MX2007001937A

MX2007001937A - Aislamiento de celulas madre/progenitoras a partir de membrana anmiotica de cordon umbilical.

Info

Publication number: MX2007001937A
Application number: MX2007001937A
Authority: MX
Inventors: Toan-Thang Phan; Ivor Jiun Lim
Original assignee: Cellres Corp Pte Ltd
Priority date: 2004-08-16
Filing date: 2005-06-03
Publication date: 2007-08-07
Also published as: JP5798546B2; BRPI0514387A; NZ553695A; CA2971062C; EP1789534B1; MY141772A; PL1789534T3; US9844571B2; US20160024466A1; US10363275B2; ES2527293T3; US20060078993A1; GB2432166B; US20180000866A1; EP2597149A1; WO2006019357A1; US20160250257A1; GB2432166A; BRPI0514387B8; RU2007109452A

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para aislar celulas madre/progenitoras a partir de la membrana amniotica de cordon umbilical, en donde el metodo comprende separar la membrana amniotica de los otros componentes del cordon umbilical in vitro, cultivar el tejido de la membrana amniotica bajo condiciones que permiten la proliferacion celular, y el alojamiento de las celulas madre/progenitoras de los cultivos de tejidos. Las celulas madre aisladas pueden tener propiedades similares a las celulas madre embrionarias, y pueden ser utilizadas para diversos fines terapeuticos. En una modalidad, la invencion se refiere al aislamiento de las celulas madre, tales como las celulas madre/progenitoras epiteliales y/o mesenquimales bajo condiciones que permiten que las celulas sufran expansion mitotica. Ademas, la invencion esta dirigida a un metodo para la diferenciacion de las celulas madre/progenitoras aisladas en celulas epiteliales y/o mesenquimales.

Description

AISLAMIENTO DE CÉLULAS MADRE/PROGENITURAS A PARTIR DE MEMBRANA AMNIÓTICA DE CORDÓN UMBILICAL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para aislar células madre/progenitoras de la membrana amniótica del cordón umbilical, en donde el método comprende la separación de la membrana amniótica de los otros componentes del cordón umbilical in vitro, el cultivo del tejido de la membrana amniótica bajo condiciones que permiten la proliferación celular, y el aislamiento de las células madre/progenitoras a partir de cultivos de tejidos. En particular, la invención se refiere al aislamiento y al cultivo de las células madre que tienen propiedades embrionarias tales como células epiteliales y/o mesenquimales madre/progenitoras bajo condiciones que permiten que las células sufran expansión mitótica. Además, la invención está dirigida a un método para la diferenciación de las células madre/progenitoras aisladas en células epiteliales y/o mesenquimales, y los usos terapéuticos de éstas células madre/progenitoras.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células madre son una población celular que posee las capacidades para auto-renovarse indefinidamente y para diferenciarse en múltiples células o tipos tisulares. Las células madre embrionarias (de aproximadamente los días 3 a 5 después de la fertilización) proliferan indefinidamente y pueden diferenciarse espontáneamente en todos los tipos de tejidos: éstas son así denominadas células madre pluripotenciales o totipotenciales (revisado por ejemplo, en Smith, A.G. (2001) Annu . Rev. Cell . Dev. Biol . 17, 435-462) . Las células madre adultas, no obstante, son más específicas del tejido y pueden tener menos capacidad réplicativa: éstas son de este modo denominadas como células madre multipotenciales (revisado por ejemplo, en Paul, G. et al. (2001) Drug Discov. Today 1 , 295-302) . La "plasticidad" de las células madre embrionarias y de adulto confía en su habilidad para trans- diferenciarse en tejidos diferentes de su origen y, quizás, a través de las capas germinales embrionarias. La habilidad de las células madre para auto- renovarse es crítica para su función como depósito de las células no diferenciadas primitivas. En contraste, la mayoría de las células somáticas tiene una capacidad limitada para la auto-renovación debido al acortamiento del telómero (revisado por ejemplo, en Dice, J.F. (1993) Physiol . Rev. 73, 149-159) . Las terapias basadas en células madre tienen de este modo el potencial para ser útiles para el tratamiento de una pluralidad de enfermedades humanas y animales. Las células madre así como las células madre/progenitoras pueden ser derivadas de diferentes fuentes. El potencial de "linajes múltiples" de las células embrionarias madre y adultas ha sido extensamente caracterizado. Aún cuando el potencial de las células madre es enorme, su uso implica muchos problemas éticos. Por lo tanto, las células madre no embrionarias derivadas del estroma de la médula ósea, el tejido grasoso, la dermis y sangre del cordón' umbilical, han sido propuestas como fuentes alternativas. Estas células pueden diferenciarse entre otras en condrocitos, adipositos, osteoblastos, mioblastos, cardiomiocitos, astrocitos y tenocitos in vitro, y sufren diferenciación in vivo, haciendo a estas células madre - en "general denominadas como células madre mesenquimales - candidatos promisorios para la reparación de defectos mesodérmicos y manejo de enfermedades. En el uso clínico, no obstante, la cosecha de tales células madre mesenquimales provoca varios problemas. La recolección de las células es una carga mental y física para el paciente yá que es requerido un procedimiento quirúrgico para obtener las células (por ejemplo, la colección de médula ósea es una táctica invasora realizada con una aguja de biopsia que requiere anestesia local o incluso general) . Además, en muchos casos, el número de células madre extraídas es más bien bajo. De manera más importante, las células no epiteliales son derivadas o diferenciadas de estas células. Esto promovió la búsqueda para otras posibles fuentes de células madre. La sangre del cordón umbilical h sidd identificada como una fuente rica de células madre/progenitoras hematopoyéticas. No obstante, la existencia de células madre/progenitoras mesenquimales es discutida controversialmente. Por una parte, tales células no pudieron ser aisladas o exitosamente cultivadas a partir de sangre de cordón umbilical a término (Mareschi, K et al., (2001) Haematologica 86, 1099-1100). Al mismo tiempo, los resultados obtenidos por Campagnoli, C. et al. (Blood (2001) 98, 2396-2402) así como por Erices, A. et al. (Br. J. Haematol. (2000) 109, 235-242) sugiere que las células madre mesenquimales están presentes en varios órganos fetales y circulan en la sangre de los fetos a pre-término, simultáneamente con los precursores hematopoyéticos . En consecuencia, la Solicitud de Patente Internacional WO 03/070922 describe los métodos de aislamiento y expansión en cultivo de células madre/progenitoras mesenquimales a partir de sangre de cordón umbilical y un método de diferenciación de tales células en varios tejidos mesenquimales. Las eficiencias de aislamiento de aproximadamente 60% han sido reportadas (Bieback, K. et al. (2004) Stem Cells 22, 625-634) . En el mismo estudio, el periodo de tiempo a partir de la recolección de la sangre de cordón umbilical hasta el aislamiento de las células y el volumen de la célula de sangre utilizado han sido determinados como parámetros cruciales para lograr tal rendimiento. No obstante, esto debía un asunto de debate si estas células madre progenitoras son en verdad derivadas de tejido de cordón umbilical. Recientemente, las células madre/progenitoras mesenquimales han