CN102517250A

CN102517250A - 兔软骨下骨成骨细胞体外扩增培养方法及应用

Info

Publication number: CN102517250A
Application number: CN2011104456791A
Authority: CN
Inventors: 李秀兰; 张杨; 郭悦; 孙晓雷; 张玮; 崔丽; 冯俊奇
Original assignee: TIANJIN HOSPITAL TIANJIN CITY
Current assignee: TIANJIN HOSPITAL TIANJIN CITY
Priority date: 2011-12-28
Filing date: 2011-12-28
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2031-12-28
Also published as: CN102517250B

Abstract

本发明涉及一种兔膝关节炎软骨下骨成骨细胞体外扩增培养方法及应用。其培养方法是：首先制作改良Hulth兔关节不稳模型4～6周后无菌手术分离兔膝关节；然后将胫骨平台软骨下骨皮质小骨片经I型胶原酶-EDTA复合酶消化0.5～2小时后接种于血清包被的12孔板内，分次加入培养液培养；骨片贴附7～14天开始有细胞从骨片边缘爬出。所获得的细胞纯度高且增殖能力良好。本发明方法简单易行，获取时间短，获得的细胞成活率高、纯度高，可在短时间内满足大量制备的需要，对研究骨性关节炎发生、发展及其防治骨性关节炎有重要意义。

Description

兔软骨下骨成骨细胞体外扩增培养方法及应用

技术领域

本发明涉及一种兔膝关节炎软骨下骨成骨细胞体外扩增培养方法及应用。

技术背景

骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)是一种临床常见的老年性退变性疾病，以关节疼痛和关节功能障碍(包括关节畸形)为主要临床表现。OA是以软骨降解和软骨下骨硬化为主要特征的骨再造，二者之间的联系对提示骨细胞代谢活性的改变有着重要意义。OA治疗时既应关注软骨变化，又要预防软骨下骨退变。然而多年来的研究多数集中在软骨病变上，软骨下骨的研究甚少。Radin等首次提出软骨下骨可能在软骨退变的开始及进展中起关键作用。骨重塑异常引起的软骨下骨硬化，使其失去作为一个“震荡吸收器”的作用，从而使反作用于关节软骨的应力增强，同时其释放的因子通过生物学交流影响软骨细胞的代谢，导致软骨破坏【Amin AK，Huntley JS，Simpson AH，Hall AC.Chondrocyte survivalin articular cartilage：the influence of subchondral bone in a bovine model.J BoneJoint Surg Br.2009，91(5)：691-9】。另外还有研究者提出软骨下骨重塑可先于软骨的退变，导致骨关节炎的病变。Sanchez等对OA病人软骨细胞进行体外培养，并与OA软骨下骨硬化骨共培，发现硬化骨成骨细胞会阻碍软骨细胞聚集蛋白多糖基因表达，却促进金属基质蛋白酶MMP-3及MMP-13表达，表明OA病人的软骨下硬化骨成骨细胞可以刺激软骨细胞产生MMP而引起软骨降解，并抑制聚集蛋白多糖的合成【Sanchez C，Deberg MA，PiccardiN，et al，Subchondral bone osteoblasts induce phenotypic changes in human osteoarthriticchondrocytes[J].Osteoarthritis Cartilage.2005；13(11)：979-997.】。然而上述方法是通过骨组织与软骨细胞共培完成，如果我们可以成功分离出软骨下骨成骨细胞与软骨细胞共培养，得到的结果无疑更有说服力。

软骨下骨成骨细胞的分离、纯化、体外大量扩增对于骨性关节炎的研究具有重要意义。骨性关节炎是力学和生物学因素共同作用下，软骨细胞、滑膜细胞、软骨下骨成骨细胞及细胞外基质降解合成偶联失衡的结果。以滑膜细胞、软骨细胞、软骨下骨成骨细胞作为实验对象，可以在模拟体内环境的条件下，考察三种细胞间的相互影响，从细胞的角度去推断骨性关节炎的发生发展机制。同时，软骨下骨成骨细胞具有普通成骨细胞的功能表达，亦可作为种子细胞参与骨组织工程的研究。

