JP2014520546A

JP2014520546A - 胎児の組織からの親細胞バンクの調製

Info

Publication number: JP2014520546A
Application number: JP2014519671A
Authority: JP
Inventors: リーアンローラン−アップルゲート
Original assignee: セントレホスピタリエユニヴェルシテールヴォードワ
Priority date: 2011-07-11
Filing date: 2012-07-10
Publication date: 2014-08-25
Anticipated expiration: 2032-07-10
Also published as: EP2546335A1; US20140193377A1; US8986678B2; CN103874763A; US20150152388A1; PL2732030T3; US9434923B2; WO2013008174A1; EP2732030B1; ES2654292T3; EP2732030A1; HK1198179A1; JP5964956B2

Abstract

本発明は、胎児の骨端組織、胎児のアキレス腱組織および胎児の皮膚組織からなり、創傷および組織の修復方法に用いられる、細胞型の迅速な機械的な初代細胞培養選択を用いた胎児の組織からの親細胞バンク（ＰＣＢ）のインビトロでの調製方法に関する。
【選択図】なし

Description

本発明は、胎児の骨端組織、胎児のアキレス腱組織および胎児の皮膚組織からなり、創傷および組織の修復方法に用いられる細胞型の迅速な機械的な初代細胞培養選択を用いた胎児の組織からの親細胞バンク（ＰＣＢ）のインビトロでの調製方法に関する。

細胞療法は、組織の機能を修復、回復または改善するための薬物療法、特に伝統的な外科技術との薬物治療の組み合わせへの興味深い補助となっている。いくつかの細胞選択は、患者の細胞治療により順応性がある。成長中の全年齢の動物およびヒトからの組織選択は、それぞれの最終的な細胞型への利点と欠点を評価され得る。ヒト細胞に基づく治療のための最新の制限は、細胞増殖能力（単純な培養条件）、初代ヒト細胞培養の分化表現型の維持、伝染病の感染およびそれらの分離手順に基づく細胞の選抜集団の一貫性および安定性に関する技術的な限界に関している。１つの臓器提供から培養された初代胎児細胞は、治療薬の開発の緊急かつ厳しい技術態様を満たす。１つの胎児の臓器提供からのオリジナルで実用的な細胞バンクは、短期間で開発され得、安全試験は細胞バンク化の全段階で達成され得る。

細胞療法は、特定の組織の外科的処置および再生医療についての低侵襲性代替療法または併用療法として提案されている。種々の細胞型は、調査されており細胞療法において用いられる：脂肪組織、血小板、胎盤および羊水細胞と共に、胚性幹細胞（ＥＳ）、へその緒細胞、（骨髄−血瘤幹細胞またはＨＳＣｓおよび髄幹細胞またはＭＳＣからの）胎児の細胞および大人の幹細胞。再生医療における任意の利用に関しては、細胞発生および細胞型は、必須の態様である。各細胞型は、種々の利点および欠点を有する具体的な治療のための分化と自己再生能力を操作するための異なる方法を必要とする。

胎児の細胞は、とりわけ、必要なワクチンの開発において、重要性はあまり公知にされることなく、長年、生物学および薬において広く用いられている。胎児の細胞は、高度に増殖し、再生し、低免疫原性の特性を有する分化細胞である。それらは発生の９週間後の胚形成期が起こる胎児の組織から分離され得る。胎児の皮膚細胞は、以下を包含するいくつかの理由のために効果的で安全な細胞療法および再生医療のための理想的な解決策を提供するだろう；ａ）１つの臓器提供から細胞の増殖能力；ｂ）最少の細胞成長の条件；ｃ）デリバリーのための生体材料への適応化；およびｄ）酸化的ストレスへの耐性。胎児の皮膚細胞は、十分に凍結した細胞を作製するために１つの臓器提供（１〜４ｃｍ^２の組織）のみを必要とするので、広範囲の拡大が可能であり、何十万もの治療をすることができるバンクを製造することができる（すなわち、皮膚に関して９×１２ｃｍを構成する３５０億超の胎児の皮膚は１つの専用の細胞バンクから製造され得る。）。細胞培養の要求または幹細胞と間葉系細胞の型と比べて最小限である。胎児の皮膚細胞はすでに分化され、直接または代替で必要とされないので、通常必要である膨大な数の追加成長因子は、細胞培養および細胞増殖には必要ではない。細胞バンク用に、遺伝性ウイルス性、真菌性または細菌性疾患を避けるためにドナーの厳選とドナーおよび培養細胞の両方の広範囲のスクリーニングは、治療用途への胎児細胞の安全性の高い利用を提供する。加えて、新生児、若者または大人の細胞のものとは異なる胎児の細胞は、患者への効率的かつ簡単な送達を可能とする生体材料の特に十分に適応する。ドナー（新生児から大人）からの細胞は、種々の生体材料へ効率的に統合することができず、いくつかの生体材料は、実際、細胞に対して毒性があることが示されている。足場は再生医療に非常に重要であるが、細胞型はほぼ確実に限定要因である。臨床デリバリーのための最終生成物の処理のため、最終生成物の均一な分配や開発の迅速性は、かなり重要な利点である。これまでのように長い培養期間が、自己移植または購入可能な製品に関して必要であるとき、不純物の増加する危険性を無視できない。一貫性があり、容易に再現されるプロセスを有することも重要である。胎児の細胞を備える一貫性のある細胞バンクを開発することにより、多くの危険因子は除外され、安全で効果的なヒト細胞に基づく治療を身近なものとしてもたらすことができる。

同一性、純度、無菌性、安定性、安全性および有効性を包含している重要な要素は、細胞に基づく生産物に勧められている。すべてにおいて、新たな法令は、臨床試験および処置に用いられる細胞に基づく生産物や生産環境に厳しい基準を課している。ヒト細胞に基づく治療の最新の制限事項は、細胞増殖能力（単純な培養条件）、初代ヒト細胞培養の分化表現型の維持、伝染病の感染およびそれらの分離手順に基づく細胞の選抜集団の一貫性および安定性に関する技術的な限界に関連している。１つの臓器提供から培養された初代胎児細胞は、治療製品の開発のための過酷で厳しい技術態様を満たす。胎児の１つの臓器提供からのオリジナルでかつ実用的な細胞バンクは、短期間で開発され得、安全試験は細胞バンクの全段階で実施され得る。治療用途のため、胎児の細胞は、アウトスケーリングプロセスにけるそれらの寿命の最大２／３に用いられ、様々な生物学的特性の一貫性は、タンパク質濃度、遺伝子発現を包含し、そして生物活性が確保される。

収集、培養増殖および貯蔵に関する胎児細胞の比較的単純な操作は、胎児の細胞を細胞療法の魅力的な選択物にしている。ＥＳ細胞とは違って、胎児細胞は、移植されたときに腫瘍を形成せず、免疫原性を欠乏すると思われる。今まで、間葉系幹細胞とは対照的に、胎児の細胞は、成長のための支持細胞層または分化のための特異的成長因子のためにを必要としない。１つの臓器提供は、何十万もの患者の処置に用いられるであろう一貫性のあるマスター細胞バンク（ＭＣＢ）を製造することができる。十分に定義された一貫した細胞バンクは、血清学および病理学が達成されるオリジナルの臓器提供と並行して、可能性のあるウイルスおよび病原体に関する安全性をより容易に評価され得る。

軟骨細胞（軟骨前駆細胞）、皮膚線維芽細胞前駆細胞、および腱前駆細胞を包含する特定の細胞源を生成できる軟骨、腱および皮膚のような特定の組織からの胎児の分化細胞の初代培養により、開発される臨床細胞バンクの質が決定される。組織の初期の処置は、後に製造される細胞の生理的特性に主に重要なものであること十分認識されている。初代培養における慣用の最新技術は、組織の小片を酵素的に消化して、細胞培養のために全ての生細胞を遊離させることである。このことは、特に「硬」組織に用いられているが、軟組織にも用いられており、複数の消化ステップは日常的に用いられている。これをすることにより、完全に異なる細胞集団は解放され、初代細胞培養および次代細胞培養において培養される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。

しかしながら、酵素による治療は、異なる形態、生理的特性、安定性、および効用を有する細胞集団の一貫性のない発生の原因となることも知られている（非特許文献５）。

関節軟骨の無血管、無神経（ａｎｅｕｒａｌ）および無リンパ球（ａｌｙｍｐｈａｔｉｃ）の性質により、外科手術と再生医療の両方に関してこの組織の修復を困難なものにしている。骨軟骨の治療戦略、とりわけ中心および物議を醸す問題のままである細胞源の選択のための至適の基準は、決定から程遠い。大人の間葉系ストロマ細胞（ＭＳＣ）は、表現型均一性、信頼性および安定性の問題にもかかわらず、これまで、最も用いられた細胞源である。

