CN108525017A - 一种缓释型透明质酸基可注射水凝胶及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
目前脊髓损伤后水凝胶注射是常用的方法,但大多数可注射水凝胶采用化学交联方法聚合,凝胶形成过程中所引入的毒性物质不利于脊髓修复。本发明提供了一种神经生长因子缓释的可注射水凝胶,首先将NGF加载于PLGA缓释微球中,然后包封于锂藻土与透明质酸原位聚合形成的可注射水凝胶中从而实现NGF的缓释;该水凝胶能在常温完成溶胶‑凝胶的转变,将其注射到脊髓后会在脊髓受损部位原位固化;并在体内环境下缓慢降解释放出NGF,避免NGF遭受化学结构破坏而失活;并且Laponite在降解过程中释放的Na+,Mg2+和Li+可显著促进神经细胞的生长,与NGF共同促进脊髓受损位置的修复;具有潜在的应用价值和良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医用材料神经修复技术领域,具体涉及一种缓释型透明质酸基可注射水凝胶及其制备方法。
背景技术
NGF可以调节周围和中枢神经元的生长发育,维持神经元的存活,在神经修复领域发挥着重要作用,但是当将NGF用于周围神经损伤修复用的材料时面临着以下问题:1)NGF易遭受化学结构破坏(有机溶剂)或被其他化学物质修饰而失去生物活性或凝聚;2)NGF生物半衰期短,不能长期有效促进神经再生。因此,设计一个稳定的NGF传递系统以在神经修复的过程中实现NGF的持续稳定释放的同时,保护NGF的生物活性免受如光线、氧气以及化学物质等外界环境的破坏,对周围神经的修复十分重要。
注射用可降解原位水凝胶指注射前为低黏度液体状态,具有环境改变敏感性,在注射后局部迅速形成凝胶,并可最终降解的一类聚合物。由于局部给药系统具有较多优势,使得注射用可降解原位水凝胶在生物医药方面被广泛应用。
透明质酸(HAc)是一种非免疫原性的生物相容性阴离子糖胺聚糖,通常与上皮和神经组织相结合,是分子量在50,000和13,000,000道尔顿之间的直链聚合物。它是非细胞粘附剂,但可以与其他天然聚合物结合使用以产生支持神经元细胞群体的ECM样支架。由于分子缠结,长链形成无规卷曲和凝胶。这样在剪切力作用下赋予HA剪切稀化性能,分子与应力和流动方向一致。透明质酸天然存在于结缔组织和脊椎生物的细胞质基质中,其是细胞质基质的主要成分之一,透明质酸对细胞增殖和迁移具有显着作用,并且还可能参与一些恶性肿瘤的进展。但如果将其单独制成水凝胶用于脊髓修复则存在力学强度较低,在体内易出现坍塌等缺点,将HAc水凝胶单独用作神经修复用支架材料存在很大的不足。
Laponite具有出良好的生物相容性,并且生物降解为Na+,Mg2+,Si(OH)4+和Li+等无毒且生物可吸收的副产物,对再生医学领域有着极大推进的作用。Laponite分散体可以通过与凝胶化速率相关的面对边相互作用自组织成“纸牌屋”状凝胶,并且凝胶化速率取决于其浓度。这种Laponite分散体可以直接吸收生物分子用于递送或与其他合成或天然生物聚合物复合以形成用于细胞或药物递送的可注射纳米复合水凝胶。然而,当它用于控制释放生物活性蛋白质时,在Laponite颗粒上的强吸收使得蛋白质的释放变得困难,从而破坏了控制释放的目的。虽然许多生物材料,如藻酸盐、胶原、和壳聚糖已被用于与Laponite混合形成可注射的水凝胶用于药物递送,这些生物材料不能保护蛋白质免受蛋白水解和延长其生物活性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的不足,提供一种缓释型透明质酸基可注射水凝胶,将蛋白质类药剂装载入PLGA微球中,再将PLGA微球包裹在可注射原位凝胶中;所得水凝胶能在较短时间内在人体生理条件下完成溶液-凝胶的转变过程,将其注射入脊髓中后,可在神经受损部位受体内pH的作用下原位固化,避免外科手术的创伤性;有效解决蛋白质类药剂(NGF等)因半衰期短、扩散或降解过快所造成的活性降低、突释等问题,保持NGF较好的生物活性,促进神经轴突延伸和髓鞘化,从而达到修复神经的目的。