sido exitosamente aisladas de tejido de cordón umbilical, a saber de jalea de Wharthon, la matriz del cordón umbilical (Mitchel, K.E. et al. (2003) Stem Cells 21, 50-60; patente de los Estados Unidos No. 5,919,702; solicitud de patente de los Estados Unidos No. 2004/0136967) . Estas células han mostrado que tienen la capacidad para diferenciarse, por ejemplo, en un fenotipo neuronal y en tejido cartilaginoso, respectivamente. Además, las células madre/progenitoras mesenquimales han sido también aisladas del endotelio y la capa subendotelial de la vena de cordón umbilical, uno de los tres vasos (dos arterias, una vena) encontrados dentro del cordón umbilical (Romanov, Y.A. et al. (2003) Stem Cells 21, 105-110; Covas, D.T. et al. (2003) Braz . J. Med. Biol. Res. 36, 1179-1183). No obstante, ninguno de estos procedimientos empleados hasta ahora ha dado como resultado el aislamiento o cultivo de células madre/progenitoras endoteliales como una fuente para las terapias basadas en células epiteliales, tales como reconformación superficial de la piel, reparación del hígado, manipulación por ingeniería de tejido de la vejiga y otros tejidos superficiales manipulados por ingeniería. De este modo, existe todavía una necesidad para métodos y fuentes confiables, útiles para el aislamiento y cultivo de células madre progenitoras epiteliales. Además, los métodos rápidos y eficientes que son éticamente aceptables y no imponen una carga biomédica sobre el paciente para el aislamiento de las células madre/progenitoras epiteliales y mesenquimlas son todavía requeridos con el fin de proporcionar tales células en una cantidad suficiente para diversas aplicaciones en medicina regenerativa y en ingeniería de tejidos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un método para aislar células madre/progenitoras de la membrana amniótica del _ cordón umbilical, el método comprende: (a) separar la membrana amniótica de los otros componentes del cordón umbilical in vitro; (b) cultivar el tejido de la membrana amniótica obtenida en el paso (a) bajo condiciones que permiten la proliferación celular; y (c) aislar las células madre progenitoras. En una modalidad, la invención proporciona un método, que comprende: (a") separar las células del tejido de la membrana amniótica antes del cultivo mediante una técnica seleccionada del grupo que consiste de digestión enzimática y explante directo de tejido. En una modalidad preferida, la invención proporciona un método para aislar células madre progenitoras que tienen propiedades similares a las células madre embrionarias . En otra modalidad preferida, la invención proporciona un método para aislar las células madre/progenitoras epiteliales y mesenquimales. En otra modalidad más, la invención proporciona un método que comprende además : (d) cultivar las células madre/progenitoras bajo condiciones que permiten que las células sufran expansión clonal . En otra modalidad más, la invención proporciona un método que comprende además: (e) cultivar las células madre/progenitoras bajo condiciones que permiten la diferenciación de las células epiteliales y/o células mesenquimales; y (f) aislar las células diferenciadas. En otra modalidad más, la invención proporciona un método que comprende además : (g) preservar las células madre/progenitoras aisladas para el uso posterior. En otra modalidad más, la invención comprende un método de cultivar células madre/progenitoras de la invención, que incluye: Obtener un explante tisular de la membrana amniótica del cordón umbilical; Cultivar el explante tisular en medios de cultivo adecuados y condiciones de cultivo adecuados en un periodo adecuado de tiempo . En otras modalidades más, la invención está dirigida a los usos terapéuticos de las células madre/progenitoras o los extractos celulares de las mismas.

Una de estas modalidades proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno, que comprende administrarle al sujeto una cantidad efectiva de una célula madre/progenitora aislada mediante el método de la invención anteriormente explicado. Otra modalidad más, proporciona una composición farmacéutica correspondiente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención será mejor comprendida con referencia a la descripción detallada cuando se considere en conjunto con los ejemplos no limitantes y los dibujos, en los cuales : La figura 1 describe el crecimiento de las células endoteliales a partir de la membrana amniótica del cordón umbilical, mediante el método de explante tisular directo (amplificación de 40 x) en el día 2 (figuras ÍA) y día 5 (figuras IB, C) de cultivo de tejidos. Las superficies plásticas del cultivo celular fueron recubiertas con mezclas de colágeno 1/colágeno 4 (1:2; Becton Dickinson) antes de colocar la membrana amniótica sobre la superficie. Los especímenes de membrana amniótica fueron sumergidos en 5 ml de medio EpiLife o Medio 171 (ambos de Cascade Biologics) . El medio fue cambiado cada 2 ó 3 días y el crecimiento celular por explante fue monitorizado bajo microscopía de luz. Fueron tomadas microfotografías a diferentes intervalos de tiempo como se estableció anteriormente. La morfología celular poliédrica observada es típica de las células epiteliales. La figura 2 describe la digestión enzimática de los segmentos de cordón umbilical que producen células epiteliales similares (magnificación 40 x) en el día 2 (Figuras A, C) y día 5 (Figuras B, D) . La membrana amniótica del cordón umbilical fue dividida en piezas pequeñas de 0.5 c x 0.5 cm y digeridas en solución de colagenasa tipo 1 al 0.1% (p/v) (Roche Diagnostics) a 37°C por 8 horas . Las muestras fueron agitadas en torbellino cada 30 minutos por 3 minutos. Las células fueron cosechadas mediante centrifugación a 4000 rpm por 30 minutos. Los botones celulares fueron resuspendidos en el medio EpiLife o en el medio 171 (ambos de Cascade Biologics) suplementado con 50 µg/ml de factor de crecimiento 1 similar a insulina (IGF-1) , 50 µg/ml de factor BB de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) , 5 µg/ml de factor de crecimiento transformante ßl (TGF-ßl) y 5 µg/ml de insulina (todos obtenidos de R&D Systems) , se contaron y se sembraron sobre cajas de cultivo de 10 cm pre-recubiertas con mezclas de colágeno 1/colágeno 4 (1:2; Becton Dickinson) a una densidad de 1 x 106 células/caja. Después de 24 horas, las células adheridas fueron lavadas con solución salina amortiguada con fosfato, caliente (PBS) y el medio de cultivo fue reemplazado con el medio EpiLife o medio 171 (ambos de Cascade Biologics) . El medio fue cambiado cada 2 ó 3 días, y el crecimiento celular fue monitorizado bajo microscopía de luz. Las microfotografías fueron tomadas a diferentes intervalos de tiempo como se establece anteriormente. Una vez más, las células demostraron morfología poliédrica de células epiteliales típicas . La figura 3 describe el crecimiento de las células mesenquímales explantadas a partir de membrana amniótica de cordón umbilical . El crecimiento celular fue observado tan tempranamente como las 48 horas después de la colocación en cajas de cultivo de tejido utilizando DMEM suplementado con 10% de suero fetal del ternera (FCS) como medio de cultivo (amplificación 40 x) (figuras 3A, C) . Los explantes fueron sumergidos en 5 ml de DMEM (Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Hyclone) (DMEM/10% de FBS). El medio fue cambiado cada 2 ó 3 días.

