KR20100063696A

KR20100063696A - 중간엽 줄기세포의 최적 증식 및 이식을 위한 방법 및 조성

Info

Publication number: KR20100063696A
Application number: KR1020107002605A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 제이. 센테노; 크리스틴 케한
Original assignee: 리제너러티브 사이언시즈, 엘엘씨
Priority date: 2007-07-05
Filing date: 2008-06-25
Publication date: 2010-06-11
Also published as: CN101878297A; EP2167648A4; WO2009006161A1; EP2167648B1; US20090010896A1; MX2009014273A; US9700583B2; JP2010532370A; CA2691427A1; BRPI0814651A2; EP2167648A1; US9095562B2; US20160106780A1

Abstract

본 조성물과 방법은 중간엽 줄기세포를 최적으로 증식하여 필요한 환자에게 이식하기 위해서 제공되는 것이다. 중간엽 줄기세포들(MSC)을 필요로하는 환자에 대하여 자가 MSC를 채취하여 환자의 혈소판에 있는 자가성장 인자들의 영향 하에 신규한 성장 매개 변수들 내에서 증식하는 것이다.

Description

중간엽 줄기세포의 최적 증식 및 이식을 위한 방법 및 조성 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR OPTIMIZED EXPANSION AND IMPLANTATION OF MESENCHYMAL STEM CELLS}

본 발명은 줄기세포를 분리, 증식하여 필요한 숙주에 이식하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 최적의 성장조건 하에서 증식한 자가 중간엽 줄기세포(Mesenchymal Stem Cells, MSC)를 이용하여 표적 조직을 대치하고 치유하는 것에 관한 것이다.

중간엽 줄기세포는 혈액, 골수, 진피 및 골막에 존재하는 다능성 모세포 또는 배아 같은 세포이다. 일반적으로 이 세포들은 오랜 시간에 걸쳐서 자신을 재생할 수 있으며 또한 여러 가지 환경 조건에서 연골, 뼈 및 기타 조직으로 분화할 수 있다. 최근에는 여러 연구자들이 이 세포들을 이용하여 뼈, 연골 등과 같은 표적조직을 치유 또는 재생할 수 있는 가능성을 연구하였다. 이렇게 해서 MSC는 수많은 동물모형에서 재생능력을 갖고 있음을 알게 되었다. Acosta et al. (2005) Neurosurg Focus 19(3):E4; Barry (2003) Novartis Found Symp. 249:86-102, 170-4, 239-41; Brisby et al. (2004) Orthop Clin. North Am. 35(1):85-89; Buckwalter and Mankin (1998) Instr Course Lect. 47:487-504; Caplan (1991) J Orthop Res. 9(5):641-650 참조. 나아가 이 연구 결과는 인체를 대상으로 한 임상시험으로 확대되었으나 대부분의 임상시험에서는 고농도의 재조합형 시토카인 및 성장 인자를 사용하는 분리된 비자가 MSC의 시험관 내 증식이 필요하다. 예컨대 인체를 대상으로 한 대부분의 연구에서는 골수(또는 말초혈액)에서 분리된 MSC를 이용하여 소태아혈청(FBS)을 주성분으로 각종의 재조합형 성장 인자들을 첨가한 배지를 사용한 실험실 환경에서 세포들을 체외 증식하였다. 이 영양보충형 FBS-주성분 배지는 MSC 증식을 지원하는 능력을 보였으나 동시에 감염 매개체들의 교차오염, 식품의약청(FDA)의 승인을 받지 않은 약품/인자들, 예를 들면 재조합형 TGF-β, FGF의 사용, 종간 교차반응 및 암성 전구세포 생성 가능성의 증가 위험을 포함하고 있다.

아울러 대부분의 MSC 기반 인체 대상 연구에는 분리된 MSC를 증식하기 위한 숙련된 실험실 요원과 실험실 장비가 필요하였다. 이 방법은 의사 및/또는 병원 의료진이 수행하기에는 부적절한데, 특히 의사들이 FDA가 승인하지 않은 약품에 관해서는 FDA의 규칙과 절차에 의해서 법적으로 규제를 받는다는 관점에서 그러하다. 그러므로 MSC 기반 요법은 실용적 방식으로, 즉, 병원 직원이 배치된 병원 환경에서는 수행하기가 어렵다. 이런 수많은 문제들을 감안하면 대부분의 MSC 기반 연구는 분리하여 영구 세포주로 배양한 비자가 세포들을 지향한다.

Doucet(Doucet, Ernou et al. 2005 J. Cell Physiol 205(2):288-36)는 최근에 5％ 혈소판 용해물 영양강화 배지를 사용하여 젊고 건강한 기증자들의 MSC를 증식하는 방법을 설명하였다. 그러나 Doucet의 연구는 노인환자, 퇴행성 관절질환(예컨대 골관절염)을 가진 환자 또는 기타 환자별 특성들에 대한 이 방법의 효과를 찾아내지 못하였다. 또한 5％ 혈소판 용해물 영양강화 배지 말고 다른 증식조건을 사용해서는 연구가 수행되지 않았다. 이러한 관점에서, 골관절염을 가진 환자 및 골관절염을 갖지 않은 환자에서 MSC성장은 나이, 성별 및 특정 유전적 표현형에 따라서 큰 차이를 나타낸다는 것을 알게 되었다. 그러므로 Doucet의 연구는 MSC 기반 요법이 필요한 대부분의 환자들이 일반적으로 나이가 많거나 퇴행성 관절, 기관 또는 척추 질환을 앓고 있는 실제 삶의 상황에 적용하기에는 매우 한계가 있다. 또한 Doucet의 연구 데이터는 무혈관괴사 또는 뼈괴사와 같은 기타 뼈대사 질환 상태에 대해서는 적용할 수 없다. 또한 Doucet의 연구에서 일반화된 결과는 성별 또는 나이별로 된 것이 아니어서 성별에 따른 치료 방법 또는 나이 많은 환자로부터 MSC를 증식하는 방법에 관해서 거의 지침이 되지 못한다.

MSC는 배양 시에 시토카인 노출, 환경조건(압력, 부착 기회, 배양 처치 등) 또는 기타 화학적 노출에 따라서 용이하게 분화될 수 있다. 예컨대 배양 시에 서로 다른 수준의 TGF-beta, FGF, 및/또는PDGF에 노출시키면 모두 최종 생성되는 표현형에 큰 영향을 끼친다. 또한 세포들을 더 오랫동안 배양상태에 두면 분화 잠재력이 큰 영향을 받는다. 세포들은 특정한 시각형태, 융합 또는 밀도로 배양될 수 있는데, 이들은 모두 최종 생성되는 세포생성물과 이것의 특정 형태의 조직재생 잠재력에 큰 영향을 끼친다. 따라서, 본 발명은 특정한 복원성을 갖는 균일한 세포를 생성할 수 있도록 인자들/매개 변수들을 제어하는데 초점을 둔다.

MSC로 조직을 교체 또는 치유하는 데 있어 한 가지 문제는 비자가 세포의 사용이다. MSC는 전통적으로 면역에 전유된 것으로 고려되었으나 최근의 연구에서 이종 숙주 내의 자연세포 독성세포 계를 활성화시킨다는 사실이 알려졌다(Spaggiari, Capobianco et al. 2006 Blood 107(4):1484-90). 이것은 비자가 세포의 사용을 어렵게 만드는데, 그 이유는 숙주의 면역계가 이들 이종세포를 공격하여 이식된 MSC의 수를 급격하게 감소시켜 그 재생능력을 심각하게 제한할 수 있기 때문이다. 또한 Ueda가 최근에 발표한 연구에는 비자가 세포에 대한 또 다른 훨씬 진전된 결과를 내포하고 있다. (Ueda, Inaba et al. 2007 Stem Cells 25(6):1356-63) 이 연구는 골다공증을 앓는 늙은 쥐가 골수벡터를 통해 그 병을 정상적인 쥐에게 옮긴다는 것을 입증하였다. 이로써 골다공증을 가진 늙은 쥐의 MSC를 일단 정상인 건강한 쥐에게 이식하면 정상인 건강한 쥐도 이 병에 걸릴 수 있게 된다는 것을 알 수 있다. 이 유전자 벡터가 질병을 전달하기 때문에, 이론적으로는 임의의 제공자의 MSC를 선별하여 그 제공자에 의해서 전이될 수 있는 알려진 모든 유전자감수성 및 질병들에 대처해야 한다.

본 기술 분야에 필요한 것은 FDA가 승인하지 않은 약품 또는 성장 인자들을 사용하지 않고 필요한 환자의 조직을 교체하는 데 효과적으로 사용할 수 있는 MSC 증식기법이다. 이 교체 작업은 환자의 의학적 상태, 나이, 성별 및 기타 교체에 관련된 상태를 기초로 해서 최적으로 증식된 자가 세포로 해야 한다. 또 공지의 재생 능력을 지닌 균일한 세포주를 생산할 수 있는 자가 기법과 엄격한 품질관리가 필요하다.

본 발명의 목적은 전술한 문제들 중 하나 이상의 문제들을 극복하는 것이다.

<본 발명의 개요>

본 발명의 구현 예를 통해 사람의 자가 중간엽 줄기세포(MSC)를 체외증식 하여 이를 필요로 하는 표적 환자에게 이식하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 이 MSC는 그 이식능력을 최적화하여 표적 조직을 교체/재생하는데 예를 들면 무릎관절 내의 연골을 재생하는 것이 여기에 해당한다. 위에서 논의한 바와 같이, 또한 이 MSC를 최적화하여 엄격한 품질 관리를 통해 균질 세포주를 생산한다. 엄격한 품질 관리는 다음 중 하나 이상의 세포 표면 항원을 발현한다. CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, CD166 및 CD105. 또한 일부 구현을 통해 상기 세포 표면 항원들 중 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개를 발현한다. 또한 여기서 설명한 일부 최적화된 세포들은 다음과 같은 세포 표면 항원 중 하나 이상을 발현하지 않는다. CD14, CD31, CD45 및/또는 CD106.

본 발명의 특징에는 정제 또는 재조합형 성장 인자들, 시토카인 또는 비천연 발생 인간 인자를 요하지 않는 신규 증식 조성물이 포함된다. 특히, 증식 조성물은 설계는 세포 성장을 최적화하고 특히 대상 환자에게 세포 이식 시 세포 성장을 최적화하기 위해 혈소판 용해물 도입량을 변경 (및 시간 조절 변경) 하도록 설계되었다. 몇 가지 최적화의 예로는 세포가 필요한 환자에게 성공적으로 세포를 이식할 수 있는 능력을 용이하게 하기 위한 제어 방식으로 세포를 증식하는 것이 있다. 경우에 따라서는 세포 성장과 세포 성장 조건을 모니터하고 수정하여 세포를 선결 "성장 채널(growth channel)" 내에 유지하기도 한다. 즉, 세포 계대(cell passages)에 이르기 전에 세포 증식을 정해진 수로 제한하는 것이다. 이 혈소판 용해물 기반 성장 조건은 그 성장 채널 내에서 MSC의 체외 증식을 용이하게 하는 데 필요한 인자들을 일관성있게 자가 방출할 수 있게 해준다. 또한 균질성 및 엄격한 품질 관리를 확보하기 위해서 "성장 채널"은 세포 밀도, 형태 및 배양 패턴과 같은 다수의 기타 구현 속성을 갖는다. 또한, 이들은 공지의 세포 복구성질을 가진 일관된 세포증식을 하도록 설계되는데, 그 이유는 이 세포성장을 위한 공식에 약간의 변화만 생겨도 다른 분화 및 복구 성능을 가진 완전히 다른 세포의 생성을 초래하기 때문이다.