为实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
一种缓释型透明质酸基可注射水凝胶,它为将Laponite基分散液和HAc基底液混合形成的水凝胶;其中Laponite基分散液包括载药PLGA微球和Laponite(硅酸镁锂)。
上述方案中,所述载药PLGA微球通过采用复乳挥发法将药剂负载至PLGA微球中而成。
上述方案中,所述药剂为多肽和蛋白质类药剂;可选用NGF、EGF或αFGF等。
上述方案中,所述载药PLGA微球中每克PLGA微球的载药量为5-10μg
上述方案中,所述载药PLGA微球的粒径为0.4-5μm。
上述方案中,所述Laponite基分散液与HAc基底液的质量比为1:(0.1-0.3)。
上述方案中,所述Laponite基分散液中载药PLGA微球和Laponite的质量比为(0.3-1):1;Laponite基分散液中Laponite的浓度为1-3wt%。
上述方案中,所述HAc基底液中HAc的浓度为0.5-1wt%。
上述方案中,所述HAc基底液中还包含钠盐,引入的钠离子的浓度50-160mmol/L。
上述一种缓释型透明质酸基可注射水凝胶的制备方法,包括如下步骤:
1)采用复乳溶剂挥发法,将药剂负载至PLGA微球中,得载药PLGA微球;
2)将载药PLGA微球加入水中,然后加入Laponite,搅拌混合均匀,得Laponite基分散液;
3)将HAc溶于钠盐溶液中,搅拌配制HAc基底液;
4)将Laponite基分散液与HAc基底液按比例混合形成均匀的水凝胶,即得所述缓释型透明质酸基可注射水凝胶。
上述方案中,所述复乳溶剂挥发法为:将PLGA高聚物溶解于定量有机溶剂中制备油相,然后加入溶解药剂的PBS,进行超声乳化形成初乳;然后加入高浓度PVA溶液形成复乳,再倒入低浓度PVA溶液在常温下机械搅拌挥干有机溶剂,离心冷冻干燥,制得微球载药PLGA微球。
上述方案中,所述药剂为多肽和蛋白质类药剂;优选为NGF、EGF、αFGF等生物活性因子。
优选的,加入药剂的同时可加入BSA等用作保护剂。
上述方案中,所述有机溶剂二氯甲烷与乙酸乙酯中的一种或二者按任意比例混合。
上述方案中,所述油相中PLGA高聚物的浓度为4-10wt%。
上述方案中,所述PLGA高聚物与药剂的质量比为(5×106~1×105):1。
上述方案中,所述超声乳化温度为0-4℃。
上述方案中,所述高浓度PVA溶液中,PVA的浓度为1-2.5wt%;低浓度PVA溶液中,PVA的浓度为0.1-0.25wt%。
上述方案中,所述高浓度PVA与初乳的体积比为1:(2-10);所述低浓度PVA与初乳的体积比为1:(20-50)。
上述方案中,步骤2)中所述搅拌温度为0-4℃。
上述方案中,步骤3)中所述搅拌条件为冰浴条件。
上述方案中,所述钠盐溶液中钠离子的浓度为50-160mmol/L。
优选的,所述钠盐溶液选用NaCl水溶液。
本发明的原理为:
本发明通过将NGF等药剂加载于PLGA缓释微球中,然后将载药PLGA微球包封于锂藻土(Laponite XLG)与透明质酸(HAc)原位聚合形成的可注射水凝胶中从而实现NGF等药剂的缓释;该水凝胶能在常温下在一定时间内完成溶胶-凝胶的转变过程,将其注射到脊髓后,会在脊髓受损部位原位固化;水凝胶在体内降解过程中,凝胶中Laponite降解产生的碱性OH-离子会与因PLGA载药微球降解产生的乳酸等酸性物质相互中和从而缓和体内pH变化,最大限度的保证NGF等药剂的生物活性;同时Laponite XLG在降解过程中释放的Na+、Mg2 +和Li+等类生物玻璃物质能够显著促进神经细胞的生长,与NGF等药剂促进脊髓受损细胞的恢复发挥协同作用。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
1)本发明的制备方法采用细胞外基质透明质酸为基底,通过与Laponite基分散液物理共混形成溶胶,在环境刺激下完成溶胶-凝胶的自身改变,不需要有机溶剂,在凝胶形成过程中不会释放能量,基本不发生体积改变且不需要引发剂;可以显著提高神经细胞的粘附、生长与增殖,生物相容性良好。