El crecimiento celular fue monitorizado bajo microscopía de luz. Fueron tomadas microfotografías a diferentes intervalos de tiempo. Las células fueron caracterizadas por su morfología en forma de husillo, y migraron y se expandieron fácil y rápidamente in vi tro, asemejándose estrechamente a fibroblastos (figuras 3B, D) . La figura 4 (amplificación 40 x) describe las células mesenquimales provenientes de células de membrana amniótica de cordón umbilical aisladas mediante digestión enzimática con colagenasa. La figura 4A muestra las células mesenquimales aisladas de la membrana amniótica de cordón umbilical en el día 2. Fue observada proliferación celular en el día 5 (figura 4B) . La membrana amniótica de cordón umbilical fue dividida en piezas pequeñas de 0.5 cm x 0.5 cm y digerida en solución de colagenasa tipo 1 al 0.1% (Roche Diagnostics) a 37°C por 6 horas. Las muestras fueron agitadas en torbellino cada 15 minutos por 2 minutos. Las células fueron cosechadas mediante centrifugación a 4000 rpm por 30 minutos. Los botones celulares fueron resuspendidos en DMEM/10% de FBS, contadas y sembradas sobre cajas de cultivo de tejidos de 10 cm a una densidad de 1 x 106 células/caja. El medio fue cambiado cada 2 ó 3 días. El crecimiento celular fue monitorizado bajo microscopía de luz. Fueron tomadas microfotografías a diferentes intervalos de tiempo. Una vez más, las células demostraron morfología en forma de husillo, típica de las células mesenquimales como fibroplastos. La figura 5 (amplificación 40 x) describe la morfología en la condición de cultivo libre de suero (DMEM) y la condición de cultivo en suero (DMEM/10% de FCS) de células mesenquimales de membrana amniótica de cordón umbilical (UCMC, Figuras 5E, F, G, H) aisladas de acuerdo al método de la invención, los fibroplastos dérmicos normales (células NF109, figuras 5A, B) y células mesenquimales derivadas de tejido adiposo (ADMC, figuras 5C, D) . La figura 5 muestra los cambios en la morfología celular de NF y ADMC cultivadas en condiciones de privación de suero (DMEM, únicamente) reflejada por células más planas y citoplasma menos denso en comparación con las condiciones ricas en suero (DMEM/10% de FCS) donde las células son más redondas con un citoplasma denso (Figura 5A, B, C, D) . No se observó ningún cambio en la morfología en ambos grupos de UCMC cultivados bajo condiciones idénticas de medio libre de suero versus rico en suero (Figuras 5E, F, G, H) , indicando una diferencia en el comportamiento y en la fisiología de estas últimas células mesenquimales. La figura 6 (amplificación 40 x) describe las UCMC aisladas de acuerdo a la invención, cultivadas en DMEM/10% de FCS en los días 3 y 7, sin una capa alimentadora de 3T3. Se observa que las células se desarrollan bien, y están formado una colonia (crecimiento vertical) en vez de mostrar dispersión radial. Una vez más, esto indica una diferencia en el comportamiento de estas células mesenquimales, en comparación a sus contrapartes más diferenciadas. La figura 7 (amplificación 40 x) describe la formación de colonias de células epiteliales de cordón umbilical (USEC) cultivadas sobre una capa alimentadora de 3T3 en los días 3 y 7. Esta apariencia es similar a aquella de las células madre de queratinocitos epiteliales derivadas de piel normal. En las últimas, la capa alimentadora de 3T3 mantiene el linaje de las células. La figura 8 (amplificación 40 x) describe la formación de colonias obvias de células mesenquimales de cordón umbilical (UCMC) aisladas de acuerdo a la invención, cultivadas sobre una capa alimentadora de 3T3 en los días 3 y 7. La capa alimentadora de 3T3 normalmente suprime el crecimiento de las células mesenquimales diferenciadas como fibroblastos dérmicos humanos. Una vez más, esto indica una diferencia en el comportamiento de estas células mesenquimales, en comparación a sus contrapartes más diferenciadas . La figura 9-1 a la figura 9-27 muestran los análisis de transferencia de Western mediante los cuales la expresión de varios marcadores de células madre embrionarias en UCEC y UCMC aisladas de acuerdo a la invención, fue comparada la expresión de estos marcadores en fibroplastos dérmicos humanos (NF) , en células mesenquimales de médula ósea (BMSC) y células mesenquimales derivadas de tejido adiposo (ADMC) . La figura 9 muestra también la ActivinaA altamente secretada y la folistatina detectada por el ensayo de ELISA en sobrenadantes de cultivo de células madre mesenquimales y epiteliales de cordón umbilical, en comparación con las células madre derivadas de tejido adiposo, de médula ósea, fibroblastos dérmicos humanos y queratinocitos epidérmicos .

La figura 10 muestra el análisis inmunofluorescente indirecto de los marcadores de células epiteliales expresadas en células madre epiteliales de cordón umbilical tales como las citoqueratinas (CK-general, CK17, CK6, CK10, CK19, CK18, C 16, CK15 (Figura 10-1) . Componentes de hemidesmosoma-integrina alfa6, integrina beta4; componentes de desmoso a (Figura 10-2). Componentes de membrana basal (lamininal, laminina5, colágeno IV, colágeno VII (figura 10-3) y otros componentes importantes de la matriz extracelular como integrina-betal y fibronectina (figura 10-4) . a £ÍC[U.ra 11 m.§?t:ra el análisis de arreglo de citocina de las citocinas secretadas y factores de crecimiento por las células madre mesenquimales de cordón umbilical (UCMC) en comparación con las células madre mesenquimales de médula ósea humana. La figura 12 muestra el análisis de arreglo de las citocinas secretadas, y los factores de crecimiento por células madre epiteliales de cordón umbilical (UCEC) en comparación con los queratinocitos epidérmicos humanos . La figura 13 muestra las células UCMC cultivadas en DMEM suplementado con 10% de suero fetal de ternera (FCS) (Figura 13-1), medio PTT-1 libre de suero (Figura 13- 2), en medio PTT-2 libre de suero (Figura 13-3, Figura 13- 4) y en medio PTT-3 libre de suero (figura 13-5) . La figura 13 muestra también el crecimiento de las células estromales derivadas de tejido adiposo (figura 13-6) y células estromales derivadas de médula ósea (figura 13-7) en medio PTT-3 libre de suero. La figura 14 muestra la expresión génica global en células madre epiteliales y mesenquimales de cordón umbilical, analizadas mediante arreglo de ácido desoxirribonucleico (DNA, por sus siglas en inglés) . Las UCEC expresaron un total de 28055 genes y las UCMC expresaron un total de 34407 genes. Estos son 27308 genes traslapados que se expresan en ambos tipos celulares. 747 genes expresados fueron únicos para UCEC y 7099 genes expresados fueron únicos para UCMC. Los genes seleccionados de interés son presentados en esta figura. Ambos tipos de células madre expresaron 140 genes relacionados a las células madre embrionarias y al desarrollo embrionario. La figura- 15 muestra una ilustración esquemática de la expansión de las células madre epiteliales y mesenquimales de cordón umbilical utilizando explantes repetitivos de tejidos membranales del revestimiento de cordón umbilical. La figura 16 describe una sección transversal de un cordón umbilical, que demuestra la membrana de revestimiento amniótica del cordón umbilical (LM) , la jalea de Wharton contenida (WJ) , así como dos arterias umbilicales (UA) y una vena umbilical (UV) soportada dentro de esta jalea.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La invención está basada en el hallazgo sorprendente de que la membrana amniótica del cordón umbilical representa una fuente de la cual pueden ser exitosamente aisladas y expandidas, bajo condiciones in vitro las células madre/progenitoras tales como las células madre/progenitoras mesenquimales y epiteliales. Aún más sorprendente es el hallazgo que estas células muestran características similares a las células madre embrionarias. La membrana amniótica, (también llamada membrana de revestimiento amniótico) por ejemplo, el saco membranoso más interno, delgado, que encierra la placenta y el embrión en desarrollo de los dominios de los mamíferos, ha sido utilizada recientemente como un sustrato natural en reconstrucción de la superficie ocular y como un sustrato biológico para la expansión de células madre epiteliales limbales (ver por ejemplo, Anderson, D.F. et al. (2001) Br. J. Ophthalmol . 85, 567-575; Grüterich, M. et al. (2003) Surv. Ophthalmol . 