CN104789524A - 骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法及应用，属于细胞技术领域。通过取骨质疏松大鼠动物模型的四肢骨，获取皮质骨骨片，在细胞培养板或培养皿中用培养基浸泡所述骨片，使细胞从骨片边缘爬出，进入细胞培养板或培养皿，收集贴壁生长的细胞，即获得骨质疏松大鼠原代成骨细胞。本发明提供了一种简单、经济、快速的骨质疏松成骨细胞分离培养方法及其应用方向。采用纯机械分离法获得原代骨质疏松长骨成骨细胞，成功避免了胶原酶消化对于成骨细胞可能存在的不可逆的损伤及改变。所获得的细胞在生化指标方面具有骨质疏松病理特性，并且能够对抗骨质疏松药物及骨诱导材料产生积极响应。

Description

骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法及应用

技术领域

本发明属于细胞技术领域，特别涉及一种骨质疏松大鼠长骨原代成骨细胞分离方法及应用。

技术背景

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种多原因诱发，以骨量的减少和骨组织微量结构破坏为特征的全身性疾病。根据WHO（世界卫生组织）统计，骨质疏松的发病率已跃升到众多常见疾病和多发病的第7位。现在全球每3名妇女和每8名男性中分别有1人患骨质疏松症。在美国，约有1000万人罹患骨质疏松，另有1.4-1.8万人患有骨质减少；在中国，目前骨质疏松症患者已达6300万。骨质疏松症主要出现在绝经后的女性和老年男性中。

骨质疏松会引起一系列的并发症，严重影响着人们的日常生活自理能力。骨折是骨质疏松最为常见和严重的并发症。骨质疏松患者骨与正常骨相比密度低、强度低、骨脆性大，骨折的风险非常高。在美国，每年因骨质疏松导致的骨折约有150万人，不同程度的有椎体骨折、髋部骨折、桡骨远端骨折，约有25%的人死于骨折相关的并发症；在欧洲，50岁以上的人群中有1/8的人因骨质疏松患过脊椎骨折，80岁人群中1/3妇女及1/9的男性因骨质疏松患过髋骨骨折。骨质疏松性骨折存在着终生危险性，据报道，在美国罹患髋骨骨折的妇女中约有60%的人不能回复到骨折前的功能状态，出现不同程度的活动受限甚至是终生活动受限。在老年人中，随着年龄增长，骨质疏松概率越高，且与其骨折发病率呈正相关性。随着全球老龄化加剧，骨质疏松症引发的骨折及其并发症逐渐成为不容忽视的医疗问题。

骨质疏松骨折补位骨量低，且多为粉碎性骨折，所以外科治疗常使用材料植入和抗骨质疏松药物的共同疗法。目前使用的植入材料包括钛、钴合金，羟基磷灰石陶瓷材料等；抗骨质疏松药物主要包括雌激素、磷酸盐类及甲状旁腺素等。每年度约有近百种新材料及抗骨质疏松药物问世。目前国内外实验室广泛地使用大鼠模型来模拟骨质疏松病症，进行新材料及药物检测和评估。但以动物活体作为筛选模型存在着成本高，周期长，细胞学机理不明等传统缺陷。该领域内缺乏一种高效而专一的体外成骨细胞病理模型。

现有的成骨细胞的一般培养方法分为酶消化法和组织块法，主要针对动物胚胎或幼体的颅骨进行胶原酶（Collagenase）消化（孵育时间通常为40分钟以上）配合物理分离，得到一定量的成骨细胞。然而胶原酶消化对于成骨细胞及其膜上的功能蛋白可能存在着不可逆的损伤及改变，消化时间难以掌握，在病理细胞的体外分离中应尽量避免。另外，动物胚胎或幼体的骨组织尚未矿化，且富含多种除成骨细胞之外的细胞，如：软骨细胞，成纤维细胞等，原代培养中难以得到较纯的成骨细胞。再者，对于成年骨质疏松动物四肢骨原代成骨细胞的分离培养方法鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于，针对上述问题提供一种骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法及应用，通过利用大鼠骨质疏松模型，采用纯机械分离法获得原代骨质疏松长骨成骨细胞。所获得的细胞在生化指标方面具有骨质疏松病理特性，并且能够对抗骨质疏松药物及骨诱导材料产生积极响应。本发明建立一种简单而有效的骨质疏松成骨细胞的提取方法。对研究骨质疏松的预防及治疗有重要意义。