2)本发明将Laponite和PLGA载药微球结合使用,利用两者降解过程中分别产生的碱性物质与酸性物质的中和效应,保证NGF等药剂的生物活性;此外,载药PLGA微球的存在还可加速水凝胶的降解过程,避免由于降解液的pH过高使水凝胶的降解陷入停滞等问题。
3)由于体内生理温度与pH值是恒定的且与外界环境存在差异,经实验检验该水凝胶的最大溶胀率为128%,较低的溶胀率可有效避免水凝胶注射入脊髓后因溶胀率过大而对脊髓造成二次伤害。
4)本发明所得缓释型透明质酸基可注射水凝胶在常温下注射入脊髓后2-5min即可发生溶胶-凝胶转变,在水凝胶合成过程中并未加入毒性较强的交联剂,减小了体系的毒副作用并有效地延长了NGF的生物活性。
5)NGF-PLGA/Laponite-HAc可注射水凝胶可以很容易充满脊髓损伤缺损部位,具有很强的可塑性,有助于更好地修复神经缺损。
6)本发明所得复合水凝胶可搭载蛋白质药物的适用性广,且涉及的制备方法简单易行,具有普适性。
附图说明
图1是本发明实施例1所制备的Laponite-HAc溶胶冷冻干燥后的扫描电子显微镜(SEM)照片
图2是本发明实施例1所制备的NGF-PLGA/Laponite-HAc可注射水凝胶的扫描电子显微镜(SEM)照片。
图3为本发明实施例1所得NGF-PLGA/Laponite-HAc可注射水凝胶的溶胀变化示意图。
图4是本发明应用例中PC12细胞在NGF-PLGA/Laponite-HAc可注射水凝胶中生长情况的DAPI荧光图片。
图5是本发明应用例中PC12细胞在NGF-PLGA/Laponite-HAc可注射水凝胶中分化情况的鬼笔环肽荧光图片。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合实施例进一步阐明本发明的内容,但本发明的内容不仅仅局限于下面的实施例。
以下实施例中,采用的Laponite为Laponite XLG。
以下实施例中,采用的PBS缓冲液中主要组分及其含量包括:NaCl 137mmol/L,KCl2.7mmol/L,Na2HPO4 10mmol/L,KH2PO4 2mmol/L;其pH=7.4。
以下实施例中,采用的药剂为NGF。
实施例1
一种缓释型透明质酸基可注射水凝胶(NGF-PLGA/Laponite-HAc),其制备方法包括如下步骤:
1)将100mg PLGA溶解于2ml的二氯甲烷/乙酸乙酯(二氯甲烷与乙酸乙酯体积比为1:1)中作为油相,量取10mg BSA以及1μg NGF溶于0.2ml PBS缓冲液中形成内水相,其中BSA用作保护剂;将油相加入溶解NGF的PBS缓冲液中,然后在冰浴(4℃)下超声1min使体系乳化,制备成W/O型初乳;之后将初乳倾入3ml的含1%(W/V)PVA外水相中,冰浴乳化,得到W/O/W复乳;最后将所得复乳倾入60ml的0.2%(w/v)的PVA溶液中,37℃下350rpm磁力搅拌3h,挥干有机溶剂;高速离心后冷冻干燥得到NGF/PLGA载药微球(粒径为0.668μm,每克PLGA微球的载药量为5.15μg);
2)量取0.3g Laponite XLG在冰浴(4℃)下加入10ml去离子水中,4℃下搅拌1h,得Laponite分散液,称取0.1g NGF-PLGA载药微球于10ml Laponite分散液中充分分散,制得Laponite基分散液(NGF-PLGA/Laponite分散液);
3)称取0.02g透明质酸溶于2mlNaCl水溶液(NaCl浓度为154mmol/L)中,冰浴下搅拌2h,制成1%(w/v)的HAc基底液;
4)将10ml的NGF-PLGA/Laponite分散液与2ml的HAc基底液共混,搅拌均匀,37℃恒温箱中放置2h,即得NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶。
