CN113337461A - 一种软骨组织消化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种软骨组织消化方法，包括：取软骨组织；将所述软骨组织处理成碎片；在所述碎片中加入胶原酶溶液，预消化1‑2小时；收集上清，提取细胞，用无菌PBS冲洗剩余的软骨碎片，重新加入胶原酶原液，进行二次消化，每次2‑3小时；之后收集上清，提取细胞；重复所述二次消化步骤，直至所述碎片消化完全后得到所需要的细胞数量为止。本发明的方法实现软骨组织的充分消化，并且具有高提取效率、高细胞活性、高细胞纯度。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是指一种软骨组织消化方法。
背景技术
软骨是一种乏血管组织，主要由软骨细胞和富含糖胺聚糖和Ⅱ型胶原蛋白的的细胞外基质构成。当软骨受损时，由于细胞密度低，缺乏血供，细胞向受损区域的迁移率低，导致软骨的修复能力有限。胶原酶消化是分离软骨细胞最常用的方法，胶原酶从外向内分解软骨，将软骨细胞从软骨基质中释放出来。但是对于不同的软骨类型，消化的方案有很大区别。
一般来说，传统方案是进行一步胶原酶消化：软骨样品在胶原酶溶液中消化一段时间(一般为10-22小时，通常为12小时以上)，然后收集上清液，离心获得软骨细胞。该过程中不更换酶溶液，不提取酶溶液中的细胞。该种方法存在以下问题：
(1)现有技术主要是一步消化法，耗时长，消化不彻底；
(2)细胞提取效率低：胶原酶长时间作用后，酶活性下降，不能很好的分解深部的软骨组织；
(3)细胞活性低：已被消化分离出的细胞长时间存在于胶原酶溶液中，损害了细胞的活性；
(4)细胞纯度低：软骨表面有软骨膜组织，难以完全剥离；在消化细胞时，软骨膜细胞与软骨细胞混杂在一起，难以区分，导致软骨细胞纯度较低。
有鉴于此，有必要研发一种软骨组织消化方法，以解决上述问题。
发明内容
本发明提出一种软骨组织消化方法，解决了现有技术中消化不彻底、低细胞产率、低细胞活性、细胞纯度低的问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种软骨组织消化方法，包括：
取软骨组织；
将所述软骨组织处理成碎片；
在所述碎片中加入胶原酶溶液，预消化1-2小时；收集上清，提取细胞，用无菌PBS冲洗剩余的软骨碎片，重新加入胶原酶原液，进行二次消化2-3小时；之后收集上清，提取细胞；
重复所述二次消化步骤，直至所述碎片消化完全后得到所需要的细胞数量为止。
在一些实施例中，所述二次消化步骤进行三次以上。
在一些实施例中，所述软骨组织为兔软骨组织。
在一些实施例中，所述兔软骨组织为兔耳软骨组织、兔肋软骨组织、兔鼻中隔软骨组织或兔膝关节软骨组织。
在一些实施例中，所述兔软骨组织取自体重为0.7-1.0千克的白兔。
在一些实施例中，所述软骨组织先进行下述处理：
所述软骨组织在氯霉素溶液中浸泡20-40分钟，用无菌PBS溶液清洗。
在一些实施例中，所述胶原酶溶液为将NB4胶原酶(Nordmark Biochemicals，德国)溶解于Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM，Gibco，USA)。
在一些实施例中，所述胶原酶溶液的终浓度为1.5mg/mL。
在一些实施例中，消化过程在37℃，5％二氧化碳，100r/min的恒温摇床中进行。
本发明相比于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明方案将胶原酶消化的步骤分为多步序贯消化，每次时间在2-3小时，每步消化后提取出细胞，并更换新的胶原酶溶液，与传统方法相比有诸多优势。
(2)本发明的方法实现软骨组织的充分消化，并且具有高提取效率、高细胞活性、高细胞纯度。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：为实施例1的序贯消化法和传统消化法得到的细胞提取效率、细胞产量对比；图1A.序贯消化法和传统消化法的细胞提取效率对比(p＜0.0001)；图1B.序贯消化法和传统消化法的总细胞产量对比(p＜0.0001)。
图2：为实施例1的序贯消化法和传统消化法得到的细胞活性对比；图2A流式细胞术检测序贯消化法和传统消化法得到的细胞活性；图2B台盼蓝染色法检测序贯消化法和传统消化法得到的细胞活性。
图3：为实施例1的序贯消化法和传统消化法得到的细胞纯度和增殖能力对比；图3A Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色测定序贯消化法和传统消化法得到的细胞纯度；图3B CCK-8法测定序贯消化法和传统消化法得到的细胞增殖能力。