본 발명의 특징에는 또한 세포들을 정해진 양의 혈소판 또는 혈소판 용해물과 함께 이식함으로써 환자들이 최적으로 배양된 MSC를 이식 받을 수 있도록 준비를 갖추게 하는 것이 포함된다. 세포 및 혈소판 이식은 동시에 실시하거나 순서대로 하나씩 할 수 있다. 일반적으로 이식을 실시할 때, MSC, 혈소판 및 혈소판 용해물은 MSC, 혈소판 및 혈소판 용해물을 이식 대상인 환자 본인에게서 채취한 것이다.

본 발명의 특징은 또한 MSC 기반 복원 치료가 필요한 환자에게서 MSC를 분리하고, 이 분리한 MSC를 표적에 필요한 정확하고 균일한 성장(즉, 성장 채널 내에서 성장)의 확보에 필요한 세포 속성(융합, 형태, 세포 배양 패턴 등)에 기초한 배양결정서 및 여러 가지 분량의 혈소판 용해물을 사용해서 얻은 세포특정 증식데이터를 사용하여 최적으로 증식하고, 이 증식된 세포들을 본 발명의 상황의존성이 없는 MSC 성장촉진물질과 함께 이식하는 방법을 포함하는 것이다.

본 발명의 특징은 지금까지는 환자에서 수집한 세포들이 교체치료에 사용될 가망성이 거의 없었다는 관점에서 볼 때 골관절염이나 기타 연골 또는 뼈대사 질환(무혈관괴사 또는 골다공증 등)을 앓는 환자에게서 세포를 수집하여 교체하는 경우에 특히 유용하다. 그러나 이 말이 본 발명의 사용과 범위를 한 가지 용도로만 제한한다는 의미로 해석되어서는 안된다.

본 발명의 특징은 또한 수집된 MSC를 자연적인 방식으로 유지하여 다시 환자에게 세포이식을 용이하게 하는 것을 확보하기 위한 성장 채널을 제공하는 것이다. 이 세포들은 자가로서 표적 내 성장 잠재력을 위해 이들을 제공한 동일한 숙주에서 나온 자연적인 인자들만을 사용하여 최적화시킨다. 즉, 세포 성장을 위해 일체의 합성 또는 재조합형 인자들을 사용하지 않는다. 전형적인 성장 채널 구현에서 세포들은 10번째 계대 이전에 이식을 위한 증식 및 준비가 되며 기타 구현에서는 3번째, 4번째, 5번째, 6 번째, 7 번째, 8 번째, 9 번째 계대에서 이식을 위한 증식 및 준비가 된다(후 수집: post harvest). 약 10번째 통로 이후에서 이식된 세포들은 임상의 용도로 비효과적인 경향이 커진다.

본 발명의 특징은 세포들을 수작업으로 세어서 증식된 MSC를 성장 채널 내에 존재토록 하는 것을 보장하는 것이다. 또 다른 본 발명의 특징에 의하면 세포들이 성장 채널 내에 존재하는 특징표시를 위해서 MSC를 육안으로 검사하며, 특징지표들은 배양 형태, 배양 패턴 및 배양 밀도를 포함한다. 몇 가지 특징들에 의하면 세포의 수와 육안검사를 이용해서 세포들이 본 발명의 성장 채널 내에 존재하는 지를 표시한다. 주목해야 할 점은 육안검사가 수행되는 곳이 MSC가 배양되는 현장, 이를테면 그 세포증식 계약을 한 병원의 혈액은행이거나 또는 현장에서 멀리 떨어진 원격지에 있는 경험이 있는 조직배양 직원이 디지털 카메라 현미경 검사법(실황 비디오 또는 영상 업데이트 또는 기타 유사한 기술)으로 배양을 관찰해서 배양된 세포의 상태에 관해서 다시 현장에 있는 직원에게 보고할 수 있다는 것이다.

마지막으로, 본 발명의 특징은 여기에 언급된 방법들을 사용하여 확인된 표현형들을 위해서 영양 강화된 세포 개체군을 제공하는 것이며, 그 표현형은 다음과 같은 세포 표면 항원 CD29, CD44, CD59, CD90, CD166, CD73 및 CD105 중에서 한 개 이상을 포함하는 것이다. 또한 여기에 확인된 세포들은 CD14, CD31, CD45 및 CD106 세포 표면 항원에 대해서 전형적으로 음성이다. 몇 가지 구현들에서 최적화되어 증식된 세포 개체군들은 다음의 세포 표면 항원 CD59, CD90, CD105 및 CD66 중에서 적어도 한 개와 함께 CD29 및 CD44를 발현한다. 그러므로 몇 가지 구현들에서 본 발명의 최적화된 세포 개체군들은 적어도 CD29, CD44 및 CD59를 발현하거나, CD29, CD44 및 CD90을 발현하거나, CD29, CD44 및 CD105를 발현하거나 또는 CD29, CD44 및 CD66을 발현한다.

본문에 언급된 방법들을 사용해서 상기 표현형을 갖도록 준비된 세포들은 이를 필요로 하는 환자에게 이식하는 데 최적의 성장 특징들을 보인다.

본 발명의 이러한 특징들과 기타 여러 가지 특징들에 관해서는 다음의 상세한 설명과 첨부한 청구 범위를 보면 명확하게 알 수 있을 것이다.

