución de
suero, se observó que las partículas se agregaban. A la vista de lo
anterior, el experimento se repitió excepto que se dobló la
concentración de glutaraldehído y el pH se ajustó a 7 por adición de
tampón bicarbonato sódico. La dispersión se invirtió después y se
lavó por sustitución en suero con tampón acetato sódico 0,1 M (pH
7,8) a temperaturas por debajo de 35ºC para evitar la agregación. El
resultado fue que las partículas no se agregaron.
Se prepararon también dispersiones acuosas (al
2,5%) de gamma-globulina humana en tampón borato
(pH 8-8,7). Sólo parte de la
gamma-globulina humana era soluble en el tampón
borato a concentración 2,5%.
Un gramo de gamma-globulina
humana en 9 g de tampón (pH 8,4) se emulsionó en 30 g de
o-xileno que contenía 1,5 g de TETRONIC 1102. La
emulsión se sometió a ultrasonidos como en el caso anterior
(posición 3:30 segundos), y se añadieron 1,0 g de glutaraldehído
acuoso al 25%. La reacción de reticulación se realizó durante 19
horas a temperatura ambiente. La dispersión se invirtió después en
un exceso de solución de TRITON X-405 al 1% y se
agitó durante 3 horas. El o-xileno se separó después
al vacío y la dispersión se lavó mediante sustitución de suero con
tampón borato (pH 8,4). Como entenderán los especialistas en la
técnica, es necesaria la dilución significativa para la destilación
del azeótropo o-xileno/agua de la dispersión.
Las partículas de gamma-globulina
humana se reticularon también usando clorhidrato de
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(ECDI). 1,0 g de solución acuosa de gamma-globulina
humana al 2% se mezcló con un 0,03, 0,10, 0,50 y 1,0% de agentes de
reticulación ECDI y con glutaraldehído (solución acuosa al 25%)
para compararlos. En cada caso se formó un precipitado visible,
aunque el precipitado era algo difícil de observar a baja
concentra-
ción.
ción.
Otros emulsionantes de agua en aceite de TETRONIC
disponibles en el mercado de BASF tales como TETRONIC 90R4 (HLB
7,1), 110R2 (HLB 3,5) y 150R4 (HLB 5,4), se ensayaron también.
Estos emulsionantes tienen todos valores bajos de HLB y se cree que
son copolímeros de bloque de óxido de propileno/óxido de etileno de
proporciones variables, de estructura similar a TETRONIC 1102. Estos
emulsionantes, sin embargo, se descubrió que no eran tan eficaces
en estas emulsiones como TETRONIC 1102. Se descubrió que TETRONIC
90R4, además, no es soluble en o-xileno.
Se ensayó solución salina tamponada con fosfato
(pH 6,95) como medio para la emulsión de
gamma-globulina humana. En este caso,
gamma-globulina humana al 2,5% era soluble en este
tampón. 10 g de la gamma-globulina humana al 2,5% en
solución salina tamponada con fosfato se emulsionaron en 30 g de
o-xileno que contenía TETRONIC 1102 al 5%. La
emulsión se sometió a ultrasonidos como en el caso anterior y se
mezcló con 0,0125 g de agentes de reticulación EDCI. La mezcla se
agitó durante 4 días; después de los cual la emulsión se invirtió en
400 g de solución salina tamponada con fosfato que contenía 0,5% de
TRITON X-405 y se separó el
o-xileno para dar una dispersión acuosa de
partículas reticuladas de gamma-globulina
humanas.
Se prepararon otros látex usando 10 g de
gamma-globulina humana al 3,5% en 30 g de
o-xileno que contenía TETRONIC 1102 al 5% y 0,035 g
de ECDI; 3 g de gamma-globulina humana al 10% con
0,035 g de ECDI en 10 g de o-xileno que contenía
TETRONIC 1102 al 5%; y 3 g de gamma-globulina humana
al 10% en 10 g de o-xileno que contenía TETRONIC
1102 al 5% con 0,06 g de ECDI.
Todos estos látex dieron dispersiones acuosas de
partículas reticuladas de gamma-globulina
humana.
En este ejemplo, se prepararon partículas
hidrófilas reticuladas a partir de hidroxietilcelulosa,
poli(alcohol vinílico), sulfato de condroitina y otros
polímeros solubles en agua. La Tabla XVIII muestra los resultados
para hidroxietilcelulosa.
| N^{o} de Experimento | HOC-1 | -02 | -03 | -04 | ||
| Fase acuosa (g) | ||||||
| HOC | 7,0 | 7,0 | 7,0 | 7,0 | ||
| Agua | 100 | 100 | 100 | 100 | ||
| pH | 7-8 | 7-8 | 7-8 | 10-11 | ||
| Fase oleosa (g) | ||||||
| Span 60 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ||
| Tolueno | 100 | 100 | 100 | 100 | ||
| XAMA-7 (g) | 4,0 | 4,0 | 4,0 | 4,0 | ||
| Agente de deshidratación (ml) | ||||||
| Metanol | 100 | - - - | - - - | - - - | ||
| Isopropanol | - - - | 100 | 100 | 100 | ||
| Matraz de Reacción | C | C | C | C | ||
| Velocidad de Agitación (rpm) | 1000 | 1000 | 1000 | 1000 | ||
| Tiempo de Reacción (h) | 19 | 14 | 18 | 22 | ||
| Tamaño de microesfera (%) | ||||||
| \hskip0.5cm a. >250 \mum | - - - | 7,5 | 19,5 | - - - | ||
| \hskip0.5cm b. 212-250 \mum | - - - | 2,3 | 5,9 | - - - | ||
| \hskip0.5cm c. 150-212 \mum | - - - | 1,8 | 29,7 | - - - | ||
| \hskip0.5cm d. <150 \mum | - - - | 88,7 | 45,00 | - - - |
La hidroxietilcelulosa se disolvió en agua y el
pH de la solución se ajustó a 7-8. El SPAN 60 se
disolvió en el tolueno y la solución se usó como fase continua para
emulsionar la solución acuosa de hidroxietilcelulosa. La emulsión
se realizó hasta que las gotas de emulsión se juzgaron
satisfactorias, es decir, las gotas se observó que eran discretas y
esféricas y que no tenían una forma irregular, con una
preponderancia de tamaños menores de 150 micrómetros de diámetro,
como se controla por microscopía óptica. A pH 7, la reacción de
reticulación (XAMA-7) ocurrió rápidamente a
temperatura ambiente.
En el experimento H0C-01, las
perlas se agregaron después de la adición del metanol, para
deshidratar las partículas reticuladas formadas. Por lo tanto, en
los restantes experimentos mostrados en la Tabla XVIII, se usó
isopropanol como agente de deshidratante. Esto dio como resultado la
formación de microesferas de los intervalos de tamaño establecidos.
Generalmente, sin embargo las microesferas no son tan perfectas como
las preparadas a partir de alginato sódico.
En estos experimentos, se investigaron otros
polímeros solubles en agua junto con la determinación del efecto
del calor y un catalizador con el agente de reticulación. Los
resultados se muestran en la Tabla XIX a continuación. En general,
el procedimiento fue: a) la disolución del polímero soluble en agua,
junto con el agente de reticulación; b) emulsionar esta solución en
una fase oleosa continua que contiene un emulsionante de agua en
aceite; c) homogeneizar la solución por agitación,
ultrasonificación u homogeneización; d) calentar la emulsión para
realizar la reticulación; e) e invertir la emulsión en agua para
transferir las partículas reticuladas a la fase
acuosa.
acuosa.
\vskip1.000000\baselineskip
| N^{o} de Experimento | 101 | 102 | 103 | 105 | 106 | 107 | 108 | 109 |
| Polímero | PVP | PVP | PVP | PVA | PVA | MC | PVA | PVA |
| Peso (g) | 1,0 | 1,0 | 2,0 | 2,3 | 6,0 | 3,0 | 6,0 | 3,0 |
| Agua (g) | 19,0 | 19,0 | 18,0 | 20,2 | 27,0 | 36,0 | 25,5 | 33,0 |
| \hskip0.5cm Glutaraldehído | - - - | - - - | - - - | 2,5 | 7,0 | 3,0 | 7,0 | 3,8 |
| o-Xileno (g) | 20,0 | 20,0 | 40,0 | 22,5 | 40,0 | 40,0 | 43,2 | 18,0 |
| Span 60 (g) | 1,0 | 0,2 | 1,0 | - - - - | - - - - | - - - - | - - - - | - - - - |
| Tetronic 1102 | - - - | - - - | - - - | 2,5 | 4,0 | 4,0 | 4,8 | 2,0 |
| Ácido p-tolueno sulfónico | 1,0* | 1,0* | 2,0* | - - - | 1,0 | 1,0 | 0,5 | 0,3 |
| Emulsionantes de inversión | - - - | - - - | - - - | - - - | - - - | - - - | X-405 | X-405 |
| * persulfato amónico | ||||||||
| X-405 - Triton X-405 | ||||||||
| PVP - poli(N-vinil pirrolidona); PM 360.000 | ||||||||
| PVA - Vinol 125 poli(alcohol vinílico); PM 70.000; 99,6% hidrolizado | ||||||||
| MC - Methocel K4M hidroxipropilmetilcelulosa |
| N^{o} de Experimento | 110 | 111 | 112 | 113 | 114 | 115 | 116 | 117 |
| Polímero | MC | PVA | PVA | MC | PVA | PVA | PVA | PVA |
| Peso (g) | 2,0 | 5,0 | 5,0 | 2,0 | 2,0 | 0,8 | 3,0 | 6,0 |
| Agua (g) | 31,5 | 15,0 | 15,0 | 29,5 | 21,0 | 8,7 | 29,3 | 57,0 |
| Glutaraldehído | 4,5 | 1,0 | 1,0 | 2,5 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | 1,0 |
| o-Xileno (g) | 18,0 | 97,2 | 45,0 | 153,0 | 52,3 | 19,0 | 57,0 | 97,0 |
| Tetronic 1102 | 2,0 | 10,8 | 5,0 | 17,0 | 0,25 | - - - - | 3,0** | - - - - |
| Pluronic L92 | - - - | - - - | - - - | - - - | 2,5 | - - - | - - - | 3,0 |
| Aerosol OT | - - - | - - - | - - - | - - - | - - - | 1,0* | - - - | - - - |
| Ácido p-tolueno sulfónico | 0,25 | 0,25 | 0,8 | 1,0 | 0,1 | 0,05 | 0,2 | 0,3 |
| X-405 | SLS | SLS | SLS | - - - | - - - | X-305 | X-305 | |
| Emulsionantes de inversión | SLS | - - - | - - - | - - - | - - - | - - - | A-102 | A-102 |
| - - - | - - - | - - - | - - - | - - - | - - - | SLS | - - - - - - - | |
| * también Tetronic 702 y 1102; Pluronic L92 | ||||||||
| ** también Tetronic 702, 70R2, 50R4; Pluronic L92; Span 60; AerosolOT | ||||||||
| PVA - Vinol 125 poli(alcohol vinílico); PM 70.000; 99,6% hidrolizado | ||||||||
| MC - Methocel K4M hidroxipropilmetilcelulosa |
El persulfato amónico en presencia del ácido
p-tolueno sulfónico se usó como un agente de
reticulación para reticular el PVA.
En el experimento 101, una solución acuosa al 5%
de poli(N-vinil pirrolidona) que contenía la
cantidad indicada de persulfato amónico como agente reticulante se
emulsionó en o-xileno. La emulsión se sometió a
ultrasonidos (aparato de ultrasonidos Branson; ajuste del
coeficiente de utilización al 50%; temperatura ambiente) y después
se calentó durante 30 minutos a 80ºC. Después de la inversión en
agua que contenía Triton X-305 (octilfenoxipolietoxi
etanol, HLB 17,3, Union Carbide), se demostró la presencia de
partículas por microscopía óptica y microscopía de barrido
electrónico, de acuerdo con las técnicas habituales.
El experimento 102 por comparación usó una
solución acuosa al 5% de PVP y persulfato amónico como agente
reticulante que sin embargo, una solución de Span 60 al 1% usando
en lugar de el 5% del experimento 101. La emulsión se sometió a
ultrasonidos (coeficiente de utilización del 50%, posición 3; un
minuto y se calentó durante 30 minutos a 80ºC. El resultado fue una
emulsión muy viscosa que no podía invertirse. La emulsión viscosa
se cree que se debía a la baja concentración de SPAN 60.
El experimento 103 usó un lote mayor tamaño y una
concentración intermedia de SPAN 50, es decir, 2,5%. La emulsión se
homogeneizó a mano (2 ciclos) para reducir el tamaño de gota a
aproximadamente 4 micrómetros se agitó a 236 rpm usando un agitador
convencional de laboratorio y se calentó a 80ºC durante 30 minutos.
Cuando se invirtió en agua, la emulsión se separó en dos capas, la
inferior de las cuales pareció ser un gel de partículas reticuladas
de 4 micrómetros de diámetro.
En el experimento 105, una solución acuosa de
poli(alcohol vinílico) se preparó y emulsionó en
o-xileno que contenía emulsionante TETRONIC 1102.
Esta emulsión se mezcló con el agente de reticulación
glutaraldehído. Este sistema falló a la hora de reaccionar después
de 1,5 horas a 70ºC. Cuando se añadieron 1,0 g de ácido
p-tolueno sulfónico en 11,0 g de agua, sin embargo,
a 6,0 g de PVA disuelto 28 gramos de glutaraldehído al 28%, ocurrió
una reacción rápida cuando la mezcla se calentó a 40ºC.
Experimentos similares usando metilcelulosa (en lugar de PVA) con
agente de reticulación glutaraldehído y ácido
p-tolueno sulfónico y catalizadores de ácido
clorhídrico dio un color pardo aunque no partículas discernibles. El
experimento 106 usó PVA como polímero soluble en agua y
glutaraldehído como agente de reticulación, con ácido
p-tolueno sulfónico como catalizador.
El experimento 107 usó metilcelulosa (Dow
METHOCEL K4M) como polímero soluble en agua y glutaraldehído como
agente de reticulación, catalizado con ácido
p-tolueno sulfónico. La reacción se realizó a
temperatura ambiente. Se retiró el agua de la emulsión por
destilación del azeótropo o-xileno/agua, y se
añadieron 61 g adicionales de o-xileno a la
emulsión. Esto dio como resultado algo de floculación. La emulsión
se invirtió después en agua para formar una dispersión de
partículas reticuladas de metilcelulosa en agua.
El experimento 108 usó PVA como polímero soluble
en agua y el mismo agente de reticulación y catalizador que en el
ejemplo 107, añadiendo el último a la solución acuosa antes de la
emulsión. El PVA reticuló en 4 minutos después de la adición del
catalizador. Las partículas finales eran blandas y se pegaron entre
sí y la esfera metálica para molerlo. La emulsión se invirtió en 500
ml de TRITON X-405 acuoso y 26 ml de
o-xileno se retiraron por destilación. Ocurrió algo
de floculación en las partículas.
El experimento 109 usó PVA y el mismo agente de
reticulación y catalizador que en el experimento 108. El
glutaraldehído y el ácido p-tolueno sulfónico se
mezclaron conjuntamente y la solución se emulsionó inmediatamente
después. Posteriormente, la reacción de reticulación fue algo
competitiva con la emulsión y se sería de esperar algo de
reticulación junto con la emulsión. Se usó una varilla de agitación
magnética para mezclar la muestra. Aunque una varilla de agitación
magnética es eficaz para preparar la emulsión, los especialistas en
la técnica entenderán fácilmente que con esto no se puede obtener
una variación fina. La reacción de reticulación tuvo lugar en 10
minutos. Se añadieron 40 g adicionales de o-xileno,
mientras el azeótropo o-xileno/agua se retiró por
destilación de la emulsión. La emulsión final se invirtió en 300 ml
de emulsionante TRITON X-405 acuoso al 10% y 500 ml
de lauril sulfato sódico acuoso al 1%, un emulsionante de alto HLB
usado par invertir la emulsión de agua en aceite. La emulsión se
invirtió con algo de floculación de las partículas reticuladas.
En el experimento 110, se usó metilcelulosa como
polímero soluble en agua. El agente de reticulación fue
glutaraldehído y se usó ácido p-tolueno sulfónico
como catalizador, añadiéndose a la solución acuosa antes de la
emulsión. La solución polimérica se emulsionó en la fase oleosa
inmediatamente después de la adición del glutaraldehído y ácido
p-tolueno sulfónico. Esto es muy viscoso es decir,
es difícil de verter, la solución se disperso en
o-xileno usando un homogeneizador manual
convencional.