骨関節炎の欠陥の治療は、これまで満足のいく治療の解決策が存在しなかったので改善される必要がある。軟骨の早期の変性を避ける新たな解決方法を開発して、全関節置換を避けるのがきわめて重要である。新たな細胞により補助される外科技術の開発は、厳しい治療薬の調製の要求を満たすことができる、明確な細胞バンクの生成物に基づく。

ＣａｒｒａｓｃｏｓａＡ，ＡｕｄｉＬ，ＢａｌｌａｂｒｉｇａＡＰｅｄｉａｔｒｉｃＲｅｓｅａｒｃｈ，１９８５年，第１９巻，ｐ．７２０〜７２７ＲｏｃｈｅＳ．ｅｔａｌ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００１年，第２２巻，ｐ．９〜１８ＢａｅＨ．ｅｔａｌ，ＴｈｅＳｐｉｎｅＪｏｕｒｎａｌ，２００８年，第８巻，第５号，ｐ．９２Ｓ〜９３ＳＲｅｇｉｎａｔｏＡ．Ｍ．ｅｔａｌ，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓａｎｄＲｈｅｕｍａｔｉｓｍ，１９９４年，第３７巻，第９号Ｄｉａｚ−ＲｏｍｅｒｏＪ，ＧａｉｌｌａｒｄＪ−Ｐ，ＧｒｏｇａｎＰ，Ｎｅｓｉｃ，ＴｒｕｂＴ，ＶａｒｌｅｔＰ−ＭＪＣｅｌｌｕｌａｒＰｈｙｓｉｏｌ，２００５年，第２０２巻，ｐ．７３１〜７４２

したがって、治療戦略において使用するための新しい組織（腱、軟骨、他の筋骨格組織、および皮膚など）を製造する方法を開発する需要がまだある。より具体的には、より安定かつ均一な細胞集団を提供する細胞バンクを開発し、免疫応答の危険なきっかけとならず、感染病原体を運ばない、適切な細胞源を見出すことの需要がある。

上述の確認された問題を解決するため、出願人らは、親細胞バンク（ＰＣＢ）の構築の特徴を定義する初期に付着する細胞集団を、機械的に、および、迅速に遊離させる非酵素方法を構築している。いくつかの実施形態において、主要な分化細胞は、特定の軟骨組織、特定の腱組織および特定の皮膚組織に由来する。当業者による、他の実施形態には、皮膚および筋骨格組織（腱、骨、筋肉および椎間板など）からの主要な分化細胞を包含してもよい。ＰＣＢの開発は、着実で、安定なさらなる細胞バンクが構築されることを可能とする。

具体的に、一実施形態において、本発明は、胎児の骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の皮膚線維芽細胞からなる群から選択される胎児細胞の単離、増殖および発生のためのインビトロの非酵素方法であって、以下の段階を提供する：
ａ）胎児の骨端軟骨細胞を含む尺骨の胎児の軟骨；胎児のアキレス腱細胞を含む胎児のアキレス腱；または胎児の皮膚線維芽細胞を含む胎児の腹部の皮膚；から選択される、胎児のサンプルを使用する工程、
ｂ）前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを外科用メスの切断面に機械的に接着させることにより、微小に切断し分散させる工程、
ｃ）前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを、前記胎児の骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の腹部の皮膚の線維芽細胞を増殖する条件下で、インビトロで培養する工程、
ｄ）第一の接着性の胎児の骨端軟骨細胞の細胞集団、第一の接着性の胎児のアキレス腱の細胞集団、および第一の接着性の胎児の皮膚線維芽細胞集団を前記培養から選択し、単離する工程。

別の実施形態において、本発明は、本発明の非酵素方法により得られ、指定番号ＦＥ００２−Ｔｅｎを有する胎児のアキレス腱細胞の細胞株を受入番号ＥＣＡＣＣ１２０７０３０３−ＦＥ００２−Ｃａｒｔで供託され、指定番号ＦＥ００２−ＳＫ２を有する受入番号ＥＣＡＣＣ１２０７０３０２−ＦＥ００２−Ｔｅｎおよび胎児の皮膚線維芽細胞株で供託され、ならびに受入番号ＥＣＡＣＣ１２０７０３０１−ＳＫ２で供託されている、胎児の細胞（指定番号ＦＥ００２−Ｃａｒｔを有する胎児の骨端軟骨細胞の細胞株など）を提供する。

別の実施形態において、本発明は、種々のマトリックスに統合された分化された軟骨、腱または皮膚細胞を用いることにより、新しい軟骨組織および／または３次元構造、新しい腱組織および／または３次元構造、新しい皮膚組織および／または３次元構造の製造のため、本発明の方法により得られる胎児細胞の使用を提供する。

別の実施形態において、本発明は、治療薬として用いられる本発明の方法により得られる胎児の細胞を提供する。

別の実施形態において、本発明は、骨軟骨組織および筋骨格組織の修復用および再生用の方法において使用するための、腱組織および筋骨格組織の修復用および再生用の方法において使用するための、ならびに皮膚組織の修復用および再生用の方法において使用するためのならびに熱傷、創傷および線維症状態を治療するための本発明の方法により得られる胎児の細胞を提供する。

別の実施形態において、本発明は、骨軟骨疾患または欠損、関節炎および筋骨格疾患の処置方法において使用するため；筋骨格疾患および腱障害の処置方法において使用するための；皮膚疾患の処置方法において使用するため、本発明の方法により得られる胎児にお細胞を提供する。

本発明のさらなる実施形態において、本発明の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）、胎児のアキレス腱細胞または胎児の皮膚線維芽細胞の使用を含む、関節炎、骨軟骨欠損、軟骨修復、腱修復、筋骨格組織修復および皮膚修復の処置のための治療薬および／または医療装置の開発のためのスクリーニング方法が提供される。

胎児の皮膚前駆細胞用の親細胞バンクの製造を始める組織生検および一貫性を示す４日目の細胞選択を示す図である。低密度播種（約２０００細胞／ｃｍ^２）の後の胎児の皮膚前駆細胞の細胞増殖と、高い安定性、一貫性および維持される機能を示す６日目および１２日目の凍結細胞ストックの回復を示す図である。組織を酵素的に消化し、親細胞バンクと非一貫性の細胞集団を調製する場合、細胞集団選択の形態学的かつ増殖の差異を示す図である。胎児の腱前駆細胞（アキレス腱細胞）について親細胞バンクの製造を始めるための組織生検および一貫性を示す４日目の細胞選択を示す図である。低密度播種（約２０００細胞／ｃｍ^２）の後の胎児の腱前駆細胞の細胞増殖と、高い安定性、一貫性および維持される機能を示す０日目、３日目、７日目および１０日目の凍結細胞ストックの回復を示す図である。胎児の腱前駆細胞を特徴付けるＦＡＣ分析および３Ｄマトリクスの堆積を示す図である。胎児の軟骨前駆細胞（胎児の骨端軟骨細胞）のための親細胞バンクの製造を始める近位尺骨の骨端の組織の処理および６日目の一貫性を示す細胞選択を示す図である。低密度播種（約２０００細胞／ｃｍ^２）の後の胎児の軟骨前駆細胞（胎児の骨端軟骨細胞）の細胞増殖と、高い安定性、一貫性および維持される機能を示す６日目および１２日目の凍結細胞ストックの回復を示す図である。胎児の軟骨前駆細胞（胎児の骨端軟骨細胞）の特徴であるＦＡＣ分析および３Ｄマトリクスの堆積を示す図である。機械的に切断してプレートに沿って配置された組織培養プラスチック上での胎児の細胞の前駆細胞の増殖を示す図である。組織の非酵素調製を用いる臨床の親細胞バンクの迅速な開発を示す図である。

本願明細書に記載されるのと同様または等価の方法および材料が本発明の研究または試験において用いられうるが、好適な方法および材料は以下に記載されている。すべての出版物、特許出願、特許および本願明細書で述べられる他の参考文献を参照によりその全体を援用したものとする。本願明細書で論じられる出版物および出願は本願の出願日の前の開示を単に提供する。本願明細書において、本発明は、先行発明に基づいたこのような出版物に先行して権利を与えられないことを認めるものと解決されるべきではない。加えて、物質、方法、および実施例は、例示目的のみであり、限定することを意図しない。