도 1 a-e는 본문에 언급된 "성장 채널"의 세포성장 속도, 세포 밀도, 세포 형태 및 세포배양 패턴을 비롯한 여러 가지 양상들을 표시한 것이다. a: 복구를 위한 증식을 최적화 하기 위한 세포성장 속도. 배가시간(doubling time)은 단층세포 배양에서 세포의 수가 배가 될 때가지 걸리는 일수로 정의된다. 이것은 기본 측정 단위인데, 복구 능력이 있는 세포들은 배양 시에 용이하게 기하급수적으로 성장할 수 있기 때문이다. 또한 허용 성장 채널 내에서 배가시간을 허용하는데 필요한 ％ 혈소판 용해물은 생체 내에서 세포증식과 접종을 지원하는데 필요한 혈소판 용해물의 양을 결정하는 것이다. 세포 배양 작용:
예상 채널(expected channel) 위에 (>3 일): 성장 속도가 예상 채널 내에 도달할 때까지 혈소판 용해물 농도를 증가시킨다. 성장 속도가 예상 채널 내에 도달할 때까지 고농도로 재파종(reseed) 한다.
예상 채널 아래 (<1 일): 성장 속도가 예상 채널 내에 도달할 때까지 혈소판 용해물 농도를 감소시킨다. 성장 속도가 예상 채널 내에 도달할 때까지 저농도로 재파종(reseed) 한다.
b: PSIS 에서 추출된 두 개의 10 cc 골수 액 생성 예이며, >100개의 유핵 세포들이 집락 형성 배양에 들어가서 약 700,000 개의 MSC로 되어 나옴(20％ 용해질에서 7-10일 후). 본 예에서, 성장 채널은 배가시간의 임의의 지체가 이미 설명한 바와 같은 세포 배양 작용을 초래하는 것으로 보여진다. 세포 배양 작용:
표시된 바와 같은 예상 채널 위에: 성장 속도가 예상 채널 내에 도달할 때까지 혈소판 용해물 농도를 증가시킨다; 성장 속도가 예상 채널 내에 도달할 때까지 고농도로 재파종(reseed) 한다.
표시된 바와 같은 예상 채널 아래: 성장 속도가 예상 채널 내에 도달할 때까지 혈소판 용해물 농도를 감소시킨다. 성장 속도가 예상 채널 내에 도달할 때까지 저농도로 재파종(reseed) 한다.
c: 세포융합은 단층 세포 배양에서 세포들 간 자유공간의 백분율로 정의된다. 여기에 표시된 바와 같이 지나치게 밀집하여 농축된 세포들은 신속하게 분화된 상태로 변하는 반면 너무 느슨하게 농축된 세포들은 목표 성장 속도에 이르지 못하게 된다. 세포들의 공간분포는 다음 식에 의해 정해질 수 있다. 표면적*(％ 융합)/세포수. 이 값은 18-23의 범위에 있어야 한다. 세포 배양 작용:
예상 채널 아래 (<18 일): 융합이 예상 채널 내에 도달할 때까지 혈소판 용해물 농도를 감소시킨다; 융합이 예상 채널 내에 도달할 때까지 저농도로 재파종(reseed) 한다.
예상 채널 위에 (>23 일): 융합이 예상 채널 내에 도달할 때까지 고농도로 재파종한다(12x10³ cells/cm² 에서 15x10³ cells/cm²까지);
예상 채널 훨씬 위에 (>27일). 혈소판 용해물 농도를 증가시킨다.
d: 세포분포는 2차원 공간(단층 세포 배양)에서 세포들의 불규칙도로 정의된다. 불규칙하게 분포된 세포들은 성장 채널 내에 존재하며, 덩어리 지거나 불균일하게 분포된 세포들은 성장 채널 밖에 존재한다. 세포 배양 작용:
예상 채널 밖에(불균일하게 분포된): 균일하게 분포될 때까지 고농도로 재파종한다; 통로세포들이 기대한 것보다 더 빠름.
e: 본 발명과 관련된 MSC 형태 및 관련되지 않은 형태. MSC는 여러 가지 환경 자극과 조건에 따라서 한 표현형을 다른 것보다 더 선택하도록 성장시킬 수 있다. 여기에 표시된 것은 본 발명과 관련되지 않은 표현형들이다. 본 발명과 관련된 표현형은 방추 모양이다. 또는 표시한 바와 같은 Type 1. 이 형태에서 벗어나는 것은 설명하는 바와 같은 세포 배양 작용을 필요로 한다.
TYPE 1: 본 발명에서 설명한 성장 채널 고려 사항들에 따라 성장시킨 iMSC에서 10x로 찍은 Type 1 MSC의 현미경 사진.
TYPE II : 10x로 찍은 Type II MSC의 현미경 사진. 출처: 해당 환경과 접해 있는 사람의 중간엽 줄기세포: Denitsa Docheva *, Cvetan Popov, Wolf Mutschler 및 Matthias Schieker 공저, "표면 특성과 인테그린 시스템", J. Cell Mol. Med. Vol 11, No 1, 2007 pp. 21-38.
TYPE III : 20x로 찍은 Type III MSC의 현미경 사진. 출처: Raquel Talens-Visconti, Ana Bonora, Ramiro Jover, Vincente Mirabet, Francisco Carbonell, Jose Vincente Castell 및 Maria Jose Gomez-Dechon Hepatogenic 공저 "인체의 지방조직에서 중간엽 줄기세포의 분화와 골수 중간엽 줄기세포의 비교", World J. Gastroenterol 2006 September 28; 12(36): 5834-5845.
TYPE IV : 10x로 찍은 Type IV MSC의 현미경 사진. 출처: V FALANGA, S IWAMOTO, M CHARTIER, T YUFIT, J BUTMARC, N KOUTTAB, D SHRAYER, P 공저 "자가 골수-유도 배양 중간엽 줄기세포를 생쥐 및 인간의 피부상처의 섬유소분무가속치유에 제공"; CARSON TISSUE ENGINEERING Volume 13, Number 6, 2007.
세포 배양 작용:
예상 채널의 외부 (> 30％ Type II 세포): 형태가 type I이 될 때까지 혈소판 용해물 농도를 증가시키거나 또는 통로가 5보다 크면 이식한다;
예상 채널의 훨씬 바깥 (> 30％ Type III of IV 세포); 통로 또는 이식 세포들이 예상보다 빠름. 세포들은 원하는 효과를 내지 못할 것이다.
도 2는 골관절염 환자의 세포 여덟 개를 5-10％ 혈소판 용해물에서 체내 성장시켰을 때 그 세포들간의 성장 속도 및 실수확율 차이를 표시한 세포증식도.
도 3 a-e는 환자에서 분리된 5개의 MSC 개체군들을 5-20％ 혈소판 용해물을 사용해서 1 내지 6-16에 걸쳐서 조사한 막대그래프.
도 4는 5-20％ 혈소판 용해물을 사용해서 6명의 서로 다른 환자들의 MSC 증식을 수행했을 때 환자의 세포들이 느린 성장 또는 빠른 성장을 하는 것을 표시한 막대그래프.
도 5는 5명의 환자들을 위한 줄기세포성장 채널 중첩을 표시한 도면.
도 6a 및 b는 본 발명의 구현에 의해서 최적화한 세포들을 사용해서 MSC 이식을 한 경우 이전과 이후의 "고속스핀양자밀도영상" 도면.
도 7은 10 또는 20％ 혈소판 용해물을 제1통로, 제2통로 또는 제3통로에 주입 사용할 때 4 명의 환자의 세포성장을 표시한 막대도.
도 8은 3-4기 무혈관괴사 환자에 대해서 두 가지 다른 골수 채취 조건 하에서 한 세포증식을 표시한 도면. 조건 1: 두 번의 10 cc 골수 채취로 수확한 4800만 개의 유핵세포들이 10％ 혈소판 용해물에서 증식하는데 실패하였다. 배양은 2주 후에 중단되었다. 조건 2: 양측 상후장골극(PSIS) 부위에서 채취한 1-2 cc의 골수로 된 6개의 작은 부분표본들에서 1억 6400만 개의 유핵세포를 수확했다. 20％ 혈소판 용해물에서 성장시킨 MSC의 증식도이다.
도 9a 및 9b는 본 발명의 구현에 의해서 최적화한 세포들을 사용해서 MSC 이식을 한 경우 이전과 이후의 "고속스핀양자밀도 MRI 영상" 도면. 전방-내측 무릎 반달연골의 부분재생을 도시하였다. 엉덩이 무혈관괴사를 앓는 환자에서 분리한 MSC 증식. 오른쪽 무릎의 이전 세포들(왼쪽영상 2007년 1월), 그리고 3개월 후 세포들(오른쪽영상 2007년 6월)에 대한 연속대응배열영상.
도 10a 및 10b는 본 발명의 구현에 의해서 최적화한 세포들을 사용해서 MSC 이식을 한 경우 이전과 이후의 방사선사진. 불유합 상완골절의 부분치유를 표시하였다.
도 11a 및 11b는 심각하게 퇴행한 내측 반달연골을 가진 골관절염 환자의 이전과 이후의 시상양자 밀도영상으로서 그 후에 본 발명의 구현에 의해서 증식한 MSC를 사용해서 그 반달연골을 부분적으로 재생한 것을 표시한 도면.
<발명의 상세한 설명>
본 발명을 구현함으로써 최적의 성장조건 하에서 자가 중간엽 줄기세포들을 수확, 증식 및 이식하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 증식조건은 환자의 특정 MSC 개체군에 대하여 개별화된 성장특성에 기초하며, 합성 또는 재조합형 성장 인자들을 필요로 하지 않는다. 전형적인 구현 과정에서 최적의 성장조건은 적어도 부분적으로는 동일한 환자에서 나온 혈소판 용해물에 의해서 제공된다. 이 혈소판 용해물 조성물은 환자 자신이 조합한 성장 인자들이 일관되게 효과적으로 방출되게 하는 것이다. 주목해야 할 점은 본 발명의 특징들은 MSC외에 기타 형태의 세포, 예컨대, 줄기세포, 연골세포 등에도 동일하게 적용할 수 있지만 편의상 본문에 설명한 구현은 MSC를 지향한다. 또한 최적으로 성장된 세포들은 세포 능력을 강화하여 치료효과를 높이기 위해서 자가 인자들과 배합해서, 예컨대 혈소판 또는 혈소판 용해물, 즉 그 MSC를 받게 될 동일한 환자에게서 확보한 혈소판과 배합해서 이식할 수 있다. 마지막으로, 본문에 설명한 본 발명의 구현은 본문에 설명한 최적의 성장조건에서 나오는 균일한 표현형을 위해서 영양강화 된 MSC를 포함하는데, 이러한 세포들은 MSC 기반 재생요법에 사용토록 최적화된 세포들로 인정되는 것이다.
용어 정의:
다음의 정의들은 본문에서 자주 사용되는 특정한 용어들의 이해를 돕기 위한 것이지 본 발명의 내용 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.
"개별화된 성장특성(Individualized growth characteristic)"은 확보한 세포들의 개별 특정 체외 성장 특성을 가리킨다. 예컨대, 골관절염을 앓는 수많은 사람들에서 전형적으로 확보한 세포들은 느린 성장을 보이는데, 세포들이 최적으로 성장하여 환자에게 재이식될 수 있게 마련할 수 있도록 성장 특성을 변경해야 한다.
"중간엽 줄기 세포" 또는 "MSC"는 골모세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포, 신경세포, 이자섬세포 및 이와 같은 것(아래 참조)으로 분화할 수 있는 다능성 줄기세포를 가리킨다.
"자연 증식 인자(Natural expansion factor)"는 필요한 환자에 선천적인 인자로서 시험관에서 제조되는 합성 또는 재조합형 증식 인자에 상대적인 말이다. 자연 증식 인자는 전형적으로 혈소판 용해물에 결합되어 있으며 거기에서 방출된다.
"혈소판 용해물(Platelet lysate)"은 혈소판에 함유되어 있어서 혈소판을 용해하면 방출되는 자연성장 인자들의 배합을 가리키는 것이다. 이것은 화학적 수단(즉, CaCl₂), 삼투적 수단(증류된 H₂O의 사용) 또는 융해 공정을 통해서 완수할 수 있다. 또한 본 발명의 혈소판 용해물은 전혈에서 유도해서 미국 특허 제5,198,357호에 기재된 바와 같이 제조할 수 있으며, 이 특허는 본문에 참고문헌으로 포함시켰다.
"단백질", "펩티드" 및 "폴리펩티드"는 호환적으로 사용되어 아미노산 중합체 또는 둘 이상의 상호작용 또는 결합된 중합체들을 가리키는데 사용된다.