48, 631-646) . No obstante, no han sido descritos los métodos hasta ahora para el aislamiento de las células madre progenitoras a partir de la membrana amniótica, al menos para humanos, ni tampoco ha sido reportada la membrana amniótica que cubre el cordón umbilical como una fuente para células madre. La invención proporciona un método para aislar las células madre progenitoras a partir de la membrana amniótica del cordón umbilical, el método comprenden: (a) separar la membrana amniótica de los otros componentes del cordón umbilical in vitro; (b) cultivar el tejido de la membrana amniótica obtenida en el paso (a) bajo condiciones que permiten la proliferación celular; y (c) aislar las células madre progenitoras. El término "células madre/progenitora" como es utilizado en la presente, se refiere a cualquier célula derivada de cordón umbilical que tenga las capacidades para auto-renovarse indefinidamente, y para diferenciarse en múltiples tipos celulares o tisulares tales como células endoteliales, células epiteliales, fibroblastos, miocitos o neuronas. Además, las células pueden ser derivadas de cualquier especie de mamífero, tales como ratón, rata, cobayo, conejo, cabra, perro, gato, oveja, mono o humano, con células de origen humano que son las preferidas en una modalidad. El término "propiedades similares a las células madre embrionarias" se refiere a la habilidad de las células derivadas de cordón umbilical que pueden - casi o exactamente como las células madre embrionarias -diferenciarse espontáneamente en todos los tipos titulares, lo que significa que éstas son células madre pluripotenciales . El término "membrana amniótica" como se utiliza en la presente, se refiere al saco membranoso delgado más interno, que encierra el embrión en desarrollo de los mamíferos. Durante la preñez, el feto está rodeado y acojinado por un líquido llamado fluido amniótico. Este fluido, junto con el feto y la placenta, está encerrado dentro de un saco llamado la membrana amniótica, que también cubre el cordón umbilical. El fluido aminiótico es importante por varias razones. Este acojina y protege el feto, permitiendo que el feto se mueva libremente. El fluido amniótico también permite que el cordón umbilical flote, previniendo que éste sea comprimido y cortando el suministro de oxígeno y nutrientes al feto, derivados de la sangre en circulación dentro de los vasos sanguíneos de la placenta. El saco amniótico contiene el fluido amniótico que mantiene un ambiente homeostático que protege el ambiente fetal del mundo externo. Esta barrera protege además al feto de los organismos (como bacterias o virus) que podrían atravesar la vagina y causar potencialmente infección. Los medios y reactivos para el cultivo de tejidos son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Pollard, J.W. y Walter, J.M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Segunda Edición, Humana Press, Totowa, NJ; Freshney, R.I. (2000) Culture of Animal Cells, Cuarta Edición, Wiley-Liss, Hoboken, NJ) . Los ejemplos de medios adecuados para incubar/transportar muestras de tejido de cordón umbilical incluyen, pero no están limitados a, Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) , medio RPMI, Solución Salina Balanceada de Hank (HBSS) , solución salina amortiguada con fosfato (PBS) , y medio L-15, con el último que es preferido en algunas modalidades. Los ejemplos de medios apropiados para cultivar las células madre progenitoras de acuerdo a la invención incluyen, pero no están limitadas a, Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), DMEM-F12, medio RPMI, medio EpiLife, y medio 171, con el último que es el preferido en algunas modalidades. Los medios pueden ser suplementados con suero fetal de ternera (FCS) o suero fetal bovino (FBS) así como antibióticos, factores de crecimiento, aminoácidos, inhibidores o similares, que está muy por dentro del conocimiento general de la persona experta en la técnica. En una modalidad, la invención proporciona un método, que comprenda además: (a") separar estas células madre/progenitoras del tejido membranal amniótico, por una digestión enzimática y/o técnica de explante tisular directo antes del cultivo. El término "técnica de digestión enzimática" como se utiliza en la presente, significa que las enzimas son agregadas para romper las células de la masa de tejido principal (aquí la membrana amniótica del cordón umbilical) . Las células separadas son subsecuentemente recolectadas . El término "técnica directa de explante de tejido" como se utiliza en la presente significa que el tejido es primeramente colocado en medio sin enzimas. Luego, bajo condiciones cuidadosas, las células se separan de la masa de tejido principal por si misma y las células son luego cosechadas para la recolección. Los métodos para separar células de un tejido u órgano particular mediante tratamiento con enzimas o mediante explante directo de tejido, son bien conocidos en la técnica (ver por ejemplo, Pollard, J.W. y Walter, J.M. (1997) Basic Cell Culture Procois, Segunda Edición , Humana Press, Totowa, NJ; Freshney, R.I. (2000) Cul ture of Animal Cells, Cuarta Edición, Wiley-Liss, Hoboken, NJ) . Cualquier disociación de tejido por catálisis enzimática puede ser utilizada para realizar los métodos de la presente invención. En modalidades preferidas, se utiliza la colagenasa para ese propósito. La enzima puede ser utilizada como una preparación cruda o en forma purificada. Esta puede ser purificada a partir de cualquier organismo procariótico o eucariótico (con Clostridium histolyticum que es el preferido) o recombinantemente producido por medio de tecnología de genes. Cualquier tipo de colagenasa puede ser empleada, por ejemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo 4 o cualquier combinación de los mismos . En algunas modalidades, está siendo preferido el uso de la colagenasa tipo 1. En una modalidad, la invención proporciona un método para aislar células madre/progenitoras que tienen propiedades similares a las células madre embrionarias. Estas células pueden al final ser diferencias en, pero no limitadas a, por morfología, células epitelial s d mesenquimales. En consecuencia, en otra modalidad más, la invención proporciona un método para aislar las células madre/progenitoras epiteliales y/o mesenquimales, en donde de acuerdo con la descripción anterior, estas células pueden tener propiedades similares a las células madre embrionarias . Las células madre/progenitoras epiteliales incluyen cualesquiera células que muestren una morfología similar a las células epiteliales (por ejemplo, una forma poliédrica) que pueda ser diferencia en cualquier tipo de célula epitelial tal como, pero no limitada a, células epiteliales de la piel, células foliculares pilosas, células epiteliales corneales, células epiteliales de la conjuntiva, células epiteliales retinales, células epiteliales hepáticas, células epiteliales renales, células epiteliales pancreáticas, células epiteliales esofágicas, células epiteliales del intestino delgado, células epiteliales del intestino grueso, células epiteliales del pulmón y de las vías respiratorias, células epiteliales de la vejiga o células epiteliales uterinas. Las células madre/progenitoras mesenquimales incluyen cualesquiera células que muestren morfología similar a las células mesenquimales (por ejemplo, una forma similar a un husillo) que puedan ser diferenciadas en cualquier tipo de células mesenquimales tales pero no limitadas a, fibroblastos de piel, condrocitos, osteoblastos, tenocitos, fibroblastos de ligamentos, cardiomiocitos, células del músculo liso, células del músculo esquelético, adipositos, células derivadas de las glándulas endocrinas, y todos los derivados y variedades de células neurectodérmicas . En otra modalidad más, la invención proporciona un método que comprende además : (d) el cultivo de las células madre/progenitoras bajo condiciones que permiten que las células sufran expansión clonal. El término "expansión clonal" (algunas veces denominado cómo "expansión clonal mitótica") se refiere a un proceso que ocurre tempranamente en el programa de diferenciación de una célula, mediante el cual las células madre/progenitoras se llegan a comprometer a una línea particular y luego sufren diferenciación terminal. Es bien conocido en la