矛盾する場合、定義を包含している本願明細書が優先されるだろう。特段の記載がない限り、本願明細書で使用される全技術用語および科学用語は、本願の属する技術分野で一般的に理解されているような意味と同じ意味を有する。本願明細書で使用する場合、以下の定義は本発明の理解を容易にするために提供される。

本願明細書において用いられる、［ａ］または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１以上」を意味する。

用語「含む」は、一般的に包含するという意味で用いられ、つまり、１以上の特徴部または成分の存在を可能とする。

用語「生体材料」は、細胞または生物組織と接触して、有害な効果を有しない金属、セラミックおよびポリマーを包含している天然または合成材料を意味する。通常、生体材料支持物は、オレフィンポリマー、フッ素ポリマー、ポリスチレン、ポリアクリルポリマー、ポリエステルポリマー、ポリウレタンポリマー、ケイ素ポリマー、セルロースポリマー、エポキシポリマー、シリコーン−ベースポリマー、合成ヒドロゲル、ポリカーボネートを含むポリマー支持物；チタンおよびチタン合金、ニチロール、ジルコニア、ステンレス鋼およびコバルトクロム、アルミナ−ジルコニア複合材料を含む生体適合性金属支持物；および／またはポセレン、ヒドロキシアパタイト；およびこれらの混合物を含む生体適合性セラミックからなる群から選択される。

用語「胎児の軟骨細胞または軟骨前駆細胞」、「胎児のアキレス腱細胞または胎児の腱前駆細胞」、または「胎児の線維芽細胞または胎児の皮膚前駆細胞」は、分化されていない胎児の細胞と比較される分化細胞を意味する。本発明に反して、用語「分化されていない」は、未熟または原子細胞を説明するために用いられる。例えば、分化されていない胎児の皮膚細胞は、皮膚線維芽細胞と表皮角化細胞または関係のない組織の他の特定の細胞型にさえも分化しうるものを包含する。分化細胞は、別の細胞型に特異的な分化培地に配置されたときまたは異なる微小環境に配置されたとき、異なる細胞系統に脱分化しないだろう。例えば、胎児の皮膚線維芽細胞が骨原性の分化培地に配置される場合、その皮膚線維芽細胞は骨芽細胞の全集団にならないであろうし、またはその皮膚線維芽細胞が脂質形成培地に配置され場合、その皮膚線維芽細胞は含脂肪細胞の全集団にならないであろうし、そして同じ細胞が骨と共に３Ｄマトリクスに配置される場合、その皮膚線維芽細胞は環境の変化のせいで骨芽細胞の全集団に脱分化しないであろう。したがって、これらの定義された分化細胞は、人間医学および獣医学の両方の治療薬としての有望な使用への大きな利点である。

用語「適切な培養条件」または「胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞、胎児の腱前駆細胞または胎児の皮膚前駆細胞が増殖する条件」は、増殖を促進する栄養素を含有する細胞を培養するための培地である。栄養分の培地は、適切な組み合わせかつ適切な濃度で、以下を任意に含有してよい：等張食塩水、緩衝液、アミノ酸、血清または血清代替物、および他の外から添加された要素。当業者は、任意の共通に用いられる培養条件が用いられうることを理解するだろう。最も適切な培地、培地調製、および細胞培養技術の選抜方法は当該技術分野で周知であり、Ｄｏｙｌｅら，（編），１９９５，Ｃｅｌｌ＆ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ；およびＨｏおよびＷａｎｇ（ｅｄｓ．），１９９１，ＡｎｉｍａｌＣｅｌｌＢｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｂｏｓｔｏｎ（参照により本願明細書に援用したものとする）を包含している様々な発信源に記載されている。例えば、任意の適切な型の培地は、本発明の胎児の骨端軟骨細胞を単離するために使用することができ、これらに限定されないが、ＤＭＥＭ、マッコイ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）、イーグル基礎培地、ＣＭＲＬ培地、グラスゴー最小必須培地、ハムＦ−１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、リーボビッツＬ−１５培地、およびＲＰＭＩ１６４０などであり、とりわけ無血清の培地である。培地は、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、定義された成長因子血清代替物、ウマ科の血清（ＥＳ）、ヒト血清（ＨＳ）、定義された細胞培養成長因子および１以上の抗生物質および／または微生物の混入を制御する抗真菌薬（例えば、ペニシリンＧ、硫酸ストレプトマイシン、アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、およびニスタチン）、とりわけ、単独または組み合わせを包含する１以上の成分を補添されていてよい。

用語「細胞株」は、無制限に継代数を限られた適切な新鮮培地と十分な空間が与えられたならば増加するであろう永久的に樹立される細胞培養物を言及する。用語初代細胞株は樹立細胞培養を言及する。

用語「細胞バンク」は、ドナーの胎児の組織（尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の皮膚など）から生検を採取すること；適切な培養条件下で、胎児の組織を成長させ、胎児の細胞を高濃度まで増殖させること；酵素または非酵素による処置（すなわち、トリプシン）を用いて、得られた培養物の組織および細胞を懸濁液とすること；懸濁した細胞のプールを作り、培養物から細胞のほぼ均一な懸濁液を作製すること；凍結保護物質と穏やかに混合すること；アンプルに細胞の懸濁液の一定分量を封入すること；一定分量を冷凍すること；を意味する。最適な冷凍速度は、実験的に決定されてよい。例えば、−８０℃まで、１℃／ｍｉｎでアンプルの温度を低下させ、次いで約２４時間後、−１６０℃に移し、または校正された、Ｎａｎｏ−Ｆｒｅｅｚｅｒ中で、自動的にプログラムサイクルで、−１６５℃まで全サイクル冷凍する。この極低温バンクは、細胞が老化を停止するように保存し、これにより、それらの細胞が集められた日の機能および活性を保つことを可能とする。

本発明の凍結保存した細胞は、細胞バンク（１〜１０^７／ｍｌ）を構成し、その一部を解凍することによって引き出すことができ、次いで必要に応じて新しい軟骨細胞および組織を製造するために用いられる。解凍は、一般的に迅速に行われるべきであり、例えば、アンプルを液体窒素から３７℃の水浴に移すことで行われる。アンプルの解凍された内容物は、滅菌状態で、１０％のＦＢＳで調整されたＤＭＥＭなどの適切な培地を含有する培養容器にすぐに移される。培地中の細胞は、約１〜６Ｘ１０^３〜４細胞／ｍｌの初期密度に調節されるのが望ましい。培養下で、細胞は毎日試験されてよく、例えば、細胞増殖を見出すために倒立顕微鏡を用いて試験され、それらが適切な密度に達するとすぐに継代培養され、または品質管理のため走査顕微鏡法を用いてリアルタイムに観測される。

本発明の細胞は、必要に応じて上記バンクから採用されてよく、そして、新しい軟骨、腱または皮膚組織または細胞の製造のため、インビトロ（例えば、本願明細書に記載されるような３次元の軟骨、腱または皮膚培養として）またはインビボ（例えば、新しい軟骨、新しい腱もしくは新しい皮膚組織または細胞が必要とされる対象者の部位の細胞の直接投与により）のいずれかで用いられてよい。

用語「対象者」（「対象者」の処置においてみられるような）または「患者」は、病態、欠陥、障害または疾患（ここでは具体的なものとして）に罹患し、なりやすく、または苦しんでいる個々の哺乳類を言及することを意図する。その用語は、年齢または性別を示さない。したがって、大人および新生児の対象者は、男性または女性に関わらず、それらが含まれることを意図する。この用語は、ヒトと動物の両方も包含する。例えば、対象者は、例えば、ヒト、人間以外の霊長類、野生生物、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、またはマウスでありうる。好ましくは、対象は、ヒトとウマである。本願明細書で使用する場合、用語「野生生物」は、家畜化されていない任意の哺乳動物、トリ、両性類またはサカナを包含する。そのような野生生物の例は、これらに限定されないが、アナグマ、ビーバー、ライオン、トラ、ベア、タカおよびシカを包含する。

３次元マトリクスは、例えば、ＨＡ（ヒアルロン酸）、シリコーン、キトサンまたはそれらの混合物を包含しているコラーゲンマトリクスまたはＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＥＧ、キトサン、エラスチン、ヒドロゲルから選択される任意のマトリクスを意味する。マトリクスは、３次元空間を提供し、胎児細胞（胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞、胎児の腱前駆細胞、胎児の皮膚前駆細胞、または胎児からの生成物）の適切な被覆および胎児細胞の送達を確保するか、または追加のインプラント材料との結合を確保する。一実施形態において、本発明の方法は、種々のマトリックスに組み込まれた分化された軟骨、腱または皮膚細胞を用いる３次元構造の調製を可能とする。マトリクスを用いた分化した軟骨、腱または皮膚細胞の統合は、マトリクス内への細胞の混合、組み込み、ピペット操作、播種、プレート化または配置により起こりうる。