本发明从骨质疏松动物模型中获取四肢骨的皮质骨骨片，然后用培养基浸泡骨片通过贴壁法获得骨质疏松动物原代成骨细胞。

本发明通过以下技术方案来实现：

一种骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，取骨质疏松大鼠动物模型的四肢骨，获取皮质骨骨片，在细胞培养板或培养皿中用培养基浸泡所述骨片，使细胞从骨片边缘爬出，进入细胞培养板或培养皿，收集贴壁生长的细胞，即获得骨质疏松大鼠原代成骨细胞。所述四肢骨为股骨或胫骨或腓骨中的至少一种。

作为可选方式，在上述方法中，采用纯机械分离法，获取皮质骨骨片。成功避免了酶消化对于成骨细胞可能存在的不可逆的损伤及改变。

作为可选方式，上述方法包括以下步骤：

1）处死模型动物，无菌条件下分离大鼠的股骨、胫骨、腓骨；

2）用消毒过的手术刀沿骨垢板闭合线切入，剥离并丢弃股骨、胫骨、腓骨生长端的骺板，彻底剔除骨上附着的肌肉组织；

3）在超净台内将皮质骨切割成骨片，弃两端，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗数次，并通过震荡彻底洗脱骨髓腔内残余的其他细胞，使骨片最终呈现乳白色；

4）在细胞培养板或培养皿中用培养基浸泡所述骨片；

5）收集贴壁生长的细胞。

作为可选方式，在上述方法中，采用茜素红（Alizarin Red）染色及碱性磷酸酶（ALP）定量分析对所得细胞进行鉴定。

作为可选方式，上述方法包括以下步骤：

1）处死模型动物，无菌条件下分离大鼠的股骨、胫骨、腓骨；

2）用消毒过的手术刀沿骨垢板闭合线切入，剥离并丢弃股骨、胫骨、腓骨生长端的骺板，彻底剔除骨上附着的肌肉组织；

3）在超净台内将皮质骨切割成约2mm×2mm的骨片，弃两端，用含双抗（青链霉素混合液）的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗数次，并用振荡法彻底洗脱骨髓腔内残余的其他细胞，使骨片最终呈现乳白色；

4）将骨片按每孔6-10片接种于血清包被的6孔板内，每孔加入含有1%L-抗坏血酸、1%双抗、10%牛胎血清的高糖DMEM培养基5mL，浸泡全部骨片，避免骨片飘起；

5）5天后进行不完全换液：留存1-2ml原培养基，补充3ml新培养基（半量换液既可以除去代谢产物又可以适量保留前期培养中累积的促生长物质，同时避免了因全部换液造成的胞外环境的波动，利于原代培养）；

6）12-15天后进行常规传代，每孔接种1×10⁵个细胞（6孔板），即获得骨质疏松大鼠原代成骨细胞。

作为可选方式，在上述方法中，所述骨质疏松大鼠动物模型的构建方式为：取成年雌鼠用维甲酸诱导建立骨质疏松动物模型；或取成年雌鼠吊尾饲养60天；或取成年雌鼠切除两侧卵巢后，饲养90天；或直接取年龄在24个月以上的雌性大鼠。

本发明还提供了一种采用上述方法获取的骨质疏松大鼠原代成骨细胞。进一步的，所述细胞呈三角形或梭形，轮廓清晰，折光好。

本发明还提供了一种上述细胞的应用，其特征在于，将其作为筛选骨质疏松药物和\或植入材料的细胞模型。

作为可选方式，在上述应用中，将所述细胞与被筛选的对象共培养后，检测细胞的成骨指标。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种简单、经济、快速的骨质疏松成骨细胞分离培养方法及其应用方向。采用纯机械分离法获得原代骨质疏松长骨成骨细胞，成功避免了胶原酶消化对于成骨细胞可能存在的不可逆的损伤及改变。所获得的细胞在生化指标方面具有骨质疏松病理特性，并且能够对抗骨质疏松药物及骨诱导材料产生积极响应。