técnica, que las condiciones para inducir la expansión clonal de las células progenitoras pueden variar significativamente entre diferentes tipos celulares. Sin estar limitados a un método particular, la inducción de la expansión clonal es en general logrado mediante el cultivo de las células madre/progenitoras en un medio que ha sido optimizado para la proliferación celular. Tales medios son comúnmente disponibles de muchos proveedores. Los ejemplos no limitantes de tales medios son el Medio KGM®- Keratinocyte (Cambrex) , el medio de células epiteliales mamarias MEGM (Cambrex) , el medio EpiLife (Cascade Biologics) o medio 171 (Cascade Biologics) . Alternativamente- Uf. medio de cultivo puede ser suplementado con reactivos que inducen la proliferación celular tales como los factores de crecimiento. Tales reactivos pueden ser mezclados en una solución simple tal como un equipo de suplemento de crecimiento de queratinocitos humanos (Cascade Biologics) , por nombrar un ejemplo, o pueden ser suplementados individualmente. Tales reactivos incluyen, pero no están limitados a, factores de crecimiento (tales como factores de crecimiento epidérmico, factor 1 de crecimiento similar a insulina, factor BB de crecimiento derivado de plaquetas, factor ßl de crecimiento transformante, insulina, por ejemplo) , hormonas (tales como un extracto de pituitaria bovina) , hidrocortisona, transferrina y similares, en cualquier combinación adecuada para inducir expansión clonal de un tipo celular dado. El término "expansión clonal" también incluye el cultivo de la célula in vivo, por ejemplo, mediante la inyección de células de mamífero, tales como humanos, ratones, ratas, monos, micos por nombrar solo unos pocos. En otra modalidad más, la invención proporciona un método que comprende además : (e) cultivar las células madre/progenitoras bajo condiciones que permiten la diferenciación de las células en células epiteliales y/o células mesenquimales; y (f) aislar las células diferenciadas. En otra modalidad más, la invención proporciona un método que comprende además : (g) preservar las células madre/progenitoras aisladas para el uso posterior. Los métodos y protocolos para preservar y almacenar las células eucarióticas, y en particular las células de mamífero, son bien conocidas en la técnica (ver por ejemplo, Pollard, J.W. y Walter, J.M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Segunda Edición, Humana Press, Totowa, NJ; Freshney, R.I. (2000) Culture of Animal Cell , Cuarta Edición, Wiley-Liss, Hoboken, NJ) . Cualquier método que mantenga la actividad biológica de las células madre/progenitoras epiteliales o mesenquimales aisladas puede ser utilizada en conexión con la presente invención. En una modalidad preferida, las células madre/progenitoras son mantenidas y- almacenadas mediante el uso de preservación criogénica. En consecuencia, la invención está también dirigida a una célula progenitora madre derivada de la membrana amniótica de cordón umbilical por medio de los métodos anteriores. Además, la invención está también dirigida a un banco de células que comprende o que consiste de una o más células madre progenitoras que han sido aisladas como se describe en la presente. Este banco de células progenitoras madre pueden ser autólogo para un individuo o combinado, y subsecuentemente puede ser empleado por diferenciación posterior para medicina regenerativa, reparación de tejidos y regeneración de tejidos, por ejemplo. De acuerdo con lo anterior, la invención está también dirigida a una composición farmacéutica que comprende una célula madre/progenitora aislada de la membrana amniótica de cordón umbilical mediante el método de la invención anteriormente descrito. La composición farmacéutica puede ser de cualquier tipo, y usualmente comprende las células madre/progenitoras o un extracto celular de las mismas junto con un portador/excipiente farmacéuticamente aceptable, adecuado. En algunas modalidades, la composición farmacéutica está adaptada para la aplicación sistémica o tópica. Una composición farmacéutica adaptada para la aplicación tópica puede estar en forma líquida o viscosa. Los ejemplos de la misma incluyen un ungüento, una crema, y una loción y similares. Los ejemplos para las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para el uso sistémico son composiciones líquidas, en donde las células madre/progenitoras o el extracto celular se disuelven en un amortiguador que es aceptable para la inyección o infusión, por ejemplo. Consecuentemente, la invención también se refiere a un método para tratar a un sujeto que tiene un trastorno. Este método comprende administrarle al sujeto una cantidad efectiva ya sea de una célula madre/progenitora aislada como se explicó en la presente, o de un extracto celular derivado de tal célula. En principio, cualquier condición que sea adecuada para ser tratada por medio de células madre/células progenitoras, puede ser tratado con una célula o un extracto celular de la presente invención. En algunas modalidades, el trastorno se selecciona del grupo que consiste de enfermedad neoplásica, envejecimiento acelerado de la piel y trastornos de la piel, trastornos de los tejidos, deficiencias endocrinas viscerales, y trastornos neurales. El trastorno tisular que va a ser tratado puede ser una deficiencia tisular congénita o adquirida. Los ejemplos de deficiencia endocrina visceral que pueden ser tratados con una célula de la invención incluyen, pero no están limitados a, diabetes melitus asociada con deficiencia de insulina, deficiencia de testosterona, anemia, hipoglucemia, hipergiucemia, deficiencia pancreática, deficiencia adrenal y deficiencias tiroideas. Los ejemplos de trastornos neurales que pueden ser tratados incluyen, pero no están limitados a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkison, enfermedad de Jacob Kreutzfeld, enfermedad de Lou Gehrig, enfermedad de Huntington y condiciones neoplásicas neurales. Un ejemplo de una enfermedad de la piel es una herida o una parte dañada de la piel, por ejemplo, piel quemada por el sol. También se considera que el envejecimiento de la piel es una enfermedad de la piel en la presente. La distribución tópica o similar de las células madre/progenitoras de la invención o los extractos celulares de las mismas, por ejemplo, como un constituyente en lociones o cremas o cualquier otro vehículo adecuado puede ser de este modo utilizado para la reparación de la piel dañada por el sol y además puede retardar también el proceso de envejecimiento de la piel (propiedades antienve ecimiento) mediante reabastecimiento, y de este modo fortificación, de los factores de crecimiento deficientes y los elementos peptídicos relacionados, sin que dicho envejecimiento de la piel pudiera ser acelerado. Las células madre/progenitoras pueden también migrar hacia las regiones dañadas del cuerpo, tales como las heridas superficiales para formar los elementos celulares requeridos necesarios para los procesos reparadores locales (ver por ejemplo, The Journal of Immunology, 2001, 166:7556-7562; o Internacional Journal of Biochemical and Cell Biology 2004; 36:598-606. La enfermedad neoplásica puede ser un cáncer, en particular ya que los estudios recientes han demostrado que las células madre pueden dirigirse selectivamente al tejido tumoral neoplásico ( Journal of the Nacional Cáncer Institute 2004; 96(21): 1593-1603) permitiendo la distribución dirigida de los agentes antineoplásicos tales como el interferón a los focos neoplásicos. El cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer incluyendo aquellos cánceres que son capaces de formar tumores sólidos, en el intervalo del cáncer de la piel a cáncer de los órganos internos. Los ejemplos de los cánceres que van a ser tratados incluyen carcinoma de células escamosas, carcinoma ductal y lobular de mama, carcinoma hepatocelular, carcinoma nasofaríngeo, cáncer pulmonar, cáncer óseo, cáncer pancreático, cáncer de la piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de los tubos falopianos, carcinoma del endometrio, carcinoma del cervix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodkgin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroides, cáncer de la glándula adrenal, sarcoma de tejido suave, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, leucemias crónicas