"줄기세포"는 비분화된 상태로서 긴 시간에 걸친 세포분열을 통해 재생되어 분화된 기능을 갖는 세포로 될 수 있는 특성을 가진 임의의 세포를 가리키는 것이다.
"세포 배양 작용(Cell Culture Action)"은 혈소판 용해물의 변화, 배양 시에 세포들을 다른 농도로 재파종하는 것 또는 계획된 통과시간의 변화(즉, 배지 변경 전에 더 오랜 또는 짧은 시간 동안 배양상태에 두는 것)를 가리키는 것이다.
"계대(Passage)"는 단층 세포 배양에서 닳은 배지를 교환하거나 또는 세포배양 미세환경을 개선하기 위해서 배지를 교환하는 것을 가리키는 것이다.
MSC 및 혈소판 용해물 공급원
중간엽 줄기세포는 골수, 말초혈액, 지방조직 및 기타 유사한 공급원에 들어있는 다능성 줄기세포이다. MSC는 골모세포, 연골세포, 근육세포, 지방세포 및 베타-이자섬세포를 비롯한 수많은 세포 형태로 분화할 수 있는 능력을 갖고 있다.
본 발명의 원천적인 MSC는 전형적으로 재생/교체 요법이 필요한 환자(또는 적당한 제공자)의 엉덩뼈 능선에서 채취하는데, 이러한 환자를 본문에서는 "필요한 환자"라고 언급한다(주목할 점은 지방조직, 윤활조직 및 결합조직과 같은 다른 공급원도 최근에 확인되어 본 발명의 범위 내에 드는 MSC 원천으로 고려되고 있다는 것이다). 한 실시예에서, 약 10-20 cc의 골수를 채취하여 Centeno의 미국 특허출원 제60/761,441 호에 기재된 방법으로 "분리(isolated)" 하거나 또는 Caplan 등의 미국 특허 제5,486,359 호에 기재된 방법으로 플라스틱에 부착시키는 것이다. 이들 참조 문헌 전체를 본문에 포함시켜서 모든 목적에 참조가 되게 하였다.
또한 본 발명은 알맞은 수의 유핵세포를 생성하여 상기 혈소판 용해물을 기법을 사용할 수 있게 하기 위해서 표준 골수 채취과정에 변화를 가하는 것을 포함한다. 발표된 대부분의 연구는 건강한 사람 또는 동물을 대상으로 다시 실시되기 때문에 각종 질환을 앓는 사람들에게 이 기법을 적용하는 것은 시험하지 않았다. 이에 해당하는 예가 도 8에 나타나 있으며, 이를 통해 무혈관괴사(AVN)를 앓는 환자(AVN 부위에 골 복원이 필요한)에게서 나온 골수 및 상기한 양측 10 cc 채취기법은 혈소판 용해물에서 배양증식에 실패하였음을 알 수 있다. 그러나 각 측방에서 2-3 cc의 소량의 골수 부분 표본을 3개씩(총 6개의 부분표본) 채취하는 변경된 기법을 사용하여 필요한 만큼 생성한 유핵세포는 20％ 혈소판 용해물에서 성공적으로 증식되었다.
본 발명에 사용하기 위한 혈소판 용해물은 Doucet의 방법을 사용해서 채취된 골수로 제조하는데, 이 방법 전체를 본문에 참고로 포함시켰다. 전형적인 용해질은 약 수천만 개 내지 수천억 개의 혈소판을 포함하고 있다. Biomaterials, 2004 25(18) p4489-503 (본문에 참고로 포함시켰음) 에서 Martineau 등이 제시한 바와 같이 혈소판 용해물은 본질적으로 일관된 MSC 성장을 용이하게 하는 데 필요한 성장 인자들을 내포한다. 전형적인 실시예들에서 혈소판 용해물과 MSC는 자가이며 MSC를 효과적이고 일관되게 증식하는데 필요한 양으로 사용한다(이하에 더욱 상세히 설명함). 특히, 주목해야 할 점은 혈소판 용해물 내에서TGF-베타 같은 성장 인자들의 수준이 MSC를 증식하는데 통상적으로 사용되는 수준보다 훨씬 낮지만, 혈소판 용해물에 내포된 모든 낮은 수준의 성장 인자들이 함께 사용될 경우에는 현저한 상승작용효과가 생긴다는 것이다.
성장 채널 고려사항
본 발명자들에 의해서 발견된 바와 같이, 본 발명에서 수확한 MSC는 열 번째 체외 통과 이하로 바람직하게는 다섯 번째 체외 통과 이하로 환자에게 다시 이식하면 최적의 복구/재생 치유를 제공하게 된다. (한번 통과는 배지 및/또는 조직배양 용기/기판에 대하여 세포수의 증가를 허용하는 세포의 수확 및 평판배양과 등가임) 이와 같이 각 환자의 MSC는 FDA가 승인하지 않은 약품이나 성장 인자들을 사용하지 않고서 일정 횟수의 통과 작업을 통해서 치료용으로 필요한 수만큼 증식해야 한다. 본 발명의 실시예들은 수확한 MSC를 혈소판 용해물을 사용해서 필요한 수만큼 증식하고 대상 환자에 이식 사용하기 위해서 최적화 하는 것을 확보하기 위한 성장 채널조건을 제공한다.
환자의 MSC 성장 잠재력(세포를 필요한 수만큼 확보하기 위한), 즉, 개별화된 성장특성(상기 정의 참조)을 결정하기 위해서는 여러 가지 고려사항들이 존재한다. 이 고려사항들은 MSC의 공급원, 즉, 나이, 성별, 유전적 제약 및 골관절염과 같은 퇴행성 질환의 존재를 포함하는 것이다.
골관절염을 앓는 환자에게서 수확한 MSC를 통하여 본 발명자들은 "느린 성장" 및 "빠른 성장" 등 두 개의 상이한 세포성장 형태를 확인했다." 환자에게 느린 성장 세포들의 존재는 이러한 세포군 내에서 세포들을 신속하게 증식하고 최대 분화 잠재력을 유지토록 하는 능력에 관한 실제적인 문제를 제시한다. 최대 분화 잠재력을 갖지 않는 세포들은 이식 시에 실패할 가능성이 있다. Crisostomo 등 공저, Shock, 2006 26(6): p 575-80. 그러므로 혈소판 용해물의 수준을 더 높여 필요한 MSC 성장이 일어나도록 해야 한다. 결과적으로, 이러한 세포들은 건강한 청년에게서 채취한 MSC와는 아주 다르게 처리해야 한다. 주목해야 할 점은 제한적인 체외증식 잠재력을 보이는 세포, 즉, 한 번의 통과 시간(<3 일) 과정에서 100％ 미만의 수로 증가하는 세포는 본 발명의 목적에서 볼 때 느린 성장으로 분류된다.
본 발명의 일 실시예에서 최적의 MSC 체외배양 증식을 위해 요구되는 혈소판 용해물의 양은 여러 가지 성장조건 하에서 수확된 세포의 성장을 관찰하여 결정한다. 이것은 특히 세포가 골관절염, 골다공증, AVN 또는 기타의 뼈, 연골 또는 결합 조직 질환을 앓는 환자와 관련된 것일 경우에 중요하다. MSC 증식은 다음과 같은 다수의 변수에 의존한다. 환자의 혈소판 용해물 내의 성장 인자들의 양(그러므로 세포성장을 최대화하는데 필요한 ％용해질을 변경), 이들 성장 인자들의 생체이용율(즉, 이 인자들의 환자의 세포에 대한 효과), 이 성장 인자들의 상대적 농도 및 환자의 시작 원천 세포들의 질/양. 본 발명의 일 실시예에서 이 변수들 하에서 MSC 증식을 최적화하기 위해서 "성장 채널"을 개발, 즉, 예정된 만큼의 시간 및/또는 세포 통과 수(최적의 성장조건을 위해서 10번 이하의 통과 수)에 관련한 환자의 세포의 목표 증식율을 개발하였다. 이 성장 채널은 특정의 균일한 세포 개체군을 생성하는데 요구되는 모든 필요한 세포배양 판단들을 고려한다.
본 발명의 일 실시예에서, 목표 MSC 배양 증식에 필요한 혈소판 용해물의 양은 시각적인 변수와 결합되어 최적의 성장조건을 결정하는 것이다. 특히, 본 실시예는 상기 논의된 혈소판 용해물 고려사항들을 수확한 MSC 집락 형성 및 MSC의 단층 증식에 관한 고려사항과 종합할 것을 요구한다. 한 특징에 의하면 집락 형성을 하는 동안 MSC의 과도증식을 방지해야 즉, 집락 가장자리에 있는 세포들이 그 집락을 감싸는 것을 방지해야 한다. 또 한 특징에 의하면 집락 형성을 하는 동안 MSC의 증식 부진, 즉, 세포들이 증식하지 못하는 현상을 방지해야 한다. MSC가 집락 형성 하는 동안 과도증식을 하면, 그들을 집락 형성 배양에서 떼어서 단층 세포 배양 상태로 옮겨야 함과 아울러 MSC가 집락 형성 하는 동안 증식부진 하게 되면, 배지를 부분적으로 제거하고(약 반만큼) 새 배지로(더하기 적어도 이전에 사용된 혈소판 용해물 농도) 교환해야 한다. 또 한 특징에 의하면, 단층 증식 상태의 세포들이 과도성장, 즉, 고밀도가 되는 지 관찰해서, 예컨대, 10,000-12,000 cells/cm² 로 재 파종해야 하거나 또는 세포 형태가 구형, 깃발모양 또는 부푼 모양으로 되는 성장 부진 상태인지 관찰해야 한다. 세포들이 이러한 형태를 보이면 혈소판 용해물 농도를 적어도 10-15％의 혈소판 용해물로 증가시켜야 한다.
더욱 구체적으로, 혈소판 용해물에서 성장하는 세포들의 최대 증식 및 복구능력을 위한 본문의 "성장 채널"은 네 개의 서로 다른 양상들을 포함한다.
1. 단층 세포 배양에서 세포성장 속도
2. 단층 세포 배양에서 세포 밀도
3. 단층 세포 배양에서 세포배양 패턴 및
4. 단층 세포 배양에서 세포 형태.
이 개념들에 관해서는 도 1의 그래픽 포맷에서 더 설명한다.
"단층 세포 배양에서 세포성장 속도"- 혈소판 용해물은 환자에 따라서 다양한 수준의 성장 인자를 가지고 있기 때문에, 이들의 배양증식에 대한 영향을 접하기 전에는 성장 인자들의 생물학적 활성도를 결정할 수 있는 방법이 없다. 본질적으로, "성장 채널" 내에서 증식의 한 가지 기본 성분은 최소 성장 속도이다. 이것은 배가시간이 1일 및 3일 사이에 있을 때까지 혈소판 용해물 농도의 매개 변수들 및/또는 파종밀도를 조정하는 것으로 정의된다. 이것은 5 번째 내지 7 번째 통과 전에 약 50-100배의 세포증가를 완수할 것이다. (도 1, 그래프 1). 또한 도 1(그래프 2)에 표시한 것은 양측의 10 cc 골수채취로 시작하는 성장 속도통로의 범례이다 (설명의 목적으로만 사용됨). 상기 논의된 성장 채널에서 편차는 도 1, 그래프 1 및 그에 관한 설명에서 알 수 있는 바와 같이 세포 배양 작용을 필요로 한다. "단층 세포 배양에서 세포 밀도:" -- 세포 밀도는 세포성장과 분화능력에 큰 영향을 끼칠 수 있다. Doucet는(상기 언급한) 밀리미터당 약 수 천 개의 세포들로 된 아주 낮은 파종밀도를 설명했다(다른 식의 건강한 대조로써). 그러나 우리가 발견한 것은 골관절염, AVN 및 골절불유합과 같은 질환을 앓는 환자들은 훨씬 더 높은 파종밀도를 필요로 하며 통과 시에 이 밀도를 유지하는 것이 복구성능을 가진 증식세포를 생성하는데 결정적이라는 사실이다. 본질적으로 도 1, 그래프 3은 본 발명의 실시예를 위해서 허용될 수 있는 세포융합통로를 표시한다(세포의 체내 복구성능을 최적화하기 위해서). 본 발명에서 설명하는 MSC의 공간분포는 다음 식으로 정량화 할 수 있다. 표면적*(％ 융합)/세포수. 이 값은 18-23의 범위에 있어야 한다. 이 값이 18미만이면, 세포들이 아주 잘 성장하기 때문에 세포들을 더 낮은 파종밀도로 파종할 수 있다. 이 값이 23-27 사이에 있으면, 세포들을 더 높은 파종밀도로 파종해야 한다(12x10³ cells/cm² 내지 15x10³ cells/cm²). 그리고 이 값이 27보다 크면, 또한 혈소판 용해물 농도를 증가시켜야 한다.
단층 세포 배양에서 세포배양 패턴 - 본 발명에서는 세포성장패턴이 중요한데 왜냐하면 세포들 간의 간격이 균일한 분포를 이루는 것이 증식을 지속적으로 증진하고 세포들을 미 분화상태로 유지하는데 필수적이기 때문이다. 이를 확보하기 위해서, 균일하게 분포된 MSC는 본문에 언급한 성장 채널 부분이다. 이것은 도 1, 그래프 4를 보면 더 잘 알 수 있다. 상기 논의된 세포배양 패턴에서 임의의 편차는 도 1, 그래프 4 및 그에 관한 설명에서 알 수 있는 바와 같이 세포 배양 작용을 필요로 한다.