附图说明：

图1 为实施例1中所述动物在建模前（左）和建模后（右）的显微CT照片。显示维甲酸灌胃15天后出现骨质疏松病理学改变（胫骨近端）。

图2 为实施例1中所述骨片培养5天后在放大倍数为10倍的光镜下观察的照片。可观察到有细胞从骨片边缘爬出。

图3为实施例1中所述骨片培养12-15天后在放大倍数为10倍的光镜下观察的照片。可见细胞逐渐爬满孔板底部，可传代。

图4为实施例1中采用茜素红染色后在放大倍数为10倍的光镜下观察的照片。鉴定结果为成骨细胞，骨质疏松组成骨细胞钙结节少于健康组。

图5为实施例1中采用碱性磷酸酶定量分析所得的柱状图。鉴定为成骨细胞，骨质疏松组成骨细胞碱性磷酸酶活性少于健康组。

图6为实施例1骨质疏松骨提取的成骨细胞与10nM雌激素和羟基磷灰石材料共培养后，进行碱性磷酸酶定量分析所得的柱状图。显示共培养后碱性磷酸酶活性均有显著性提升，趋近于健康组水平。

具体实施方式：

以下通过实施例的具体实施方式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应当将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。在不脱离本发明的精神和原则之内做的任何修改，以及根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的等同替换或者改进，均应包括在本发明的保护范围内。

实施例1

1）选择2-3月龄体重在250克左右的Sprague Dawle雌鼠，饲养一周，使其适应环境。以维甲酸70mg/kg灌胃15天后，骨质疏松模型造模成功。经显微CT（micro-CT）鉴定，出现骨密度降低，骨小梁稀疏且形态改变，等骨质疏松症状（图1）。

2）采用脊椎脱臼法处死模型鼠，无菌条件下逐层切开腿部皮肤、皮下肌肉组织。用手术刀分离出股骨、胫骨和腓骨。用消毒过的手术刀小心沿骨垢板闭合线切入，剥离并丢弃股骨和胫骨生长端的骺板（富含软骨细胞、成纤维细胞、骨髓干细胞）。彻底剔除骨上附着的肌肉组织，将骨浸泡于含有5%双抗的无菌PBS溶液中30分钟，转移至超净台内；

3）取90mm细胞培养皿，将长骨置于其中，用含有2%双抗的无菌PBS溶液反复用移液器冲洗长骨3次。用手术刀刮净骨表面附着的骨膜；

4）切除并丢弃长骨两头末端约3mm的不规则骨段（末端难以彻底清除肌肉纤维组织，易引入杂细胞），用灭菌咬骨钳和止血钳将骨头钳成约2mm×2mm的骨片。用含有1%双抗的无菌PBS溶液洗涤骨片2次；

5）将骨片收集于15ml离心管，倒入适量（淹没所有骨片）的含1%双抗无菌PBS溶液。

将离心管置于涡旋振荡器上振荡10秒（IKA振荡器，1500 1/min），再静置10秒，重复此过程5次。目的为去除骨片上残留的红色骨髓及其中的杂细胞，直至骨片呈现乳白色半透状；

6）倾空离心管内液体后，用灭菌镊子小心取出骨片，置于90mm培养皿。用手术刀刮去骨片靠骨髓腔一侧潜在的残余骨髓。再次用含1%双抗的无菌PBS溶液漂洗骨片。

7）将骨片按每孔6-10片接种于血清包被的6孔板内，每孔加入含有1%L-抗坏血酸、1%双抗、10%牛胎血清的高糖DMEM培养基5mL，浸泡全部骨片，勿使骨片飘起；

8）5天后可观察到有细胞从骨片边缘爬出（图2），进行不完全换液：留存1-2ml原培养基，补充3ml新培养基；若分离骨片时未彻底刮除表面附着的肌肉、结缔组织，则培养基表层会出现大量增殖的成纤维细胞聚集而成的白色光滑团块。弃该孔培养基及骨片。若严格按前述步骤操作，则不会出现；

9）12-15天后细胞逐渐爬满孔板底部，单个细胞呈三角形、梭形，轮廓清晰，遮光好（图3）。进行常规传代，每孔接种1×10⁵个细胞（6孔板）；

10）经茜素红染色（图4）及碱性磷酸酶定量分析（图5）鉴定，证实其确为成骨细胞，细胞纯度为90%以上，且上述成骨指标均显著性低于同样方法提取的健康骨成骨细胞；

11）所述骨质疏松骨提取的成骨细胞分别与10nM雌激素和羟基磷灰石材料共培养后，成骨指标均有显著性提升，趋近于健康组水平（图6）。证明此细胞模型可作为筛选骨质疏松药物及植入材料的可靠手段。

实施例2

参照实施例1所述的方法，将建模方式改变为：

选择2-3月龄体重在250克左右的Sprague Dawle雌鼠，饲养一周，使其适应环境。麻醉后，在常规无菌条件下，切除双侧卵巢，伤口缝合、消毒。分笼饲养。术后抗感染治疗连续3天，密切观察伤口情况。造模90天后，骨质疏松模型造模成功。表现为CT扫描鉴定下骨量减少，疏质骨微观形态改变。