图4：A实施例2中的为手术取下的兔肋软骨组织；B为细胞提取效率统计图；C为细胞活性统计图。
图5：A实施例3中的为手术取下的兔鼻中隔软骨组织；B为细胞提取效率统计图；C为细胞活性统计图。
图6：A为实施例4中的为手术取下的兔膝关节软骨组织；B为细胞提取效率统计图；C为细胞活性统计图。
其中：#代表与“序贯第一次”组对比，*代表与“传统消化法”组对比。#：p＜0.05；##：p＜0.01；###：p＜0.001；*：p＜0.05；**：p＜0.01；***:p＜0.001
图7：为本发明的序贯消化法、以及传统消化法的流程图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中使用的试剂均为市售。
实施例1
提取兔耳软骨细胞：
取体重为0.7kg的新西兰白兔，麻醉满意后，在无菌手术环境中，打开胸腔，取兔肋软骨组织，在浓度为0.25％的氯霉素溶液中浸泡30分钟，用无菌PBS溶液清洗两次。在超净台内，尽量分离软骨表面的皮肤和软骨膜，并用眼科剪处理为大小约为1×1mm的碎片。然后分为两组，每组软骨质量均为3克，分别加入30毫升胶原酶溶液。胶原酶溶液是将NB4胶原酶(Nordmark Biochemicals，德国)溶解于Dulbecco的改良Eagle培养基(DMEM，Gibco，USA)，其终浓度为1.5mg/mL。
分别采用两种方法进行酶消化，进行对比：
序贯消化法(实验组)，采用多步消化方案，软骨碎片依次进行2小时、3小时、3小时的三次消化(本文中定义为序贯消化法，具体为序贯第一次，序贯第二次，序贯第三次)，每次消化后称重剩余软骨的重量，按每克软骨加入10毫升胶原酶溶液的比例更换新的酶溶液。其中的第一次2小时消化可视为简易的预消化步骤，得到的细胞可弃去不用。后续的3小时消化可多次重复，直至软骨碎片消化完全，或者得到所需要的细胞数量为止。序贯第一次之后，用无菌PBS冲洗剩余的软骨碎片，再进行序贯第二次；依此类推。
传统消化法(对照组)，采用传统的一步消化方案，3克软骨碎片在30毫升胶原酶溶液中持续消化12小时。
所有的消化过程都在37℃，5％二氧化碳，100r/min的恒温摇床中进行。
对于收集的软骨细胞，进行细胞计数、活力测定、增殖能力分析、表型和软骨基质合成能力分析。其中，细胞计数采用显微镜下计数板计数，活力测定使用台盼蓝染色计数和流式细胞分析方法，细胞增殖能力采用CCK-8增殖曲线测定，表型分析采用II型胶原免疫荧光染色来测定。
如图1所示，序贯消化法和传统消化法得到的细胞提取效率、细胞产量对比；图1A序贯消化法和传统消化法的细胞提取效率对比(p＜0.0001)，可见序贯消化法的软骨细胞的提取效率显著高于对照组：通过显微镜下细胞计数和剩余软骨质量称重，计算出序贯消化法的软骨细胞提取效率为13.32±2.20×106细胞/克耳软骨，传统消化法为3.84±0.82×106细胞/克耳软骨，可见序贯消化法的细胞提取效率为传统消化法的3.5倍左右，统计学分析显示差异有统计学意义。图1B序贯消化法和传统消化法的总细胞产量对比(p＜0.0001)，可见序贯消化法的软细胞总量远远大于传统消化法。
如图2所示，序贯消化法和传统消化法得到的细胞活性对比；图2A流式细胞术检测序贯消化法和传统消化法得到的细胞活性；图2B台盼蓝染色法检测序贯消化法和传统消化法得到的细胞活性。可见序贯消化法的软骨细胞的活性显著高于对照组。台盼蓝染色显示，序贯消化法的第一次、第二次、第三次收集的细胞中，活细胞比例分别为72.87±9.77％，89.53±6.38％，92.18±4.06％，传统消化法收集的细胞中，活细胞比例为76.53±7.89％。流式细胞术分析显示，序贯消化法的第一次、第二次、第三次收集的细胞中，活细胞比例分别为82.22±8.41％，91.81±4.18％，93.20±3.79％，传统消化法收集的细胞中，活细胞比例为79.84±9.73％。统计学分析显示，无论是采用台盼蓝染色还是流式细胞分析，序贯消化法第二次、第三次的细胞活性都显著高于传统消化法。
如图3所示，序贯消化法和传统消化法得到的细胞纯度和增殖能力对比；图3A Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色测定序贯消化法和传统消化法得到的细胞纯度；图3B CCK-8法测定序贯消化法和传统消化法得到的细胞增殖能力。序贯消化法的软骨细胞纯度显著高于传统消化法：Ⅱ型胶原蛋白是软骨组织的特异性标记蛋白，我们对收集的原代细胞进行II型胶原蛋白的免疫荧光染色，用Image J软件计算Ⅱ型胶原蛋白阳性的细胞占总细胞数的比例，结果显示：序贯消化法的第一次、第二次、第三次收集的细胞中，Ⅱ型胶原蛋白阳性的细胞比例分别为6.90±0.80％，19.10±1.11％，29.50±3.75％，传统消化法收集的细胞中，Ⅱ型胶原蛋白阳性的细胞比例11.47±1.88％。统计学分析显示，序贯消化法第二次、第三次的Ⅱ型胶原蛋白阳性的细胞比例显著高于传统消化法。序贯消化法软骨细胞的增殖能力显著高于传统消化法：两组细胞的CCK-8增殖曲线显示：在培养的第三天，序贯消化法第一次、第三次收集的细胞的增殖量显著高于传统消化法；在培养的第四天，序贯消化法第二次、第三次收集的细胞的增殖量显著高于传统消化法。