단층 세포 배양에서 세포 형태: 단층 세포 배양에서 세포 형태는 본 발명과 관련된 특정한 MSC 표현형을 확보하는데 중요하다. 이것은 중간엽 줄기세포에 적용할 때에만 그 바람직한 형태가 단층 세포 배양에서 스핀들형(섬유모세포형)이다. 주의해야 할 점은 다른 중간엽 줄기세포주는 다변형 또는 깃발형 형태로 나타나는데, 이것은 설명한 바와 같은 성장 채널에서 표현형이 아니라는 사실이다. 또한 주목해야 할 점은 types 1-4를 포함하는 본 발명의 목적을 위해서 분류시스템을 만들었으며, 본 발명에 관련된 바람직한 세포 형태는 type 1이라는 사실이다. 이것은 도 1, 그래프 5를 보면 더 잘 알 수 있다. 주의해야 할 점은 도 1, 그래프 5에 표시한 등급 2-4는 공지기술에서 온 것이며 인용된 저자들 각각은 이것들이 그들의 MSC 세포주로 허용될 수 있는 형태라고 판단하고 있다는 사실이다. 또한, 설명한 성장 채널에 머물 수 있는 바람직한 형태는 방추형으로서 이 세포는 표면적을 적게 차지하는 반면 이에 비해 types 2-4 에 속하는 MSC는 최적의 type 1 세포보다 약 50％나 더 많은 면적을 차지한다. 배양액이 등급 2-4의 MSC를 30％ 보다 더 많이 가지게 되면, 혈소판 용해물 농도를 10％ 에서 15-20％까지 증가시켜야 한다. 세포개체군은 이 시점에서 이상적인 형태에서 벗어날 가능성을 피하기 위해서 이식해야 한다.
상기 논의한 세포 형태통로에서 임의의 편차는 도 1, 그래프 5 및 관련 설명에서 알 수 있는 바와 같이 세포 배양 작용을 필요로 한다.
일 실시예에서, 성장 채널은 무릎관절과 같은 표적지점에 이식하기 위해서 천만 내지 일억 개의 세포들의 생성을 필요로 하는 체외배양에서 자가 MSC의 특성을 나타내는 것이다. 증식되는 세포의 수는 재생이 필요한 표적지점에 어느 정도 의존하는데, 예컨대 척추디스크의 재생은 ml당 약100만 내지 1000만 개의 세포들을 필요로 하는 반면에 무릎 표면은 ml 당 약 수천만 내지 수억 개의 세포들을 필요로 한다. 확보한 세포들은 자가 혈소판 용해물의 양을 변화시키면서 성장을 관찰하고 조절한다.
체외 증식되는 본 발명의 MSC는 세포 계수 기술 및/또는 육안 세포배양 매개 변수들을 통해서 성장을 관찰할 수 있다. 세포 계수 기술은 세포의 수가 세포들에 대한 유효 공간/밀도를 초과했을 때 조직배양용기 또는 기판에서 세포들을 수확해서 보내는 것에 기초하고 있다. 세포계수법은 현장에서 혈구계와 같은 혈구계산판 장치로 또는 분광광도법으로 세포들을 수확하고 계수할 수 있는 자격을 갖춘 기술자가 실시해야 한다. 본 발명의 일부로서 다른 부분에 설명되어 있는 바와 같이 세포계수는 인터넷을 통해서 디지털 영상을 숙련 기술자에게 전송하여 원격으로 수행할 수도 있다.
상기 논의한 바와 같이, 본문에 소개한 육안 세포배양 매개 변수들은 본 발명의 세포들을 육안으로 검사하여 세포들이 수확되어 이식될 준비가 되었는지를 결정하는 능력을 포함하는 것이다. 시각적 매개 변수들은 세포배양 형태, 세포배양 패턴 및 세포배양 밀도를 포함하는 것이다. 특히, 다음의 구체적인 정성적 매개 변수들을 관찰할 수 있다. 집락 형성 과도성장, 집락 형성 성장부진, 단층세포증식배양 과도성장, 단층세포증식배양 성장부진, 혈소판 및 줄기세포 계수를 위한 혈구계의 영상; 골수채취 후에 최초로 플라스크에 파종했을 때 부착하는 세포의 수, 세포들을 채집해야 할 때를 결정하기 위한 집락 형성 및 나중에 발현된 집락 (과도성장 및 성장부진을 포함), 세포들이 플라스크에 균일하게 파종되는 방식, 즉, 세포들은 단층배양 증식할 때 플라스크 내에서 균일하게 있어야 함, 세포들이 밀집하게 파종되는 방식; 세포들의 통과 준비된 때를 결정하기 위한 융합의 과정과 아울러 세포분열 시각화, 세포들이 집락 상태에 있을 때 플라스크에 피가 보이는 정도, 혈소판을 얻기 위해서 피를 회전시킨 후 분리, 회전시켜 적혈구에서 유핵세포들을 분리해낸 후 골수 내에서 분리된 것이 보이는 모습; 및 세포 형태, 즉, 부푼 모양, 밝은 구형, 펴진 모양.
목표 배양의 육안검사는 숙련된 조직배양 직원이 현장에서 하거나, 디지털 현미경 영상 기술(실황전송)에 의해 또는 본문에 설명한 성장 채널 프로세스 과정을 통해서 디지털 현미경 카메라로 찍은 영상을 갱신하며 원격으로 수행할 수 있다. 복수의 세포배양 현장들에 대하여 더욱 제한된 통제가 필요한 경우에 세포배양 관찰을 원격으로 수행할 수 있다. 예컨대 고도로 숙련된 전문가에게 수많은 멀리 떨어진 배양현장에서 보내온 육안데이터를 제공하는 것이다. 고도로 숙련된 전문가는 특정한 시각적 매개 변수들, 예를 들어 무릎관절 퇴행, 무혈관괴사 안정화, 뼈 골절 불유합 등에 좋은 진료효과를 제공한 특정 세포 밀도, 배양 패턴 또는 형태의 사용을 유효케 하는 정보에 접근할 수 있다. 그러면 전문가는 그 배양 형태를 모든 그러한 배양들과 연관시키는 방법을 알 수 있게 된다(반면에 많은 현장 직원들은 어떤 방법으로든 수개월 또는 수년 동안 이러한 상관관계를 모를 수도 있다). 한 실시예에서 세포들이 일관되고 과도성장이 안되었을 경우에는, 세포배양 형태는 최적이고 성장 채널 내에 있고 따라서 수확 및 이식 준비가 되었다고 판단한다.
본 발명의 혈소판 용해물 조성물은 세포 유사분열에 필요한 것으로 알려진 많은 수의 인자들을 포함하는데, 다음의 것들도 포함한다. hFGF, PDGF-BB, TGF-β, 및 VEGF. 혈소판 용해물 조성물을 혈청 자유 성장배지에 부가하여 그 배지에서 목표량의 용해질을 얻을 수 있다. 이를테면 10％ 혈소판 용해물은 10 체적％ 혈소판 용해물 조성물을 포함하는 것이다. 바람직한 실시예들에서 혈청 자유 기초배지는 DMEM, Hams F12, MEM 또는 기타 유사한 배지이다. 유용한 성장 인자들은 환자의 혈소판 용해물에 고유한 것으로서 전형적으로 환자에 따라서 다양하다.
전형적인 실시예들에서 환자에서 나온 세포들은 처음에 10％ 혈소판 용해물을 갖는 배지에서 7-10일 동안 배양되어 집락을 형성한 다음에 재 계수된다(집락 형성). 환자가 골관절염을 앓고 있으면, 초기 10 ％ 혈소판 용해물을 사용해서 세포들을 단층 세포 배양에 투입한다. 세포들은 2-4일 동안 성장시킨 후 특정 환자의 치유과정에 필요한 총 세포수와 비교한다. 몇 개의 실시예들에서는 세포들을 육안으로 조사한다. 상기 성장 채널 내에 없는 세포들은 혈소판 용해물의 양을 증가시켜(예컨대 15-20％) 그들의 배지를 변화시키는 반면, 그 통로 내에 존재하는 세포들은 2-4일 동안 진행되도록 한 후에 그 공정을 반복한다. 통로조건에 의존하는 기타 세포 배양 작용은 세포들을 더 낮은 또는 더 높은 밀도로 재파종하는 것, 배지를 약간 자주 변화시키는 것 또는 세포들을 더 빨리 또는 더 나중에 이식하는 것을 포함한다. 주목해야 할 점은 시각적 매개 변수들을 세포들이 설명한 성장 채널 내에 존재하는 지를 결정하는데 사용할 수도 있다는 사실이다 (상기 참조).
주목해야 할 점은 MSC 증식속도의 가변성이 환자에서 수확한 MSC뿐만 아니라 환자의 혈소판 내의 성장 인자들의 수준에도 의존한다는 사실이다. 본질적으로, 특정한 예들에서, 환자의 MSC를 성장 채널 내에 유지시키는데 필요한 더 높은 수준들의 혈소판 용해물은 세포성장특성에만 기인하는 것이 아니라, 필요한 수준의 성장 인자들을 제공하기 위해서는, 즉, 환자의 혈소판 용해물이 다른 혈소판 용해물에 비해서 더 낮은 농도의 성장 인자들을 가지고 있을 경우, 더 많은 혈소판들을 필요로 한다는 것에도 기인한다는 사실이다. 놀랍게도 본 발명자들은 최적의 조건 하에서 성장한 세포들이 비최적(비성장 채널) 조건 (예컨대 필요한 치유효과를 나타내기 위한 충분한 수를 얻기 위해서 15개의 통과들을 필요로 하는 세포배양) 하에서 성장한 동일한 수의 세포들에 비해서 훨씬 더 치유효과를 성취할 수 있다는 것을 알았다. 예컨대 본 발명자들은 10 cc의 양측 PSIS 골수채취(총 20 cc 골수)를 이용해서 덜 최적하게 증식 성장한 세포들이 본문에 설명한 성장 채널 방법을 사용해서 최적하게 증식한 세포들에 비해서 빈약한 임상효과(후속의 MRI에서 연골재생이 아니 또는 덜 되었으며, 반달연골재생도 아니 또는 덜 되었다)를 나타낸다는 사실을 알았다.
자가 MSC 교체 방법
본문에 언급한 실시예들은 필요한 환자의 환부를 치유재생하기 위한 방법을 포함하는 것이다. 예컨대, 본 발명의 방법은 퇴행성 디스크 또는 관절의 연골을 재생하기 위한 것이다. 기타의 예들로서는 MSC 증식에 의하여 심근재생, 피부상처치료, 골절 또는 뼈 불유합의 치유, 신경복구, 대숙주이식편질환 치유 및 기타 면역 적용 및 기타 용도, 이자섬세포 교체, 골다공증 치료, 청각손실 치료 및 기타 용도 등이 있다. 본 발명의 방법은 자가 MSC 복원 치유를 이용하는 것으로서 MSC를 자연(비합성 /비재조합형) 성장 인자들(전형적으로 다양한 퍼센트의 혈소판 용해물에 의한 배양으로 얻은)로 처리한다.
처음에 MSC 원천은 줄기세포치유복원이 필요한 환자에서 채취한다. 채취한 원천은 무균환경에서 유지하며 무균상태에서 전 공정이 수행되도록 한다. 상기한 바와 같이, 확보한 세포들은 본 발명의 성장 채널 내에 유지하기 위한 조건 하에서 파종하여 체외 배양 한다(원천에서 MSC를 분리하는 것은 위에서 설명하였다). 이것을 위해서는 예컨대 실시예 1에서 설명한 바와 같이, 혈소판 용해물을 환자에서 채취하여 준비해야 한다. 세포들이 10번의 통과과정들을 거치기 전에 목표수확량인 1천만 개 내지 1억 개의 세포들을(표적지점을 위한 총 세포수에 관해서는 상기에서 언급하였다) 얻을 수 있도록 최적의 증식조건 하에서 성장하는 자가 MSC를 모니터링하여 이식을 위한 준비를 한다. 몇 실시예들에서는 세포들이 5번의 통과과정들을 거치기 전에 목표수확량인 1일천만 개 내지 4천만 개의 세포들을 얻을 수 있도록 자가 MSC를 모니터링 성장시켜 이식을 위한 준비를 한다. 다른 실시예들에서는 세포들이 6, 7, 8 또는 9번의 통과과정들을 거치기 전에 목표수확량인 1천만 개 내지 4천만 개의 세포들을 얻을 수 있도록 자가 MSC를 모니터링 성장시켜 이식을 위한 준비를 한다. 이어서 준비한 MSC 조성물을 표적지점에 이식하고 이후 수개월에 걸쳐서 효과를 관찰한다. 이 과정을 원하는 결과를 얻을 때까지 반복할 수 있다. 4-7번의 통과과정들로 1천만 개 내지 4천만 개의 세포들을 얻는 조건하에서 처리된 세포들은 원하는 환자의 표적지점에 이식할 수 있는 최적의 세포들이다.
특히, 몇 실시예들에서 본 발명은 초기 집락 형성과 부착배양에 분리 골수 유핵세포들과 함께 적혈구를 파종하는 신규의 방법도 포함하는 것이다. 적혈구는 성장 인자들도 내포하고 있기 때문에, 이것이 세포성장환경을 더욱 보강하여 분리된 MSC에 대하여 다른 분화효과를 가한다.