其余步骤与实施例1相同，同样可获得与实施例1中所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞，单个细胞呈三角形、梭形，轮廓清晰，遮光好。经茜素红染色及碱性磷酸酶定量分析鉴定，证实其确为成骨细胞，且上述成骨指标均显著性低于同样方法提取的健康骨成骨细胞；所述骨质疏松骨提取的成骨细胞分别与10nM雌激素和羟基磷灰石材料共培养后，成骨指标均有显著性提升，趋近于健康组水平。证明此细胞模型可作为筛选骨质疏松药物及植入材料的可靠手段。

实施例3

参照实施例1所述的方法，将建模方式改变为：

取成年雌鼠吊尾饲养60天；或直接取年龄在24个月以上的雌性大鼠。

其余步骤与实施例1相同，同样可获得与实施例1中所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞，单个细胞呈三角形、梭形，轮廓清晰，遮光好。经茜素红染色及碱性磷酸酶定量分析鉴定，证实其确为成骨细胞，且上述成骨指标均显著性低于同样方法提取的健康骨成骨细胞；所述骨质疏松骨提取的成骨细胞分别与10nM雌激素和羟基磷灰石材料共培养后，成骨指标均有显著性提升，趋近于健康组水平。证明此细胞模型可作为筛选骨质疏松药物及植入材料的可靠手段。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，取骨质疏松大鼠动物模型的四肢骨，获取皮质骨骨片，在细胞培养板或培养皿中用培养基浸泡所述骨片，使细胞从骨片边缘爬出，进入细胞培养板或培养皿，收集贴壁生长的细胞，即获得骨质疏松大鼠原代成骨细胞。

2.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，采用纯机械分离法，获取皮质骨骨片。

3.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）处死模型动物，无菌条件下分离大鼠的股骨、胫骨、腓骨；

2）用消毒过的手术刀沿骨垢板闭合线切入，剥离并丢弃股骨、胫骨、腓骨生长端的骺板，彻底剔除骨上附着的肌肉组织；

3）在超净台内将皮质骨切割成骨片，弃两端，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗数次，并用振荡法彻底洗脱骨髓腔内残余的其他细胞，使骨片最终呈现乳白色；

4）在细胞培养板或培养皿中用培养基浸泡所述骨片；

5）5天后更换培养基；

6）12-15天后收集贴壁生长的细胞。

4.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）处死模型动物，无菌条件下分离大鼠的股骨、胫骨、腓骨；

2）用消毒过的手术刀沿骨垢板闭合线切入，剥离并丢弃股骨、胫骨、腓骨生长端的骺板，彻底剔除骨上附着的肌肉组织；

3）在超净台内将皮质骨切割成约2mm×2mm的骨片，弃两端，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗数次，并用振荡法彻底洗脱骨髓腔内残余的其他细胞，使骨片最终呈现乳白色；

4）将骨片按每孔6-10片接种于血清包被的6孔板内，每孔加入含有1%L-抗坏血酸、1%双抗、10%牛胎血清的高糖DMEM培养基5mL，浸泡全部骨片，避免骨片飘起；

5）5天后进行半量换液：留存1-2ml原培养基，补充3ml新培养基；

6）12-15天后进行常规传代，采用6孔板每孔接种1×10⁵个细胞，即获得骨质疏松大鼠原代成骨细胞。

5.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，采用茜素红（Alizarin Red）染色及碱性磷酸酶（ALP）定量分析对所得细胞进行鉴定。

6.根据权利要求1所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞分离培养方法，其特征在于，所述骨质疏松大鼠动物模型的构建方式为：取成年雌鼠用维甲酸按照70mg/kg的给药量胃灌15天；或取成年雌鼠吊尾饲养60天；或取成年雌鼠切除两侧卵巢后，饲养90天；或直接取年龄在24个月以上的雌性大鼠。

7.一种采用权利要求1所述的分离培养方法获取的骨质疏松大鼠原代成骨细胞。

8.根据权利要求7所述的骨质疏松大鼠原代成骨细胞，其特征在于，所述细胞呈三角形或梭形，轮廓清晰，折光好。

9.一种如权利要求7所述细胞的应用，其特征在于，将其作为筛选骨质疏松药物和\或植入材料的细胞模型。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述细胞与被筛选的对象共培养后，检测细胞的成骨指标。