实施例2
提取兔肋软骨细胞；
取体重为0.7千克的新西兰白兔，麻醉满意后，在无菌手术环境中，打开胸腔，取兔肋软骨组织，在浓度为0.25％的氯霉素溶液中浸泡30分钟，用无菌PBS溶液清洗两次。在超净台内，尽量分离软骨表面的皮肤和软骨膜，并用眼科剪处理为大小约为1×1mm的碎片。
然后按照实施例1的方法分为两组，分别进行序贯消化法和传统消化法。序贯消化法预消化1.5小时，然后每次消化3小时，传统消化法消化12小时。
如图4所示，图4B为细胞提取效率统计图，可见序贯消化组中第二次、第三次的细胞提取效率显著高于传统消化法。图4C为细胞活性统计图，细胞活性是通过台盼蓝染色测定的，可见序贯消化组中第二次、第三次提取的细胞活性显著高于传统消化法。由此可见，本发明中提出的序贯消化法适用于提取兔肋软骨细胞且明显优于传统消化方法。
实施例3
提取兔鼻中隔软骨细胞；
取体重为0.8千克的新西兰白兔，麻醉满意后，在无菌手术环境中，打开胸腔，取兔鼻中隔软骨细胞，在浓度为0.25％的氯霉素溶液中浸泡30分钟，用无菌PBS溶液清洗两次。在超净台内，尽量分离软骨表面的皮肤和软骨膜，并用眼科剪处理为大小约为1×1mm的碎片。
然后按照实施例1的方法分为两组，分别进行序贯消化法和传统消化法。序贯消化法预消化1小时，然后每次消化2小时，传统消化法消化12小时。
如图5所示：图5B为细胞提取效率统计图，可见序贯消化组中第二次、第三次的细胞提取效率显著高于传统消化法。图5C为细胞活性统计图，细胞活性是通过台盼蓝染色测定的，可见序贯消化组中第二次、第三次提取的细胞活性显著高于传统消化法。由此可见，本发明中提出的序贯消化法适用于提取兔鼻中隔软骨细胞且明显优于传统消化方法。
实施例4
提取兔膝关节软骨细胞；
取体重为1kg的新西兰白兔，麻醉满意后，在无菌手术环境中，打开兔膝关节囊，取兔膝关节软骨组织，在浓度为0.25％的氯霉素溶液中浸泡30分钟，用无菌PBS溶液清洗两次。在超净台内，尽量分离软骨表面的皮肤和软骨膜，并用眼科剪处理为大小约为1×1mm的碎片。
然后按照实施例1的方法分为两组，分别进行序贯消化法和传统消化法。序贯消化法预消化2小时，然后每次消化3小时，传统消化法消化12小时。
如图6所示，图6B为细胞提取效率统计图，可见序贯消化组中第二次、第三次的细胞提取效率显著高于传统消化法。图6C为细胞活性统计图，细胞活性是通过台盼蓝染色测定的，可见序贯消化组中第二次、第三次提取的细胞活性显著高于传统消化法。由此可见，本发明中提出的序贯消化法适用于提取兔膝关节软骨细胞且明显优于传统消化方法。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (8)
1.一种软骨组织消化方法，其特征在于包括：
取软骨组织；
将所述软骨组织处理成碎片；
在所述碎片中加入胶原酶溶液，预消化1-2小时；收集上清，提取细胞，用无菌PBS冲洗剩余的软骨碎片，重新加入胶原酶原液，进行二次消化2-3小时；之后收集上清，提取细胞；
重复所述二次消化步骤，直至所述碎片消化完全或得到所需要的细胞数量为止。
2.根据权利要求1所述的一种软骨组织消化方法，其特征在于，所述二次消化步骤进行三次以上。
3.根据权利要求1所述的一种软骨组织消化方法，其特征在于，所述软骨组织为兔软骨组织。
4.根据权利要求3所述的一种软骨组织消化方法，其特征在于，所述兔软骨组织为兔耳软骨组织、兔肋软骨组织、兔鼻中隔软骨组织或兔膝关节软骨组织。
5.根据权利要求3所述的一种软骨组织消化方法，其特征在于，所述兔软骨组织取自体重为0.7-1.0千克的新西兰白兔。
6.根据权利要求1或3所述的一种软骨组织消化方法，其特征在于，所述软骨组织先进行下述处理：
所述软骨组织在氯霉素溶液中浸泡20-40分钟，用无菌PBS溶液清洗。
7.根据权利要求1或2所述的一种软骨组织消化方法，其特征在于，所述胶原酶溶液为将NB4胶原酶溶解于Dulbecco的改良Eagle培养基。
8.根据权利要求7所述的一种软骨组织消化方法，其特征在于，所述胶原酶溶液的终浓度为1.5mg/mL。
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