目前涉及到软骨下骨的研究均是以生物力学及外科手术研究为主，生物学研究特别是细胞学水平的研究甚少。究其原因，除了骨性关节炎标准化模型制造困难，更重要的是骨性关节炎软骨下骨成骨细胞难以获取。现报道的成骨细胞的培养方法主要有酶消化法和组织块法，前者是将消化骨片后的细胞悬浮液离心后所得细胞接种于培养瓶进行培养，而后者是用骨片贴附培养【Pelletier JP，Lajeunesse D，Jovanovic DV，et al.Carprofensimultaneously reduces progression of morphological changes in cartilage andsubchondral bone in experimental dog osteoarthritis[J].J Rheumatol2000；27：2893-2902.】。两种方法对于实验动物的颅骨或骨膜来源组织的消化均能得到一定量的成骨细胞，然而对于成年关节炎模型动物的软骨下骨成骨细胞的分离效果鲜有报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种兔软骨下骨成骨细胞体外扩增培养方法及应用，通过利用兔关节不稳模型，采用I型胶原酶消化联合组织块贴附法获得软骨下骨成骨细胞，所获得的细胞纯度高且增殖能力良好。本发明建立一种简单、高效的软骨下骨成骨细胞的制备方法。对研究OA发生、发展及其防治OA有重要意义。

本发明提供的兔膝关节炎软骨下骨成骨细胞是采用改良Hulth兔关节不稳模型，无菌手术分离兔膝关节，于胫骨平台下软骨下骨皮质区获取软骨下骨骨片，通过酶消化联合贴壁法获得的。

本发明提供的兔膝关节炎软骨下骨成骨细胞的体外扩增培养方法包括如下的步骤：

1)制作改良Hulth兔关节不稳模型4～6周后，无菌手术分离兔膝关节；

2)将胫骨平台软骨下骨皮质区削为小骨片，经I型胶原酶-EDTA复合酶消化0.5～2小时，I型胶原酶单独消化2次，第1次12-20小时，第2次1～4小时，弃净消化液；

3)将骨片接种于血清包被的12孔板内，分次加入培养液培养，每2天换液，注意手法轻柔，勿使骨片漂起；

4)骨片贴附7～14天开始有细胞从骨片边缘爬出，制备出软骨下骨成骨细胞。

所述的骨片来源于胫骨平台软骨下骨皮质区，大小为0.5～3×0.5～3×1mm。

步骤2)所述的I型胶原酶-EDTA复合酶浓度为0.05～0.5％I型胶原酶及0.01～0.05％EDTA，消化条件为摇床37℃，250～500转/分。

所述的I型胶原酶单独消化浓度为0.05～0.5％，第1次消化条件为24～30℃，第2次消化条件为摇床37℃，250～500转/分。

步骤3)所述的培养液为包含5-20％胎牛血清的高糖DMEM。

所述软骨下骨成骨细胞呈短梭形或三角形，胞体透亮，折光性好，经过四甲基偶氮唑蓝(MTT)、I型胶原染色及RT-PCR检测鉴定，证实其确实具有成骨细胞生物学特性，增殖能力良好，纯度高。

所述的软骨下骨成骨细胞可作为骨组织工程种子细胞，观察其增殖活性及特异性表达产物可作为评价调控软骨下骨代谢及重塑药物疗效的可靠手段。

本发明的优点在于所选用的关节不稳模型可以准确定位并获取软骨下骨骨片。经过两步复合酶消化法获取的目标骨片在培养皿中培养7～14天即可见细胞贴壁、伸展和增殖。来源于关节炎模型的软骨下骨成骨细胞比颅骨、骨膜等来源的成骨细胞更适合于骨性关节的研究，及在防治骨性关节炎方面的应用。本发明方法简单易行，获取时间短，获得的细胞成活率高、纯度高，可在短时间内满足大量制备的需要。

附图说明

图1兔关节炎膝关节大体照。

图2兔关节炎膝关节组织学HE染色(a)×400和(b)×100。

图3P0软骨下骨成骨细胞培养11d(×100)。

图4P0软骨下骨细胞培养21d(×100)。

图5P1软骨下骨细胞培养1d(×100)。

图6P1软骨下骨细胞培养9d(×100)。

图7软骨下骨成骨细胞增殖活性曲线。

图8软骨下骨成骨细胞I型胶原免疫组化染色阳性(×100)。

图9软骨下骨成骨细胞RT-PCR检测I型胶原表达阳性。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细地说明。

1)改良Hulth动物模型【王云峰，白人骁，张杨等.改良Hulth模型复制膝不同时期骨关节炎的实验研究.天津医科大学学报.2009，15(3)：25-27】构建兔关节不稳模型：选用3～4月龄健康新西兰大耳白兔(清洁级，军事医学科学院)，雌雄不限，肌注氯胺酮100μl/kg(军事医学科学院)、速眠新II 100μl/kg(军事医学科学院)联合麻醉后，在常规无菌条件下，于兔膝关节前内侧行纵形切口，暴露膝关节，切断前交叉韧带，切除内侧半月板，切断内侧副韧带。术中保护关节软骨不受损伤。无菌生理盐水将关节腔冲洗干净，逐层缝合。分笼饲养。术后抗感染治疗，连续3天，密切观察伤口情况。