La reticulación se juzgó completa en dos horas a
temperatura ambiente después de la adición del catalizador y del
agente de reticulación. La emulsión se invirtió en una solución
acuosa que comprendía 200 ml de solución acuosa de TRITON
x-405 al 15% y 200 ml de solución acuosa al 1% de
lauril sulfato sódico. La floculación ocurrió durante esta
inversión. No se observaron partículas mediante microscopía de
barrido electrónico.
El experimento 111 usó PVA como polímero soluble
en agua y el mismo agente de reticulación y catalizador que en los
experimentos anteriores. El agente de reticulación y el catalizador
se añadieron antes de la emulsión y se mezclaron por ultrasonidos.
Cuando 30 ml de la emulsión de agua en aceite se invirtieron en 270
ml de solución acuosa al 1% de lauril sulfato sódico, y el
azeótropo o-xileno/agua se retiró por destilación,
la emulsión de agua en agua resultante mostró que no había
partículas por microscopía electrónica de barrido. Por comparación,
cuando se agitaron 20 g de emulsión de agua en aceite con 1,0 g de
ácido p-tolueno sulfónico durante 30 horas a
temperatura ambiente, no ocurrió reticulación, quedando demostrado
esto por la ausencia de formación de partículas. Independientemente
de esto, cuando la emulsión de agua en aceite se calentó a 50ºC
ocurrió la reticulación, según se confirmó por la presencia de
partículas.
En el experimento 112 se usaron 20 g de PVA al
20% y 16 g de glutaraldehído al 25% con 4 g de catalizador de ácido
p-tolueno sulfónico emulsionado en 50 g de
o-xileno que contenía aproximadamente 5 g de
TETRONIC 1102. Esta emulsión se calentó a 40ºC. Cuando el
catalizador se añadió antes de la emulsión, la solución polimérica
soluble en agua se hizo muy viscosa y no pudo agitarse.
Independientemente de esto, cuando el catalizador se añadió después
de la emulsión, después la emulsión se giró de un extremo a otro en
una botella cerrada durante 30 horas a temperatura ambiente, ocurrió
la reticulación, según queda evidenciado por la formación de perlas.
Cuando la emulsión se invirtió en 800 ml de solución acuosa de
lauril sulfato sódico al 1% formó un precipitado que se redispersó
el agua con un homogeneizador manual.
El experimento 113 usó 10 g de solución de
metilcelulosa al 10% y las cantidades establecidas de agente de
reticulación y catalizador como solución polimérica soluble en agua.
Esta solución se emulsionó en una fase oleosa que comprendía
o-xileno y emulsionante TETRONIC 1102 al 10%. La
emulsión se separó de acuerdo con las técnicas habituales a 40ºC
para retirar el azeótropo o-xileno/agua (25 g de
agua y 55 g de o-xileno). 30 g de esta emulsión,
invertida en 300 ml de una solución de lauril sulfato sódico al 1%
mostraron pocas evidencias de reacción. Otros 100 g de muestra de
la emulsión se invirtieron en 900 ml de lauril sulfato sódico al
0,5% con resultados similares. Este experimento se repitió usando
20 g de metilcelulosa al 10%, 10 g de glutaraldehído al 25% y 5 g
de solución catalizadora de ácido p-tolueno
sulfónico al 20% emulsionado en 170 g de o-xileno
que contenía TETRONIC 1102 al 10%. La emulsión se homogeneizó dos
veces en un homogeneizador manual convencional. La emulsión aún era
estable después extraer 20 ml de agua. La reacción de reticulación
se realizó volteando la emulsión en una botella cerrada de un
extremo a otro durante 24 horas a 40ºC. El polímero precipitó y la
solución se hizo transparente, ocurriendo esto antes de que la
inversión como en la parte anterior de este experimento 113.
En el experimento 114, 20 g de
poli(alcohol vinílico) al 10% (VINOL 124; PM 90 M) solución,
2 g de glutaraldehído al 25% y 0,5 g de solución de ácido
p-tolueno sulfónico al 20% se emulsionaron en 50 g
de o-xileno que contenía PLURONIC L92 al 5%. Se
formó algún coagulo después de extraer 12 ml de agua y 28 ml de
o-xileno. La emulsión se realizó también en 50 g de
o-xileno que contenía TETRONIC 1102 al 5%. Esta
emulsión floculó después de extraer 18 g de agua y la emulsión se
agitó en un agitador de pintura Red Devil convencional.
El experimento 115 usó una solución polimérica
acuosa soluble en agua (8 g PVA al 10%), 2 g de solución de
glutaraldehído al 25% y 0,2 g de solución de ácido
p-tolueno sulfónico al 25% emulsionado en 20 g de
o-xileno que contenía aerosol OT al 5% (el dioctil
éster del ácido sulfosuccínico sódico), disponible en el mercado en
American Cyanamid. En este experimento, la emulsión se formó y
después se añadió el catalizador. Las gotas de emulsión poliméricas
se reticularon en 30 minutos después de añadir el catalizador a la
emulsión. La emulsión floculó sin embargo después de agitarla en un
agitador de pintura Red Devil. Otras emulsiones, realizadas en
o-xileno que contenía TETRONIC 702 al 5% (BASF; HLB
1,0-7,0, se cree que es un copolímero de bloque de
óxido de propileno/óxido de etileno) añadiendo el catalizador
después de la emulsión, también dio floculación. TETRONIC 1102 dio
una emulsión estable con sólo un pequeño coagulo, que se invirtió en
500 ml de solución de lauril sulfato sódico al 0,5%. PLURONIC L92
dio una emulsión estable con sólo un pequeño coagulo, que se
invirtió en 300 ml de solución de lauril sulfato sódico al 0,2%,
300 ml de solución de TRITON X-305 al 0,2% o 200 ml
de solución de AEROSOL A-102 al 0,4%, sin
floculación. Por otro lado, el aerosol OT dio una floculación para
formar una masa de polímero.
En el experimento 116, 30 g de solución acuosa de
PVA al 10%, 2 g de solución acuosa de glutaraldehído al 25% y un
gramo de solución acuosa de ácido p-tolueno
sulfónico al 20% se emulsionaron en o-xileno (60 g)
que contenía TETRONIC 1102 al 6,0%. El agua se extrajo de la
emulsión, antes de añadir el catalizador. La reticulación de las
gotas de emulsión polimérica se realizó volteando la emulsión en una
botella cerrada de un extremo a otro durante 12 horas a temperatura
ambiente. La emulsión, cuando se invirtió en 800 ml de TRITON
X-305 al 0,2% o solución de AEROSOL
A-102, floculó, aunque se redispersó por
ultrasonidos (aparato de ultrasonidos Branson temperatura ambiente).
Se compararon otros emulsionantes usando 8 g de solución acuosa de
PVA al 10%, 2 g de solución acuosa de glutaraldehído al 15% y 0,2 g
de solución acuosa de ácido p-tolueno sulfónico
(25%), emulsionando estas soluciones en 20 g de
o-xileno que contenía un 5% de emulsionante. En cada
caso, la primera etapa se realizó de la emulsión usando el
homogeneizador manual. TETRONIC 1102 dio una emulsión muy estable;
PETRONIC 702 dio una emulsión que se separó tras el cese de la
agitación. PLURONIC L92 dio una emulsión muy estable así como el
AEROSOL OT. SPAN 60, TETRONIC 70R2 y TETRONIC 50R4 dieron cada uno
emulsiones que se separaron con el cese de la agitación.
El segunda etapa en estos experimentos fue la
reticulación de las gotas de emulsión del polímero en la emulsión;
se añadió ácido p-tolueno sulfónico después de la
emulsión, y las botellas tapadas en las que están contenidas las
emulsiones se voltearon de un extremo a otro a temperatura ambiente
durante 12 horas. La emulsión de TETRONIC 1102 permaneció estable;
la emulsión de TETRONIC 702 se reticuló para formar una masa de
polímero soluble en agua; la emulsión de PLURONIC L92 formó una
pequeña cantidad de coagulo aunque por otro lado dio una emulsión
estable. La emulsión de AEROSOL OT floculó para dar una masa de
polímero.
La tercera etapa en estos experimentos fue la
inversión de la emulsión en agua que contenía TRITON
X-305, AEROSOL A-102 o lauril
sulfato sódico al 0,5% (siendo todos ellos emulsionantes con un
elevado HLB). El TRITON X-305 y AEROSOL
A-102 dieron cada uno de ellos emulsiones estables a
partir de la cuales se destiló fácilmente el
o-xileno; el lauril sulfato sódico formó un pequeño
coagulo y el o-xileno se destiló sólo con
dificultad. El AEROSOL A-112 se seleccionó para
evaluación adicional.
En el experimento 117 se usaron 60 g de PVA al
10% (VINOL 125), 4 g de glutaraldehído al 25% y 1,5 g de ácido
p-tolueno sulfónico al 25% emulsionado en 100 g de
o-xileno que contenía 3 g de PLURONIC L92 y se
sometió a ultrasonidos usando un aparato de ultrasonidos Branson
(posición 7; coeficiente de utilización al 50%; 2 minutos). El
azeótropo o-xileno/agua se extrajo en un evaporador
rotatorio Buchler Rotovap, y el o-xileno se añadió a
la emulsión hasta retirar 45 ml de agua y 185 ml de
o-xileno. La emulsión final se sometió después a
ultrasonido como está mencionado anteriormente para experimento, se
llevó el catalizador y la emulsión se volteo de un extremo a otro en
botellas cerradas durante 12 horas a temperatura ambiente.
La emulsión se invirtió después añadiéndole un
exceso de agua que contenía TRITON X-305 o AEROSOL
A-102 al 0,2%. El resultado fue una dispersión
acuosa de partículas reticuladas de poli(alcohol
vinílico).
Los especialistas en la técnica entenderán que el
peso molecular del poli(alcohol vinílico) afectara a las
propiedades de las partículas poliméricas reticuladas. Un polímero
de alto peso molecular necesita menos reticulaciones para
reticularse que un polímero de bajo peso molecular. El parámetro
crítico es el peso molecular entre reticulaciones. Aunque sin desear
ceñirse a esta teoría, el peso molecular de un polímero que daría la
propiedad deseable de formación de hebra vermiforme tras la
extrusión de una aguja es probablemente uno que tiene un peso
molecular de bajo a moderado.
Se realizaron otros experimentos usando
metilcelulosa de Dow Methocel K4M. Esta es una
hidroxipropilmetilcelulosa (conocida habitualmente como
"metilcelulosa") y es representativa de este tipo de derivado
soluble en agua de celulosa natural. La metilcelulosa puede
reticularse por la reacción de sus grupos hidroxilo con dichos
compuestos difuncionales tales como ácido cítrico, glioxal,
dimetilolurea, resinas melamina-formaldehído
solubles en agua, sales de amonio cuaternario y resinas de
urea-formaldehído solubles en agua.
Los derivados de tipo acetal de celulosa
parcialmente alquiladas solubles en agua se produjeron por técnicas
conocidas tratando una celulosa alquilada tal como metilcelulosa con
un aldehído tal como glioxal o aldehído pirúvico que tiene la
fórmula general
R-CO-CO-H, en la que
R puede ser un hidrógeno o un grupo alquilo y retirar el agua de
los productos de reacción como por ejemplo secado en una placa de
vidrio. Los productos obtenidos y solubles en agua, acetona y
alcoholes alifático monohídricos inferiores.
La metilcelulosa se disolvió pesando el polímero
ponderado a 75-85ºC y después añadiendo el agua
restante mientras se enfriaba y agitaba. La transparencia de la
solución se mejoró enfriando a menos de 10ºC. 16 g de metilcelulosa
acuosa al 1% se mezclaron de la manera convencional con 0,1 g de
hexametoximetilmelamina (CYMEL 300) y 0,0128 g de catalizador de
ácido p- tolueno sulfónico y se calentaron durante 20 minutos a 50ºC
para formar un gel reticulado. Cuando se calentó, el lugar de
durante 30 minutos a 60ºC se formó una gran masa de polímero
reticulado. Esta reacción de reticulación se realizó en la
emulsión.
50 g de una solución que contenía metilcelulosa
al 1%, 0,15 g de CYMEL 300 y 0,070 g de ácido
p-tolueno sulfónico se emulsionó en 0 g de
o-xileno que contenía 5,0 g de SPAN 60. La emulsión
se sometió a ultrasonidos (posición 5; coeficiente de utilización al
10%, 5 minutos) para dar una emulsión de 0,20-0,40
micrómetros de tamaño de gota. La emulsión se calentó después
durante 30 minutos a 70ºC para reticular las gotas poliméricas.
Posteriormente la emulsión se invirtió en 800 ml de agua que
contenía 10 g de TRITON X-305 (HLB 17,3). La
microscopía óptica mostró que la emulsión final, después de
invertirla en agua había floculado. Basándose en esta observación,
se cree que un emulsionante de alto HLB podría uno se adecuado para
la inversión; en consecuencia, se ensayaron otros
emulsionantes.
TRITON X-102 (un octilfenoxi
polietoxi etanol, HLB 14,6, disponible en el mercado en un Union
Carbide) en una proporción 9:1 de agua emulsionante no invirtió la
emulsión; TRITON N-101 (un nonilfenoxi polietoxi
etanol, HLB 13,4, Union Carbide) dio resultados similares; TRITON
X-405 (HLB 17,9) y TRITON X-305
(HLB 17,3) dieron la separación en dos capas. La microscopía óptica
mostró que no había floculación con TRITON X-102 o
TRITON N-101, ligera floculación con TRITON
X-405 y mucha más floculación con TRITON
X-305.
En otro experimento, 50 g de metilcelulosa acuosa
al 1% que contenía 0,25 g de CYMEL 300 y 0,06 g de ácido
p-tolueno sulfónico se emulsionaron en 70 g de
o-xileno que contenía 7 g de SPAN 60. La emulsión se
sometió a homogeneización manual y ultrasonidos y después se agitó
a 158 rpm en un matraz de fondo redondo con un agitador convencional
de laboratorio durante 2,5 horas a 60ºC. 50 ml de esta emulsión se
invirtieron en 500 g de agua que contenía 5 g de TRITON
X-405 (HLB 17,9) para dar una dispersión acuosa de
las partículas reticuladas de metilcelulosa/CYMEL 300.
Se realizó un experimento adicional usando 50 g
de solución acuosa de carboximetilcelulosa al 2,5% que contenía 0,20
g de CYMEL 300 y 0,06 g de ácido p-tolueno
sulfónico. Esta solución polimérica soluble en agua se emulsionó en
50 g de o-xileno que contenía SPAN 60 al 10% y se
sometió a homogeneización manual ultrasonidos (posición 7;
coeficiente de utilización al 50%; 2 minutos) y se calentó durante 1
hora a 62ºC mientras se agitaba a 240 rpm, para preparar una
dispersión acuosa de partículas reticuladas de
carboximetilcelulosa.
Se emulsionaron soluciones acuosas de
poli(alcohol vinílico) (10%) y metilcelulosa (5%) conteniendo
cada una glutaraldehído en o-xileno que contenía
SPAN 60 al 10% o 15% en proporciones de solución
polimérica/o-xileno de 1:1 y 1:2 y se dejó
reaccionar a temperatura ambiente en botellas cerradas. 10 g de
metilcelulosa al 5% y 6,0 g de glutaraldehído (%) fallaron a la hora
de reaccionar después de 14 horas a temperatura ambiente o 30
minutos a 60ºC. 10 g de metilcelulosa al 5% se emulsionaron en 10 g
de o-xileno que contenía SPAN 60 al 10%, con y sin
1,0 g de glutaraldehído, también falló para a la hora de reaccionar
a temperatura ambiente. 10 g de metilcelulosa al 5% emulsionada en
30 g de o-xileno que contenía 15 g de SPAN 60 con y
sin 1,0 g de glutaraldehído al 25%, dio resultados ligeramente
mejores. De manera similar, 20 g de PVA al 15% con 10 g de
glutaraldehído al 25% falló a la hora de reaccionar después de 14
horas a temperatura ambiente.