주목해야 할 점은 본 방법의 실시예들은 자가 세포들과 성장 인자들을 가지고서 수행하기 때문에 다른 비자가 MSC 교체요법 특유의 수많은 면역 및 감염 문제들을 예방할 수 있다는 사실이다. 최근의 연구에 의하면 비자가 MSC가 숙주의 자연 살해세포시스템을 활성화시키기 때문에 이는 현재 매우 중요하다. Spaggiari 등 공저., Blood, 2006 107(4):1484-90; Rasmusson 등 공저, Transplantation, 2003 76(8):1208-13. 본 발명의 실시예들은 또한 이식된 세포들이 이식지점에서 증식하여 필요한 세포들(관절표면의 연골세포, 뼈결함의 골모세포, 등)로 분화하는 잠재력을 최적화 시키는 것이다. 다음의 실시예에서 알 수 있는 바와 같이, 혈소판 용해물 조성물(또는 혈소판 그 자체)은 표적지점에 MSC 이식과 동시에 또는 그 후에 주입할 수도 있다.
본 발명의 세포성장 실시예들을 사용하여 대상 환자에 사용하기 위한 최적으로 성장된 세포들을 제조할 수 있다. 본 발명의 실시예들에 따라서 성장시킨 세포들은 FACS를 사용해서 검사하여 세포 표현형을 결정, 즉, 세포 표면 항원 계수를 결정한다. 본 발명의 일 특징에 의하면, 다음에 열거한 세포 표면 항원들 중 적어도 하나에 대하여 양성이 되도록 세포 개체군을 선택하여 증식하는 것이다. CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, CD105 및 CD166. 주목해야 할 점은 양성 결과는 FACS 분석에 의해서 시험 세포들 중 90％ 이상이 특정 세포의 표면 항원에 대하여 양성인 경우이다.
전형적인 실시예들에서 확인된 세포 개체군들은 다음에 열거한 세포 표면 항원들 중 적어도 두 개에 대하여 양성이었다. CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, CD105 및 CD166. 보다 전형적인 실시예들에서 세포 개체군들은 다음에 열거한 세포 표면 항원들 중 적어도 세 개에 대하여 양성이었다. CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, CD105 및 CD166. 더욱 전형적인 실시예들에서 세포 개체군들은 다음에 열거한 세포 표면 항원들 중 적어도 네 개에 대하여 양성이었다. CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, CD105 및 CD166. 더한층 전형적인 실시예들에서 세포 개체군들은 다음에 열거한 세포 표면 항원들 중 적어도 다섯 개에 대하여 양성이었다. CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, CD105 및 CD166. 마지막으로, 몇 실시예들에서 본문에 설명한 세포 개체군들은 세포 표면 항원들 CD29, CD44, CD59, CD73, CD90 및 CD105 중 여섯 개 또는 일곱 개 모두에 대하여 양성이었다. 이들 잠재적 세포 표면 항원들을 갖는 세포 실시예들은 치유목적으로 사용하는데 최적이었다. 또한, 본문의 세포 개체군 실시예들은 상기 세포 표면 항원들을 가지고 있으나 다음에 열거하는 항원들 중 적어도 하나를 결여하였다. CD14, CD31, CD45 및 CD106. 다른 실시예들에서 본문의 세포 개체군 실시예들은 상기 세포 표면 항원들을 가지고 있으나 다음에 열거하는 항원들 중 적어도 두 개 이상 결여하였다. CD14, CD31, CD45 및 CD106. 또 다른 실시예들에서 본문의 세포 개체군 실시예들은 세포 표면 항원 CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, CD105 및 CD166에 대해서 양성이었으나 세포 표면 항원 CD14, CD31, CD45 및 CD106에 대해서는 음성이었다.
표적지점에 직접 혈소판 주입
본 발명의 몇 실시예들에서는 혈소판 조성물을 환자의 표적지점에 직접 주입한다. 혈소판 주입은 MSC 교체 이전에 하거나 MSC 교체와 함께(동시에) 또는 MSC 교체 이후에 수행하여 MSC 성장환경을 최적화하는 것을 도울 수 있다. 전형적인 실시예들에서 혈소판 용해물 기초 배지와 본 발명의 성장 채널 고려사항들을 이용해서 증식한 MSC를 수확해서(이들이 성장 채널 내에 있는 동안) 자가 혈소판 또는 혈소판 용해물과 함께 표적지점에 주입한다.
표적지점에 직접 주입하는데 필요한 혈소판의 수를 결정하기 위해서 다음의 계산을 수행할 수 있다. 첫 번째 문제는 최대의 체외 MSC 성장을 유지하는데 필요한 평균 혈소판 수/cc를 결정하는 것이다. 예컨대 환자의 세포들이 3일 동안 10％ 혈소판 용해물을, 또 3일 동안 20％ 혈소판 용해물을 또한 3일 동안 30％ 혈소판 용해물을 필요로 하는 것으로 보인다면 표적지점에서 보충을 필요로 하는 혈소판의 양을 결정하는데 최고의 혈소판 용해물 농도를 사용한다. 하루에 cc당 혈소판 최대 사용량은 본 실시예에서 30％ (사흘 동안) 이었다. 환자에 대한 체적 cc당 혈소판 시작 체적이 1.0 x 10⁹이라면, 이 기간 동안 체적 cc당 3 x 10⁸ 개의 혈소판을 3일에 걸쳐서 사용하거나 체적 cc당 1 x 10⁸ 개의 혈소판을 하루에 사용하는 것이 필요하다.
Marineau 등의 공저 Biomaterials, 2004 25(18): p 4489-502 (본문에 모든 목적을 위해서 참고로 포함시켰음)의 내용은 혈소판에서 방출되는 성장 인자들에 의해서 체내 MSC 성장을 증진하는데 필요한 트롬빈 및 칼슘의 수준에 관한 해석을 제공하고 있다. 이것은 첫 번째 성장 주간에 조직성장과 혈관형성을 증진하기 위해서 자연적으로 일어나는 것이다. 이 연구에서 추론할 수 있는 것은 혈소판들이 활성화될 때 그들이 가진 성장 인자들의 대부분을 트롬빈 및 칼슘과 함께 7일 동안에 걸쳐서 방출할 것이라는 사실이다. 따라서 하루에 cc당 1x 10⁸ 개의 혈소판에 7을 곱해서 cc당 필요한 혈소판의 최종적인 양을 산출한다 - cc당 7 x 10⁸ 개의 혈소판. 환자에 주입할 최종 체적을 초기 체액 결합 체적(Initial Fluid Joint Volume: IFJV)에 부가하면 최종 체액 결합 체적(Final Fluid Joint Volume: FFJV)이 표시된다. 그러므로 상기 계산을 이용하여 cc당 7 x 10⁸ 개의 혈소판에 12.5를 곱해서 8.75 x 10⁹개의 혈소판을 산출한다. 이 숫자가 최종 혈소판 투여량을 나타낸다(공식 1 참조).
(배지 변경 전에 MSC 성장/Days 를 이 수준에 유지하기 위한 cc당 평균 혈소판 수) x (배지 변경 전에 이 수준에 필요한 Days ((7) (최종체액결합체적)) = PHC 혈소판 투여량. (공식 (I)).
이와는 달리, 보충은 증식을 증진하는데 필요한 최고 체외 백분율과 등가의 혈소판 용해물을 사용해서 수행할 수 있으며, 결합체적에 대하여 조정하고, 또한 더 자주 보충한다.
MSC 이식 현장 모니터링
본문에 설명한 이식된 세포들은 이들이 체내에 생존하고 있는지 그리고 궁극적으로 원하는 복구를 위해 필요한 세포 형태로 분화되는 지 확인하기 위해서 모니터할 수 있다. 한 실시예에서 MRI 표지를 수행하여 환부의 비침습 모니터링을 할 수 있다 (그러나 주의해야 할 점은 이 방법은 자기입자들을 사용해서 단지 세포의 위치를 알려 줄 뿐이며 세포의 증식이나 분화 상태에 관해서는 알려주지 않는다는 사실이다).
그러므로 실시간 세포모니터링이 바람직하다. 최적으로 증식된 세포들을 이식한 후, 이식 지점에서 경피 체액세척을 취한다. 부유성 세포들과 최소 부착성 MSC를 획득하여 세포의 수, 세포의 형태, MSC(있다면)의 분화상태, MSC 모양 및 MSC 증식상태에 관해서 검사한다. 결합 세척을 모니터링 또는 분석해서 글리코아미노글라이칸과 같은 중요 물질들의 발현, 중요 단백질, 유전자발현 또는 기타 결합 미세환경 개선을 위해 중요한 화학 또는 유전 지표를 알 수 있다.
두 가지 형태의 실시간 모니터링을 수행할 수 있다. 환부 체액의 무작위표본추출 및/또는 환부 체액의 고압 "분리("knock-off)". 고압 분리는 바늘 또는 카테터(전형적으로 14-22 게이지에 대응하는)를 가지고 수행하여 고압 수액을 밀어 넣어서 최소 부착성 MSC를 떨어낸다.
이와는 달리, 바늘 관절경 검사법 또는 재래의 관절경 검사법을 사용해서 분석용 조직 표본들을 얻을 수도 있다.
MSC를 이식하기 전에 기저선에서 경피 표본추출을 수행한다(이것은 모든 미래의 표본에 대하여 비교될 수 있는 표본을 형성하는 것이다). 표본추출은 MSC를 환부에 이식한 이후에 1주일마다, 가능한 2주일마다, 그리고 가능한 3주일마다 수행한다.
특히 이식 1주일 후에 결합 세척을 취하거나 또는 조직 표본을 검사한다. 세포 개체군은 체내 표본추출방법을 사용치 않고서 체외에서 쉽게 검사할 수 있으며 성장 배지를 조절하는 것은 사실로 인정되지만, 동일하게 요구되는 조절작업을 체내 성장 및 접종을 확보하기 위해서 할 수 없다. 그러나 이 실시간 모니터링에 근거해서, 혈소판 및/또는 혈소판 용해물 보충을 표적 지점에 대하여 할 수 있다. 이 방법은 필요에 따라서 반복할 수 있다. 또한, 자가적으로 배양된 MSC를 환부에 더 이식할 수 있다.
마지막으로, 이식된 MSC가 생존하여 증식할 수 있다는 것과 또는 결합 미세환경이 세포의 생존과 접종에 적절하다는 것을 결정할 때 분화 인자를 환부에 접촉시킬 수 있다. 또한, 실시간 모니터링 분석에서 얻은 세포들을 각 종의 분화 인자의 존재 하에 배양하여 어느 분화 인자가 필요한 결과를 위해서 가장 적합한지를 결정할 수 있다. 표시한 인자들은 뼈 형태형성유전 단백질 2, 덱사메타존, 히알루론산 및 이와 같은 것을 포함하는 것이다. 또한, 실시간 모니터링에서 염증세포가 복원되었을 경우에는, 항염증제를 치료에 포함시킬 수 있거나 또는 환부가 탈수되었을 경우에는 히알루론산을 첨가할 수 있다.
또한, 세포들의 체내 후 이식을 분석법을 이용해서 모니터링하여 글리코아미노글라이칸(GAG's)의 생성, 공지의 퇴행효소 감소 및 기타 인자들과 같은 기타 2차적 조직재생 효과들에 관해서 알아볼 수 있다. 본 발명의 이 부분에서 중요한 특징은 세포들을 이식한 후에 직접 또는 간접적인 모니터링을 계속한다는 것이다. 또한, 이것은 이식후 시험계획에 실시간 변경을 허용하여 세포의 생존 및 접종과 아울러 한번 분화된 기능을 확보할 수 있도록 한다. 표시한 실시예로서, 일단 초기 단계의 연골세포로 분화된 MSC는 모니터링을 통해 GAG 생성을 확인하여 성숙하고 건강한 연골세포와 기능적 및 생물학적으로 완전히 같은 것인지를 판단할 수 있다. 또한, 특정의 분화하는 또는 보충적인 물질들을 관절에 주입하여 관찰된 GAG 생성을 증가시키도록 할 수 있다. 똑같은 실시예를 이자섬세포의 교체와 같은 다른 분야의 조직재생과 체내에서 섬세포로 분화하는 MSC에서 생성되는 인슐린을 관찰하는데도 적용할 수 있다.
요법적용
본 발명의 방법과 조성물은 치료에, 즉, MSC 적용을 필요로 하는 환자의 환부를 복구 및 유지하는데 사용할 수 있다. 본문에 기재된 실시예들을 사용해서 치료할 수 있는 질환들은 골관절염, 퇴행성 디스크 질환, 관절의 연골 교체, 뼈무혈관괴사환부의 안정화, 골절 또는 기타 뼈 불유합의 치료, 심근재생, 피질 복구, 피부상처 치료, 신경 복구, 면역억제 또는 조절을 위한 세포요법, 베타섬세포 교체, 청각에 연관된 세포 및 조직 교체, 골다공증 치료 및 기타 MSC 가 세포로 분화하여 손상, 멸실 또는 퇴행 세포들을 복구 및 교체할 수 있는 질환들을 포함한다.