agudas, tumores sólidos de la niñez, linfoma linfocítico, cáncer de vejiga, cáncer del riñon o del uréter, carcinoma de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés) , linfoma primario del CNS, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tallo celular, adenoma de la pituitaria, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide, o cualquier combinación de tales cánceres, incluyendo formas diseminadas (en metástasis) de los mismos. En el caso del tratamiento de una enfermedad neoplásica el líquido amniótico del cordón umbilical derivado de las células madre y/o de los extractos celulares, descritos en la presente, puede ser administrado sistemáticamente como un tratamiento directo y/o como un vehículo portador. En el último caso de la terapia tumoral antineoplásica, las células comprenden un agente antineoplásico. En otro uso farmacéutico, las células madre/progenitoras de la presente invención pueden ser utilizadas para terapia génica. Para este propósito, las células pueden ser transformadas con un ácido nucleico que codifica para la proteína que va a ser producida en las células. El ácido nucleico puede ser introducido dentro de una célula de la invención utilizando cualquiera de los diversos métodos que son bien conocidos para la persona experta en la técnica, por ejemplo, utilizando un vector viral y/o una composición de transfección que contiene lípido, tal como IBAfect (IBA GmbH, Góttingen, Alemania) , Fugene (Roche) , GenePorter (Gener Therapy Systems) , Lipfectamina (Invitrogen) , Superfect (Qiagen) , Metafecten (Biontex) o aquellos descritos en la solicitud del PCT WO 01/015755) . En una modalidad relacionada, las células de la invención, después de ser transformadas con un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de elección, puede ser utilizado para la producción recombinante de este polipéptido. Como se mencionó anteriormente, los extractos de células madre son ricos en una variedad de factores de crecimiento y péptidos que son relevantes . para la fisiológica de los tejidos normales. Tales factores de crecimiento y/o péptidos pueden ser deficientes en las partes expuestas del cuerpo, tales como la piel, que es la capa superficial de todos los seres humanos, que protege el cuerpo de los elementos externos para el mantenimiento de la homeostasis interna. Por lo tanto, en una modalidad adicional, las células madre progenitoras de la invención o los extractos de la invención o los extractos celulares de las mismas son adecuados para el tratamiento y/o mantenimiento de la homeostasis interna. En una modalidad adicional, y en línea con la descripción anterior, las células madre/progenitoras de la invención pueden ser utilizadas para la producción de cualquier molécula biológica. La molécula biológica puede ser, por ejemplo cualquier molécula que sea producida de manera natural en las células o una molécula del ácido nucleico de codificación del cual ha sido introducido dentro de las células vía tecnología de ADN recombinante. Los ejemplos de moléculas que puedan ser producidas por las células de la invención incluyen, pero no están limitadas a, una proteína tal como una citocina, un factor de crecimiento tal como un factor de crecimiento similar a insulina (IGF) , factor de crecimiento epidérmico (EGF) , factor beta de crecimiento transformante (TGF-beta) , Activina A, una proteína morfogenética ósea (BMP) , PDGF o una hormona como insulina o eritropoyetina o una proteína transportadora tal como transferrina, o un péptido tal como un factor de crecimiento u hormoma (hormona luteinizante (LSH) , hormona estimulante del folículo (FSH) ) , una molécula orgánica pequeña tal como una hormona esteroide, un oligo- o polisacárido, por ejemplo heparina o sulfato de heparan (ver por ejemplo, documentos WO 96/23003, o WO 96/02259 a este respecto) , un proteoglicano, una glucoproteína tal como colágeno o laminina, o un lípido, por nombrar solo algunos pocos. En un aspecto adicional, y de acuerdo con los recientes procedimientos (ver por ejemplo, A it, M et al., Human feeder layers for human e bryonic stell cells, Biol Reprod 2003; 68:2150-2156), las células madre/progenitoras descritas aquí pueden ser utilizadas como la capa alimentadora para el cultivo de otras células madre embrionarias en particular, células madre embrionarias humanas. En una de estas modalidades las células de la presente invención son preferentemente de origen humano, ya que el uso de células humanas como la capa alimentadora reduce al mínimo el riesgo de contaminación del cultivo celular con componentes derivados de animales tales como patógenos o inmunógenos de animales. A este respecto, se debe notar que las células de la invención pueden ser cultivadas bajo condiciones libres de suero En consecuencia, el empleo de las células como capa alimentadora y el cultivo de la línea celular bajo medio libre de suero como aquel descrito más adelante en la presente, o en Draper et al. (Culture and characterization of human embryonic stem cell lines, Stem Cells Dev 2004, 13:325-336) o en la solicitud de patente internacional WO 98/30679, por ejemplo. En este contexto, se nota que en la cirugía de trasplante y en la terapia basada en células, son cruciales altas cantidades de células paso bajo con una proporción mínima de células senectas (por ejemplo, una gran proporción de células de alta calidad) y se requiere que sean derivadas dentro del tiempo más corto posible durante la expansión celular. Por ejemplo, las células madre mesenquimales provenientes de la médula ósea y sangre de médula son bajas en cantidad y por lo tanto requieren expansión sobre muchos pases por un periodo prolongado de tiempo, con el fin de lograr el número suficiente de células requeridas para el trasplante de células. Las células de pase alto no obstante tienden a deteriorarse en calidad y pueden conducir a senectud celular o a transformación cancerosas. Se ha encontrado aquí que las altas cantidades de células de la presente invención pueden ser obtenidas mediante bajos números de pases utilizando una técnica de explante repetitiva. La presente invención también se refiere de este modo a un método de cultivo de las células madre/progenitoras de la invención, en donde este método comprende: La obtención de un explante tisular a partir de la membrana médica del cordón umbilical; El cultivo del explante tisular en medio de cultivo adecuado y las condiciones de cultivo en un periodo de tiempo adecuado, Exponer opcionalmente el explante tisular a medios de cultivo y continuar el cultivo bajo condiciones adecuadas en un periodo adecuado de tiempo (ver figura 15) . El cultivo puede ser llevado a cabo en tantos ciclos (pases) como se desee, y ser detenido una vez que ha sido obtenido el número deseado de células. La exposición del explante tisular al cultivo fresco puede ser llevado a cabo al retirar el medio de cultivo celular utilizado del recipiente utilizado para desarrollar las células, y agregar el medio fresco a ese recipiente. En vez de reemplazar el medio en el recipiente utilizado, la exposición al medio de cultivo fresco puede ser lograda al transferir el explante tisular a un nuevo recipiente el cual es llenado con medio de cultivo. El explante tisular utilizado para el cultivo/propagación de las células puede ser obtenido mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante la "técnica de explante tisular directo" como se explicó anteriormente (en la cual el tejido es primeramente colocado en medio sin enzimas, y luego bajo condiciones cuidadosas las células se separan de la masa- de tejido principal por si mismas, y las células son luego cosechadas para la recolección) . El cultivo de los explantes tisulares puede ser llevado a cabo en cualquier medio que sea adecuado para el cultivo de las células de mamífero. Los ejemplos incluyen los medios convencionales y comercialmente disponibles que son dados anteriormente con respecto al cultivo o la expansión clonal de las células de la invención, tales como pero no limitadas a, medio de queratinocitos KGM® (Cambrex) , medio de células epiteliales mamarias MEGM (Cambrex) , medio EpiLife (Cascade Biologics) , medio 171 (Cascade Biologics), DMEM, DMEM-F12 o RPMI . El cultivo es típicamente llevado a cabo a condiciones (temperatura, atmósfera) que son normalmente utilizadas