用語「コラーゲン」は、ポリペプチド化合物を言及し、それは、細胞外の酵素により分解を受けやすい天然で親水性の化合物を言及する。この物質は、十分に研究されているので、多くのキーパラメータが制御され得る。コラーゲンは、弱い抗原であり、これにより、結果的に最少限の拒絶反応の可能性となる。本発明の方法および使用において用いられる好ましいコラーゲンは、ウマのコラーゲンまたはブタのコラーゲンである。

「インプラント」は、欠乏した生物学的構造を置換し、損傷した損傷した生物学的構造を保護し、または存在する生物学的構造を強化するための医療装置として考えられうる。インプラントは、人工または天然の物質から作製され得る。医療用インプラントは、人工装置であり、チタン、シリコーン、ポリマー、アパタイト、バイオフォームおよびバイオゲルなどの生体材料から作製されてよい体に接するインプラントの表面である。いくつかのインプラントは、すでに付随している生理活性溶出薬品（埋め込み型のカプセルまたは薬品溶出ステントなど）を有しうる。インプラント材料は、特定の組織の種類（抗繊維応答のための分化された胎児の細胞）と結合できる。

用語「送達システム」は、任意の金属または通常用いられる整形外科、外傷、顎顔面の天然または合成インプラント材料、ヒドロゲル、シリコーンまたはグラフトを意味し、胎児の細胞もしくは胎児の細胞の生成物のみを移動させる手段または組織を処置するためにインプラントと結合する手段またはインプラントを与える手段を提供する。

用語「軟骨組織」は、当該技術分野で一般的に理解される言語として本願明細書で使用され、ＥＣＭに組み込まれた細胞を含む密性結合組織の特定の型を言及する（例えば、Ｃｏｒｍａｃｋ，１９８７，Ｈａｍ’ｓＨｉｓｔｏｌｏｇｙ，第９版，Ｊ．Ｂ．ＬｉｐｐｉｎｃｏｔｔＣｏ．，ｐｐ．２６６〜２７２参照）。軟骨の生化学組成は、種類より異なり、しかしながら、一般的な軟骨組成物は、コラーゲン、プロテオグリカンおよび水からなる密生ＥＣＭによって取り囲まれている軟骨細胞を含む。種々の軟骨の型は、例えば、硝子軟骨、関節軟骨、肋軟骨、線維軟骨、半月板の軟骨、弾性軟骨、耳介軟骨、および黄色の軟骨を包含していると、当該技術分野で理解されている。軟骨の任意の型の生産物は、本発明の範囲に含まれる。一実施形態によれば、本発明は、好ましくはヒトに用いられる新しい軟骨組織の生産物の組成物および方法に向けられている。しかしながら、本発明は、とりわけ、新しい軟骨組織を必要とする任意の哺乳動物（ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタを包含している）において使用するための新しい軟骨組織を製造するために実施されてもよい。そのような動物の処置は、本発明の範囲に含まれることを意図される。

用語「腱組織」は、その用語が当該技術分野で一般的に理解されているように本願明細書で使用され、主にコラーゲン、プロテオグリカンおよび水を含む線維性結合組織の特定の種類を言及する。

用語「皮膚組織」は、当該技術分野で一般的に理解される言語として本願明細書で使用され、コラーゲン、エラシチン、およびプロテオグリカンも含む特定の繊維製組織を言及する。

本発明の一実施形態において、親細胞バンク（ＰＣＢ）の構築の特徴を定義する初期に付着する細胞集団を機械的に、迅速に遊離させる非酵素方法が開示されている。いくつかの実施形態において、主要な分化細胞は、特定の軟骨組織、特定の腱組織および特定の皮膚組織からもたらされる。ＰＣＢの開発は、一定して安定なさらなる細胞バンクが完成するのを可能とする。

したがって、本発明の一実施形態によれば、胎児の骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の皮膚線維芽細胞からなる群から選択される胎児細胞の単離、増殖および発生のためのインビトロの非酵素方法であって、以下の段階が提供される；
ａ）胎児の骨端軟骨細胞を含む尺骨の胎児の軟骨；胎児のアキレス腱細胞を含む胎児のアキレス腱；または胎児の皮膚線維芽細胞を含む胎児の腹部の皮膚；から選択される、胎児のサンプルを使用する工程、
ｂ）前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを外科用メスの切断面に機械的に接着させることにより、微小に切断し分散させる工程、
ｃ）前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを、前記胎児の骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の腹部の皮膚の線維芽細胞を増殖する条件下で、インビトロで培養する工程、
ｄ）第一の接着性の胎児の骨端軟骨細胞の細胞集団、第一の接着性の胎児のアキレス腱の細胞集団、および第一の接着性の胎児の皮膚線維芽細胞集団を前記培養から選択し、単離する工程。

好ましくは尺骨の胎児の軟骨サンプルは胎児の近位尺骨の骨端のサンプルである。

具体的な実施態様において、本発明は、１つの組織の提供（たった０．２〜２ｃｍの組織）から、胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞（ＦＥＣ）、胎児のアキレス腱の前駆細胞、および胎児の皮膚前駆細胞の親細胞バンクの単離、増殖および発生のための方法に関する。軟骨、腱および皮膚の源は、一定した細胞バンクを構築するのに重要である。出願人らは、尺骨の胎児の軟骨が脛骨、大腿骨または肋軟骨からの源より優れていること、胎児のアキレス腱が優れ、および腹部からの胎児の皮膚が優れていることを見出した。胎児の軟骨、腱および皮膚は、著しい修復能力を有し、そして胎児の細胞は、免疫調節活性および重要な創傷治療能力を示す。軟骨に関して、ＦＥＣの骨端および細胞特性化後の天然の骨軟骨形成能力と組み合わせて、本発明の非酵素の方法において単離された細胞集団を、骨軟骨および／または軟骨組織修復および再生のための非常に興味深い細胞選抜にする。

選択された細胞集団の遊離用の消化の伝統的な初代培養方法は、本発明の方法において用いられていない。消化は、自動的に解離しない組織から一般的になされる（すなわち、血液細胞成分、いくつかの胎盤組織部分、いくつかの臍帯部分）。組織培養プレートへの切開部に誘導された組織／細胞増殖と合わされている組織の機械的解離により、数日における成長のみの第一接着細胞集団が選択され、この集団は非常に一定であり、均一である。これらの細胞集団はより迅速に成長し、すでに酵素により消化されている他の細胞集団とは異なる形態学的かつ生理的プロファイルを有する。出願人は、表面への細胞アラインメントを伴った機械的処理と比較して酵素により消化された胎児の皮膚組織について、２Ｄにおいて成長の差異を示した。

重要なことに、組織の消化なしで初代培養が行われる場合、胎児の間接軟骨細胞、胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞は、他の細胞系統へ容易に脱分化できない。細胞バンク手順において酵素による消化なしで成長された軟骨細胞または軟骨前駆細胞、腱前駆細胞および皮膚前駆細胞は、それらの初代細胞培養のために酵素により処理されているまたはプラスチック培養ティッシュに付着させるための固体組織成分を有しない骨髄または胎児の間接軟骨細胞由来の間葉系幹細胞などの神経、脂質生成および完全な骨原性細胞に分化しない。別の重要な態様は、非酵素細胞初代細胞培養からの開発された細胞バンクが結果的にインビトロで継代よりもさらに安定な細胞となることである。形態および染色体の安定性は、ヒトの治療薬のためにこれらのバンク細胞を用いるための重要な因子である。

非酵素の方法を用い、培養物中のこのＦＥＣ集団、腱前駆細胞集団および皮膚前駆細胞集団の観測された均一性および安定性と共に処理される完全なｃＧＭＰ単離の安定性は、インビトロでのＦＥＣ、腱前駆細胞および皮膚前駆細胞の確実な培養およびこの開示されている方法のＰＣＢ集団から広範なマスター細胞バンクの開発を可能とする。何十万もの患者の臨床応用のために各組織の同じ細胞バンクを用いることが可能となり、新規な骨軟骨、筋骨格および皮膚の再生治療を可能とする。