图1为Laponite-HAc溶胶(制备步骤为:量取0.3g Laponite XLG在冰浴(4℃)下加入10ml水中,4℃下搅拌1h,得Laponite分散液,将10ml的Laponite分散液与2ml的HAc基底液共混,搅拌均匀,37℃恒温箱中放置2h)冷冻干燥后的扫描电镜图,可以看到Laponite无机粘土在水凝胶以片状分布为主,这是由于Laponite颗粒在溶胶中自发聚集形成“纸牌屋”状结构。
图2为本实施例所得NGF-PLGA/Laponite-HAc水凝胶的扫描电镜图,图中可以看出高倍放大的图可以清楚的看到NGF-PLGA载药微球部分被包裹与水凝胶片层中,部分则分布于凝胶片层结构的表层。
图3为本实施例所得NGF-PLGA/Laponite-HAc水凝胶的溶胀变化,可以看出从溶胀开始至结束,溶胀变化不大,根据称重法测量了水凝胶的溶胀率,最高达到128%。
对本实施例所得载药PLGA微球的包封率和载药率进行表征;通过Bradford法测量载药微球的包封率和载药率;结果表明所得载药PLGA微球的包封率为51.5%。
NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶系统的药物释放量表征
将所得NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶进行冷冻干燥后称取1g,与10mL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)一起置于透析袋中,将透析袋置于装有40ml磷酸盐缓冲溶液的烧杯中,将烧杯置于37℃恒温振动器中,以100r/min的速度进行释放试验;定时取出0.5ml溶液,然后向试管中补加0.5ml新鲜的PBS溶液,继续振荡;向所取的0.5ml释放液加入5ml考马氏亮蓝G-250溶液染色,在595nm处测量药物的吸光度,计算释放液药物浓度,重重复3次,然后计算药物的释放量,14内生长因子累计释放量为82.6%。
NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶的细胞毒性测试,具体步骤如下:
1)实验共分为四组:HAc粉末、Laponite-HAc凝胶、NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶、空白组;
2)将HAc粉末紫外灭菌后以浓度为0.01g/ml的浓度制溶解于培养基中备成HAc浸提液;将冷冻干燥后的Laponite-HAc凝胶、NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶以浓度为0.1g/ml的浓度浸没于培养基中24h,之后对培养基过滤分别配置成Laponite-HAc凝胶浸提液和NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶浸提液,备用;
3)取对数期生长的RSC96细胞,调整浓度为5×104个/ml,每孔100μl加入48孔板内,用空的细胞培养液作为对照;5%CO2、37℃培养72h;
4)分别在24h、48h、72h进行测定,具体方法如下:每孔加入10μl CCK-8溶液,在培养箱内继续培养4h,在450nm处测定各孔OD值,计算细胞的存活率;CCK-8检测在酶标仪上测得的OD值按照公式计算相对增殖率以反映细胞的存活率;相对存活率(relative survivalrate,RSR)=(实验组OD值/对照组OD值)×100%。
CCK-8实验结果
实施例2
一种缓释型透明质酸基可注射水凝胶(NGF-PLGA/Laponite-HAc),其制备方法包括如下步骤:
1)将200mg PLGA溶解于2ml的二氯甲烷/乙酸乙酯(二氯甲烷与乙酸乙酯体积比为1:1)中作为油相,量取20mg BSA以及2μg NGF溶于0.2ml PBS缓冲液中形成内水相,其中BSA用作保护剂;将油相加入溶解NGF的PBS缓冲液中,然后在冰浴(4℃)下超声1min使体系乳化,制备成W/O型初乳;之后将初乳倾入3ml的含1%(W/V)PVA外水相中,冰浴乳化,得到W/O/W复乳;最后将所得复乳倾入60ml的0.2%(w/v)的PVA溶液中,37℃下350rpm磁力搅拌3h,挥干有机溶剂;高速离心后冷冻干燥得到NGF/PLGA载药微球((粒径为0.476μm,每克PLGA微球的载药量为8.12μg);