para el cultivo de células de la especie de la cual se derivan las células, por ejemplo, a 37°C en atmósfera de aire con 5% de C02. En una modalidad, el cultivo es llevado a cabo utilizando medio libre de suero, en particular libre de suero bovino. El cultivo (en un pase) es realizado para cualquier tiempo adecuado que las células necesiten para el crecimiento, típicamente, pero por ningún medio limitado a, aproximadamente 1 a varios días, por ejemplo aproximadamente 7 a aproximadamente 8 días . Las invenciones ilustrativamente descritas en la presente pueden ser adecuadamente practicadas en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no específicamente descritas en la presente. Por ejemplo, los términos "que comprenden", "que incluyen", "que contienen", etc., serán leídos extensamente y sin limitación. Además, los términos y expresiones empleados en la presente han sido utilizados como términos de descripción y no de limitación, y no existe intención en el uso de tales términos y expresiones de excluir cualesquier equivalente de las características mostradas y descritas, o las porciones de las mismas, pero se reconoce que son posibles diversas modificaciones dentro del alcance de la invención reclamada. De este modo, se debe entender que aunque la presente invención ha sido específicamente descrita o las modalidades preferidas y las características opcionales, la modificación y variación de la invención ejemplificada y descrita en la presente, pueden ser utilizadas por aquellos expertos en la técnica, y que tales modificaciones y variaciones son consideradas dentro del alcance de esta invención. La invención ha sido descrita ampliamente y genéricamente en la presente. Cada una de las especies y agrupamientos subgenéricos más estrechos que caigan dentro de la descripción genérica forman también parte de la invención. Esto incluye la descripción genérica de la invención con una condición o limitación negativa que elimina cualquier materia de interés no obstante de si el material extirpado es o no específicamente indicado en la presente. Otras modalidades están dentro de las siguientes reivindicaciones y los ejemplos no limitantes. Además, donde las características o aspectos de la invención son descritas en términos de grupos de Markush, aquellos expertos en la técnica reconocerán que la invención es también con esto descrita en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Colección del tejido del cordón umbilical El tejido de cordón umbilical es recolectado inmediatamente después del nacimiento del bebe. El espécimen es enjuagado para limpiarlo e inmediatamente transferido a una botella de vidrio estéril de 500 ml que contiene el medio de transporte de cultivo (medio L-15 suplementado con 50 Ul/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina, 250 µg/ml de fungizona, 50 µg/ml de gentamicina; todos los reactivos adquiridos de Invitrogen) antes del transporte al laboratorio. En el laboratorio, la extracción de las células madre es conducida en una campana de flujo laminar bajo condiciones estériles. El espécimen es primeramente transferido a una charola de acero inoxidable estéril. Toda la sangre remanente en los vasos sanguíneos es retirada mediante lavados múltiples con jeringa utilizando solución salina caliente amortiguada con fosfato (PBS) suplementada con 5 IU/ml de heparina (de Sigma) . Se utiliza PBS puro sin heparina en los lavados finales. El espécimen de tejido de cordón umbilical es luego cortado en piezas de 2 cm de longitud y transferido a cajas de cultivo celular de 10 cm de diámetro, donde es realizado el lavado y desinfección adicionales con etanol al 70%, seguido por lavados múltiples utilizando PBS que contiene una mezcla de antibióticos (50 IU/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina, 250 µg/ml de fungizona, 50 µg/ml de gentamicina; todos adquiridos de Invitrogen) hasta que la solución se vuelve clara.

Ejemplo 2: separación/cultivo de células La disección del tejido de cordón umbilical es primeramente realizada para separar la membrana amniótica del cordón umbilical de la jalea de Wharton (por ejemplo, la matriz del cordón umbilical) y otros componentes internos. La membrana amniótica enfriada es luego cortada §fi p§?í?!?í.as piezas (0.5 cm x 0.5 cm) para el aislamiento de las células. El explante es realizado mediante la colocación de las piezas de la membrana amniótica de cordón umbilical sobre cajas de cultivo de tejidos a diferentes condiciones de cultivo celular para el aislamiento ya sea de las células madre epiteliales o mesenquimales. Para la separación cultivo de células mesenquimales, los explantes fueron sumergidos a 5 ml de DMEM (Invitrogen) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Hyclone) (DMEM/10% de FBS) y mantenido en una incubadora de cultivo de células con C02 a 37 °C. El medio fue cambiado cada 2 ó 3 días . El crecimiento celular fue monitorizado bajo microscopía de luz. Las células en crecimiento fueron cosechadas mediante tripsinización (0.125% de tri?sina/0.05% de EDTA) para la expansión posterior y la criopreservación utilizando DMEM/10% de FBS. Para la separación/cultivo de células epiteliales, las superficies de plástico del cultivo celular fueron recubiertas con mezclas de colágeno 1/colágeno 4 (1:2) antes de la colocación de las muestras de tejidos sobre la superficie. Las muestras de tejido fueron sumergidas en 5 ml de medio EpiLife o medio 171 (ambos de Cascade Biologics) . El medio fue cambiado cada 2 ó 3 días. El crecimiento celular a partir de los explantes de cultivo de tejido fue monitorizado bajo microscopía de luz. Las células en crecimiento fueron cosechadas mediante tripsinización (0.125% de tripsina/O .05% de EDTA) utilizando el medio EpiLife o medio 171. Para el método de extracción enzimática de las células, la membrana amniótica de cordón umbilical fue dividida en pequeñas piezas de 0.5 cm x 0.5 cm y digerida en solución de colagenasa tipo 1 al 0.1% (p/v) (Roche Diagnostics) a 37°C por 6 horas. Las muestras fueron agitadas en torbellino cada 15 minutos por 2 minutos. Las células fueron cosechadas mediante centrifugación a 4000 rpm por 30 minutos. Se emplearon dos procedimientos diferentes para aislar las células madre epiteliales o mesenquimales . Para el aislamiento de las células madre epiteliales, los botones celulares fueron resuspendidos en el medio EpiLife o en el medio 171 (ambos de Cascade Biologics) suplementado con 50 µg/ml de factor 1 de crecimiento similar a insulina (IGF-1) , 50 µg/ml de factor BB de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-BB) , 5 µg/ml de factor ßl de crecimiento transformante (TGF-ßl) y 5 µg/ml de insulina (todos obtenidos de R&D Systems) , contadas y sembradas sobre cajas de cultivo de tejido de 10 cm pre-recubiertas con mezclas de colágeno 1/colágeno 4 (1:3; Becton Dickinson) a una densidad de 1 x 106 células/ca a. Después de 24 horas, las células adheridas fueron lavadas con PBS caliente y el medio fue reem laza o con el medio EpiLife agregado con suplemento o medio 171. El medio fue cambiado cada 2 ó 3 días . El crecimiento celular y la formación clonal en expansión fueron monitorizados bajo microscopía de luz. A una confluencia de aproximadamente 70%, las células fueron subcultivadas mediante tripsinización (0.125% de tripsina/O .05% de EDTA) para la expansión y crio-preservación posteriores. Para el aislamiento de células madre mesenquimales, los botones celulares fueron resuspendidos en DMEM/10% de FBS, contadas y sembradas sobre cajas de cultivo de tejido de 10 cm a un densidad de 1 x 106 células/caja. El medio de cultivo fue cambiado cada 2 ó 3 días. El crecimiento celular y de expansión celular fueron monitorizadas bajo microscopía de luz. A una confluencia de aproximadamente 90%, las células fueron subcultivadas como se describe anteriormente. Para el cultivo de las células madre epiteliales y mesenquimales sobre la capa alimentadora, la membrana de revestimiento de cordón umbilical fue digerida por tratamiento con colagenasa, contada y sembrada sobre cajas de cultivo de 10 cm recubiertas con fibroblastos 3T3 tratados con mitomicina C o letalmente irradiados (capa alimentadora) en medio de Green. El medio de cultivo fue cambiado cada 2 ó 3 días . La formación de colonia fue monitorizada bajo microscopía de luz y fotografiadas.