Generalmente, el CYMEL 300 mostró una solubilidad
significativa en el o-xileno así como el ácido
p-tolueno sulfónico. A 40ºC, el CYMEL 300 polimerizó
en o-xileno para formar un precipitado. En
contraste, el glutaraldehído no se disolvió en el
o-xileno, incluso a 60ºC. El emulsionante TETRONIC
1102 de agua en aceite fue eficaz en la emulsión de metilcelulosa en
o-xileno. TRITON X-405 (HLB 17,9)
fue eficaz a la hora de invertir estas emulsiones estabilizadas con
TETRONIC 1102 en agua. Ni la metilcelulosa y ni PVA reaccionaron con
glutaraldehído en 14 horas a temperatura ambiente o dos horas a
70ºC. La combinación de PVA o metilcelulosa y glutaraldehído con
unas pocas gotas de ácido clorhídrico reaccionó después de
1,5-2,0 horas a 100ºC.
Las Tablas XX y XIX muestran que la reticulación
de sulfato de condroitina con el agente de reticulación
XAMA-7 no dio el gel de sulfato de condroitina
hidrófilo desead (como lo hizo con alginato sódico) incluso a
proporciones en peso pajas de sulfatos de
condroitina/XAMA-7. En lugar de ello, se formó un
precipitado blanco amorfo. La Tabla XX muestra la disminución de la
concentración de XAMA-7 a concentración constante de
sulfato de condroitina (pH 7,5) para dar proporciones de sulfato de
condroitina/XAMA-7 de 2,0-4,0 y
también un precipitado blanco amorfo. La cantidad de este
precipitado disminuyó con el aumento de la proporción de sulfato de
condroitina/XAMA-7.
| Sulfato de Condroitina | CS | Agua* | XAMA-7 | CS/XAM-7 | Tiempo | ||
| N^{o} de Experimento | (%) | (g) | (g) | (g) | Proporción | Resultados** | (h) |
| CSX-071 | 7 | 0,219 | 2,906 | 0,219 | 1,0 | precipitación | >0,8 |
| CSX-072 | 7 | 0,219 | 2,906 | 0,175 | 1,3 | precipitación | >0,8 |
| CSX-073 | 7 | 0,219 | 2,906 | 0,146 | 1,5 | precipitación | >0,8 |
| CSX-074 | 7 | 0,219 | 2,906 | 0,125 | 1,8 | precipitación | >0,8 |
| CSX-075 | 7 | 0,219 | 2,906 | 0,110 | 2,0 | precipitación | >0,8 |
| CSX-076 | 7 | 0,219 | 2,906 | 0,0735 | 3,0 | precipitación | >24 |
| CSX-077 | 7 | 0,219 | 2,906 | 0,0540 | 4,0 | precipitación | >24 |
| CSX-078 | 8 | 0,219 | 2,906 | 0,0438 | 5,0 | precipitación | >24 |
| * pH 7,5 | |||||||
| ** formación de precipitado blanco amorfo, gelificación no visible |
Este precipitado blanco amorfo se atribuyó a la
formación de un gel duro inelástico por reticulación del sulfato de
condroitina de bajo peso molecular. Esta muestra de sulfato de
condroitina pareció tener un peso molecular menor que el alginato
sódico o las muestras de ácido hialurónico usada anteriormente, y su
solución al 10% tenía una baja viscosidad.
Cuando el alginato sódico se sustituyó con el
sulfato de condroitina en el procedimiento usado para preparar
microesferas hidrófilas de alginato sódico, el producto parecía un
látex inverso más que una suspensión inversa. La estructura
molecular del sulfato de condroitina contiene un grupo -OSO_{3}Na
además de los grupos carbonilo e hidroxilo. Esta es la diferencia
principal entre el sulfato de condroitina y el ácido hialurónico y
alginato sódico, que dieron resultados diferentes. Cuando 3 g de
agua se agitaron con 3 g de tolueno en un pequeño vial, y 0,15 g de
sulfato de condroitina se añadieron, se formó una emulsión de
aceite en agua. A pH mayor de 10, este efecto fue más pronunciado.
Por lo tanto, el sulfato de condroitina es un polisacárido especial
comparado con ácido hialurónico y alginato sódico; actuaba como
emulsionante en solución alcalina debido al grupo -OSO^{3}Na.
| Sulfato de Condroitina | CS | Agua* | XAMA-7 | CS/XAM-7 | Tiempo | |
| N^{o} de Experimento | (%) | (g) | (g) | (g) | Proporción | Resultados** |
| CSX-082 | 8 | 0,250 | 2,875 | 0,1261 | 2,0 | ++++ |
| CSX-083 | 8 | 0,250 | 2,875 | 0,0855 | 3,0 | +++ |
| CSX-084 | 8 | 0,250 | 2,875 | 0,0625 | 4,0 | ++ |
| CSX-085 | 8 | 0,250 | 2,875 | 0,0500 | 5,0 | + |
| * pH 8,5 | ||||||
| ** formación de precipitado blanco amorfo, gelificación no visible |
Ácido hialurónico (0,14 g) se disolvió en 2,0 g
de agua para dar un gel transparente semisólido al 7%. Este gel se
diluyó con 2,0 g de agua para dar un gel inmóvil al 3,5%. Cuando 1,0
g de este gel de ácido hialurónico al 3,5% se diluyeron con 1,5 g de
agua, dio un líquido viscoso que fluyó lentamente cuando se
invirtió. El agente de reticulación XAMA-7 (0,15 g)
se añadió para dar una proporción de ácido
hialurónico/XAMA-7 de 0,23; después de 30 minutos,
se formó un gel blanco elástico.
La Tabla XXII muestra que el intervalo de pH
7-9 fue favorable para la reticulación del ácido
hialurónico pero que el intervalo de pH de 12-13 no
fue favorable. La Tabla XXIII muestra que las proporciones de ácido
hialurónico/XAMA-7 menores de
0,2-0,4 dieron los mejores geles para la preparación
de las microesferas reticuladas de ácido hialurónico; proporciones
mayores de 0,6-2,0 dieron peores geles que no fueron
satisfactorios para las microesferas y proporciones de
1,5-2,0 dieron geles inelásticos e inmóviles después
de 24 horas a temperatura ambiente.
La Tabla XXIV, que usó un ácido hialurónico de
bajo peso molecular (0,75x10^{6}) mostró diferentes resultados. El
ácido hialurónico de alto peso molecular tiene que usarse a una
concentración de 1,5%; concentraciones superiores dieron geles
inmóviles. El ácido hialurónico de menor peso molecular se usó una
concentración del 2,5%. Esto dio una solución móvil. Mayores
concentraciones tales como 3,5% dieron geles y móviles. La
proporción óptima de ácido hialurónico/XAMA-7 para
producir un elastogel fue de 0,5 para el ácido hialurónico de menor
peso molecular y de 0,25 para el de mayor peso molecular. Fue
necesario más XAMA-7 para reticular el ácido
hialurónico de bajo peso molecular a un elastogel adecuado que para
el ácido hialurónico de alto peso molecular. Esta tendencia era de
esperar: cuanto menor sea el peso molecular, mayor será el número de
reticulaciones necesarias para la insolubilidad. Puede haber alguna
reticulación intramolecular del ácido hialurónico de alto peso
molecular.
| Ácido hialurónico | ||||||||
| XAMA-7 | HA/XAMA-7 | Tiempo de | Tiempo de | |||||
| HA | Agua* | Turbidez** | Gelificación | |||||
| N^{o} de Experimento | (%) | (g) | (g) | pH | (g) | Proporción | (min) | (min) |
| HAX-1513 | 1,5 | 0,0450 | 3,0025 | 13 | 0,0490 | 0,92 | - | - |
| HAX-1512 | 1,5 | 0,0450 | 3,0011 | 12 | 0,0457 | 0,99 | - | - |
| HAX-1511 | 1,5 | 0,0450 | 3,0078 | 11 | 0,0452 | 1,0 | 85 | 420 |
| HAX-1510 | 1,5 | 0,0450 | 3,0000 | 10 | 0,0450 | 1,0 | 60 | 150 |
| HAX-1509 | 1,5 | 0,0450 | 3,0000 | 9 | 0,0458 | 0,98 | 60 | 130 |
| HAX-1508 | 1,5 | 0,0450 | 3,0010 | 8 | 0,0455 | 0,93 | 60 | 120 |
| HAX-157 | 1.5 | 0,0450 | 3,0021 | 7 | 0,0450 | 1,0 | 60 | 120 |
| * 1,2x10^{6} | ||||||||
| ** formación de un precipitado turbio |
\vskip1.000000\baselineskip
| Ácido hialurónico | ||||||||
| XAMA-7 | HA/XAMA-7 | Tiempo de | Tiempo de | |||||
| HA | Agua* | Turbidez | Gelificación | |||||
| N^{o} de Experimento | (%) | (g) | (g) | pH | (g) | Proporción | (min) | (min) |
| HAX-15820 | 1,5 | 0,0458 | 3,0050 | 8 | 0,0229 | 2,0 | >180 | >1400*** |
| HAX-15817 | 1,5 | 0,0454 | 3,0053 | 8 | 0,0270 | 1,75 | 100 | >1440*** |
| HAX-15815 | 1,5 | 0,0454 | 3,0021 | 8 | 0,0303 | 1,5 | 80 | >1440*** |
| HAX-15810 | 1,5 | 0,0456 | 3,0000 | 8 | 0,0454 | 1,0 | 60 | 120 |
| HAX-15808 | 1,5 | 0,0456 | 3,0023 | 8 | 0,0563 | 0,8 | 60 | 120 |
| HAX-15806 | 1,5 | 0,0456 | 3,0029 | 8 | 0,0750 | 0,6 | 60 | 120 |
| HAX-15805 | 1,5 | 0,0459 | 3,0010 | 8 | 0,0900 | 0,5 | 60 | 120 |
| HAX-15804 | 1,5 | 0,0460 | 2,9997 | 8 | 0,1121 | 0,4 | 45 | elastogel |
| HAX-15802 | 1,5 | 0,0452 | 3,003 | 8 | 0,2250 | 0,2 | 40 | elastogel |
| * 1,2 x 10^{6} | ||||||||
| ** tiempo para formar un precipitado blanco, turbio | ||||||||
| *** inelástico, gel movible |
| Ácido hialurónico | ||||||||
| XAMA-7 | HA/XAMA-7 | Turbidez de | Tiempo de | |||||
| Gelificación | Gelificación** | |||||||
| HA | Agua* | ..... | ||||||
| N^{o} de | (%) | (g) | (g) | pH | (g) | Proporción | (min) | (min) |
| Experimento | ||||||||
| 25815 | 2,5 | 0,0769 | 3,000 | 8 | 0,0522 | 1,5 | 50 | >180 |
| 25812 | 2,5 | 0,0769 | 3,000 | 8 | 0,0641 | 1,2 | 50 | >180 |
| 25810 | 2,5 | 0,0769 | 3,000 | 8 | 0,0760 | 1,0 | 50 | 180 |
| 25808 | 2,5 | 0,0769 | 3,000 | 8 | 0,0983 | 0,8 | 50 | 130 |
| 25805 | 2,5 | 0,0769 | 3,000 | 8 | 0,1526 | 0,5 | 50 | 60*** |
| * 0,75 x 10^{6} | ||||||||
| ** en minutos | ||||||||
| *** elastogel |
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon microesferas de ácido hialurónico
usando el mismo procedimiento usado para preparar las microesferas
de alginato sódico. En primer lugar se añadió hidróxido amónico para
elevar el pH de la solución de ácido hialurónico a
10-11; la solución se emulsionó después en tolueno
para dar las gotas deseadas. Después, el agente de reticulación
XAMA-7 se añadió y el pH se disminuyó a
8-9 usando ácido acético. El sistema se dejó después
reticular después a temperatura ambiente durante 4 ó 24 horas;
después, se añadió el agente de deshidratación isopropanol. La
muestra formó dos capas: la capa superior se separó y se lavó con
metanol para dar una sola fase sin microesferas. El fallo a la hora
de producir microesferas se atribuyó a la proporción 1,75 o 2,0 de
ácido hialurónico/XAMA-7 y al alto peso molecular
del ácido hialurónico (1,2 x 10^{6}). Una concentración de ácido
hialurónico al 3,5% dio un gel inmóvil. Una solución del 1,5% de
ácido hialurónico fue suficientemente viscosa para hacer inversas
las gotas en presencia del emulsionante Span 60 en solución de
tolueno. Esta fue la razón principal por la que la soluciones
poliméricas de baja concentración requirieron una alta
concentración de agente de reticula-
ción.
ción.
Para preparar microesferas de gel hidrófilas de
ácido hialurónico, se dispersaron 100 g de solución acuosa que
contenía 1,5 g de ácido hialurónico se dispersaron en 100 g de
tolueno que contenía Span 60 al 1,0% p/p usando un agitador mecánico
a miles de PM durante 15 minutos. Después, 6,0 g de agentes de
reticulación XAMA-7 se añadieron, la dispersión se
agitó durante 5 horas más, después de lo cual se añadieron 100 ml de
agente deshidratante isopropanol para endurecer adicionalmente las
microesferas formadas. La capa superior de la mezcla
tolueno/isopropanol se separó por decantación. Las microesferas se
lavaron dos veces con 200 ml de isopropanol, se separaron por
ultracentrifugación y se secaron en un horno de aire a 75ºC.
La Tabla XXV muestra que, para un mayor peso
molecular (1,2 x 10^{6}), la proporción en peso de ácido
hialurónico/agente de reticulación XAMA-7 y el pH
del sistema fue importante: proporciones de ácido
hialurónico/XAMA-7 menores de 0,25 y control de pH
primero a 10-11 para preparar la emulsión, después a
8-9 para la etapa de reticulación, fueron necesarias
para dar las microesferas deseadas. Las proporciones de ácido
hialurónico/XAMA-7 mayores de 0,5 tales como 1,25 o
1,75 (experimentos HAB-01 y -02) no dieron las
microesferas deseadas. Si el pH del sistema se mantuviera a
7-8, las microesferas se reticularían aunque
fácilmente se pegarían unas a otras.
La Tabla XXVI muestra que el ácido hialurónico de
bajo peso molecular (0,75 x 10^{6}) dio microesferas esféricas a
una proporción de ácido hialurónico/XAMA-7 de 0,5.
La mayoría de estas microesferas esféricas fue menor de 212
micrómetros.
El peso molecular del ácido hialurónico usado en
la Tabla XXV (1,2 x 10^{6}) fue mayor que el usado en la Tabla
XXVI (0,75 x 10^{6}). Se necesitó más XAMA-7 para
reticular esté ácido hialurónico de mayor peso molecular que para el
ácido hialurónico de menor peso molecular. Esta tendencia fue la
opuesta a la esperada y se atribuyó a la posible reticulación
intramolecular del ácido hialurónico de mayor peso molecular. Las
microesferas de gel elástico deseadas se obtuvieron en ambos
casos.