筋骨格組織（腱、骨、筋肉、椎間板および軟骨ならびに皮膚組織など）は、１０〜１６週の胎児の組織に由来するとき、臨床用途のために親細胞バンクを迅速に開発するための理想的な源である。組織が酵素により消化されないとき、および細胞アラインメントがギザギザな表面に沿って向いているときに得られる細胞は、素早く（組織が酵素により消化されるときの数週間〜数か月に対して１２〜１４日間以内で）調製され、集団中で均一になり、生物指標に関連する特定の組織から細胞型の特徴を維持する。

本発明の非酵素の方法は、公知の酵素による方法により得られた細胞と異なる細胞を提供する。したがって、実施形態において、本発明は、本発明の非酵素方法により得られ、指定番号ＦＥ００２−Ｃａｒｔを有し、受入番号ＥＣＡＣＣ１２０７０３０３−ＦＥ００２−Ｃａｒｔ（２０１２年７月３日）で供託されている胎児の骨端軟骨細胞細胞株を提供する。別の実施形態において、本発明は、指定番号ＦＥ００２−Ｔｅｎを有し、受入番号ＥＣＡＣＣ１２０７０３０２−ＦＥ００２−Ｔｅｎ（２０１２年７月３日）で供託されている本発明の非酵素方法により得られる胎児のアキレス腱細胞細胞株（本願明細書に胎児のアキレス腱前駆細胞株として示されてもいる）を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、指定番号ＦＥ００２−ＳＫ２を有し、受入番号ＥＣＡＣＣ１２０７０３０１−ＦＥ００２−ＳＫ２（２０１２年７月３日）で供託されている本発明の非酵素方法により得られる胎児の皮膚線維芽細胞株（胎児の皮膚前駆細胞細胞株として本願明細書に示されてもいる）を提供する。

一度構築されれば、胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞の培地は、新しい軟骨細胞および組織を製造することができる軟骨細胞を製造するために用いられてよい。胎児の骨端軟骨細胞の軟骨細胞への分化、その後の軟骨組織の産生は、特定の外因性の成長因子（例えば、アスコルビン酸塩などを用いたまたは用いないＢＭＰ（ＢＭＰ−１３などまたはＴＧＦ−β）など）の使用と共にまたは使用なしで、培地に添加することにより引き起こされ得る。構築された胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞から同様の手順が利用されうる。

本発明は、さらに、軟骨細胞の培養物と胎児の骨端軟骨細胞および軟骨細胞の両方を含む混合培養物の構築および維持を企図する。胎児の骨端軟骨細胞と同様に、軟骨細胞の培養物または胎児の骨端軟骨細胞および軟骨細胞の混合培養物が構築されると、軟骨を形成せずに細胞増殖をもたらす条件下、例えばＴＧＦ−βまたは他の成長因子を欠く培地中などで、細胞密度を指定した新鮮な培地への継代により細胞集団はインビトロで分裂して増殖する。プレ軟骨細胞の培養物と同様に、軟骨細胞の培養物と胎児の骨端軟骨細胞および軟骨細胞の混合された培養物とは、十分な細胞密度に達するときに新鮮な培地に移されるべきである。したがって、細胞の単層の形成は、例えば、新しい培養容器の新鮮な培地に細胞の一部を移すことにより妨げられ、または最小化されるべきである。そのような除去または移動は、約２５％培養密度を超える細胞単層を有する任意の培養容器中で行われるべきである。あるいは、培養系は撹拌され細胞の接着を妨げうる。同じ方法は、胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に同様に用いられうる。

本発明のさらなる実施形態において、尺骨の胎児の軟骨から単離された胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞の集団は、分裂して膨張し、インビトロで増殖され、治療用途用の軟骨組織および細胞を製造しうる軟骨細胞を生じる。同じ方法は胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等しく用いられうる。したがって、実施形態において、本発明は、治療薬としての使用のための本発明の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）、胎児のアキレス腱細胞および胎児の皮膚線維芽細胞に関する。

本発明の別の実施形態において、尺骨の胎児の軟骨から単離された胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、低温保存され、「バンク」に凍結して貯蔵され、その「バンク」からそれらの細胞が、必要な場合に軟骨組織および細胞を製造するために、解凍されて、使用できる。そこから回収されまたは製造される胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、数年間、「バンク」に冷凍保存され得る。細胞は、解凍され、必要に応じてバンクから取り出され、その解凍された細胞は、軟骨、他の間葉系の組織（骨、腱または靭帯）の修復、置換および増強のためにいつでも新しい組織および細胞を製造するために使用されうる。同じ方法は胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に同等に用いられうる。

尺骨の胎児の軟骨サンプルから単離された細胞の胎児の性質の結果として、本発明の移植された胎児の骨端軟骨細胞またはそこから製造された軟骨組織の免疫拒絶は最小化されるかもしれない。したがって、本発明の別の実施形態において、そのような細胞は、その細胞を必要とする対象者に使用するための「偏在性ドナー細胞」として有用である。同じ特質は胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞にも同等に見られうる。

本発明の別の実施形態において、胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞、胎児のアキレス腱前駆細胞または胎児の皮膚前駆細胞は、ヒドロゲル溶液に懸濁され、患者に注射または移植され得る。あるいは、細胞はまずヒドロゲルに播種され、次いで移植前に培養される。好ましくは、細胞は、ヒドロゲル中で培養され、移植前に分裂して増殖する。

本発明のさらに別の実施形態において、新しい軟骨組織および細胞集団は、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞から調製され、当該技術分野で公知のまたは将来開発される修復、置換または増強の任意の技術を用い対象者における軟骨組織の修復、置換または増強に用いられる。例えば、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、軟骨細胞で埋めることができる間質腔、開口部または細孔を有する生体適合性非生物物質からなる３次元のフレームワークまたは足場に播種できる。適切なインビトロの培養条件下で、播種された細胞は、実質的に３次元の骨格を包み込み、細胞外マトリクスを隠し、インビボで移植されうる新たな生きた軟骨組織を形成する。あるいは、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、３次元のフレームワークに播種され、すぐに対象者の部位に移植される。播種された細胞は、インビボで新しい軟骨組織を形成し続け、またはレシピエントの軟骨の修復および再建を促進する。同じ方法は胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に同じ手段で等しく利用され得、レシピエントの腱または皮膚の新しい腱組織または新しい皮膚組織の修復および再建を形成または促進する。

さらに別の実施形態において、本発明の細胞が播種された３次元のフレームワークは、抗炎症剤、成長因子、免疫抑制剤、などからなる群から選択される１以上の生物活性剤または他の化合物で被覆される。

本発明のさらに別の実施形態において、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、接種され、３次元のフレームワーク上で成長し、間欠的な圧力変化を可能とするように操作され得る容器、またはバイオリアクターが増殖中チャンバーの与圧との対流により軟骨細胞へ栄養の十分な提供を可能とする、インビトロでの軟骨組織構成の製造のために設計された特定のバイオリアクターシステムに配置される。同じ方法は、胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に適用され得る。

足場に基づく細胞療法は、治療組織生成因子、この場合は細胞が簡単に局在化され、それゆえ足場に沿って関節鏡的に移植されうるという明白な利点を与える（Ｉｗａｓａら、２００９年）。これは大部分の侵襲性外科手術（全関節置換）を回避し、可能な限りそのままの組織を保存し、これにより、治療の結果に悪影響を非常に十分及ぼす炎症の発生を有意に低下させる（ｖａｎＯｓｃｈら、２００９年）。３Ｄ組織成長の周りの鋳型を提供するため、足場構造および組成物を注意深く調整しなければならない。合成物質（ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリグリコール酸（ＰＧＡ）など）と天然物質（ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸塩およびキトサンなど）はさらなる化学修飾を用いてまたは用いずに、ならびに骨および軟骨を形成するために側基の添加を用いてまたは用いずに使用されている。（Ａｈｍｅｄら、２０１０年；Ｃｈｕｎｇら、２００８年；Ｋｈａｎら、２００８年）。

生体材料足場は、細胞を保護し、組織成長を誘導する物理的構造を与える細胞外マトリクスとして機能する。マトリクスへの組み込みは、注目の手術部位に配送するための３次元システムを有することが必須である。大人の間葉系細胞と異なる胎児の細胞は、それらの本来の接着性および遊走性に起因する種々の生体材料を浸透することが示されている。このことは、個々の生体材料および移植前のインプラントの少ない操作に細胞の迅速な播種を可能とする。異なる材料および制作技術は、軟骨の再生医療に適しうる明らかな特性を有する生体材料足場を形成しうる。多くの生分解性生体材料およびヒドロゲルは、他の手術目的（止血スポンジおよび組織充填剤（Ｍａｓｔら、１９９３年；Ｐａｔｉｎｏら、２００２年；ＤｒｕｒｙおよびＭｏｏｎｙ、２００３年）など）のために既に開発されている。これらの生体材料は、生体適合性が試験され、臨床等級物質（医療機器として分類される）が与えられ、生体材料送達システムおよび細胞生産物の会合により生成されるラジカル誘導体生成物がないことが確認されている。