실시예

다음의 실시예들은 단지 설명하기 위한 것일 뿐이지 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것이 아니다.

실시예 1: 성장 채널과 관련된 환자의 MSC 성장

환자의 뒤쪽 엉덩뼈능선에서 유핵세포들을 채취하여 원심분리(혈청이 한 구배임)에 의해서 적혈구(RBC)에서 분리하였다.

약 10 ml의 골수를 표적 환자에서 채취하여 15 ml 원심관에 넣어 세포배양실로 전달하였다. 이어서 골수표본을 100g에서 2-3분간 회전시켰다. RBC 침사를 검사하여 RBC 덩어리가 그 표본의 하반부에 있는지 그리고 투명대역이 RBC 덩어리와 상부물질 사이에 존재하는 지 확인하였다. 주의해야 할 점은 상부물질이 총체적의 40-50％가 되지 않으면, 그 회전과정을 반복해야 한다는 사실이다. 이어서 상부물질을 분리하여 15 ml 원심관에 넣고서 1000g에서 10분간 회전시켰다. 이때 유핵세포 침사가 현존하는 RBC 의 수에 따라서 적색으로 그리고 아마도 느슨하게 엉겨있는지를 주목해야 한다. 혈청윗물을 분리해서 다시 RBC 침사에 첨가하였다. 유핵세포 침사를 1 ml의 식염수에 재 부유시켰다. 상기 과정들을 반복하여 부가적인 유핵세포들을 얻었다.

이어서 그 부유액을 물에 1:20으로 희석시켜서(용해 RBC) 유핵세포들을 계수하였다. RBC는 1:2000로 희석하여 계수하였다.

이어서 유핵세포들을 파종하여 단층 성장시켰다. 각 cm²당 유핵세포수가 약 0.66 -1.25 x 10⁶ 개 이었으며 0.16 x 10⁹ 개의 RBC를 결합시켰다(RBC 부유물에서 나온 세포들을 가진 유핵세포 부유물에 보충 RBC). 이 결합된 세포혼합물을 1000g에서 10분 동안 회전시키고 다시 Cipro + 헤파린 + 10％ 혈소판 용해물(Doucet가 설명한 바와 같이 5％ 용해질을 가지고 현저한 차선의 증식을 나타낸 본 발명자들의 데이터에 근거해서 시작 투여량으로 10％ 를 선택하였음) 에 재부유시켰다. 이어서 부유물을 37℃에서 30분간 가열하였다. 가열된 부유물을 적당한 크기의 조직 배양 플라스크에 넣고 새로운 배지를 첨가하였다. 세포배양을 5％ CO², 37℃에서 7-12 일간 유지하였다.

도 1에 표시한 바와 같이, 8명의 환자에서 MSC를 채취하여 기판 위에 놓고 상기한 조건 하에서 성장시켜 날짜에 대한 세포수의 함수로서 성장곡선을 그렸다. 허용 성장 채널을 세포증식에 대하여 겹쳐놓았다. 7일째 되는 날, Gi 세포들이 이식하기에 충분히 최적화 되었으며, 8일째 되는 날 St 세포들이 이식하기에 충분히 최적화 되었으며, 또한 10일째 되는 날 Cl 세포들이 이식하기에 충분히 최적화 되었다. 기타 다른 모든 세포들은 충분한 성장 속도에 이르지 못했기 때문에 혈소판 용해물의 수준을 증가시켜 배지에 첨가하여 최적의 성장을 확보하도록 해야 했다.

실시예 2: 환자 MSC 성장은 환자의 건강에 의존한다

골관절염을 앓는 사람들에게서 MSC를 채취하여 실시예 1에 설명한 바와 같이 성장시켰다. 각 환자의 세포들의 성장 속도와 아울러 전체적인 수확량을 결정했다. 수확한 MSC를 여러 가지 양의 혈소판 용해물(5-10％)에서 성장시켜 11일 간의 과정에 걸쳐서 도표를 그렸다 (환자의 고유의 혈소판 500％ 농도와 결빙을 사용한 용해). 데이터는 도2에 그래프로 도시하였는데, MSC 수확량과 성장 속도는 현저하게 변하였다. 본 실시예는 환자들 간에 관찰된 성장의 다양성과 MSC 성장 속도를 최적화할 필요성을 도시하고 있다.

실시예 3: 5％ 혈소판 용해물은 MSC 성장을 최적화하는데 비효과적이다

골관절염을 앓는 환자들에서 채취한 MSC(느린 성장 MSC)를, 실시예 1에 기재한 바와 같이, 5％ 혈소판 용해물, 10％ 혈소판 용해물 또는 20％ 혈소판 용해물을 사용해서 증식하였다. 도 3a-e에 표시한 바와 같이, 5％ 혈소판 용해물을 가지고 증식한 수많은 세포주들은 10-20％ 혈소판 용해물을 가지고 증식한 세포들에 비해서 최대의 증식을 보여주지 못했다. 주목해야 할 점은 20％ 혈소판 용해물조건에서 증식한 대부분의 세포주들은 10％ 혈소판 용해물에 비해서 오직 최소의 증식 이익만을 보여주었을 뿐이라는 사실이다. 그러나 강조할 점은 우리들의 시험데이터가 OA를 가진 환자들이 아주 다양한 증식속도들을 보여주었으며, 몇 명의 환자들은 5％에서, 대부분 10％에서 성장 채널표적을 맞출 수 있었으며, 약간은 20％ 보충을 필요로 하였다. 또한, 대퇴골두무혈관괴사와 같은 다른 질환을 앓는 환자들은 10％ 용해질에서 조차 증식에 실패하였으며 오직 실험계획서를 통해서 결정되는 복수의 변경들을 필요로 하였다(다음 실시예 참조).

도 4를 보면 골관절염 환자들에서 채취한 MSC가 전형적으로 최적의 증식을 얻기 위해서 더 높은 수준의 혈소판 용해물(10％+) 를 요구함을 더욱 알 수 있다. 그러나 정상 성장을 하는 건강한 개인들에서 나온 MSC는 5％ 또는 10％ 혈소판 용해물의 성장조건 하에서 거의 변화를 보이지 않는다.

본 실시예의 데이터를 보면 Doucet 등이 설명한 조건들은 세포들을 골관절염 환자들에서 채취한 조건 하에서는 최적의 증식조건을 생성하지 못하였다. 이 세포들은 최적의 증식을 보이기 위해서 더 높은 퍼센트의 혈소판 용해물을 필요로 했다.

그러나 채취된 세포들이 "빠른 성장 형태"를 보이는 조건하에서는 세포들이 5 또는 10％ 혈소판 용해물 조건하에서도 성장할 수 있었다.

실시예 4: 5명의 환자들에 대한 성장 채널 얼개

5명의 환자들이 실시예 1에서 채취한 바와 같이 MSC를 제공하였다. 다양한 용해질 농도를 사용해서 세포들을 증식하여 세포수를 계수하였다. 세포증식데이터는 도 5에 도시하였으며, 본 발명의 세포성장 채널을 겹치게 하였다. 세포성장 채널 매개 변수들 내에서 증식할 수 있는 세포들은 표적 환자에 사용할 수 있도록 최적으로 준비된 것으로 판단되었으나, 환자 5를 위한 세포증식은 성공적인 치료의 가능성이 최소일 정도로 빈약하였다. 따라서, 혈소판 용해물에 기초한 세포증식조건의 완화는 언급된 성장 채널 내에서 세포증식을 하는데 사용되어야 한다. 또한, 세포 밀도, 배양 패턴 및 형태에 기초하여 이미 설명한 배양 결정들도 적용해야 한다.

실시예 5: 세포들을 성장 채널 매개 변수들 내에서 증식할 때 존재하는 MSC 세포 표면 항원들

실시예 1 및 2와 본문에 언급한 실시예들을 사용해서 MSC를 수확하였다. 배양된 세포들의 표현형을 결정하기 위해서 이들을 공지의 줄기세포 표면 항원들을 지향하는 형광표지 단클론 항체(MAbs)로 증식하였다(사용된 MAbs를 표 1 및 2에 열거하였다).

2명의 환자에게서 나온 배양 세포들에 대한 세포 표면 항원들의 발현 수준을 FACSCalifur 유식세포측정기를 사용하여 분석하였다. 결과들은 표 1 및 2에 표시하였다.

표 1은 각 표적 세포 표면 항원에 대한 평균 형광 세기(MFI)를 표시한 것이다. 각 세포 표면 항원에 대한 퍼센트 양성은 표 2에 열거하였다. 표 2에 표시한 바와 같이, 대상 환자에 이식하기 위하여 최적화된 세포들의 99％ 이상이 CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, CD105 및 CD166를 발현하였다. 반대로, 표적 환자에 이식하기에 최적의 능력을 가진 세포들에 일반적으로 존재하는 세포 표면 항원으로 판단되지 않는 CD14, CD31, CD45 및 CD106를 발현하는 세포들은 거의 없었다.

실시예 6: 본문의 실시예들을 사용한 MSC 이식은 체내 골연골 교체를 대비한다

무릎 결함을 고치기 위해서 연골교체를 필요로 하는 57세의 늙은 환자에서 골수 표본을 채취하였다. 이 골수에서 실시예 1에서 언급한 방법으로 MSC를 분리하였다. 세포들을 10-20％ 혈소판 용해물에서 6번의 통과과정들을 거쳐서 증식하여 1천만 개의 세포들을 얻었다. 세포들을 본 발명의 성장 채널 내에 유지시켰다. 이어서 자가 MSC를 사용해서 세포들을 이식하였다.

도 6(a＆b)은 3.0 T MRI로 찍은 시상 신속스핀양자밀도 영상을 표시한 것이다. 측방넙다리돌기의 뒤쪽 하중지지면 연골결함(A)을 표시하였다. 39일 후에 영상을 다시 찍어서 보니 연골결함이 채워졌다(도 6b 참조). 본 실시예의 데이터는 본 발명의 방법과 조성물을 사용해서 표적지점의 큰 연골결함을 고친 효과를 표시하는 것이다.