\newpage
El secado de las microesferas también era
importante: después de lavar las microesferas con el agente
deshidratante isopropanol, cinco gotas de la suspensión se pusieron
en un portaobjetos de vidrio y se calentaron en un horno de aire a
75ºC; cuando el agua se evaporó, las microesferas generalmente eran
de menor tamaño, con superficies suaves comparadas con las de la
muestra completa secada en el horno. La eficacia del método de
secado debe investigarse adicionalmente. Un secador de lecho
fluidizado puede ser necesario para secar las microesferas a mayor
escala.
| N^{o} de Experimento | HAB-01 | -02 | -03 | -04 |
| Fase acuosa (g) | ||||
| Ácido hialurónico | 1,5 | 1,5 | 1,5 | 1,5 |
| Agua | 100 | 100 | 100 | 100 |
| pH** | 7-8 | 7-8 | 7-8 | 10-12 |
| Fase oleosa (g) | ||||
| Tolueno | 100 | 100 | 100 | 100 |
| Span | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| Agente de Reticulación (ml) | ||||
| XAMA-7 | 0,67 | 1,1 | 5,0 | 5,0 |
| 0,80 g | 1,3 g | 6,0 g | 6,0 g | |
| Proporción HA/XAMA-7 | 1,75 | 1,25 | 0,25 | 0,25 |
| pH** | 7-9 | 7-9 | 7-9 | 7-9 |
| Velocidad de Agitación (rpm) | 1000 | 800 | 1000 | 1000 |
| Tiempo de Reacción (h) | 5 | 13 | 5 | 12 |
| Agente de deshidratación | ||||
| Isopropanol (ml) | 100 | 100 | 2 x 200 | 2 x 200 |
| Metanol (ml) | 100 | 100 | - | - |
| Forma de la partícula | Líquida | Líquida | Agregada | Esférica |
| Microesfera (%) | - | - | - | |
| \hskip0.5cm a. >150 \mum | - | - | - | 11,5 |
| \hskip0.5cm b. 150-212 \mum | - | - | - | 12,6 |
| \hskip0.5cm c. 212-150 \mum | - | - | 69,7 | 68,8 |
| \hskip0.5cm d. <150 \mum | - | - | 30,3 | 7,0 |
| * 1,2 x 10^{6} | ||||
| ** pH ajustado con hidróxido amónico concentrado o ácido acético |
| N^{o} de Experimento | LHAB-01 | -02 | |
| Fase acuosa (g) | |||
| LHA | 2,5 | 2,5 | |
| Agua | 100 | 100 | |
| pH** | 10-11 | 10-11 | |
| Fase oleosa (g) | |||
| Span 60 | 1,0 | 1,0 | |
| Tolueno | 100 | 100 | |
| Agente de Reticulación (ml) | |||
| XAMA-7 | 4,2 | 4,2 | |
| 5,0 g | 5,0 g | ||
| Proporción en peso LHA/XAMA-7 | 0,5 | 0,5 | |
| pH** | 8-9 | 8-9 |
| N^{o} de Experimento | LHAB-01 | -02 |
| Velocidad de Agitación (rpm) | 1000 | 1000 |
| Tiempo de Reacción (h) | 12 | 12 |
| Agente de deshidratación (ml) | ||
| Isopropanol | 2 x 200 | 2 x 200 |
| Forma de la Partícula | Esférica | Esférica |
| Microesfera (%) | ||
| \hskip0.5cm a. >250 \mum | 5,9 | 23,9 |
| \hskip0.5cm b. 250-212 \mum | 6,9 | 3,4 |
| \hskip0.5cm c. 212-150 \mum | 35,3 | 24,2 |
| \hskip0.5cm d. <150 \mum | 51,2 | 48,6 |
| * 0,75 x 10^{6} | ||
| ** pH ajustado con hidróxido amónico concentrado o ácido acético |
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra una producción de tamaño de
lote de 500 ml de microesferas.
- Solución A:
- Disolver 15,00 g de NaOH en 500 ml de agua destilada y desionizada.
- Solución I:
- Mezclar 0,5 g de ácido hialurónico con 25 ml de solución A en un tubo de ensayo de 50 ml.
- Solución B:
- Mezclar 9,0 g de monoestearato de sorbitano (Span-60) en 150 ml de tolueno en un botella de vidrio de 500 ml.
- Solución II:
- Añadir 10 ml digicidil éter de etilenglicol (EGDGE) u otro agente de reticulación de tipo diepóxido a la solución B.
- Etapa 1:
- Verter la solución I en un reactor de fondo redondo de vidrio indentado de tres bocas de 500 ml que se pre-equilibró a 25ºC \pm 2ºC.
- Etapa 2:
- Ajustar la velocidad de agitación de un eje agitador a 500 rpm \pm 10 rpm; permitir la agitación continua durante 20 minutos \pm 2 minutos.
- Etapa 3:
- Añadir 0,5 ml monooletado de polioxietileno [20] sorbitano (Tween-80) en el reactor.
- Etapa 4:
- Continuar agitando durante 10 minutos \pm 1, añadir 5,0 ml de agente de reticulación (EGDGE) al reactor. (Nota: esto es adicional al agente de reticulación usado en la solución 2.
- Etapa 5:
- Continuar mezclando durante 10 minutos \pm 2 minutos, después verter la solución 2 en el reactor.
- Etapa 6:
- Aumentar la velocidad de agitación inmediata en 20 hasta 1000 RPM \pm 50 RPM.
- Etapa 7:
- Detener la agitación y cesar el experimento a las 9,0 horas \pm 30 minutos.
- Etapa 8:
- Añadir 300 ml de metanol a la suspensión de gel resultante y agitar continuamente durante 15 minutos \pm 2 minutos a 1000 RPM \pm 50 RPM.
- Etapa 9:
- Detener el lavado, retirar cuidadosamente el aparato agitador de la solución del reactor y después separar las perlas de la solución de gel por filtración al vacío.
- Etapa 10:
- Lavar las perlas con 400 ml de acetona y continuar el vacío durante 5-8 minutos.
- Etapa 11:
- Reconstituir las perlas con 2 l de agua destilada desionizada y agitar a 100 rpm, 20-24ºC durante una noche.
- Etapa 12:
- Tamizar las perlas usando el Tamizador de Ensayo Estándar de Estados Unidos para el intervalo de tamaño deseado de 20 a 90 \mum.
- Etapa a:
- Lavar 10 ml de perlas empaquetadas por gravedad con 100 ml de agua tres veces.
- Etapa b:
- Suspender las perlas lavadas en 100 ml de agua y ajustar el pH a 4,0-4,5.
- Etapa c:
- Disolver 0,5 mg de Moléculas Bioactivas en 2,0 ml de agua y ajustar el pH a 4,0-4,5.
- Etapa d:
- Añadir 2,5 mmol (aproximadamente 500 mg) de Agente de Acoplamiento a la suspensión de perlas y mantener el pH a 4,0-4,5.
- Etapa f:
- Añadir inmediatamente la solución de molécula bioactiva a la suspensión de perlas y mantener el pH a 4,0-4,5.
- Etapa g:
- Poner la suspensión de perlas en un agitador y agitar durante 4 horas a temperatura ambiente.
- Etapa h:
- Lavar el gel secuencialmente con 2 x 100 ml de agua, 100 ml de ácido acético 0,1 M, 100 ml de agua, 100 ml de NaOH 0,1 M, 100 ml de NaCl 0,5 M y 100 ml de PBS.
- Etapa i:
- Almacenar las perlas acopladas con la molécula bioactiva en PBS que contenía agentes antimicrobianos a 4ºC.
Las microesferas de polisacáridos se prepararon
de acuerdo con el proceso del Ejemplo 29. Las microesferas que
variaban en tamaño de 10 \mum a 200 \mum se prepararon usando
alginato de diversas formulaciones, sulfato de condroitina,
hialuronatos con diferentes pesos moléculas, inulina y
hidroxipropilmetilcelulosa reticulada (HPMC) - un implante de
"tipo fibra" (es decir no esférico) se preparó también de
acuerdo con el proceso del Ejemplo 29 usando
hidroxipropilmetilcelulosa. El tamaño, rigidez y características
reológicas de las microesferas se controlaron fácilmente variando
los parámetros de proceso.
- Acuoso:
- 1 gramo de HPMC en 50 ml de NaOH 0,5 M + 30 gramos de EGDGE + 3,2 gramos de Tween 80
- Orgánico:
- 100 ml de tolueno
- Reacción:
- Mezclar el orgánico en el acuoso, después de mezclar bien se añadieron 51,02 gramos de EGDGE. Agitar toda la noche
- Reacción final:
- 20 ml de NaOH 0,5 M + 5 gramos de EGDGE se añaden. Calentar el sistema a 70ºC durante dos horas. Calentar a temperatura ambiente
- Purificación:
- Lavar con 1-propano 3 veces, lavar con acetona una vez, lavar con agua desionizada tres veces
- Despirogenación:
- Usar NaOH 1,0 M durante una noche a temperatura ambiente
- Almacenamiento
- PBS despirogenado
Solución acuosa: 1,0 g de hialuronato sódico en
50 ml de NaOH 0,75 M + 3 ml de Tween 80.
Solución orgánica: 150 ml de tolueno + 9 ml de
Trioleato de Sorbitán (SPAN 85).
Reacción: Añadir 25 ml diglicidil éter de
etilenglicol (EGDGE) a la solución acuosa cuando el hialuronato
sódico estaba completamente disuelto en solución acuosa en un
reactor puesto en un baño de agua a 70ºC. La solución orgánica se
añadió después de disolver EGDGE en solución acuosa. El reactor se
enfrió a temperatura ambiente 30 minutos después de la adición de la
solución orgánica. Añadir 75 ml de EGDGE y continuar agitando
durante una noche.
Purificación: Lavar en 1-propanol
(3 veces el volumen del gel) 3 veces, acetona (3 veces el volumen
del gel) 2 veces, agua destilada (5 veces el volumen de gel) 2
veces. Las perlas se llevaron a ebullición en H_{2}O destilada
durante 30 minutos.
Solución acuosa: 1,0 Sulfato de Condroitina A en
50 ml de NaOH 0,75 M + 3 ml de Tween 80.
Solución orgánica: 150 ml de tolueno + 9 ml de
trioleato de sorbitano (SPAN 85).
Reacción: añadir 25 ml de diglicidil éter de
etilenglicol (EGDGE) a la solución acuosa cuando el sulfato
condroitina A estaba completamente disuelto en solución acuosa en un
reactor situado en un baño de agua a 70ºC. La solución orgánica se
añadió después de que disolviera el EGDGE en solución acuosa. El
reactor de enfrió a temperatura ambiente 30 minutos después de la
adición de solución orgánica. Añadir 75 ml de EGDGE y continuar
agitando durante una noche.
Purificación: lavar en 1-propanol
(3 veces el volumen del gel) 3 veces, acetona (3 veces el volumen
del gel) 2 veces, H_{2}O destilada (5 veces el volumen del gel) 2
veces. Las perlas se llevaron a ebullición en H_{2}O destilada
durante 30 minutos.
Solución acuosa: 1,0 g de inulina en 50 ml de
NaOH 1 M + 3 ml de Tween 80.
Solución orgánica: 200 ml de tolueno + 12 ml de
SPAN 85 (Trioleato de Sorbitan) + 20 ml de EGDGE (diglicidil éter de
etilenglicol).
Reacción: añadir 35 ml de EGDGE a la solución 1,
después 178 ml de solución II se añadieron inmediatamente a la
solución I después de disolver EGDGE en la solución I. Agitar
durante \sim 40 horas.
Purificación: lavar en 1-propanol
(2 veces el volumen del gel) 4 veces, acetona (2 veces el volumen
del gel) 2 veces, H_{2}O destilada (5 veces el volumen del gel) 5
veces. Las perlas se llevaron a ebullición en H_{2}O destilada
durante 30 minutos.
Despirogenación: usar NaOH 0,5 M, durante una
noche a temperatura ambiente.
Solución acuosa: 1,0 g de alginato en 50 ml de
NaOH 0,5 M + 3 ml de Tween 80.
Solución orgánica: 150 ml de tolueno + 6 ml de
trioleato de sorbitano (SPAN 85).
Reacción: añadir 10 ml de diglicidil éter de
etilenglicol (EGDGE) a la solución acuosa cuando el alginato estaba
completamente disuelto en solución acuosa en un reactor situado en
un baño de agua a 70ºC. La solución acuosa se añadió después de
disolver el EGDGE en solución acuosa. El reactor de enfrió a
temperatura ambiente 30 minutos después de la adición de la solución
orgánica. Añadir 30 ml de EGDGE y continuar agitando durante
una
noche.
noche.
Purificación: lavar en lavar en
1-propanol (3 veces el volumen del gel) 3 veces,
acetona (3 veces el volumen del gel) 2 veces, H_{2}O destilada (5
veces el volumen del gel) 2 veces. Las perlas se llevaron a
ebullición en H_{2}O destilada durante 30 minutos.
Las microesferas producidas en el Ejemplo 30
pasaron los ensayos de citotoxicidad, esterilidad y pirogenicidad y
se descubrió que eran sustancialmente no tóxicas.
Se realizaron ensayos de inmunogenicidad en dos
lotes diferentes de microesferas de alginato y las microesferas de
hialuronato producidas en el Ejemplo 31 implantando en animales.
Estas microesferas suscitaron sólo una respuesta inmunológica mínima
en los animales implantados.
Se realizó un ensayo en inflamación aguda sobre
microesferas producidas de acuerdo con el Ejemplo 30. Todos los
materiales se inyectaron fácilmente a la cavidad peritoneal de
ratones. No se observaron signos de mortalidad, morbilidad o
toxicidad o cualquier otro síntoma de dolor en los animales de
ensayo. El ensayo puso de manifiesto que el tipo, no la forma de
material implantado afecta en menor medida a las respuestas
celulares inflamatorias de los hospedadores a los implantes. Los
geles de hidroxipropilmetilcelulosa reclutaron más neutrófilos que
otros materiales. Las microesferas de hialuronato atrajeron más
monocitos/macrófagos transitorios que otros materiales
ensaya-
dos.
dos.
Ensayos de implantación crónica usando las
microesferas del ejemplo 32 mostraron que no había reacción tisular
sistémica o local adversa a los implantes. Las microesferas
retuvieron su forma y tamaño en el sitio de implante.
Se descubrió que las microesferas del Ejemplo 32
se extruían fácilmente en agujas hipodérmicas de calibre 22 a 28 y
se suministraron a los tejidos. No hubo incisión quirúrgica o
procedimiento complicado no fue necesario para la implantación. El
implante y tejido circundante mostró que no había signos de rojez,
irritación o hinchamiento.
En este ejemplo, el tamaño de lote fue de 22
litros, el polímero hidrófilo fue ácido hialurónico, la fase
orgánica fue tolueno, los agentes de emulsionantes fueron una
combinación de SPAN 60 y TWEEN 80 y el agente de reticulación
diglicidil éter de etilenglicol (un reticulante de tipo diepóxido
que reticula a través de grupos OH).
La velocidad de agitación fue sólo de 400 rpm
(una velocidad suficientemente rápida para mezclar los reactivos,
permitir la formación y una emulsión estable aunque no tan rápida
como para crear una tensión mecánica excesiva y provocar la cizalla
y rotura de la reticulación.
La reacción se realizó a 25ºC y el pH se ajustó a
7,4 después de la reticulación. El tiempo de reacción fue de 8,5
horas después de los cual se lavó con metanol, acetona y después se
resuspendió en solución salina tamponada con fosfato.
La reacción produjo partículas que tenía tamaño
en el intervalo de 10 \mum a 50 \mum, con aproximadamente el
75% de las partículas siendo de 30 \mum.
Las micropartículas presentaron una estabilidad
excelente. Bajo una fuerza de cizalla alta constante generada por
agitación a 34,0 litros/segundo mezclando durante 2 horas, la
viscosidad aparente cambio sólo ligeramente (aproximadamente 2,9%).
La viscosidad caería significativamente (por ejemplo más del 10%) si
las partículas se degradaran en partículas menores y fragmentos de
partícula.
Las partículas formadas en este ejemplo fueron
sorprendentemente fáciles de extruir a través de una aguja de
calibre 22, que requería menos de 5 libras por pulgada
cuadrada.
Se suspendieron perlas de Sephadex de diferentes
tamaños y rigideces en hialuronato no reticulado en solución salina
(1 mg/ml) o soluciones salinas solas y se compararon las fuerzas de
extrusión entre las dos. No se descubrió diferencia entre las
suspensiones de Sephadex con o sin hialuronato, lo que demuestra
que el hialuronato no funciona como adyuvante de suministro cuando
se mezcla con microesferas inyectables.
Incluso el hialuronato no reticulado funcionaba
como adyuvante de inyección, se descubrió que era un ingrediente
útil para implantes inyectables debido a la reducción de respuestas
inflamatorias en el hospedador a los materiales de implante. Por lo
tanto, materiales como Sephadex o cualquier otras microesferas de
polisacáridos reticuladas que pueden no ser biocompatibles
inherentemente al hospedador, pueden emplearse como materiales de
implante cuando se usan junto con hialuronato.
Se postula que el hialuronato puede
"enmascarar" el material de microesfera de implante, evitando
de esta manera las células inflamatorias del hospedador (es decir,
neutrófilos, macrófagos y monocitos) del reconocimiento y respuesta
inmunológica a los mismos. Posteriormente la implantación, cuando el
hialuronato está probablemente degradado, la fase de regeneración
tisular ha comenzado y las células inflamatorias pueden no jugar
más un papel en el sitio de implante.
\vskip1.000000\baselineskip
I. Objetivo - Para deshidratar las
perlas Sephadex en una solución de hialuronato en PBS igual a 1 mg
de hialuronato
{}\hskip0.22cm por ml de PBS.
{}\hskip0.22cm por ml de PBS.
II. Propósito ayudar a la
lubricación de las perlas para facilitar el flujo a través de la
aguja.
