CN111304162A - 感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，包括如下步骤：（1）利用解剖学结构获取感觉神经和运动神经，将其消化培养后获得混合生长的感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞；（2）差速消化法结合差速贴壁法分离出施万细胞并收集；（3）差速消化法结合差速贴壁法分离出成纤维细胞并收集。本发明建立了一种快速高效的体外纯化培养感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的方法，为深入研究周围神经特异性再生的机制提供有力的支撑。
Description
技术领域
本发明属于生物医学专业领域，具体涉及一种感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法。
背景技术
周围神经损伤的修复一直是临床治疗的一个难题，虽然随着显微外科学的发展，在神经缺损的桥接吻合方面取得了一定的进展，但神经功能恢复的效果仍不理想，其原因主要由于再生的神经未能准确地、选择性地再支配靶组织器官（感觉神经末梢和运动终板），即错向生长：如感觉神经轴突错向长入运动支的神经内膜管，运动神经轴突错向长入感觉支的神经内膜管。因此，充分理解周围神经特异性再生的细胞和分子生物学基础，在临床治疗中加以运用以促进周围神经功能更好的恢复具有非常重要的意义。
周围神经主要由神经元的轴突、包绕在轴突上的施万细胞（SCs）和成纤维细胞（Fbs）组成。在神经损伤再生过程中，再生轴突沿着特定的通路延伸，而神经突起特异性引导延伸的现象是由于神经元、施万细胞和成纤维细胞之间复杂而精确的相互作用。成纤维细胞是组成神经内膜、神经外膜和神经束膜的主要成份，施万细胞仅在神经内膜中表达。
体外培养成纤维细胞和施万细胞有助于研究周围神经特异性再生的细胞与分子机制。目前常用的纯化培养施万细胞和成纤维细胞的方法有阿糖胞苷处理法和补体抗体法，以上方法均去除了成纤维细胞仅获得高纯度的施万细胞。流式细胞分选法虽然可以同时获得高纯度的施万细胞和成纤维细胞，但是需要价格昂贵的流式分选仪，同时需要耗费大量的细胞，并且分选后细胞得率也很低。差速贴壁法是利用成纤维细胞和施万细胞对多聚赖氨酸的黏附能力不同对两种细胞进行分离，但是纯化后两种细胞的纯度不如其他方法获得的纯度高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，能快速高效地体外纯化培养感觉与运动神经来源施万细胞和成纤维细胞，为深入研究周围神经特异性再生的机制提供有力的支撑。
为解决上述技术问题，本发明的实施例提供一种感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，包括如下步骤：
（1）利用解剖学结构获取感觉神经和运动神经，将其消化培养后获得混合生长的感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞；
（2）差速消化法结合差速贴壁法分离出施万细胞并收集；
（3）差速消化法结合差速贴壁法分离出成纤维细胞并收集。
其中，步骤（2）的具体步骤为：在培养皿中加入0.25%胰酶停留10s后迅速加入完全培养基终止消化，施万细胞变圆，轻轻吹打细胞，施万细胞脱落，而成纤维细胞仍然紧贴皿底，收集施万细胞接种培养30min，至施万细胞中夹杂的少量成纤维细胞已经贴壁，通过差速贴壁法收集含未贴壁施万细胞的上清接种在多聚赖氨酸预包被的培养皿中培养，培养2天后重复步骤（2）一遍，培养2-3天至细胞铺满皿底，胰酶消化后收集施万细胞。
其中，步骤（3）的具体步骤为：步骤（2）中经差速消化法去除施万细胞后，培养皿中剩余的成纤维细胞加入0.25% 胰酶消化2-4min，加入完全培养基终止消化，收集成纤维细胞，然后离心接种在培养皿中培养30 min，至大部分成纤维细胞已经贴壁，弃去上清中残留的少量施万细胞，加完全培养基培养2天后重复步骤（3）一遍，培养2-3天至细胞铺满皿底，胰酶消化后收集成纤维细胞。
其中，所述的施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法还包括步骤（4）感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的纯度鉴定。
优选的，步骤（4）中采用免疫细胞化学染色鉴定感觉/运动施万细胞和成纤维细胞纯度。也可以采用流式细胞仪检测感觉与运动施万细胞和成纤维细胞纯度。
本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明建立了一种快速高效的体外纯化培养感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的方法，为深入研究周围神经特异性再生的机制提供有力的支撑。
附图说明
图1为本发明中感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞培养光镜图；
图2为本发明中感觉/运动神经成纤维细胞免疫细胞化学染色图；
图3为本发明中感觉/运动神经施万细胞免疫细胞化学染色图；