さらなる実施形態において、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、インビボの部位に、例えば、注射によって３次元フレームワークへの接触なしに直接投与され、その部位に新しい軟骨組織および細胞集団を生み出す。同じ方法は等価に胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に用いられる。したがって、実施形態において、本発明は、新しい軟骨組織および／または３次元構造の製造のため本発明の非酵素方法によって得られた胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）の使用：新しい腱組織および／または３次元構造の製造のため本発明の非酵素方法によって得られた胎児のアキレス腱細胞の使用および新しい皮膚組織および／または３次元構造物を製造するための本発明の非酵素方法によって得られた胎児の皮膚線維芽細胞の使用に関する。

本発明のさらなる実施形態において、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、外因的に供給される成長因子（例えば、ＴＧＦ−βまたはＢＭＰ類（ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３など）を用いて軟骨の製造を促進させる。

本発明のさらに別の実施形態において、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、例えば、インプラントに伴う拒絶リスクや炎症を低下させることにより、生産される軟骨の量を増加させるか、または移植の成功を向上させる機能をする、特定の種類の成長因子、ペプチド、タンパク質または他の分子を生産するか、またはそれらの生産を増加させるように遺伝子改変されてもよい。同じ方法は等価に胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に適用され得る。

本発明は、上述の方法の生産物にも関し、これらに限定されないが、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞、分裂して増殖したものまたは他のもの；それらから製造された新しい軟骨組織；それらから抽出された細胞外マトリクス；および３次元の軟骨／骨組みの構築物を包含する。本発明は、インビボでこれらの細胞、構築物および組織を使用して軟骨の修復、置換または増強への使用に関し、またはインビトロで、新しい軟骨組織または生物活性剤を製造、または有望な治療薬の細胞毒性の試験のために有望な３次元の軟骨培養物を形成することにも関する。同じ方法は、胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に用いられ得る。

本発明の一実施形態において、尺骨の胎児の軟骨から単離された胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、それらから分化された軟骨細胞と同様、軟骨を修復または置換する新しい軟骨組織および細胞を製造するために使用することができる。同じ方法は、
新しい腱または皮膚組織を製造し、腱または皮膚を修復または置換するための細胞を製造するために使用されうる胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に利用され得る。

本発明のさらなる実施形態において、本発明の方法に関する尺骨の胎児の軟骨から単離された胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、それらから分化された軟骨細胞と同様、治療薬として用いられうる。好ましくは、本発明の方法に係る尺骨の胎児の軟骨から単離された、胎児の骨端軟骨細胞は、そこから分化された軟骨細胞と同様、骨軟骨の修復（軟骨修復および腱修復）および再生を包含している）、および骨軟骨の疾患または欠陥（骨軟骨の病変、損傷、外傷、分裂および骨折、軟骨下骨壊死および骨軟骨炎を包含している）および／または関節炎を処置する方法において使用するためである。同じ方法は、腱および皮膚の特定の処置の胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に用いられうる。

したがって、一実施形態において、本発明は、骨軟骨組織および筋骨格組織の修復用および再生用の方法において使用するための本発明の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）；腱組織および筋骨格組織の修復用および再生用の方法において使用するための本発明の非酵素方法により得られる胎児のアキレス腱細胞；皮膚組織の修復用および再生用の方法において使用するためおよび熱傷、創傷および線維症状態を処置するための本発明の非酵素方法により得られる胎児の皮膚線維芽細胞；に関する。

本発明のさらなる実施形態において、骨軟骨疾患または欠損、関節炎および筋骨格疾患の処置方法において使用するための本発明の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）；筋骨格疾患および腱障害の処置方法において使用するための本発明の非酵素方法により得られる胎児のアキレス腱細胞；皮膚疾患の処置方法において使用するための本発明の非酵素方法により得られる胎児の皮膚線維芽細胞が提供される。

骨軟骨再生医療用の胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）または軟骨前駆細胞の使用は、とても有望である。実際、胎児の成長（ｆｏｅｔａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）の全体にわたって、骨端は二次骨核（ＳＯＣ）の主な部分になり、ＦＥＣ縮合物を、関節の軟骨性の領域と血管浸潤後の骨端骨梁および骨髄になる領域の両方に変換する（Ｂｌｕｍｅｒら、２００８；Ｏｎｙｅｋｗｅｌｕら、２００９）。胎児の軟骨（胎児の皮膚で見られるもの）は、自己修復の著しい能力を有する。胎児のヤギモデルにおいて、欠陥は瘢痕または線維性の組織形態なしで修復することが知られている（Ｎａｍｂａら、１９９８）。

本発明の細胞（胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞および軟骨細胞）および軟骨組織は、医薬品、増殖調節因子、消炎剤、などの有効性および細胞毒性のための実に様々な化合物をスクリーニングするためにインビトロで用いられてよい。この目的のために、本発明の細胞または上記の組織培養物はインビトロで維持され、そして化合物に暴露され、試験される。細胞毒性の化合物の活性は培養物中で細胞にダメージを与えまたは殺す能力によって測定され得る。これはすぐに生体染色技術により評価できる。増殖調節因子の効果はインビトロで生存している細胞の数を分析すること、例えば、全細胞数を計算することおよび分化細胞を計算することにより評価されてよい。これは標準細胞学および／または種特異的な細胞抗原を定義する抗体を用いる免疫細胞化学的手法の使用を包含している組織学的な技術を用いてなされてよい。本発明の細胞においてかまたは懸濁液培養物もしくは上記の３次元系において種々の薬品の効果は評価されてよい。したがって、尺骨の胎児の軟骨から単離された胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、関節炎、骨軟骨欠損、軟骨修復、腱修復の治療用の高度治療薬および／または医療装置を開発するためにも使用され得る。同じ方法は、筋骨格組織の治療用の高度治療薬および／または医療装置を開発するためにも使用され得る胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に適用され得る。

本発明の一実施形態において、本発明の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）、胎児のアキレス腱細胞または胎児の皮膚線維芽細胞の使用を含む関節炎、骨軟骨欠損、軟骨修復、腱修復、筋骨格組織修復および皮膚修復の治療のための治療薬および／または医療装置の開発のためのスクリーニング方法が提供される。

本発明の細胞（胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞および軟骨細胞）および軟骨組織は、生理学または病態の研究のためのモデル系として用いられてよい。例えば、固定された関節は、いくつかの観点において比較的すぐに不快になる。軟骨細胞の代謝活性は、プロテオグリカンの損失として影響を受けるようで、そして水分含量の増加がすぐ観測される。軟骨の正常、白くて、輝く外観は、光沢がなく青みがかった色に変化し、軟骨の厚さは減少する。しかしながら、ストレス依存性の代謝恒常性における不調に起因する量に対し、栄養素の不足に起因する変化の量はまだ明らかではない。本発明の細胞および軟骨組織は、異なる身体の条件下（例えば、断続的な加圧）が軟骨構築へのおよび軟骨構築からの培養液のポンプ作用により、軟骨の栄養の必要性を決定するために用いられてよい。これは、外傷性損傷に対して弱くなった軟骨を前もって処理する、例えば、膝における、関節軟骨の引張強さにおける、加齢に関連したまたは損傷に関連した疾患についての根本原因を研究するのに特に有用であり得る。同じ方法は、外傷性または加齢に関連した損傷に対する腱および皮膚の引張強さにおける加齢に関連したまたは損傷に関連した疾患についての根本原因を研究するのに有用な胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞へ等価に利用されうる。

本発明の細胞（胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞および軟骨細胞）および軟骨組織は、リュウマチ性疾患の結果として骨液に放出されるサイトカインおよび他の炎症性のメディエーター（例えば、ＩＬ−１、ＴＮＦおよびプロスタグランジン）の作用機序の研究に用いられてもよい。したがって、患者自身の骨液は、本発明の細胞の成長においてこれらの化合物の効果を研究するためインビトロで試験される。加えて、細胞毒性および／または医薬品は、軟骨の再吸収の削減または防止、他方で関節軟骨のバランスのとれた成長を増加するなど、特定の患者に最も有効であるものについてスクリーニングされてもよい。インビトロで有効であると証明されている試薬は、その後、患者を治療的に処置するために用いられうる。同じ方法は、成長因子、サイトカインおよび組織修復において不安定の原因となる他の炎症性のメディエーターの作用機序の研究において有効に胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に用いられうる。