\newpage
Instron serie 4200 Interface con célula de carga
del N 2418-80
Placa de Compresión superior para Instron
Jeringuillas de 30 cc (dos para cada ensayo)
Jeringuillas de 3 cc - Becton Dickinson Nº de
Catálogo 9585 (una para cada ensayo 3 cc de material de ensayo)
Agujas de 22G/l pulgadas - Becton Dickinson Nº de
Catálogo 5155
Estante de secado para agujas transuretrales
Equilibrio analítico
(RR-0026/Cal. Due
7-29-96)
Rejilla de tubos de ensayo
Tapones de goma para las jeringuilla
Accesorios macho/hembra
Lure-Lok
\vskip1.000000\baselineskip
Sephadex G-200-50
- Sigma (Nº de lote 64H1244)
Sephadex G-75-50
- Sigma (Nº de lote 75H907)
Sephadex G-50-50
- Sigma (Nº de lote 124H0078)
Sephadex G-25-50
- Sigma (Nº de lote 12H1057)
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco
sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio
Sigma - Nº de Catálogo D-5527, Nº
de lote 44H4646, Exp. 05/96
Hialuronato sódico
Life Core - Nº de Catálogo
1011-1100, Nº de lote
1-91323-1
\vskip1.000000\baselineskip
A. Preparar la solución de hialuronato en
PBS.
- 1)
- 0,210 g de hialuronato se añadieron a 210 ml de PBS.
- 2)
- Poner en una placa de agitación y agitar con agitador magnético hasta que esté completamente en solución.
B. Preparar jeringuillas de 30 cc.
- 1)
- Retirar el émbolo
- 2)
- Tapar el fondo con un tapón de goma.
- 3)
- Etiquetar con el tipo de Sephadex que se añade.
C. Añadir 10 cc de la solución apropiada a cada
jeringuilla.
D. Pesar 0,5 g de Sephadex para cada jeringuilla
y añadir a la jeringuilla.
E. Llevar a un volumen de 30 cc con la solución
apropiada.
F. Volver a poner suavemente el émbolo en su
sitio.
G. Invertir la jeringuilla retirar el tapón de
goma y expulsar el aire atrapado.
H. Sustituir el tapón y dejar reposar en el
émbolo en la rejilla de tubos de ensayo durante una noche.
I. Registrar la cantidad total de perlas
hinchadas.
J. Retirar el tapón y empujar la porción líquida
que no contiene Sephadex.
K. Enganchar el accesorio macho/macho en el
extremo de la jeringuilla.
L. Enganchar la segunda jeringuilla de 30 cc a la
muestra.
M. Mezclar la muestra empujando hacia atrás y
hacia delante entre las dos jeringuillas cinco veces.
N. Retirar la segunda jeringuilla de 30 cc.
O. Usar el ajuste para transferir la muestra a
jeringuillas de 3 cc, 3 cc por jeringuilla.
P. Poner la aguja de 22 G en cada jeringuilla de
la muestra.
Q. Ensayar la capacidad de extrusión de la
máquina Instron
\vskip1.000000\baselineskip
Sephadex/Hialuronato
| Muestra de | Más o Menos | Volumen de perlas | Número de | Carga máxima en | Carga media entre |
| Sephadex | Hialuronato | empaquetas | jeringuillas | libras. media | límites. media |
| en CC | (desviación típica) | (desviación típica) | |||
| G-200-50 | Más | 15 | 5 | 1,221 (0,143) | 0,6657 (0,512) |
| G-200-50 | Menos | 16 | 5 | 1,269 (0,109) | 0,5877 (0,1444) |
| G-50-50 | Más | 6 | 2 | 1,299 (0,053) | 0,8455 (0,0980) |
| G-50-50 | Menos | 7 | 1 | 1,224 (***) | 1,019 (***) |
| G-25-50 | Más | 3 | 1 | 21,2 (***) | 3,363 (***) |
| G-25-50 | Menos | 3 | 1 | 1,272 (***) | 0,78 (***) |
| G-75-50 | Más | 9 | 3 | 1,174 (0,090) | 0,6244 (0,0843) |
| G-75-50 | Menos | 9 | 2 | 1,224 (0,016) | 0,774 (0,0129) |
\vskip1.000000\baselineskip
El hialuronato a ese nivel pareció tener un
efecto pequeño o ninguno sobre Sephadex. Una mayor concentración de
hialuronato podría dar un resultado más positivo.
Este estudio de implantación de 30 días mostró
que las microesferas de menor tamaño desencadenan respuestas menos
inflamatorias y por lo tanto son más deseables que las microesferas
de mayor tamaño cuando se usan como implante inyectable.
El objetivo de este estudio fue investigar si el
tamaño de partícula de las microesferas de polisacárido implantadas
influía a largo plazo sobre las respuesta inflamatorias y/o
fibróticas en un modelo de rata.
Ratas Sprague Dowley macho con buena salud, que
pesaban aproximadamente 100 gramos se usaron en el estudio.
1. Material de ensayo Nº A (animal A1):
- Gel hialurónico (tamaño de la perla <20 - >150 \mum)
2. Material de ensayo Nº B (animales B1 y
B2):
- Gel hialurónico (tamaño de perla 20-45 \mum)
3. Material de ensayo Nº C (animales C1 y
C2):
- Gel hialurónico (tamaño de perla 45-33 \mum)
4. Material de ensayo Nº D (animales D1 y
D2):
- Gel hialurónico (tamaño de perla 63-90 \mum)
5. Material de ensayo Nº E (animales E1 y
E2):
- Gel hialurónico (tamaño de perla 90 - \geq 150 \mum)
1. Las ratas Sprague Dawley macho (1 animal por
material de ensayo Nº A, 2 animales por grupo para los otros
materiales de ensayo en total 9 ratas) se adquirieron en Taconic
Farms (Germantown, NY) y se mantuvieron en las instalaciones de
Albany Medical College Animal Resource durante 7 días antes del
inicio del estudio.
2. Las ratas se anestesiaron con
quetamina-xilazina (quetamina 80 mg/kg de peso
corporal y xilazina 12 mg/kg de peso corporal) de acuerdo con
procedimientos estándar. Después se esquiló el pelo del lomo.
3. 0,5 ml del material de ensayo se inyectaron
(por inoculación subescapular) en ambos lados izquierdo y derecho
de cada animal.
4. Después de 30 días, las ratas se sacrificaron
por inhalación de CO_{2}. Los materiales implantados y los
tejidos que los rodean se recuperaron por disección cuidadosa y se
fijaron con Formalina.
5. El material fijado se embebió en un bloque de
parafina, se seccionó y se tiñó con hematoxilina y eosina.
Aproximadamente 0,5 ml de los materiales de
ensayo se administraron por vía subescapular a ambos lados
izquierdo y derecho del animal. Los pesos de los materiales
inyectados se midieron y se muestran en la Tabla 1.
Peso de los Materiales
Implantados en
Ratas
| Nº de ID | Peso izquierdo (gramos) | Peso derecho (gramos) |
| A-1 | 0,62 | 0,59 |
| B-1 | 0,61 | 0,53 |
| B-2 | 0,65 | 0,59 |
| C-1 | 0,58 | 0,54 |
| C-2 | 0,48 | 0,53 |
| D-1 | 0,46 | 0,55 |
| D-2 | 0,53 | 0,59 |
| E-1 | 0,61 | 0,53 |
| E-2 | 0,49 | 0,52 |
Después de la implantación, los animales se
observaron para respuestas tisulares visibles alrededor del sitio de
implantación. Éstas se registraron a las 1, 24, 72, y 144 horas
después de la inyección. Los sitios de inyección se graduaron en
una escala de 0 a 3 de la siguiente manera:
0 = Sin reacción
1 = Ligero enrojecimiento e hinchamiento sólo
sobre el implante
2 = Moderado enrojecimiento e hinchamiento sobre
el implante y tejidos circundantes
3 = Fuerte enrojecimiento e hinchamiento sobre el
implante y tejidos circundantes
\vskip1.000000\baselineskip
Respuestas Tisulares Visibles a
Materiales de Ensayo Implantados Ensayo Animal.
Puntuación
de las respuestas tisulares a los
materiales
| Nº | 1 hora | 24 horas | 72 horas | 144 horas | |
| A | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| B | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| B | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| C | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| C | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| D | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| D | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| E | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| E | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
\vskip1.000000\baselineskip
No se observaron respuestas inflamatorias
visibles externamente u otras respuestas tisulares negativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se midieron los pesos de los animales antes y 30
días después de la implantación. Los materiales de ensayo no tenían
un efecto obvio sobre el crecimiento de los animales de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Pesos y Cambio de Peso en
Animales
Implantados
| Nº de ID de la rata | Peso corporal (gramos) | ||
| Inicial | Final | Ganancia | |
| A-1 | 95,1 | 327,4 | 232,3 |
| B-1 | 84,5 | 311,7 | 227,2 |
| B-2 | 102,6 | 349,6 | 247,2 |
| C-1 | 108,6 | 333,5 | 224,9 |
(Continuación)
| Nº de ID de la rata | Peso corporal (gramos) | ||
| Inicial | Final | Ganancia | |
| C-2 | 100,6 | 334,1 | 233,5 |
| D-1 | 99,5 | 294,8 | 195,3 |
| D-2 | 94,4 | 324,7 | 230,3 |
| E-1 | 100,4 | 338,6 | 238,2 |
| E-2 | 98,4 | 308,6 | 210,2 |
Después de 30 días de implantación, los
materiales implantados se recuperaron, se fijaron y se embebieron
como se ha descrito anteriormente. Las muestras se seccionaron y se
tiñeron con hematoxilina y eosina. Las respuestas tisulares se
categorizaron de acuerdo con la extensión de respuesta corporal
ajena (fundamentalmente, los números de células corporales gigantes
presentes), fibrosis y extensión de la infiltración celular (en una
escala de 0 a 3):
- 0 = Sin respuesta visible
- 1 = Respuesta débil
- 2 = Respuesta moderada
- 3 = Respuesta fuerte
Nota: El grado 0-3 se diseñó con
propósito de comparación para diferenciar los 5 materiales
estudiados. Las interpretaciones para cada material de ensayo (a
continuación) son también con el mismo propósito. No hubo aparición
de ninguna reacción negativa en animales durante una implantación
de 30 días con cualquiera de los 5 materiales polisacárido. Los 5
materiales se consideran seguros para la implantación de
tejidos.
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo y Extensión de las
Reacciones Tisulares a los
Implantes
| Materiales de ensayo | Nº de muestras | Respuestas Corporales | Fibrosis | Filtración Celular |
| Ajenas | ||||
| A | 1 | 3+ | 1-2+ | 3+ |
| A | 2 | 3+ | 1+ | 3+ |
| B | 1 | 1-2+ | 2-3+ | 1+ |
| B | 2 | 1+ | 3+ | 0-1+ |
| C | 1 | 1-2+ | 1-2+ | 1-2+ |
| C | 2 | 1-2+ | 2+ | 1-2+ |
| D | 1 | 2+ | 2+ | 2+ |
| D | 2 | 2-3+ | 2+ | 2-3+ |
| E | 1 | 3+ | 2+ | 3+ |
| E | 2 | 3+ | 1-2+ | 3+ |
La reacción corporal ajena y la respuesta
inflamatoria crónica fueron bastante evidentes alrededor de los
implantes. Estaba presente tejido fibrótico significativo
(fibroblastos y fibrillas de colágeno) en las cápsulas alrededor
del implante. Un gran número de células corporales gigantes ajenas y
macrófagos habían penetrado el cuerpo de implantes y había envuelto
partículas individuales del material de ensayo.
Estos implantes desencadenaron sólo débiles
reacciones corporales ajenas. Estuvieron presentes fuertes
respuestas fibróticas, fundamentalmente una acumulación de un gran
número de fibroblastos y fibrillas de colágeno. Sin embargo, la
interacción entre la célula y el material se limitó a la interfaz
entre ellos y el tejido. La penetración celular en los intersticios
del cuerpo del implante fue mínima.
Se observaron respuestas corporales ajenas y
respuestas fibróticas moderadas alrededor de los implantes. Las
células corporales gigantes ajenas eran abundantes en la interfaz
material/tejido. La infiltración celular moderada también ocurrió
inmediatamente rodeando los implantes. Sin embargo, la mayoría de
las porciones internas del implante estaban libres de células
invasoras.
Los implantes provocaron respuestas corporales
periféricas ajenas y fibróticas moderadas. Sin embargo, un número
significativo de células corporales gigantes ajenas y macrófagos
penetraron en los implantes de material. Cabe destacar que se habían
desarrollado pequeños vasos sanguíneos (angiogénesis) en los
implantes.
Se encontraron fuertes reacciones corporales
ajenas y respuestas fibróticas moderadas en el tejido inmediatamente
adyacente a estos implantes. Aparecieron numerosas células
corporales gigantes ajenas en la mayoría de las áreas del y
adyacentes al implante.
Después de una implantación durante 30 días, los
diferentes materiales de ensayo desencadenaron distintas respuestas
tisulares tales como respuestas corporales ajenas, fibrosis e
infiltración celular. Los materiales de ensayo B y C desencadenaron
una respuesta inflamatoria débil y respuestas fibróticas moderadas.
En contraste, los materiales de ensayo A y E provocaron respuestas
inflamatorias notables. Las perlas de menor tamaño desencadenan sólo
respuestas inflamatorias débiles y, por lo tanto, son más deseables
que las perlas de mayor tamaño, que suscitan una fuerte respuesta
inmunológica, cuando se usan para la implantación.
El objetivo de este estudio es investigar si
diferentes materiales polisacárido reticulados preparados de
acuerdo con el proceso de la presente invención provocan respuestas
inflamatorias agudas en ratones.
1. Material de ensayo Nº 1: Fibra de
hidroxipropilmetilcelulosa (longitud 150-500
\mum, anchura 10 -20 \mum)
2. Material de ensayo Nº 2: Perlas de Inulina
(38-90 \mum)
3. Material de ensayo Nº 3: Perlas de Alginato
(38-90 \mum)
4. Material de ensayo Nº 4: Perlas de Sulfato de
Condroitina (38-90 \mum)
5. Material de ensayo Nº 5: Perlas de Ácido
Hialurónico (38-90 \mum)
6. Solución Salina
7. Zimosano A (1 mg/ml, de Saccharomyces
cerevisiae)
1. Los ratones Balb/c macho se adquirieron en
Taconic farm (Germantown, NY) y se aclimataron durante 7 días antes
de iniciar este estudio.
2. Después del procedimiento de implantación, se
inyectó 1 ml de materiales de ensayo al peritoneo de los
ratones.
3. Después de la implantación durante 24 horas,
los ratones se sacrificaron y las células peritoneales se
recuperaron después con 5 ml de solución salina tamponada con
fosfato.
4. El número de células inflamatorias
(especialmente neutrófilos y monocitos/macrófagos) y células totales
se determinó por las actividades enzimáticas celulares
específicas.
A. Registro de
Animales
| Materiales de ensayo | Nº de animal | Peso Corporal | Peso total | |
| Antes de la | Después de la | Inyectado | ||
| Implantación | Implantación | |||
| 1 | 1 | 21,84 gramos | 19,83 gramos | 1,012 gramos |
| 1 | 2 | 20,24 gramos | 18,46 gramos | 1,011 gramos |
| 1 | 3 | 20,63 gramos | 18,58 gramos | 1,029 gramos |
| 2 | 1 | 21,04 gramos | 19,24 gramos | 1,095 gramos |
| 2 | 2 | 20,00 gramos | 18,27 gramos | 1,125 gramos |
| 2 | 3 | 19,73 gramos | 18,30 gramos | 1,242 gramos |
| 2 | 4 | 21,94 gramos | 20,21 gramos | 1,191 gramos |
| 3 | 1 | 18,39 gramos | 16,26 gramos | 1,041 gramos |
| 3 | 2 | 20,64 gramos | 18,76 gramos | 1,093 gramos |
| 3 | 3 | 20,18 gramos | 18,32 gramos | 1,066 gramos |
| 4 | 1 | 21,14 gramos | 18,36 gramos | 1,029 gramos |
| 4 | 2 | 20,46 gramos | 18,09 gramos | 1,200 gramos |
| 4 | 3 | 22,23 gramos | 19,44 gramos | 1,033 gramos |
| 5 | 1 | 21,04 gramos | 19,12 gramos | 1,073 gramos |
| 5 | 2 | 20,52 gramos | 18,02 gramos | 1,093 gramos |
| 5 | 3 | 17,73 gramos | 16,03 gramos | 1,042 gramos |
| 6 | 1 | 20,48 gramos | 20,60 gramos | 1,081 gramos |
| 6 | 2 | 21,10 gramos | 20,93 gramos | 1,021 gramos |
| 6 | 3 | 21,98 gramos | 21,42 gramos | 1,001 gramos |
| 7 | 1 | 20,75 gramos | 19,87 gramos | 1,052 gramos |
| 7 | 2 | 20,22 gramos | 19,77 gramos | 1,095 gramos |
| 7 | 3 | 20,95 gramos | 20,55 gramos | 1,042 gramos |
Las respuestas inflamatorias agudas a
biomateriales implantados pueden provocar la pérdida de peso. Sin
embargo, es difícil determinar simplemente el grado de respuestas
inflamatorias mediante los datos de pérdida de peso. En
consecuencia, se estimaron los números de células inmunológicas.