图4为本发明中感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞流式细胞分析检测细胞纯度图。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
本发明提供了一种感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，包括如下步骤：
（1）利用解剖学结构成功获取感觉神经和运动神经，将其消化培养后获得大量混合生长的感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞；
（2）差速消化法结合差速贴壁法分离出施万细胞并收集，具体步骤为：在培养皿中加入0.25%胰酶停留10s后迅速加入完全培养基终止消化，此时施万细胞变圆，轻轻吹打细胞，施万细胞脱落，而成纤维细胞仍然紧贴皿底，收集施万细胞接种培养30min，至施万细胞中夹杂的少量成纤维细胞已经贴壁，通过差速贴壁法收集含未贴壁施万细胞的上清接种在多聚赖氨酸预包被的培养皿中培养，培养2天后重复步骤（2）一遍，培养2-3天至细胞铺满皿底，胰酶消化后收集施万细胞。
（3）差速消化法结合差速贴壁法分离出成纤维细胞并收集，具体步骤为：步骤（2）中经差速消化法去除施万细胞后，培养皿中剩余的成纤维细胞加入0.25% 胰酶消化2min左右，加入完全培养基终止消化，收集成纤维细胞，然后离心接种在培养皿中培养30 min，至大部分成纤维细胞已经贴壁，弃去上清中残留的少量施万细胞，加完全培养基培养2天后重复步骤（3）一遍，培养2-3天至细胞铺满皿底，胰酶消化后收集成纤维细胞。
其中，所述的施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法还包括步骤（4）感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的纯度鉴定，采用免疫细胞化学染色鉴定感觉/运动施万细胞和成纤维细胞纯度。也可以采用流式细胞仪检测感觉与运动施万细胞和成纤维细胞纯度。
下面结合具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
以下实施例中，未详尽描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1 感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的培养和纯化
1、感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的培养
新生SPF级 SD大鼠（7-8天）4只，75%乙醇消毒，断头，无菌条件下分离脊柱置于解剖液中，沿两侧轻轻剪开椎管，充分暴露脊髓，置于含有链霉素和青霉素的D-Hank’s平衡盐溶液中，解剖显微镜下仔细剥离脊髓蛛网膜。根据解剖学结构，从脊髓腹侧发出的神经为运动神经（前根），从脊髓背侧发出的神经为感觉神经（后根）。分离并获取感觉神经纤维和运动神经纤维，将获得的神经纤维剪成2-5mm左右的神经段，0.25%胰酶消化20 min，完全培养基（DMEM+10%FBS）终止消化，轻轻吹打混匀后离心（800g，5 min）。弃上清，使用完全培养基重悬沉淀，轻轻吹打混匀后细胞悬液过400目筛网。将细胞接种在培养皿中培养（37℃，5%CO2）4到5天。如图1A和图1B所示，施万细胞形态呈双极或三极，许多细胞聚集在一起肩并肩或端对端排列在成纤维细胞之间的空隙中或贴附在成纤维细胞表面生长，而成纤维细胞形态不规则，扁平状贴附在皿底生长。其中，图1A所示为运动神经施万细胞和成纤维细胞的培养光镜图，图1B为感觉神经施万细胞和成纤维细胞的培养光镜图。
2、感觉/运动神经施万细胞的纯化
细胞铺满皿底达90% 时，利用两种细胞对胰酶的反应时间不同，先采用差速消化法分离施万细胞与成纤维细胞。施万细胞对胰酶的反应时间较短，约10秒，而成纤维细胞对胰酶的反应时间较长，约需2-3分钟。因此在培养皿中加入0.25%胰酶停留10s后迅速加入完全培养基终止消化，此时施万细胞变圆，轻轻吹打细胞，施万细胞脱落，而成纤维细胞仍然紧贴皿底（如图1C和图1D所示）。收集施万细胞离心（800g，5min）。弃上清，使用完全培养基重悬沉淀后接种在培养皿中培养（37℃，5% CO2）30min。此时施万细胞中夹杂的少量成纤维细胞已经贴壁，收集包含未贴壁施万细胞的上清接种在多聚赖氨酸包被的培养皿中培养（37℃，5% CO2）。培养2天后重复此步骤一遍：差速消化法结合差速贴壁法。经过两次差速贴壁法结合差速消化法纯化后，施万细胞已纯化并呈现典型的梭形形态（如图1G和图1H所示）。其中，图1C为运动神经施万细胞胞体变圆的结果图，图1D为感觉神经施万细胞胞体变圆的结果图；图1G为运动神经施万细胞呈现典型的梭形形态生长示意图，图1H为感觉神经施万细胞呈现典型的梭形形态生长示意图。
3、感觉/运动神经成纤维细胞的纯化