造模4～6周，关节不稳模型造模成功。表现为膝关节肿胀，滑膜充血水肿，炎性渗出增多，关节软骨失去光泽，关节面粗糙，可见小裂隙(图1)。组织学表现为软骨面纤维化，软骨细胞坏死(图2-a)，与软骨下骨脱离，表层见纤维素性渗出物包裹的纤维软骨组织(图2-b)。

2)选用空气栓塞法处死模型兔，无菌条件下，逐层切开膝关节皮肤、皮下组织。去除关节囊周围的肌肉等软组织，咬骨钳分离出整个关节，用含100～500U/ml青霉素的Hank’s液浸泡10～30分钟，再用Hank’s液冲洗3次，放入无菌大平皿中。

切开关节囊，充分暴露关节，用手术刀去除胫骨平台表面的关节软骨和其它结缔组织，暴露软骨下骨皮质区准确定位。用锤子敲击手术刀将软骨下骨皮质区削为大小约0.5～3×0.5～3×1mm的骨片，直至肉眼见到胫骨平台出现蜂窝样骨小梁组织为止。获得的骨片立即放入含100～300U/ml青霉素的Hank’s液浸泡5～10分钟，再移入Hank’s液继续清洗2次，获得软骨下骨骨片。

3)将经过Hank’s液清洗的骨片移入0.05～0.5％I型胶原酶(Invitrogen)及0.01～0.05％EDTA复合酶消化液中进一步剪碎后，置入摇床37℃，250～500转/分，消化0.5～2小时，800～1500转/分离心5～15分钟弃净消化液；再次加入0.05～0.5％I型胶原酶消化液，24～30℃条件下消化10～20小时；置入摇床36～38℃，250～500转/分，1～4小时，血清终止消化，800～1500转/分离心5～15分钟弃净消化液，获得目标软骨下骨骨片。

4)目标骨片接种于血清包被的12孔板内(Gibco血清均匀涂布于培养板底，37℃，5％CO2条件下12-20小时)，每孔约5～10片，置于37℃，1～10％CO₂条件下固定培养0.5～3小时，而后每孔于组织块周围轻轻滴加100～200μl含5～20％Gibco FBS的高糖DMEM培养液，继续培养；1～4小时后，每孔再加入100～400μl上述培养液；培养12～24小时后，再加入500μl培养液。此后每2天换液一次，每孔500μl～800μl 5～20％GibcoFBS的高糖DMEM培养液，注意手法轻柔，勿使骨片漂起。

骨片贴附7～14天开始有细胞从骨片边缘爬出，倒置显微镜下观察细胞呈短梭形或三角形，胞体透亮。(图3)。21天，细胞以骨片为中心，密度明显增大，细胞间隙致密(图4)。传代接种后1天，细胞以短梭型为主(图5)，9天可呈复层生长(图6)。

5)经四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测细胞增殖活性【Mosmann T.Rapid colorimetric assayfor cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicityassays.Journal of Immunological Methods，1983，65(1-2)：】，在培养过程中软骨下骨成骨细胞的增殖活性总体呈上升趋势，10天时最高。(图7)

6)I型胶原免疫组化染色【4％多聚甲醛固定15min，加入3％H₂O₂ 15min，PBS洗3次；加入10倍稀释的羊血清10min，甩干；加入1∶50的I型胶原一抗4℃过夜，PBS洗3次；加入二抗90min，PBS洗3次；加入DAB，避光15min，去离子水冲洗，镜下观察。】及RT-PCR检测I型胶原表达【杨志明，余希杰，解慧琪等.不同来源成骨细胞生物学特性的比较研究.中华创伤杂志.2001，17(1)：10-13】证明所制备的软骨下骨来源的成骨细胞具有合成分泌I型胶原的功能活性(图8)，在mRNA水平，I型胶原高表达(图9)。

Claims

1.一种兔膝关节炎软骨下骨成骨细胞的体外扩增培养方法，其特征在于，包括如下的步骤：

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的骨片来源于胫骨平台软骨下骨皮质区，大小为0.5～3×0.5～3×1mm。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的I型胶原酶-EDTA复合酶浓度为0.05～0.5％I型胶原酶及0.01～0.05％EDTA，消化条件为摇床37℃，250～500转/分。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的I型胶原酶单独消化浓度为0.05～0.5％，第1次消化条件为24～30℃，第2次消化条件为摇床37℃，250～500转/分。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于所述的培养液为包含5-20％胎牛血清的高糖DMEM。

6.根据权利要求1所述的培养方法得到的兔膝关节炎软骨下骨成骨细胞，其呈短梭形或三角形，胞体透亮。

7.根据权利要求1所述的培养方法得到的兔膝关节炎软骨下骨成骨细胞在评价调控软骨下骨代谢及重塑药物疗效中的应用。