2)量取0.2g Laponite XLG在冰浴(4℃)下加入10ml水中,4℃下搅拌1h,得LAponite分散液,称取0.1g NGF-PLGA载药微球于10ml Laponite分散液中充分分散,制得Laponite基分散液(NGF-PLGA/Laponite分散液);
3)称取0.02g透明质酸溶于2mlNaCl水溶液(NaCl浓度为154mmol/L)中,冰浴下搅拌2h,制成1%(w/v)的HAc基底液;
4)将10ml的NGF-PLGA/Laponite分散液与2ml的HAc基底液共混,搅拌均匀,37℃恒温箱中放置2h,即得NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶。
对本实施例所得载药PLGA微球的包封率和载药率进行表征;通过Bradford法测量载药微球的包封率和载药率;结果表明所得载药PLGA微球的包封率为40.6%。
NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶系统的药物释放量表征
将0.3g Laponite XLG在冰浴(4℃)下加入其中,4℃下搅拌1h,制得Laponite分散液,将10ml的Laponite分散液与2ml步骤3)所得HAc基底液进行共混,搅拌均匀,37℃恒温箱中放置2h得到Laponite-HAc凝胶,与本实施例所得NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶进行对比。
将本实施例所得NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶进行冷冻干燥后称取1g,与10mL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)一起置于透析袋中,将透析袋置于装有40ml磷酸盐缓冲溶液的烧杯中,将烧杯置于37℃恒温振动器中,以100r/min的速度进行释放试验;定时取出0.5ml溶液,然后向试管中补加0.5ml新鲜的PBS溶液,继续振荡;向所取的0.5ml释放液加入5ml考马氏亮蓝G-250溶液染色,在595nm处测量药物的吸光度,计算释放液药物浓度,重重复3次,然后计算药物的释放量,14内生长因子累计释放量为63.4%。
参照实施例1所述方法进行NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶的细胞毒性测试,结果见表2。
表2 CCK-8实验结果
实施例3
一种缓释型透明质酸基可注射水凝胶(NGF-PLGA/Laponite-HAc),其制备方法包括如下步骤:
1)将100mg PLGA溶解于2ml的(二氯甲烷与乙酸乙酯体积比为1:1),量取10mg BSA以及1μg NGF溶于0.2ml PBS缓冲液中形成内水相,其中BSA用作保护剂;将油相加入溶解NGF的PBS缓冲液中,然后在冰浴(4℃)下超声1min使体系乳化,制备成W/O型初乳;之后将初乳倾入5ml的含1%(W/V)PVA外水相中,冰浴乳化,得到W/O/W复乳;最后将所得复乳倾入150ml的0.2%(w/v)的PVA溶液中,37℃下350rpm磁力搅拌3h,挥干有机溶剂;高速离心后冷冻干燥得到NGF/PLGA载药微球(粒径为4.597μm,每克PLGA微球的载药量为6.04μg);
2)量取0.3g Laponite XLG在冰浴(4℃)下加入10ml水中,4℃下搅拌1h,得LAponite分散液,称取0.1g NGF-PLGA载药微球于10ml Laponite分散液中充分分散,制得Laponite基分散液(NGF-PLGA/Laponite分散液);