실시예 7: 더 높은 수준의 혈소판 용해물의 시간조절이 느린 성장 형태의 MSC 로 하여금 성장 채널 표적을 맞출 수 있도록 하는 성장 모멘텀을 가할 수 있다

다음의 실시예는 체외 증식 과정 중에 혈소판 용해물 농도 변경은 MSC 수확을 현저하게 개선한다는 사실을 설명하는 것이다. 20％ 혈소판 용해물 농도("용해질추가")를 세포들이 집락 형성에서 출현할 때 초기 증식배양에 사용하였다. 네 개의 환자 세포 개체군들을 시험하여, Re, Gi, Ve 및Ca로 표시하였다. 성장조건들을 관찰하여 표 3 및 도 7에 표시하였다.

표 3에 열거한 네 명의 환자들 중에서, 주목해야 할 점은 Gi 및 Ve에 대해서, 통과당 세포증식에서 MSC 중첩증가가 현저하게 개선되었다는 사실이다. 환자 Gi에 관해서는 통과당 중첩증가의 합이 20％ 용해질추가를 사용했을 때 9.74에서 12.96로 증가했다. Re에 대해서는 계측이 6.88에서 10.34로 거의 두 배가 되었다. 이 환자들은 둘 다 MSC에 의한 재생요법을 위한 인구학적 표적이다 (골관절염 진단받은 (OA) 그리고 나이가 50대 및 60대이다). 젊은 환자 Ve (OA에 관해 알려진 바 없음)에 대해서는, 통과과정당 중첩증가의 합이 약간만 개선되었을 뿐이다(5.0에서 5.7). 70대의 가장 연령이 많고 중증의 다중관절 OA를 앓는 환자는 측정이 약간 개선되었을 뿐이다(5.08에서 5.13).

4명의 환자 중 절반이 현저하게 개선된 수확량을 가지고 있었으며 나머지 두 환자는 수확량에 감소가 없이 극히 미약한 개선이 있었기 때문에 본 발명의 방법 및 조성물은 재생의학을 필요로 하는 OA 환자들의 코호트에서 MSC 수확량의 개선이 유효하다.

실시예 8: MSC 이식을 필요로 하는 환자를 위한 증식조건

44세의 무혈관괴사를 앓는 백인 여성의 각 PSIS 에서 10 cc의 골수를 채취하여 본 발명에 따라서 세포들을 처리하였다. 이 여성의 유핵세포 수확량은 매우 빈약하였으며 그 세포들을 10％ 용해질로 단층배양 증식하였으나, 2차 통과과정을 넘어 증식하는데 실패하였다. 다시 변경된 골수채취방법으로 그 환자의 좌 및 우측 PSIS에서 3개의 작은 부분표본들을 채취해서 세포들이 아직 집락 형성에 있는 동안에 20％ 혈소판 용해물로 세포들을 추가하여 20％ 용해질로 증식하였다. 도 8은 양쪽 세포 증식 그래프를 도시하며 이 질환을 앓고 있는 수많은 환자들이 유핵세포 수를 개선하기 위해서 변경된 골수채취방법과 집락 형성배양 중에 용해질추가와 단층배양증식 중에 훨씬 더 높은 혈소판 용해물 농도를 필요로 함을 강조한 것이다.

실시예 9: 본 발명의 세포들의 직접 주입

9개월 된 상완골절을 앓는 37 세 백인 여성으로서 개방교정 및 외부고정 그리고 뼈 자극 치료를 받았음. 이 골절이 도 10a에 표시한 바와 같이 현저한 불유합으로 되었다. 이 환자의 각 PSIS에서 100 cc의 골수를 채취해 그 MSC를 분리하여 10％ 혈소판 용해물에서 증식하였다. 이들을 투시안내 하에 무균 트로카를 통해서 골절불유합 지점에 경피 이식하였다. 도 10b는 세포의 주입 후 5주째에 불유합이 현저하게 치료되었음을 표시한다. 이 실시예는 본 발명으로 증식된 MSC의 체내 뼈발생 능력을 설명하는 것이다.

실시예 10: 무릎연골교체

내측 앞쪽 반달연골이 현저한 퇴행증상을 보이는 무릎의 내측칸에 심각한 퇴행질환을 앓는 43세의 늙은 백인 남자. 도 11a는 3.0T 양자밀도시상 MRI 영상을 표시한 것으로 심각하게 퇴행된 내측 반달연골이 앞쪽에서 거의 완전히 없어진 것을 볼 수 있다. 도 11b는 본 발명의 성장 채널 방법에 따라서 증식하여 얻은 MSC를 경피 주입한 후 3개월째에 관찰한 것을 표시한 것이다. 도 11b는 반달연골의 재생을 표시한 것으로 3-D 영상 체적 분석결과를 보면 반달연골체적이32.5％ 증가했음을 알 수 있다. 주목해야 할 점은 반달연골의 재생은 "흰색" 또는 "무혈관"이라고 알려져 있는 안쪽 부분에서 일어났다는 사실이다. 이것이 일어나기 위해서는, 혈관을 그 지점에 가져와야 한다. 이것은 이 특정한 세포주의 특성 때문이거나 또는 더욱 가능하게는 세포들의 이식 후에 관절에 공급한 혈소판 용해물 때문에 일어났다. 예컨대, 혈소판 용해물은 신생혈관증식을 일으킬 수 있는 VEGF를 현저하게 많이 갖고 있음은 공지된 사실이다.

지금까지 본 발명에 관해서 수많은 실시예들을 참조하여 구체적으로 설명하였지만 본 기술분야에 숙련된 사람은 누구나 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고서도 본문에 설명한 여러 가지 실시예들을 구체적으로 변형할 수 있음과 아울러 본문에 소개한 각종의 실시예들은 본 발명의 정신과 범위를 한정하기 위한 것이 아님을 알 수 있을 것이다.

본 명세서에는 특허, 특허출원 및 간행물 인용문이 포함되어 있다. 그 각 내용은 일체의 목적을 위해 여기에 참고문헌으로 포함되어 있다.

Claims

MSC 이식으로 환자를 치료하기 위한 방법으로서:
환자로부터 MSC 를 획득하고,
환자로부터 혈소판들을 획득하고,
환자의 혈소판들로 혈소판 용해물을 제조하는 한편 환자의 혈소판 용해물의 일부를 포함하는 세포 성장 배지를 제조하고,
상기 세포 성장 배지로 MSC를 증식하고,
상기 증식한 자가 MSC를 환자의 필요한 환부에 이식하는 단계들로 구성된 환자 치료방법.
제1항의 방법에 있어서, 증식한 MSC를 이식한 후에 환자의 환부를 체내에서 모니터링하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항의 방법에 있어서, 상기 증식한 자가 MSC를 이식하는 중에 또는 그 후에 환자의 환부에 혈소판 또는 혈소판 용해물을 직접 주입하여 MSC의 증식을 더욱 용이하게 단계를 더 포함하는 방법.
제1항의 방법에 있어서, 혈소판 용해물을 포함하는 상기 배지는 체적을 기준으로 약 5％ 혈소판 용해물 내지 30％ 혈소판 용해물을 포함하는 방법.
제1항의 방법에 있어서, 상기 MSC는 10번째 체외 통과과정에 의해 체적화된 성장을 할 수 있도록 증식하는 방법.
제5항의 방법에 있어서, 상기 MSC는 7번째 체외 통과과정에 의해 체적화된 성장을 할 수 있도록 증식하는 방법.
제1항의 방법에 있어서, 상기 필요한 환부는 퇴행성 디스크인 방법.
제1항의 방법에 있어서, 상기 필요한 환부는 심근인 방법.
제1항의 방법에 있어서, 상기 필요한 환부는 본질이 신경세포인 방법.
제1항의 방법에 있어서, 상기 필요한 환부는 퇴행성 관절인 방법.
제3항의 방법에 있어서, 주입되는 혈소판 또는 용해질의 농도는 체외 MSC 증식을 최대화하는데 필요한 용해질의 농도에 의해서 결정되는 방법.
제1항의 방법에 있어서, 상기 환자는 골 관절염으로 진단받은 환자인 방법.
MSC에 체외 증식을 위해서 기초배지와 약 5％ 혈소판 용해물 내지 약 30％ 용해질로 구성한 세포 배양 배지.
제13항의 세포 배양 배지에 있어서, 상기 혈소판 용해물은 약 10％ 내지 약 20％인 세포 배양 배지.
제13항의 세포 배양 배지에 있어서, 혈소판 용해물은 상기 MSC에 대하여 자가인 세포 배양 배지.
제13항의 세포 배양 배지에 있어서, 상기 MSC를 증식하는 동안에 수확양을 최대화하기 위하여 더 높은 용해질 농도를 특정 회수 사용한 세포 배양 배지.
환자에게 이식이 유용한 세포를 증식하기 위한 것으로서 환자의 세포들이 환자에게서 나오는 통과 과정이 10번 이내에서 증식되고 이식될 수 있는 것이 확보되도록 하기 위한 매개 변수들로 구성하되, 한 매개 변수는 세포들을 증식하는데 사용되는 혈소판 용해물의 수준을 가리키는 성장 채널.
제1항의 방법에 있어서, 비자가 제공자가 증식을 위한 MSC와 혈소판 용해물을 제공하는 방법.
증식 수확양을 최적화하기 위해서 MSC의 증식에 사용되는 성장 채널.
제2항의 방법에 있어서, 체내 모니터링을 통해 얻은 데이터를 사용하여 환부 복구를 최적화하기 위해 체내 보충을 조절하는 방법.
세포표면 항원 CD29, CD44 및 CD59를 위하여 영양강화된 세포들로 구성된 인체 MSC 격리 개체군.
제21항의 개체군에 있어서, 상기 세포들이 CD73을 더 포함하는 인체 MSC 격리 개체군.
제21항의 개체군에 있어서, 상기 세포들이 CD73 및 CD90을 더 포함하는 인체 MSC 격리 개체군.
제21항의 개체군에 있어서, 상기 세포들이 CD73, CD90 및 CD105를 더 포함하는 인체 MSC 격리 개체군.
제21항의 개체군에 있어서, 상기 세포들이 CD73, CD90, CD105 및 CD166을 더 포함하는 인체 MSC 격리 개체군.
제17항의 방법에 있어서, 상기 매개 변수들은 세포배양 파종밀도, 배지교환전 때까지 세포배양 시간 및 세포 성장패턴 방법.
제1항의 방법에 있어서, 퇴행성 부위를 치료하는데 사용되는 MSC의 투여량은 1백만개 내지 1억개의 세포들인 방법.
제1항의 방법에 있어서, 상기 골수 채취방법은 MSC 수확량을 추가하기 위해서 골수채취 방법은 1-10 ml 양으로 많은 회수에 걸쳐서 채취하는 것을 의미하는 방법.
제1항의 방법에 있어서, 적혈구를 초기 집락 형성에 사용하여 본문에 기재한 특정 MSC 표현형의 부착 및 집락 형성을 개선하는 방법.
제2항의 방법에 있어서, 상기 체내 모니터링 과정은 외과적, 관절경식, 및/ 또는 경피적 수단을 통해 치료되는 부위를 직접 시각화하는 것을 포함하는 방법.
제2항의 방법에 있어서, 상기 인체 내 모니터링 과정은 체외 시각화를 위해서 부착성 또는 비부착성 세포들을 채취하는 것을 포함하는 방법.
제2항의 방법에 있어서, 상기 인체 내 모니터링 과정은 2차적 화학물질 또는 글리코아미노글라이칸, 효소, 단백질, 펩타이드, 폴리펩타이드, 지질과 같은 세포 생성물들을 포함하는 방법.