\vskip1.000000\baselineskip
B. El reclutamiento de
neutrófilos
(PMN)
| Material de Ensayo | Actividades de mieloperoxidasa (mUnit) | Número de células estimado (x 10.000) |
| Nº 1 | 47,6 \pm 14,0 | 207,4 \pm 61,0 |
| Nº 2 | 12,8 \pm 6,5 | 55,8 \pm 28,3 |
| Nº 3 | 23,6 \pm 8,2 | 102,8 \pm 35,7 |
| Nº 4 | 18,0 \pm 12,8 | 78,4 \pm 55,8 |
| Nº 5 | 15,2 \pm 12,4 | 66,2 \pm 54,0 |
| Nº 6 | 0,0 \pm 0,0 | 0,0 \pm 0,0 |
| Nº 7 | 33,1 \pm 14,2 | 144,2 \pm 61,9 |
Los materiales ajenos implantados a menudo
desencadenan las respuestas inflamatorias agudas, que median la
acumulación de células inflamatorias (neutrófilos y macrófagos) en
los sitios del implante. En la cavidad peritoneal sin tratamiento
previo o a la que se inyecta solución salina, el sitio de
implantación para este estudio, sólo se acumularon unos pocos
neutrófilos. Después de introducirles materiales poco compatible
(tales como zimosano A-material Nº 7), los ratones
desarrollaron respuestas inflamatorias agudas con la acumulación de
un gran número de neutrófilos. Por lo tanto, puede obtenerse el
número de neutrófilos reclutados y usarse como indicador de la
compatibilidad del tejido a los materiales implantados. Como los
neutrófilos pueden causar daño a los tejidos circundantes y a los
materiales implantados un buen implante de material provocará un
influjo mínimo de neutrófilos. El material Nº 1 provocó una
acumulación significativa de neutrófilos. Se encontró una
acumulación moderada de neutrófilos para el material Nº 3 y sólo se
encontró una acumulación moderada de neutrófilos usando los
materiales Nº 2, Nº 4 y Nº 5. Los materiales Nº 2, Nº 3, Nº 4 y Nº 5
se consideran aceptables como materiales de implante.
\vskip1.000000\baselineskip
C. El reclutamiento de
monocitos/macrófagos
| Material de Ensayo | Actividades Enzimáticas (mUnit) | Número de células estimado (x 100.000) |
| 1. | 354 \pm 48 | 322 \pm 44 |
| 2. | 284 \pm 75 | 258 \pm 68 |
| 3. | 236 \pm 9 | 215 \pm 8 |
| 4. | 321 \pm 25 | 292 \pm 23 |
| 5. | 887 \pm 466 | 807 \pm 424 |
| 6. | 31 \pm 6 | 28 \pm 5 |
| 7. | 48 \pm 13 | 44 \pm 12 |
Aproximadamente 2.000.000 de macrófagos
residentes residen habitualmente en el peritoneo de ratón sin
tratar. Durante las respuestas inflamatorias, pueden reclutarse
monocitos periféricos al peritoneo para unirse a los macrófagos
residentes. Los macrófagos son importantes para mediar las
respuestas en el curado de heridas, por ejemplo fagocitando residuos
de tejido y mediando la proliferación de fibroblastos. Por lo tanto,
el número de macrófagos reclutados puede usarse como indicación de
la sensibilidad al curado de heridas, es decir como indicador de la
reconstrucción de tejidos que ocurre en los sitios de implante. La
cavidad peritoneal sin tratamiento previo o a la que se ha
inyectado solución salina (material Nº 6) tenía acumulación de
macrófagos "normales" (en su mayoría macrófagos residentes).
Los agentes inflamatorios fuertes (tales como zimosano
A-material Nº 7) desencadenan respuestas
inflamatorias graves y la acumulación de neutrófilos, que retrasa la
aparición de los macrófagos. El Material Nº 5 desencadenó la mayor
acumulación de macrófagos. Se ha encontrado acumulación moderada de
macrófagos en los materiales Nº 1, Nº 2, Nº 3 y Nº 4. Este estudio
sugiere que los materiales Nº 1, Nº 2, Nº 3, Nº 4, y Nº 5 no
confieren respuestas normales al curado de heridas.
\vskip1.000000\baselineskip
D. Células Peritoneales
Totales
| Material de Ensayo | Actividades Enzimáticas (mUnit) |
| 1. | 1526 \pm 135 |
| 2. | 397 \pm 98 |
| 3. | 877 \pm 131 |
| 4. | 924 \pm 145 |
| 5. | 1097 \pm 593 |
| 6. | 167 \pm 155 |
| 7. | 525 \pm 155 |
En el proceso de respuestas tisulares mediadas
por el implante, los sitios de implante están ocupados por células
inflamatorias (tales como macrófagos/monocitos y neutrófilos) y
fibroblastos en proliferación. El número total de células en los
sitios de implante, (cavidad peritoneal), puede representar el
grado de respuestas tisulares a los materiales de ensayo
implantados. El número total de células puede evaluarse mediante las
actividades de lactato deshidrogenasa, que es una enzima
citoplásmica habitual. El Material Nº 1 desencadenó una acumulación
celular sustancial. Otros materiales de ensayo Nº 2, Nº 3, Nº 4 y Nº
5 inducen respuestas tisulares más moderadas.
El objetivo de este estudio fue investigar si los
materiales polisacárido de ensayo tenían una tendencia diferente
para desencadenar respuestas tisulares crónicas (incluyendo fibrosis
e inflamación) en ratas.
Se usaron ratas Sprague Dowley macho con buena
salud, que pesaban aproximadamente 150 gramos.
1. Material de ensayo Nº 1 (1-1,
1-2, 1-3) Fibra de
Hidroxipropilmetilcelulosa (longitud 150-500 \mum,
anchura 10-20 \mum)
2. Material de ensayo Nº 2 (2-1,
2-2, 2-3) Perlas de Inulina
(38-90 \mum)
3. Material de ensayo Nº 3 (3-1,
3-2, 3-3) Perlas de Alginato (alto
contenido en ácido manurónico, 38-90 \mum)
4. Material de ensayo Nº 4 (4-1,
4-2, 4-3) Perlas de Sulfato de
Condroitina (38-90 \mum)
5. Material de ensayo Nº 5 (5-1,
5-2, 5-3) Perlas de Ácido
Hialurónico (38-90 \mum)
6. Material de ensayo Nº 6 (6-1,
6-2, 6-3) Perlas de Alginato (alto
contenido en ácido gulurónico) (38-90 \mum)
7. Solución Salina Nº 8 (control)
(7-1, 7-2, 7-3)
1. Las ratas Sprague Dawley macho (3 animales por
material de ensayo, 24 ratas en total) se adquirieron en Taconic
Farms (Germantown, NY) y se aclimataron durante 7 días antes de
iniciar de este estudio.
2. Las ratas se anestesiaron con
quetamina-xilazina (quetamina 80 mg/kg de peso
corporal y xilazina 12 mg/kg de peso corporal) de acuerdo con
procedimientos estándar. El pelo del lomo se retiró después con
esquiladoras eléctricas.
3. Se implantó 1 ml de material de ensayo por
inoculación subescapular en cada animal.
4. Después de 4 semanas las ratas se sacrificaron
y los materiales implantados con los tejidos fibrosos/colagenosos
circundantes se retiraron cuidadosamente y se fijaron con formalina
tamponada.
5. Los tejidos explantados y fijados se
embebieron después en parafina, se seccionaron y se tiñeron con
hematoxilina y eosina.
\vskip1.000000\baselineskip
Peso de los Materiales de Ensayo
Implantados en
Ratas
| Nº de ID | Peso (gramos) | Nº de ID | Peso (gramos) | Nº de ID | Peso (gramos) |
| 1-1 | 1,07 | 1-2 | 1,09 | 1-3 | 1,04 |
| 2-1 | 1,04 | 2-2 | 1,01 | 2-3 | 0,95 |
| 3-1 | 1,02 | 3-2 | 1,03 | 3-3 | 1,04 |
| 4-1 | 1,04 | 4-2 | 0,99 | 4-3 | 0,97 |
| 5-1 | 1,04 | 5-2 | 1,00 | 5-3 | 1,04 |
| 6-1 | 1,03 | 6-2 | 1,13 | 6-3 | 1,03 |
| 7-1 | 1,02 | 7-2 | 0,95 | 7-3 | 1,07 |
\vskip1.000000\baselineskip
Después de la inyección, los animales implantados
se observaron para respuestas tisulares visibles alrededor del sitio
de implantación. Éstas se a las 1, 24, 72, y 144 horas después de
la inyección. Los sitios de inyección se graduaron en una escala de
0 a 3 de la siguiente manera:
0 = Sin reacción
1 = Ligero enrojecimiento e hinchamiento sólo
sobre el implante
2 = Moderado enrojecimiento e hinchamiento sobre
el implante y tejidos circundantes
3 = Fuerte enrojecimiento e hinchamiento sobre el
implante y tejidos circundantes
Respuestas Tisulares Visibles a
los Materiales de Ensayo
Implantados
| Materiales de ensayo | Nº de animal | La puntuación de las respuestas tisulares | |||
| 1 | 24 horas | 72 horas | 144 horas | ||
| 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 1 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 3 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 3 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 3 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 4 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 4 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 4 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 5 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 5 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 5 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 6 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 6 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 6 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 7 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 7 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 7 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
No se observaron respuestas inflamatorias
tisulares evidentes para todos los implantes de polisacáridos.
Se midieron los pesos de los animales antes y
después de la implantación. Los animales ganaron peso después de la
implantación y los materiales de ensayo no tuvieron una influencia
obvia sobre la velocidad de crecimiento comparados con el grupo de
control (Nº 7).
Pesos y Cambio de Peso en
Animales
Implantados
| Nº de ID de la rata | Peso corporal (gramos) | Nº de ID de la rata | Peso corporal (gramos) | ||||
| Inicial | Final | Ganancia | Inicial | Final | Ganancia | ||
| 1-1 | 138,6 | 365,3 | 226,7 | 2-1 | 172,4 | 368,3 | 195,9 |
| 1-2 | 142,1 | 326,1 | 184,0 | 2-2 | 132,6 | 324,2 | 191,6 |
| 1-3 | 160,9 | 365,1 | 204,2 | 2-3 | 128,9 | 341,8 | 202,9 |
| 3-1 | 150,4 | 337,2 | 186,8 | 4-1 | 152,3 | 333,5 | 181,2 |
| 3-2 | 146,7 | 306,5 | 159,8 | 4-2 | 172,3 | 379,3 | 207,0 |
| 3-3 | 160,8 | 384,1 | 223,3 | 4-3 | 136,1 | 309,9 | 173,8 |
| 5-1 | 170,6 | 379,2 | 208,6 | 6-1 | 157,8 | 354,3 | 196,5 |
| 5-2 | 145,6 | 330,7 | 185,1 | 6-2 | 166,4 | 375,3 | 208,9 |
| 5-3 | 160,6 | 341,1 | 180,5 | 6-3 | 138,8 | 345,2 | 206,4 |
| 7-1 | 163,8 | 364,6 | 200,8 | ||||
| 7-2 | 147,8 | 357,4 | 209,6 | ||||
| 7-3 | 146,3 | 344,4 | 198,1 |
\vskip1.000000\baselineskip
Después de 30 días de implantación, los
materiales implantados se recuperaron, se fijaron y se embebieron
como se ha descrito anteriormente. Las muestras se seccionaron y se
tiñeron con hematoxilina y eosina. Las respuestas tisulares a los
materiales de ensayo se categorizaron en dos patrones y se graduaron
subjetivamente de acuerdo con la gravedad en aumento
(0-3) por dos investigadores y un patólogo con
amplia experiencia.
Patrón A: mayores respuestas fibróticas,
tipificadas por la presencia de fibroblastos y material fibroso que
rodea la masa del implante. Fuerte infiltración de las células
inflamatorias y reacción de las células gigantes que rodean
partículas individuales de materiales de ensayo.
Patrón B: Débil filtración celular (los centros
de los implantes tienen pocas o ninguna célula) y reacciones
relativamente moderadas con las células gigantes y fibrosis
alrededor de los materiales de ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Tipo y Gravedad de las
Reacciones Tisulares a los
Implantes
| Material de ensayo | Nº de animal | Patrón | Células corporales | Fibrosis | Inflamación crónica |
| gigantes ajenas | |||||
| 1 | 1 | B | 3+ | 0 | 2+ |
| 1 | 2 | B | 3+ | 0 | 1-2+ |
| 1 | 3 | B | 3+ | 0-1+ | 1+ |
| 2 | 1 | A | 3+ | 2+ | 1+ |
(Continuación)
| Material de ensayo | Nº de animal | Patrón | Células corporales | Fibrosis | Inflamación crónica |
| gigantes ajenas | |||||
| 2 | 2 | A | 3+ | 2+ | 1+ |
| 2 | 3 | A | 3+ | 0-1+ | 1-2+ |
| 3 | 1 | - | (no se observó material) | ||
| 3 | 2 | B | 2+ | 1-2+ | 2+ |
| 3 | 3 | B | 2+ | 2+ | 1-2+ |
| 4 | 1 | A | 3+ | 1-2+ | 1+ |
| 4 | 2 | A | 3+ | 1+ | 1+ |
| 4 | 3 | A | 3+ | 1+ | 1+ |
| 5 | 1 | A | 3+ | 1+ | 0-1+ |
| 5 | 2 | A | 3+ | 1+ | 1+ |
| 5 | 3 | A | 3+ | 1+ | 2+ |
| 6 | 1 | A | 3+ | 1+ | 1+ |
| 6 | 2 | A | 3+ | 2+ | 1+ |
| 6 | 3 | A | 3+ | 2+ | 0-1+ |
| 7 | 1 | B | 0 | 0 | 0 |
| 7 | 2 | B | 0 | 0 | 0 |
| 7 | 3 | B | 0 | 0 | 0 |
\vskip1.000000\baselineskip
No hubo aparición de ninguna reacción negativa en
animales durante una implantación de 30 días con cualquiera de los 6
materiales polisacárido. Los 6 materiales se consideran seguros para
implantación tisular. Todos los implantes (excepto el animal 1 con
el material Nº 3) permanecieron en su sitio cuando se
recuperaron.
La reacción corporal anterior y la respuesta
inflamatoria crónica fueron evidentes alrededor de los implantes de
material. No se encontró tejido fibrótico obvio (fibroblastos y
fibrillas de colágeno) en las cápsulas alrededor del implante. La
mayoría de las células inflamatorias se acumularon alrededor de los
implantes, y se encontraron pocas células en el interior de los
implantes.
Estos implantes desencadenaron fuertes reacciones
corporales ajenas y respuestas fibróticas. Los implantes fueron
rodeados también por cápsulas fibrosas/colagenosas (de 100 a 300
\mum de espesor) compuestas por fibrillas de colágeno y numerosas
células corporales gigantes y fibroblastos ajenos. Los intersticios
de los implantes se llenaron también con un gran número de células.
Se encontraron células invasoras (incluyendo numerosas células
gigantes y algunos fibroblastos) rodeando a partículas individuales
del material de ensayo.
Este material inició las respuestas moderadas
corporales y fibróticas ajenas. Un gran número de fibroblastos,
fibrillas de colágeno y algunas células gigantes formaron cápsulas
fibróticas alrededor de los implantes (espesor de
50-300 \mum). La penetración celular a los
aspectos internos del implante fue relativamente poco frecuente.
Estos implantes desencadenaron fuertes reacciones
corporales ajenas aunque débiles respuestas fibróticas. Los
implantes fueron rodeados por una capa fina (espesor de 50 a 150
\mum) de cápsulas fibrosas/colagenosas, compuestas principalmente
por fibroblastos y fibrillas de colágeno. Apareció un gran número de
células corporales gigantes ajenas alrededor y en el interior de los
implantes corporales.