如步骤2中所述，差速消化法去除施万细胞后，培养皿中剩余的成纤维细胞用D-Hank’s平衡盐溶液洗一遍，加入0.25% 胰酶消化2min左右，加入完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞，收集成纤维细胞离心（800g，5 min）。弃上清，使用完全培养基重悬沉淀后接种在培养皿中培养（37℃，5% CO2）30 min。此时大部分成纤维细胞已经贴壁，弃去上清中残留的少量施万细胞，加完全培养基培养（37℃，5% CO2）。培养2天后重复此步骤一遍：差速消化法结合差速贴壁法。经过两次差速贴壁法结合差速消化法纯化后，成纤维细胞已纯化并呈现典型的扁平不规则形态（如图1E和图1F所示）。其中，图1E所示为经过两次差速消化法结合差速贴壁法纯化后运动神经成纤维细胞呈现典型的扁平不规则形态生长，图1F为经过两次差速消化法结合差速贴壁法纯化后感觉神经成纤维细胞呈现典型的扁平不规则形态生长。
实施例2 感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的纯度鉴定
1、免疫细胞化学染色鉴定感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的纯度
采用成纤维细胞标记物CD90标记感觉和运动成纤维细胞，Hoechst 33342标记细胞核，统计结果显示纯化后的感觉神经成纤维细胞和运动神经成纤维纯度分别为92.64%和92.51%（如图2所示），其中，图2 A为CD90 标记运动神经成纤维细胞，图2D为CD90 标记感觉神经成纤维细胞，图2B为Hoechst 33342标记运动神经成纤维细胞核，图2D为Hoechst33342标记感觉神经成纤维细胞核，图2C和图2F 为CD90和Hoechst 33342染色合并图，图2G为运动和感觉神经成纤维细胞纯度统计图。
采用施万细胞标记物S100标记感觉和运动施万细胞，Hoechst 33342标记细胞核，统计结果显示感觉神经施万细胞和运动神经施万细胞的纯度分别为93.56%和91.61%（如图3所示），其中，图3 A为S100 标记运动神经施万细胞，图3D为S100 标记感觉神经施万细胞，图3B为Hoechst 33342标记运动神经施万细胞核，图3E为Hoechst 33342标记感觉神经施万细胞核，图3C和图3F 为S100和Hoechst 33342染色合并图，图3G为运动和感觉神经施万细胞纯度统计图。
2、流式细胞仪检测感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的纯度
采用成纤维细胞标记物CD90标记感觉/运动神经成纤维细胞后经流式细胞仪检测细胞纯度，结果显示：> 90% CD90阳性细胞为成纤维细胞。采用施万细胞标记物S100标记感觉和运动施万细胞，结果显示：> 92% S100阳性细胞为施万细胞（如图4所示）。其中，图4A为运动和感觉神经成纤维细胞纯度统计图，图4B为运动和感觉神经施万细胞纯度统计图。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）利用解剖学结构获取感觉神经和运动神经，将其消化培养后获得混合生长的感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞；
（2）差速消化法结合差速贴壁法分离出感觉与运动施万细胞并收集；
（3）差速消化法结合差速贴壁法分离出感觉与运动成纤维细胞并收集。
2.根据权利要求1所述的感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤（2）的具体步骤为：在培养皿中加入0.25%胰酶停留10s后迅速加入完全培养基终止消化，施万细胞变圆，轻轻吹打细胞，施万细胞脱落，而成纤维细胞仍然紧贴皿底，收集施万细胞接种至新的培养皿培养30min，此时施万细胞中夹杂的少量成纤维细胞已经贴壁，通过差速贴壁法收集含未贴壁施万细胞的上清接种在多聚赖氨酸预包被的培养皿中培养，培养2天后重复步骤（2）一遍，培养2-3天至细胞铺满皿底，胰酶消化后收集施万细胞用于后续研究。
3.根据权利要求1所述的感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤（3）的具体步骤为：步骤（2）中经差速消化法去除施万细胞后，培养皿中剩余的成纤维细胞加入0.25% 胰酶消化2-3min，加入完全培养基终止消化，收集成纤维细胞，然后离心接种在培养皿中培养30 min，至大部分成纤维细胞已经贴壁，弃去上清中残留的少量施万细胞，加完全培养基培养2天后重复步骤（3）一遍，培养2-3天至细胞铺满皿底，胰酶消化后收集成纤维细胞用于后续研究。
4.根据权利要求1所述的感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，其特征在于，还包括步骤（4）感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的纯度鉴定。
5.根据权利要求4所述的感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤（4）中采用免疫细胞化学染色鉴定感觉/运动施万细胞和成纤维细胞纯度。
6.根据权利要求4所述的感觉/运动神经施万细胞和成纤维细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤（4）中采用流式细胞仪检测感觉与运动施万细胞和成纤维细胞纯度。
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