当業者は、明細書に開示されている本発明は、詳細に記載されている以外の変更や修正に影響を受けやすいということはわかるであろう。本発明は、そこの精神または本質的な特徴から逸脱せずに変化および修正などの全てを包含する。本発明は、本願明細書に、個別にまたは集合的に、そして任意のおよび上記段階または特徴部の任意の２以上の任意およびすべての組み合わせも包含する。本開示は、それゆえ、説明され、限定されていない全ての態様であり、添付する請求項に示される本発明の範囲として考えられ、そして意味に含まれるすべての変更および等価の範囲のものは本願明細書に受け入れられると考えられる。

上述の事項は、以下の実施例を参照してより十分に理解されるだろう。しかしながら、そのような実施例は、本発明の方法を例示するものであり、本発明の範囲の制限を意図するものではない。

近位尺骨の骨端、アキレス腱および腹部の皮膚は、厳格な移植の法律およびその付属法ならびに臓器提供のためのガイドラインならびに再生医療用途のためのＦＥＣ、腱および皮膚の親細胞バンク（ＣＨＵＶＥｔｈｉｃｓＣｏｍｍｉｔｔｅｅｐｒｏｔｏｃｏｌ番号６２／０７）を作成するためのスクリーニングにしたがって処理した。組織生検（軟骨（約２ｍｍ^３）、腱（約０．２ｍｍ^３）、皮膚（約２ｃｍ^２）を、外科用メスの切断面に機械的に接着させることにより、微小に切断し、分散させた。（軟骨、腱または皮膚の派生物のみの接着および細胞集団の一貫性：臨床用途のための必要な基準を確保するために酵素による処置は使用しなかった。ＦＥＣ、腱および皮膚の派生物を、１〜２日〜１週間で観測し、増殖は１週間および２週間で完了した。親細胞バンクを５〜１０ｘ１０^６細胞の５０〜２００バイアルを用いて構築し、液体窒素の気相中に貯蔵した。単離した細胞のインビトロでの特性評価は、重なる傾向のある目立った増殖能（３Ｄ培養）と同様、単層培養における顕著な均一性を示す。ＦＥＣ、腱前駆細胞および皮膚前駆細胞は、最初の６継代において、著しい表現型変異を示しそうにはない。ＦＥＣおよび腱前駆細胞は、ペレット培養形態、堆積マトリクスに配置されたときに自発的に癒着でき、基本的な軟骨形成または腱細胞マーカーを表す。フローサイトメトリー分析は、均一な集団の単峰性分配を示した。大人の骨髄由来のＭＳＣとの比較は、分化されていない前駆細胞の表現型よりむしろ軟骨形成または腱細胞と一致した、ＦＥＣまたは腱の表面のマーカープロファイルを生み出す。

（胎児の軟骨細胞、腱前駆細胞および皮膚前駆細胞バンク、治療薬調製に関する特性評価）
（細胞バンク）
細胞バンクは、情報に基づき書面で同意し、そして１９９３年から、現地の医大倫理委員会（ＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌＥｔｈｉｃｓＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）から、より具体的には２００７年からの臨床細胞バンクのための承認を得た妊娠中絶後の１２〜１４週の妊娠の胎児の生検から、ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＬａｕｓａｎｎｅ（ローザンヌ大学病院）で構築されている。臨床前関節軟骨の細胞バンクは、これまで２人の異なるドナーから成功裏に開発されている。これら（ＦＥ００２−Ｃａｒｔ（ｐ．０）、ＦＥ−００２−Ｔｅｎ（ｐ．０）、ＦＥ−００２−ＳＫ２（ｐ．０））の１つを使用し、少ない継代での臨床前および臨床試験のために必要なすべての細胞を構築することが可能であるだろう（ＭＣＢ（ｐ．３）およびＷＣＢ（ｐ．５））。

前臨床の細胞バンクを、約０．３ｃｍ^３の関節軟骨（半径）（図７参照）から、〜０．２ｍｍ^３のアキレス腱からおよび約１ｃｍ^２の腹部の皮膚から、継代０代および１代で調製した。組織を、可能な場合、＜０．５ｍｍ^３のフラグメントに切断し、そして１０％ＦＣＳおよびグルタミンを補完されたＤＭＥＭ中で増殖し、その細胞は継代３代および６代または１代および９代で特性評価および実験に用いられた。それらの細胞は分離する前にコンフルエンスに増殖し、ＰＢＳで２回洗浄して数えた。

（酵素工程なしでの詳細な手順）
組織を２つの１０ｃｍプレートに分け、１つのプレートにつき、約５の全組織フラグメント（＜０．５ｍｍ^３）にする。組織培養皿を、前もって、ラミナーフローフードの下、チェックボードのパターンにおいて滅菌メスを用いて深くスコア付した。組織フラグメントを、静かに細かく切り、プラスチックインデント内にフラグメントを付着させてスコア付されたプラスチック領域に配置した。少量の栄養分を含む培地を、各フラグメントの周囲に配置し、最初の２４時間、組織の流動を回避した。最初の２４時間の後、８ｍＬの培地を、各１０ｃｍのプレートに添加し、これを継代の前に週２回変更した。これらのフラグメントを１０％ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）だけで補添したＤＭＥＭ中で増殖させ、一貫した細胞培養を確実にするのを補助した。細胞培養物を９５％空気／１０％ＣＯ_２の加湿された雰囲気において３７℃で成長させた。臨床試験用の細胞培養に必要な任意の栄養成分は、徹底した安全の必要性および追跡を有するべきであるということを言及するのは重要である。すべての動物由来の製品（ウシ胎児血清およびトリプシン、外来性物質のために試験されたトリプシンおよびガンマ線照射血清の臨床ロット）が用いられるべきである。細胞増殖は最初、１日後でさえ見られたが、５〜７日の間に細胞増殖が上昇した後、組織および細胞の培養皿をトリプシン処理（０．２５％のトリプシン−０．１％のエチレンジアミン四酢酸［ＥＤＴＡ］）することにより、またはＥＤＴＡのみを用いることによりプレートから除去して、複数の組織培養フラスコに継代するまたは細胞バンクのために冷凍した。この時点で、いくつかの胎児の軟骨、胎児の腱または胎児の皮膚細胞は、液体窒素中個々の単位に冷凍され、一方でＰＣＢの製造のため１，０００〜２，０００細胞／ｃｍ^２または１０，０００〜５０，０００細胞／ｃｍ^２で継代した。２０００ｇで細胞を１５分間遠心分離し、ＤＭＥＭ（５ｍｌ）＋ＦＣＳ（４ｍｌ）＋ＤＭＳＯ（１ｍｌ、Ｆｌｕｋａ製）の冷凍溶液に再懸濁させ、１ｍｌの一定分量（約５００万〜１０００万の細胞）を、ＮａｌｇｅｎｅＣｒｙｏの１℃冷凍容器（Ｎａｌｇｅｎｅ製ＮａｌｇｅｎｅＣｒｙｏ１℃ ＦｒｅｅｚｉｎｇＣｏｎｔａｉｎｅｒ）中、−８０℃で凍結させ、−１℃／分の冷却速度と冷却曲線を達成した。２４時間後、細胞をより長期の貯蔵のため液体窒素に移動した。

前臨床の胎児の関節軟骨、胎児の腱または胎児の皮膚の１〜２個のバイアルを特性評価のため一貫性のあるＷｏｒｋｉｎｇＣｅｌｌＢａｎｋ（ワーキング細胞バンク）（ＷＣＢ）を調製するために用いる。手順設計はｃＧＭＰの製造において用いられたものと同じである。要するに、細胞を１５ｍｌの栄養分を含む培地（ＤＭＥＭ＋１０％臨床等級血清、胎児のウシ、インビトロゲン）を伴う１００細胞培養のフラスコ（Ｔ７５、Ｎｕｎｃ）に１，５００細胞／ｃｍ^２、または１，０００〜１００，０００細胞／ｃｍ^２で開始する。細胞の培地を２日毎に変更し、細胞の生成／増殖を１０〜１４日間、３７℃、湿度１０％で、または３〜６日間、より高密度の播種を行う。１２〜１４日目に、１０Ｔ７５フラスコのバッチをＴｒｙｐＬＥに晒し、フラスコから細胞を分離し、遠心管に入れた。栄養分を含む培地の等量を遠心分離の前に各チューブに添加し、ＴｒｙｐＬＥの効果を緩衝する。すべてのフラスコから得られる細胞ペレットを２００ｍｌの冷凍培地溶液（ＤＭＥＭ、血清、ＤＭＳＯ、割合；５：４：１）に再懸濁し、１０×１０^６細胞／ｍｌの希釈度で１００Ｎｕｎｃ（ヌンク）凍結バイアル（１．５ｍｌ）に分注した。