Los materiales implantados provocaron fuertes
reacciones corporales ajenas y débiles respuestas fibróticas. Los
implantes con una fina cápsula fibrosa/colagenosa (espesor de 25 a
100 \mum), compuesta predominantemente por fibroblastos y
fibrillas de colágeno. Un gran número de células gigantes había
invadido el cuerpo del implante y envolvió a las partículas de
materiales de ensayo.
Fuerte reacción corporal ajena y respuestas
fibróticas moderadas mediadas por los implantes de material. Los
implantes quedaron rodeados por un gran número de células gigantes y
algunos fibroblastos (espesor de 50 a 150 \mum). La penetración
celular en este material fue notable. Un gran número de células
gigantes había invadido profundamente el centro de la masa de
material y formado muchos compartimentos pequeños reticulares dentro
del implante.
No se encontró reacción corporal ajena o
respuesta fibrótica en los tejidos como era de esperar. La solución
salina normalmente desaparecía aproximadamente una hora después de
la inyección.
Como era de esperar, el control negativo
(material de ensayo Nº 7 - inyección salina) no provocó ninguna
respuesta tisular negativa visible. Después de una implantación
durante 30 días, los materiales de ensayo desencadenaron respuestas
tisulares muy diferentes. Caritativamente, los materiales de ensayo
pueden dividirse en dos grupos distintos: "bioactivo" y
"bioinerte". Los materiales más bioactivos (material de ensayo
Nº 2, 4, 5, y 6) desencadenaron respuestas tisulares más fuertes
(incluyendo inflamación crónica, fibrosis, y respuestas de células
corporales gigantes ajenas) mientras que los materiales bioinertes
(material de ensayo Nº 1 y 3) desencadenaron solo respuestas
tisulares moderadas o débiles.
\vskip1.000000\baselineskip
Los estudios demostraron que los polisacáridos
reticulados (un hialuronato y dos alginatos diferentes) son no
inmunógenos, lo que es esencial para el material de implante.
El objetivo de este estudio fue evaluar la
producción de anticuerpos para biomateriales polisacáridos
implantados en conejos.
Los conejos adultos jóvenes macho (New Zealand
White) con buena salud, que pesaban aproximadamente 2 kg, se
obtuvieron de Millbrook Farm (Amherst, Massachusetts). A cada animal
se le marcó con un único número de identificación.
1. Perlas de Ácido Hialurónico
(45-90 \mum) (animal Nº 1, 2, y 3)
2. Perlas de Alginato (alto contenido en ácido
manurónico; 45-90 \mum) (animal Nº 4, 5 y 6).
3. Perlas de Alginato (alto contenido en ácido
gulurónico; 45-90 \mum) (animal Nº 7, 8, y 9).
1. Conejos macho New Zealand White (3 animales
por grupo de ensayo, en total 9 conejos) se adquirieron en Millbrook
Farms (Amherst, MA) y se aclimataron durante 7 días antes de iniciar
de este estudio.
2. Después de una anestesia ligera, cada uno de
los nueve conejos se inmunizó con materiales de ensayo/mezcla
completa de Freund en el día cero (semana 0) y después estímulos
cortos con material de ensayo/mezcla incompleta de Freund en el día
28, 35, 42, 49, y 56 (o la semana, 4, 5, 6, 7, y 8).
- 2a.
- Aproximadamente 2,0 ml de material de ensayo/mezcla completa de Freund (v:v = 1:1) se usaron para la inyección inicial.
- 2b.
- Aproximadamente 2,0 ml del material de ensayo/mezcla incompleta de Freund (v:v = 1:1) se usaron para estímulos cortos.
3. Los conejos se controlaron durante seis días
después de la inmunización. Posteriormente, se realizó la inspección
semanal de la salud de los animales, la dieta y la ingesta de
fluidos.
4. Las muestras de sangre (10 ml) se recogieron
en tubos de suero de cada animal en la semana 0 y 10.
5. Después de coagularse a temperatura ambiente
durante dos horas, las muestras de sangre se centrifugaron (500 xg,
10 minutos) para recoger el suero. Los conejos se sacrificaron por
inhalación de CO_{2}. Los materiales implantados y tejidos que
los rodean se recuperaron por disección cuidadosa y se fijaron con
Formalina.
6. El material fijado se embebió en un bloque de
parafina, se seccionaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 0,5 ml de los materiales de
ensayo se administraron por vía subescapular a ambos lados izquierdo
y derecho del animal. Los pesos de los materiales inyectados se
midieron y se muestran a continuación.
Peso de los Materiales de Ensayo
Implantados En
Ratas
| N^{o} de ID | Peso izquierdo (gramos) | Peso derecho (gramos) |
| A-1 | 0,62 | 0,59 |
| B-1 | 0,61 | 0,53 |
| B-2 | 0,65 | 0,59 |
| C-1 | 0,58 | 0,54 |
| C-2 | 0,48 | 0,53 |
| D-1 | 0,46 | 0,55 |
| D-2 | 0,53 | 0,59 |
| E-1 | 0,61 | 0,53 |
| E-2 | 0,49 | 0,52 |
Después de la implantación, se observó a los
animales para respuestas tisulares visibles alrededor del sitio de
implantación. Éstos se registraron a las 1, 24, 72, y 144 horas
después de la inyección. Los sitios de inyección se puntuaron en
una escala de 0 a 3 de la siguiente manera:
| 0 = | Sin reacción | |
| 1 = | Ligero enrojecimiento e hinchado sólo sobre el implante | |
| 2 = | Moderado enrojecimiento e hinchado sobre el implante y en los tejidos circundantes | |
| 3 = | Grave enrojecimiento e hinchado sobre el implante y en los tejidos circundantes |
Respuestas Tisulares Visibles a
Materiales de Ensayo
Implantados
| Materiales de ensayo | Nº de animal | La puntuación de las respuestas tisulares | |||
| 1 hora | 24 horas | 72 horas | 144 horas | ||
| A | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| B | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| B | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| C | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| C | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| D | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| D | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| E | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| E | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 |
\vskip1.000000\baselineskip
No hubo respuesta inflamatoria visible
externamente u otras reacciones tisulares negativas
Se midieron los pesos de los animales antes y
después de 30 días de implantación. Los materiales de ensayo no
tuvieron un efecto obvio sobre el crecimiento de los animales de
ensayo.
| Materiales de ensayo | Titulación del anticuerpo | Medias | Área superficial del gel | Área superficial estándar |
| 1 | 148,78,100 | 109\pm36 | 16,17 cm^{2} | 0,28 cm^{2} |
| 2 | 86,32,42 | 53\pm29 | 12,86 cm^{2} | 0,28 cm^{2} |
| 3 | 48,50,108 | 69\pm34 | 14,56 cm^{2} | 0,28 cm^{2} |
\vskip1.000000\baselineskip
Se observaron titulaciones muy bajas de
anticuerpo en animales inyectados con cualquiera de los 3 materiales
de ensayo. Después de la normalización con el área superficial, los
valores de la titulación son completamente insignificantes. Por lo
tanto, se concluye que los tres materiales polisacárido de ensayo
son no inmunógenos.
\vskip1.000000\baselineskip
Apéndice
A
Solución necesaria:
- Suero de ensayo (diluido 1:10 con PBS)
- Suero pre-inmune (diluido 1:10 con PBS)
\newpage
- PBS
- Tampón de lavado: PBS/Tween 20 al 0,05%
- Solución de bloqueo: PBS/BSA al 1,0%
- Anticuerpo: Proteína A conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) (Accurate Chem & Sci Nº BYA 8605-1) en PBS (10 mM pH 7,4)
- Tampón citrato: agua destilada 100 ml
- 1,42 g de NaH_{2}PO_{4} (o 1,63 g de monohidrato)
- 1,05 g ácido cítrico (1,15 g de monohidrato)
- Sustrato para peroxidasa de rábano picante (HRP)*
- 15 mg de o-fenilendiamina (abreviada OPD, sigma Nº P1526)
- 25 ml de tampón citrato
- 25 \mul de H_{2}O_{2} al 30%
*Este sustrato debería cambiarse por una cantidad
recién preparada cada vez antes del ensayo.
\vskip1.000000\baselineskip
Equipamiento necesario:
- Sistema de tira de filtro Octavac (Fisher)
- Placas de tira de 96 pocillos (Fisher Nº 07-200-359)
- Espaciador de tira de filtro (Fisher Nº 07-200-363)
- Centrífuga
- Adaptador de centrífuga para placa estándar de 96 pocillos
1. 10 \mul de materiales de ensayo y 90 \mul
de PBS se añadirán a la placa de tira de 96 pocillos. Esto
proporciona aproximadamente 5 \mug de antígeno por pocillo. (Se
añadirán 100 \mul de PBS a los pocillos de control).
2. Retirar la solución por centrifugación (500 X
g, 10 minutos). Se añadirán 100 \mul de PBS a cada pocillo.
Después de 10 minutos de incubación a temperatura ambiente, la
solución se retirará después por centrifugación. Seguido de 2
lavados más con PBS.
3. Añadir 200 \mul de solución de bloqueo a
cada pocillo (incluyendo pocillos de control). Incubar a 37ºC
durante una hora.
4. Lavar cada pocillo 1X con PBS/Tween 20 como se
describe en la etapa 2, después 2X con PBS.
5. Añadir suero diluido en serie (100
\mul/pocillo) a cada pocillo usando PBS como diluyente. Incubar
durante una hora a 37ºC.
6. Lavar cada pocillo 1X con PBS/Tween 20,
después 2X con PBS.
7. Añadir 100 \mul de proteína A conjugada con
HRP a 37ºC durante 1 hora.
8. Lavar cada pocillo 1X con PBS/Tween 20,
después 2X con PBS.
9. Añadir 200 \mul de sustrato (OPD, sigma Nº
P1526) a cada pocillo a 37ºC durante 30 minutos.
10. Leer los resultados (absorbancia a 450 nm),
comparar el color con suero preinmune.
\newpage
| Número de pocillo | Anticuerpo de Tratamiento | Antígeno |
| 1,2 | BSA | No (PBS) |
| 3,4 | BSA | Conejo anti-BSA (1:10) |
| 5,6 | Sí | Suero de control (1:10) |
| 7,8 | Sí | Suero de ensayo (1:10) |
| 9,10 | Sí | Suero de ensayo (1:20) |
| 11,12 | Sí | Suero de ensayo (1:40) |
Se realizó un ensayo de esterilidad sobre
microesferas de hialuronato y los resultados demuestran que este
polisacárido no soporta el crecimiento de ninguna bacteria u hongo
sobre su superficie o en la matriz de material. Además, los geles
pre-esterilizados (es decir, no esterilizados en
autoclave) también fueron negativos para el crecimiento bacteriano.
Se concluye que usando polisacáridos tales como hialuronato para
implantes limitaría la aparición de infecciones asociadas con el
biomaterial, una complicación habitual que a menudo da como
resultado el fallo del implante/dispositivo.
También se ensayó la citotoxicidad y hemólisis
in-vitro sobre geles de hialuronato. Los
resultados demostraron que los materiales no son tóxicos paralas
células, lo que podría esperarse ya que la mayoría de los
polisacáridos se extraen de organismos vivos.
Propósito: el propósito de este experimento es
ensayar la esterilidad de perlas de hialuronato antes y después de
esterilizarlas en autoclave.
1. Remitir una jeringuilla de perlas de
hialuronato antes de esterilizar en autoclave y una jeringuilla de
perlas de hialuronato después de esterilizar en autoclave al
laboratorio de microbiología para el ensayo de esterilidad.
Nota: cada jeringuilla contiene 3 cc de perlas de
hialuronato reticuladas.
Resultados: ambas muestras resultaron negativas
para el crecimiento.
1. Bajo una campana de flujo laminar, expulsar la
mitad del contenido de la jeringuilla de ensayo en un tubo de ensayo
de 25 x 200 mm que contenía un mínimo de 40 ml de Caldo de Soja
Tripticaseína (TSB) estéril.
2. Incubar muestras de producto en FTM a
30-35ºC durante 14 días, y las que están en TSB a
20-25ºC durante 14 días.
3. Después de 14 días, comprobar si hay señales
de turbidez que indicarían el crecimiento de bacterias u hongos.
No se encontró turbidez en las muestras de
"Antes" o "Después". Estos significa que no se encontraron
bacterias u hongos en las muestras. Por lo tanto, el Hialuronato
Antes y el Hialuronato Después puede considerarse estéril.
Propósito: el propósito de este
experimento es ensayar el gel de hialuronato para citotoxicidad y
hemólisis.
1. Preparar jeringuillas, conteniendo cada una 4
ml de gel de hialuronato de 45- 90 micrómetros.
2. Remitir las jeringuillas al Laboratorio de
Microbiología para ensayar la citotoxicidad y hemólisis.
1. Se saturaron discos absorbentes con la muestra
de ensayo y se dejaron drenar durante aproximadamente cinco minutos.
Los discos se transfirieron a la superficie de agar que cubría las
monocapas de la célula de ensayo. La muestra de ensayo no mostró
reactividad citotóxica y satisfacía los requerimientos del ensayo de
citotoxicidad por difusión en agar.
2. El procedimiento de ensayo se modificó
ligeramente debido a la naturaleza viscosa de la muestra de ensayo.
10 ml de la suspensión se transfirieron a un tubo de ensayo estéril.
25 ml de solución salina estéril se añadieron a ésta para obtener
un volumen total de 35 ml que se extrajo después a 70ºC durante 24
horas por ML-009. Al ensayar desde este punto de
vista se ganó por ML-009. La muestra tenía un valor
medio de hemólisis de 1,99%, que satisface los requerimientos del
ensayo.
Para calificarlo como implante, el material de
implante debe contener un nivel de endotoxinas muy bajo (< 20 EU
para un dispositivo de implante o < 5 EU/Kg de peso corporal por
hora para inyección del fármaco, como exige la FDA). Los materiales
o componentes brutos de un implante deben tener, por lo tanto, un
nivel muy bajo de endotoxinas, para evitar las etapas caras de
despirogenación.
Se han realizado ensayos de selección de
endotoxinas en muchas materias primas diferentes de polisacáridos
así como en todos los geles reticulados implantables incluyendo (1)
hidroxipropilmetilcelulosa, (2) inulina, (3) alginatos con
diferentes formulaciones, (4) sulfato de condroitina, (5)
hialuronatos sódicos de diferentes suministradores (7) Sephadex con
diversos tamaños y diferentes rigideces. Los resultados mostraron un
nivel de endotoxina muy bajo o inexistente, lo que sugiere que los
polisacáridos sean buenos candidatos para materiales de
implante.
Se realizaron estudios de cultivos celulares
in vitro para ensayar si las microesferas de hialuronato
reticuladas de dos fuentes diferentes soportaban el desarrollo de
fibroblastos humanos. El fibroblasto juega un papel esencial en el
curado de heridas y en los procesos de remodelación de tejidos.
Brevemente, produce enzimas para digerir el tejido muerto, genera
nuevo colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular para
reconstruir tejido nuevo, y coordina muchos sucesos durante la
inflamación y angiogénesis para asegurar un remodelado suave. Los
materiales de implante que son compatible con fibroblastos deberían
ayudar al curado. Los estudios demostraron que hialuronato soporta
un crecimiento normal de fibroblastos.
Propósito: el propósito de este experimento es
ver si los fibroblastos se unirán a las Perlas de Hialuronato en
los Placas de Pocillos Tratadas con Cultivo Tisular y sin Cultivo
Tisular.
1. Recubrir dos pocillos de Perlas de Hialuronato
de la fuente Nº 1 en ambos Placas de Pocillos Tratadas con Cultivo
Tisular y sin Cultivo Tisular.
2. Recubrir dos pocillos de Perlas de Hialuronato
de la fuente Nº 2 en ambos Placas de Pocillos Tratadas con Cultivo
Tisular y sin Cultivo Tisular.
3. Permitir que se seque durante una noche.
4. Poner 100.000 células en Medio MEM Incompleto
+ L-glutamina en cada pocillo.
5. Permitir que se seque durante una noche.
Las Placas de Pocillos se examinaron al
microscopio.
Para perlas de hialuronato de ambas fuentes, las
células se unieron a toda la superficie de las perlas y del
pocillo.
Para perlas de hialuronato de ambas fuentes, las
células sólo se unieron a las perlas.
Sumario: las células se unieron a las perlas en
ambas Placas de Pocillos Tratadas con y sin Cultivo Tisular.