3)称取0.02g透明质酸溶于2mlNaCl水溶液(NaCl浓度为154mmol/L)中,冰浴下搅拌2h,制成1%(w/v)的HAc基底液;
4)将10ml的NGF-PLGA/Laponite分散液与2ml的HAc基底液共混,搅拌均匀,37℃恒温箱中放置2h,即得NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶。
对本实施例所得载药PLGA微球的包封率和载药率进行表征;通过Bradford法测量载药微球的包封率和载药率;结果表明所得载药PLGA微球的包封率为60.4%。
NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶系统的药物释放量表征
将0.3g Laponite XLG在冰浴(4℃)下加入其中,4℃下搅拌1h,制得Laponite分散液,将10ml的Laponite分散液与1ml步骤3)所得HAc基底液进行共混,搅拌均匀,37℃恒温箱中放置2h得到Laponite-HAc凝胶,与本实施例所得NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶进行对比。
将本实施例所得NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶进行冷冻干燥后称取1g,与10mL磷酸盐缓冲溶液(pH=7.4)一起置于透析袋中,将透析袋置于装有40ml磷酸盐缓冲溶液的烧杯中,将烧杯置于37℃恒温振动器中,以100r/min的速度进行释放试验;定时取出0.5ml溶液,然后向试管中补加0.5ml新鲜的PBS溶液,继续振荡;向所取的0.5ml释放液加入5ml考马氏亮蓝G-250溶液染色,在595nm处测量药物的吸光度,计算释放液药物浓度,重重复3次,然后计算药物的释放量,14内生长因子累计释放量为75.2%。
参照实施例1所述方法进行NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶的细胞毒性测试,结果见表3。
表3 NGF-PLGA/Laponite-HAc凝胶的细胞毒性测试结果
应用例
包裹PC12细胞的NGF-PLGA/Laponite-HAc可注射水凝胶支架的制备
1)将100mg PLGA溶解于2ml的二氯甲烷/乙酸乙酯中作为油相,量取10mg BSA以及1μg NGF溶于0.2ml的去离子水中形成内水相,其中BSA用作保护剂;将油相加入溶解NGF的PBS中,然后在冰浴(4℃)下超声1min使体系乳化,制备成W/O型初乳;之后将初乳倾入5ml的含1%(W/V)PVA外水相中,冰浴乳化,得到W/O/W复乳;最后将所得复乳倾入150ml的0.2%(w/v)的PVA溶液中,37℃下350rpm磁力搅拌3h,挥干有机溶剂。高速离心后冷冻干燥得到0.1gNGF-PLGA载药微球;
2)在无菌条件下,将PC12低分化细胞以1×105个每毫升的密度分散于补充有1%抗生素和10%胎牛血清的2ml的DMEM培养基中,迅速在冰浴条件下将0.02g的HAc溶解于加载细胞的DMEM培养基中。
3)量取0.3g Laponite XLG在冰浴(4℃)下加入其中,4℃下搅拌1h,得到Laponite分散液,称取0.1g NGF-PLGA载药微球于10ml Laponite分散液中充分分散,制得NGF-PLGA/Laponite分散液。
4)将10ml的NGF-PLGA/Laponite分散液与2ml的PC12/HAc基底液共混并迅速涡旋40s,并于37℃无菌恒温培养箱中孵育2h即可制得包裹PC12细胞的NGF-PLGA/Laponite-HAc可注射水凝胶支架。
DAPI检测PC12细胞增值率
将水凝胶支架分别置于培养基中1天和3天,用0.25%Trypsin消化水凝胶支架表面细胞,1000rpm离心8min,用PBS清洗2遍,吸净PBS。每孔加入0.2ml DAPI染色液(5μg/ml)浸没48孔版底部,轻轻摇晃,避光静置5min后吸出DAPI染色液,用PBS洗涤3次,每次3min。每孔加入1ml 4%多聚甲醛溶液固定15min,吸出溶液用PBS洗涤3次。将48孔板置于荧光显微镜下观察细胞形态并拍照。