細胞をＮａｌｇｅｎｅＣｒｙｏ１℃ ＦｒｅｅｚｉｎｇＣｏｎｔａｉｎｅｒ（Ｎａｌｇｅｎｅ）中、−８０℃で冷凍し、−１℃／分の冷却速度と冷却曲線を成し遂げる。２４時間後、細胞を気相中の液体窒素に移動する。このＷＣＢは継代２であり、細胞の特性評価のために用いられ、細胞は種々の継代（しかし、主に２〜８）で用いられる。

（胎児の軟骨細胞の特性評価：同一性、安定性、一貫性、遺伝子安定性）
バンクされた胎児の軟骨細胞は、出願人らの研究の全体にわたって、出願人らの研究室の同じ技術条件下でバンクされたＢＭ−ＭＳＣ細胞と比較されている。ＭＳＣの細胞は、他の組織の中で軟骨再生のための前臨床および臨床実験において提案されかつ使用されている同種異系細胞および主な他の細胞型の１つである（しかしながら、間葉系細胞は組織特異的でなく、他の組織の種類を作製するように調製されなければならない）。さらに、ＭＳＣの細胞は、より不安定であり、継代４の下で用いられなければならない。同じ方法は胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等しく利用され得る。

（ＢＭ−ＭＳＣと対比する胎児の軟骨の特性評価）
胎児の関節軟骨の細胞バンクは、ＢＭ−ＭＳＣ細胞と比較されるマトリクスの供託用の機能アッセイのＦＡＣＳ分析を用いて行われた表面マーカーにより特性評価されている。関節骨端組織から得られる胎児の軟骨細胞を単離し、親細胞バンクを冷凍している。

予備実験において比較されているいくつかのマーカーは以下を包含する。
ＣＤ１０５：Ｅｎｄｏｇｌｉｎ．ＴＧＦベータ受容体コンプレックスの部分．ＭＳＣの陽性の選択のための主な基準．
ＣＤ９０：Ｔｈｙ−１．ＭＳＣの陽性の選択のための主な基準．
ＣＤ４４：ＰＴＰＲＣ．白血球マーカー．ＢｍＭＳＣｓの陰性の選択のための基準．
ＣＤ７３：ＮＴ５Ｅ．ＭＳＣの陽性の選択のための主な基準．
ＣＤ１６６：ＡＬＣＡＭ．

（図８および図９参照）
同じ方法が、胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等しくに用い得られうる。

（生体適合性：ヒドロゲルおよびマトリクスとの胎児の軟骨の生体適合）
医学的使用に用い得る異なるマトリクスを初めに生体適合性について試験した。種々の組成物のヒドロゲル、コラーゲンおよびいくつかの生分解性ポリマーを最初の実験に用いる。ヒドロゲルに関して、細胞を、前もって調製した寒天モールドに挿入されたゲル内で培養する。これは、チューブへの細胞の接着を回避し、３次元成長を可能とする必要があるためである。当該モールドを、０．５ｍｌの無菌コニカルエッペンドルフ遠心分離チューブが液体の寒天に挿入されている、１．５ｍｌの無菌コニカルエッペンドルフ遠心分離チューブ内に１ｍｌの融解したアガロース（２０％寒天、低温融解した寒天）をピペット操作により調製し、凝固でき、その後、コニカルをはめこんだままで０．５ｍｌのチューブを取り出す。ゲルおよび細胞添加に続き、１００μｌの培地を各チューブの表面にピペットし、培地を週に２回変更した。細胞を９５％相対湿度および１０％Ｃ０_２で、３７℃の培養器中、１、２、４週間成長させる。

マトリクス調剤のため、細胞播種密度（１０^３〜１０^４細胞ｃｍ^２）および増殖期間（１〜２８日）を調査した予備実験は、胎児の細胞送達の最適条件を決定するために行われる。継代３または４（その後の不安定性に起因してＭＳＣは最大４）における胎児の細胞およびＢＭ−ＭＳＣの細胞は、１０ｍｌの培地（１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ）に配置され、マトリクス上で播種された。細胞を含有するマトリクスは、３７℃の培養器に９５％相対湿度および１０％ＣＯ_２で配置された。その１時間後、追加の３０ｍｌの培地を添加した。マトリクスは栄養分を含む培地を用いて週に２回変化させた。ヒドロゲルまたはマトリクスが最初に播種された組織培養プレート内で細胞を培養する接触アッセイによって、生体適合性も測定される。１、２、および４週間後、サンプルを染色し、写真を撮った（ＳｏｎｙＣｙｂｅｒＳｈｏｔＤＳＣ−Ｓ７０，Ｚｅｉｓｓｍａｃｒｏｌｅｎｓ，Ｚｏｏｍ６ｘ，３．３ｍｅｇａｐｉｘｅｌｓ）。

Claims

胎児の骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の皮膚線維芽細胞からなる群から選択される胎児細胞の単離、増殖および発生のためのインビトロの非酵素方法であって、以下の段階を含む：
ａ）胎児の骨端軟骨細胞を含む尺骨の胎児の軟骨；胎児のアキレス腱細胞を含む胎児のアキレス腱；または胎児の皮膚線維芽細胞を含む胎児の腹部の皮膚；から選択される、胎児のサンプルを使用する工程、
ｂ）前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを外科用メスの切断面に機械的に接着させることにより、微小に切断し分散させる工程、
ｃ）前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを、前記胎児の骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の腹部の皮膚の線維芽細胞を増殖する条件下で、インビトロで培養する工程、
ｄ）第一の接着性の胎児の骨端軟骨細胞の細胞集団、第一の接着性の胎児のアキレス腱の細胞集団、および第一の接着性の胎児の皮膚線維芽細胞集団を前記培養から選択し、単離する工程。
尺骨の胎児の軟骨サンプルが胎児の近位尺骨の骨端のサンプルである、請求項１に記載の非酵素方法。
指定番号ＦＥ００２−Ｃａｒｔを有し、受入番号ＥＣＡＣＣ１２０７０３０３−ＦＥ００２−Ｃａｒｔで供託されている、請求項１に記載の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）細胞株。
指定番号ＦＥ００２−Ｔｅｎを有し、受入番号ＥＣＡＣＣ１２０７０３０２−ＦＥ００２−Ｔｅｎで供託されている、請求項１の非酵素方法により得られる胎児のアキレス腱細胞細胞株。
指定番号ＦＥ００２−ＳＫ２を有し、受入番号ＥＣＡＣＣ１２０７０３０１−ＳＫ２で供託されている、請求項１の非酵素方法により得られる胎児の皮膚線維芽細胞株。
新しい軟骨組織および／または３次元構造物を製造するための請求項３に記載の胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）の使用方法。
新しい腱組織および／または３次元構造物を製造するための請求項４に記載の胎児のアキレス腱細胞の使用方法。
新しい皮膚組織および／または３次元構造物を製造するための請求項５に記載の胎児の皮膚線維芽細胞の使用方法。
治療薬として使用する請求項３に記載の胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）。
治療薬として使用する請求項４に記載の胎児のアキレス腱細胞。
治療薬として使用する請求項５に記載の胎児の皮膚線維芽細胞。
骨軟骨組織および筋骨格組織の修復および再生方法において使用する、請求項３に記載の胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）。
腱組織および筋骨格組織の修復用および再生用の方法において使用する、請求項４に記載の胎児のアキレス腱細胞。
皮膚組織の修復および再生方法ならびに熱傷、創傷および線維症状態の処置のために使用する、請求項５に記載の胎児の皮膚線維芽細胞。
骨軟骨疾患または欠損、関節炎および筋骨格疾患の処置方法において使用する、請求項３に記載の胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）。
筋骨格疾患および腱障害の処置方法において使用する、請求項４に記載の胎児のアキレス腱細胞。
皮膚疾患の処置方法において使用するための、請求項５に記載の胎児の皮膚線維芽細胞。
請求項３の胎児の骨端軟骨細胞（ＦＥＣ）、請求項４の胎児のアキレス腱細胞、または請求項５の胎児の皮膚線維芽細胞の使用を含む、関節炎、骨軟骨欠損、軟骨修復、腱修復、筋骨格組織修復および皮膚修復の処置のための治療薬および／または医療装置の開発のためのスクリーニング方法。