Se realizaron ensayos de extrusión sobre muchos
geles de polisacárido reticulados diferentes manualmente (extrusión
manual) o mediante una máquina Instron. Controlando la suavidad y el
intervalo de tamaño de las partículas, todos los polisacáridos
pueden extruirse fácilmente a través de agujas de pequeño calibre
(por ejemplo, de calibre 22). La propiedad de elastoviscosidad de
la mayoría de materiales polisacárido los garantiza como candidato
excelente para implantes inyectables.
Se han inyectado también diferentes geles de
polisacárido en vejigas de cerdo y uretras de cerdo. Comparando los
resultados con inyección de colágeno, se descubrió que muchos
polisacáridos proporcionaban una integridad igual o incluso mejor,
así como estabilidad (es decir, efectos globales) en el tejido de
la mucosa. Se concluye que usando polisacáridos reticulados para
aumentar el tejido blando es sorprendentemente eficaz.
1. Poner 0.4 g de perlas en una jeringuilla de 10
cc.
2. Añadir 10 ml de PBS a cada jeringuilla y
mezclar minuciosamente.
3. Poner boca abajo cada jeringuilla hacia el
lado del émbolo y dejar reposar.
1. Sephadex
G-50-50
2. Sephadex
G-75-50
3. Sephadex
G-200-50
4. Sephadex
G-200-120
5. Alginato
6. Sulfato de Condroitina A
7. Hialuronato
Dos de las cuatro jeringuillas se separaron en
una capa líquida y una capa de perlas.
| Sephadex G-50-50 | 5 cc de perlas 5 cc de líquido |
| Sephadex G-75-50 | 6 cc de perlas 4 cc de líquido |
| Sephadex G-200-50 | 10 cc de perlas |
| Sephadex G-200-120 | 10 cc de perlas |
4. Extruir la capa líquida de las jeringuillas
que se habían separado.
5. Unir la aguja de calibre 22.
6. Inyectar la muestra en una vejiga de cerdo y
una uretra de cerdo.
Colágeno - Se extruye fácilmente a través de la
aguja y hacia los tejidos. Blando y esponjoso una vez que está
dentro de los tejidos. No mantiene la forma. Se dispersa con el
tiempo. Tiene el mismo aspecto que la grasa.
G200-120 - Se extruye fácilmente
a través de la aguja y hacia los tejidos. Blando una vez que está
dentro de los tejidos. Mantiene la forma. Es similar al
Colágeno.
G-50-50 - Se
extruye fácilmente a través de la aguja y hacia los tejidos. Muy
duro una vez que está dentro de los tejidos. Mantiene la forma muy
bien. Es similar a un tumor duro.
Alginato - Muy difícil de extruir hacia los
tejidos. Duro una vez que está dentro de los tejidos. Mantiene bien
la forma. Muy similar a Sephadex 50-50, aunque no
tan duro.
G-200-50 - Se
extruye fácilmente a través de la aguja y hacia los tejidos. Blando
dentro de los tejidos. Mantiene la forma con una ligera dispersión
con el tiempo. Similar al Colágeno, aunque mantiene mejor la
forma.
Hialuronato - Se extruye fácilmente a través de
la aguja y hacia los tejidos. Blando una vez que está dentro de los
tejidos. Mantiene la forma con una ligera dispersión con el tiempo.
Similar al Colágeno, aunque mantiene mejor la forma.
G-75-50 - Se
extruye fácilmente a través de la aguja y hacia los tejidos. Duro
una vez que está dentro de los tejidos. Mantiene bien la forma.
Similar a Sephadex G-50-50, aunque
no tan duro.
Sulfato de Condroitina A - Se extruye fácilmente
a través de la aguja y hacia los tejidos. Blando una vez que está
dentro de los tejidos. Mantiene la forma con una ligera dispersión
con el tiempo. Es similar al Colágeno, aunque más firme y mantiene
mejor la forma.
Resumen de Datos de Inyección a
Vejiga
| Muestra | Capacidad de extrusión a | Firmeza | Estabilidad |
| través de un calibre 22 | |||
| Colágeno | Fácil | Muy blando | Se dispersa con el tiempo |
| Sephadex G-50-50 | Fácil | Muy duro | Mantiene la forma |
| Sephadex G-75-50 | Fácil | Duro | Mantiene la forma |
| Sephadex G-200-50 | Fácil | Blando | Ligera dispersión con el tiempo |
| Sephadex G-200-120 | Fácil | Blando | Mantiene la forma |
| Alginato | Difícil | Duro | Mantiene la forma |
| Hialuronato | Fácil | Blando | Ligera dispersión con el tiempo |
| Sulfato de Condroitina A | Fácil | Blando | Ligera dispersión con el tiempo |
1. Sephadex
G-50-50
2. Alginato
3. Sephadex
G-75-50
4. Hialuronato
5. Sulfato de Condroitina A
6. Colágeno*
6. Sephadex
G-200-120*
6. Sephadex
G-200-50*
*Todos muy similares
7. Cortar cada sitio de inyección y abrir para
observar la textura de las perlas una vez dentro de los
tejidos.
Observaciones: cuando el sitio de inyección se
abrió con un escalpelo, cada muestra salió como gel en forma de
pasta.
Propósito: inyectar perlas en una vejiga de cerdo
y una uretra de cerdo mientras se observaba la facilidad de
extrusión y si las perlas permanecían o no en su sitio una vez
dentro de los tejidos de la vejiga y la uretra.
1. Poner 0,4 g de perlas en una jeringuilla de 10
cc.
2. Añadir 10 ml de PBS a cada jeringuilla y
mezclar minuciosamente.
3. Poner boca abajo cada jeringuilla hacia el
lado del émbolo y dejar reposar durante una noche.
Las cuatro jeringuillas se prepararon de la
siguiente manera:
- 1.
- Sephadex G-50-50
- 2.
- Sephadex G-200-50
- 3.
- Sephadex G-200-120
- 4.
- Sepharose CL-2B-300
4. Se extruyó la capa líquida de cada una de las
cuatro jeringuillas.
5. Unión de la aguja de calibre 22.
6. Inyectar en la vejiga y uretra de cerdo.
7. Adicionalmente se inyectó colágeno en la
vejiga de cerdo y también en la uretra.
Colágeno - Se extruyó fácilmente a través de la
aguja y hacia los tejidos. Permanece en su sitio una vez que está
dentro de los tejidos. Formó una protuberancia blanda y esponjosa
cuando se inyectó. También era muy blando y flexible.
La primera inyección a la vejiga dio como
resultado una burbuja (pústula de tipo ampolla). Esto se debe a que
la inyección se realizó demasiado cerca de la superficie. La segunda
inyección a la vejiga fue suficientemente profunda en los tejidos de
manera que no provocó una burbuja, si no que nunca aparecerá en el
tejido una protuberancia. Cuando se inyectó a la uretra se formó
otra burbuja. También el colágeno podría empezar a salir por el
orificio en el que se insertó la aguja.
G-50-50 Se
extruyó fácilmente hacia la vejiga y la uretra. Permaneció en su
sitio una vez inyectado a los tejidos. Formó una protuberancia
extremadamente dura donde se inyectó. La protuberancia no podía
moverse o estrujarse.
Se extruyó fácilmente hacia los tejidos.
Permaneció al principio en su sitio, aunque lentamente empezó a
disiparse. Al principio se formó una protuberancia firme, pero no
mantuvo la forma con el tiempo. Aunque era firme no lo era tanto
como Sephadex G-50-50 y con el
tiempo se hizo tan blando y flexible como el colágeno.
Se extruyó fácilmente hacia los tejidos.
Permaneció en su sitio después de la inyección. Formó una bola dura
dentro del tejido. Esta bola era más dura que
G-200-50, aunque no tanto como
G-50-50.
La primera inyección en la uretra fue
suficientemente profunda para formar un nódulo visible sin
hemorragia. El nódulo retuvo bien su forma.
Se extruyó fácilmente hacia los tejidos.
Permaneció en su sitio dentro de los tejidos. Formó un nódulo firme
en primer lugar, pero perdió su firmeza con el tiempo.
Inyecciones
| Muestra | Capacidad de extrusión a | Estabilidad | Firmeza |
| través del calibre 22 | |||
| Colágeno | Fácil | Permaneció en su sitio | Blando y flexible |
| Sephadex G-50-50 | Fácil | Permaneció en su sitio | Nódulo muy duro |
| Sephadex G-200-50 | Fácil | Se disipó con el tiempo | Firme al principio, pero |
| blando con el tiempo | |||
| Sephadex G-200-120 | Fácil | Permaneció en su sitio | Se formó un nódulo duro |
| Hialuronato (Lifecore) | Imposible en los tejidos | n/a | n/a |
| Sulfato de | Fácil | Permaneció en su sitio | Se formó un nódulo firme |
| Condroitina A | |||
| Alginato (Sigma) | Fácil | Permaneció en su sitio | Firme al principio, pero |
| blando con el tiempo |
\vskip1.000000\baselineskip
Propósito: hinchar perlas de Sephadex y después
ensayar su capacidad de extrusión a través de una aguja de calibre
22 en la máquina Instron.
1. Poner 0,5 g de perlas en un vaso de
precipitados pequeño.
2. Añadir 30 ml de PBS a las perlas.
3. Permitir que las perlas se hinchen durante una
noche.
Se usaron las siguientes perlas:
- Sephadex G-50-50
- Sephadex G-75-50
- Sephadex G-200-50
- Sephadex G-200-120
4. Llenar las jeringuillas de 3 inhibidor de
HMG-CoA reductasa con perlas. Se prepararon tres
jeringuillas para cada tipo de perlas.
5. Ensayar cada jeringuilla en la máquina Instron
usando una aguja 22G1. La carga media a carga máxima y la carga
media entre los límites fue de 6,54 kg y 0,30 kg (14,41 lbs y 0,6584
lbs) para G-50-50; 2,55 y 0,23
(5,632 y 0,5047) para G-75-50; 0,42
y 0,15 (0,9315 y 0,3349) para
G-200-50; y 0,43 y 0,18 (0,9450 y
0,4018) para G-200-120.
El propósito de este experimento fue ensayar la
cantidad de fuerza necesaria para extruir las Perlas de Hialuronato
antes y después de Esterilizarlas en Autoclave a través de una
jeringuilla.
Se ensayó cada jeringuilla en el Instron usando
una aguja 22G1.
Perlas de Hialuronato antes de
Esterilizarlas en
Autoclave
| Carga Máxima: | 1,97 kg (4,333 lbs) | |
| Carga Media entre los Límites 1: | 0,14 kg (0,3037 Ibs) | |
| (Esta es la carga media desde el principio hasta el final). |
\vskip1.000000\baselineskip
Perlas de Hialuronato después de
Esterilizarlas en
Autoclave
| Carga Máxima: | 1,96 kg (4,327 lbs) | |
| Carga Media entre los Límites 1: | 0,14 kg (0,3010 Ibs) | |
| (Esta es la carga media desde el principio hasta el final). |
La esterilización en autoclave no tuvo efecto
sobre la capacidad de extrusión de las Perlas de Hialuronato.
Claims (23)
1. Una preparación de partículas poliméricas
reticuladas solubles en agua en la que las partículas tienen un
diámetro menos de 212 \mum y en la que al menos el 80% de las
partículas son esféricas, que puede obtenerse añadiendo una solución
polimérica acuosa, que comprende un polímero soluble en agua
seleccionado entre ácido hialurónico, sulfato de condroitina,
sulfato de dermatano, sulfato de queretano, celulosas, quitina,
quitosano, agarosa, carragenanos, curdlano, dextranos, emulsano,
gelano, xantanos, poli(óxido de etileno), poli(alcohol
vinílico), poli(N-vinil pirrolidona),
proteínas, peptidoglicanos, lipopolisacáridos, o combinaciones de
los mismos, y un medio acuoso, a una base oleosa que contiene un
agente emulsionante de agua en aceite, agitar la mezcla para formar
una emulsión que contiene gotas poliméricas, y reticular las gotas
poliméricas in situ mediante un agente reticulante dando
como resultado la formación de partículas poliméricas
reticuladas.
2. Una preparación de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el agente de reticulación se selecciona
entre
pentaeritritol-tris-[beta(N-aziridinil)-propionato],
divinilsulfona, glutaraldehído, ácido p-tolueno
sulfónico, carbodiimidas, diepóxidos, o persulfato amónico.
3. Una preparación de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en la que el polímero soluble en agua se
selecciona entre ácido hialurónico, sulfato de condroitina, sulfato
de dermatano, sulfato de queratano, celulosa, quitina, quitosano,
agarosa, carragenanos, curdlano, dextranos emulsano, gelano,
xantanos, proteínas, glucoproteínas, pectidoglicanos,
proteoglicanos, lipopolisacáridos o combinaciones de los mismos.
4. Una preparación de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el tamaño de las partículas poliméricas
es menor de aproximadamente 150 micrómetros de diámetro.
5. Una preparación de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en la que la reticulación se proporciona
mediante enlaces covalentes.
6. Una preparación de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, que comprende adicionalmente un
agente bioactivo.
7. Una preparación de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en la que la proporción del peso
del polímero soluble en agua a la del agente de reticulación es de
0,1 a 10.
8. Una dispersión acuosa que comprende una
preparación de partículas poliméricas solubles en agua reticuladas
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones
anteriores.
9. La dispersión acuosa de las partículas
poliméricas de acuerdo con la reivindicación 8, que puede extruirse
a través de una agua de una jeringuilla hipodérmica de calibre
20.
10. El uso de la dispersión acuosa de la
reivindicación 8 ó 9 en la fabricación de un medicamento.
11. El uso de la reivindicación 10 en el que el
medicamento es para ayudar al aumento del tejido blando.
12. Un proceso para la preparación de una
preparación de partículas poliméricas solubles en agua reticuladas
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que
comprende,
añadir la solución polimérica acuosa, que
comprende el polímero soluble en agua y un medio acuoso, a una fase
oleosa que contiene un agente emulsionante de agua en aceite, agitar
la mezcla para formar una emulsión que contiene gotas poliméricas, y
reticular las gotas poliméricas in situ por el agente de
reticulación, dando como resultado la formación de partículas
poliméricas reticuladas.
13. El proceso de la reivindicación 12, en el que
el agente emulsionante es hexadecil ftalato sódico, monoestearato de
sorbitano, o un jabón metálico.
14. El proceso de la reivindicación 12 o 13, que
comprende adicionalmente invertir la preparación de emulsión que
contiene partículas poliméricas en un exceso de agua para
proporcionar una dispersión acuosa de partículas poliméricas
solubles en agua reticuladas.
15. El proceso de la reivindicación 14, que
comprende adicionalmente recuperar las partículas poliméricas
solubles en agua reticuladas.
16. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15, que comprende la etapa de seleccionar la
proporción del peso de polímero soluble en agua a la del agente de
reticulación de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 10.
17. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 15 en el que las partículas que tienen un
diámetro menor de 150 micrómetros.
18. El proceso de una cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 17, en el que el pH de la solución polimérica
acuosa se ajusta por encima o por debajo de pH 7 reduciendo de esa
manera la velocidad de reacción del agente de reticulación con el
polímero soluble en agua, ajustándose el pH después de que se
formara la emulsión a aproximadamente pH 7.
19. El uso de la preparación de partículas
poliméricas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7,
en la fabricación de un medicamento.
20. Uso de la preparación de partículas
poliméricas solubles en agua reticuladas definida en la
reivindicación 1 en la que las partículas tienen un diámetro menor
de 212 \mum y en el que al menos el 80% de las partículas son
esféricas, para la preparación de un medicamento para tratar un
defecto seleccionado entre incontinencia urinaria, reflujo de
vesicoureteral, insuficiencia glótica, influjo gastroesofágeo, y
defectos de la piel.
21. Uso de la preparación de partículas
poliméricas solubles en agua reticuladas definida en la
reivindicación 1 en la que las partículas tienen un diámetro menor
de 212 \mum y en el que al menos el 80% de las partículas son
esféricas, para la preparación de un medicamento que sirva como
material estructural para el curado de heridas.
22. Uso de la preparación de partículas
poliméricas solubles en agua reticuladas definida en la
reivindicación 1 en la que las partículas tienen un diámetro menor
de 212 \mum y en el que al menos el 80% de las partículas son
esféricas, para la preparación de un medicamento para aumentar el
tejido blando.
23. Uso de la preparación de partículas
poliméricas solubles en agua reticuladas definida en la
reivindicación 1 en la que las partículas tienen un diámetro menor
de 212 \mum y en el que al menos el 80% de las partículas son
esféricas, para la preparación de un material de implante
tisular.
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