DAPI染色结果
通过对DAPI染色结果定性观察,分别观察了PC12细胞在水凝胶支架中培养1天和3天的细胞数量。图4是本发明应用例中PC12细胞在NGF-PLGA/Laponite-HAc可注射水凝胶中生长1天和3天的细胞荧光染色,可以看到生长3天的细胞数量比1天显著增多,表明该水凝胶支架生物相容性良好,且对PC12细胞增殖作用明显。
鬼笔环肽染色观察PC12细胞骨架
将水凝胶支架分别置于培养基中1天和3天,之后将水凝胶支架取出,采用4%的多聚甲醛溶液固定细胞,并用0.1%Triton X-100透化10min,用PBS洗涤随后使用37℃温育,随后用鬼笔环肽染液对细胞核以及细胞膜染色,采用倒置荧光显微镜观察细胞突触的生长状态。
鬼笔环肽染色结果
通过对鬼笔环肽细胞染色结果定性观察,分别观察了PC12细胞在水凝胶支架中培养1天和3天的的细胞形态变化。图5是本发明应用例中PC12细胞在NGF-PLGA/Laponite-HAc可注射水凝胶中生长1天和3天的细胞形态变化,在(A)图中多数细胞仍呈椭圆形和多角形,(B)图中多数细胞由于NGF的刺激大多数都发生了分化,细胞体积增大、突起增多并增长。表明所制备的NGF-PLGA/Laponite-HAc载药水凝胶缓释出的NGF具有良好的生物活性。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的实例,而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种缓释型透明质酸基可注射水凝胶,它为将Laponite基分散液和HAc基底液混合形成的水凝胶;其中Laponite基分散液包括载药PLGA微球和Laponite。
2.根据权利要求1所述的缓释型透明质酸基可注射水凝胶,其特征在于,所述载药PLGA微球采用复乳挥发法,将药剂负载至PLGA微球中。
3.根据权利要求1所述的缓释型透明质酸基可注射水凝胶,其特征在于,所述PLGA微球的粒径为0.4-5μm。
4.根据权利要求1所述的缓释型透明质酸基可注射水凝胶,其特征在于,所述Laponite基分散液与HAc基底液的质量比为1:(0.1-0.3)。
5.根据权利要求1所述的缓释型透明质酸基可注射水凝胶,其特征在于,所述药剂为多肽和蛋白质类药剂。
6.权利要求1~5任一项所述缓释型透明质酸基可注射水凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
1)采用复乳溶剂挥发法,将药剂负载至PLGA微球中,得载药PLGA微球;
2)将载药PLGA微球加入水中,然后加入Laponite,搅拌混合均匀,得Laponite基分散液;
3)将HAc溶于钠盐溶液中,配制HAc基底液;
4)将Laponite基分散液与HAc基底液按比例混合形成均匀的水凝胶,即得所述缓释型透明质酸基可注射水凝胶。
7.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述Laponite基分散液中载药PLGA微球和Laponite的质量比为(0.3-1):1。
8.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述Laponite基分散液中Laponite的浓度为1-3wt%。
9.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述HAc基底液中HAc的浓度为0.5-1wt%。
10.根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述HAc基底液中钠盐中引入钠离子的浓度为50-160mmol/L。
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