Ejemplo 3: Identificación de las células madre/progenitoras Células epiteliales : La figura 1 muestra fotografías de las células epiteliales en desarrollo provenientes de la membrana amniótica de cordón umbilical, preparadas mediante métodos utilizando explante tisular (amplificación 40 x) . Las fotografías fueron tomadas en el día 2 (figura ÍA) y en el día 5 (figura IB, C) del cultivo de tejidos. El análisis de morfología celular demostró células similares a las epiteliales, de forma poliédrica. La digestión enzimática de los segmentos de cordón umbilical produjo similarmente (figura 2) células epiteliales en el día 2 (figura A, C) y en el día 5 (figura B, D) (amplificación 40 x) . La figura 7 muestra las imágenes de la formación colonial de las células madre epiteliales provenientes de membrana amniótica de cordón umbilical cultivadas sobre capa alimentadora utilizando el método de Green (amplificación 40 x) . Una colonia de células similares a las epiteliales, de forma poliédrica se expandió rápidamente en el día 3 al día 7. Células mesenquimales : El crecimiento de las células mesenquimales explantadas de la membrana amniótica de cordón umbilical, fue observado tan tempranamente como a las 48 horas después de la colocación en cajas de cultivo de tejidos utilizando DMEM suplementado con 10% de suero fetal de ternera (FCS) como medio de cultivo (figura 3A, C) (amplificación 40 x) . Las células fueron caracterizadas por su morfología en forma de husillo, y migraron y se expandieron fácil y rápidamente in vitro, asemejándose estrechamente a los fibroblastos (figura 3B, D) (magnificación 40 x) . Se notaron observaciones similares en el grupo de células aisladas mediante digestión enzimática con colagenasa (figura 4) . La figura 4A muestra las células mesenquimales aisladas de membrana amniótica de cordón umbilical en el día 2. La proliferación celular fue observada en el día 5 (figura 4B) (amplificación 40 x) . Las figuras 6 y 8 muestran imágenes de la formación de colonias de las células madre mesenquimales provenientes de la membrana amniótica de cordón umbilical, cultivadas sobre la capa no alimentadora, y la condición de capa alimentadora en DMEM/10% de FCS (magnificación 40 x) . Las colonias de las células similares a fibroblastos, en forma alargada, se expandieron rápidamente del día 3 al día 7. El análisis de transferencia de Western (figura 9) muestra que las células madre mesenquimales provenientes de la membrana amniótica de cordón umbilical (UCMC) y las células epiteliales de cordón umbilical (UCEC) aisladas de acuerdo con la invención, expresaron el gen P0U5fl el cual codifica para el factor de transcripción Octamer-4 (Oct-4) un marcador específico de células madre embrionarias (ver Niwa, H., Miyazaki, J., y gmith, A.6. (2000). Wat. GQnQt. 24, 372-376) . De este modo, este análisis indica las propiedades similares a las embrionarias de estas células madre. Estas células también expresaron en gran medida los otros factores de crecimiento tales como el factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) , factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , factor de crecimiento similar a la placenta PLGF, STAT3, factor de células madre (SCF) , factor de crecimiento derivado de hepatoma (HDGF) , factor 2 de crecimiento de fibroblastos (FGF-2) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , actina alfa de músculo liso (a-SMA) , fibronectina, decorita, sindecan-1, 2, 3, 4. En la figura 9, la expresión de estos genes es comparada a los fibroblastos dérmicos humanos, a las células mesenquimales de médula ósea (BMSC) y las células mesenquimales derivadas de adipositos (ADMC) . La figura 9 también muestra la Activina A y la folistatina altamente secretadas (estas dos proteínas son bien conocidas por promover la reparación y regeneración de tejidos, la angiogénesis aumentada y mantener el cultivo de células madre embrionarias, de modo que la expresión de los genes respectivos es un signo para las propiedades embrionarias y la habilidad de la célula para diferenciarse) detectada por ensayo de ELISA en sobrenadantes de cultivo de células madre mesenquimales y epiteliales de cordón umbilical, en comparación con la médula ósea, células madre derivadas de tejido adiposo, fibroblastos dérmicos humanos y queratinocitos epidérmicos. También, estos resultados indican que las células de la invención son candidatos promisorios en la aplicación terapéutica de estas células en áreas tales como la medicina regenerativa, medicina del envejecimiento, reparación tisular e ingeniería tisular. Las células mesenquimales fueron además caracterizadas por análisis de la citocinas y factores de crecimiento secretados, en comparación con las células madre mesenquimales de médula ósea humana. Las células madre epiteliales de cordón umbilical (UCEC) fueron analizadas en comparación con los queratinocitos epidérmicos humanos. Este análisis fue llevado a cabo como sigue: En resumen, UMMC, UCEC, fibroblastos dérmicos, células mesenquimales de médula ósea, queratinocitos epidérmicos fueron cultivados en medios de cultivo hasta 100% de confluencia (37 °C, 5% de C02) y luego sincronizadas en medio de inanición (DMEM libre de suero) por 48 horas. Al siguiente día, el medio fue reemplazado con DMEM libre de suero, fresco, y las células fueron luego cultivadas por otras 48 horas. Los medios condicionados fueron recolectados, concentrados, y analizados utilizando un arreglo de citocina (RayBiotech, Inc., GA, Estados Unidos). Los resultados de este análisis muestran que las UCMC secretan interleucina 6 (IL-6) , (MCP1) ; factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) ; interleucina 8 (IL8) ; sTNFRl; GRO; TIMP1; TIMP2; TRAILR3; uPAR; ICAM1; IGFBP3; IGFBP6 (figura 11), mientras que las UCEC secretan IGFBP-4; PARC; EGF; IGFBP-2; IL-6; Angiogenina; GCP-2; ILIRa; MCP-1; RANTES; SCF; TNFß; HGF; IL8; sTNFR; GRO; GRO-a; Anfirregulina; IL-1R3/ST2; TIMP1, TIMP2; uPAR; VEGF (figura 12) . En consecuencia, esto muestra que ambos tipos celulares secretan grandes cantidades de citocinas y factores de crecimiento que juegan papeles importantes en la biología del desarrollo, la homeostasis tisular, la reparación tisular y la regeneración y angiogénesis. Esto demuestra además la versatilidad de las células de la invención para el uso en aplicaciones terapéuticas respectivas.

Además, las células de la invención fueron además examinadas con respecto a su perfil de seguridad utilizando el ensayo de formación de queratoma de ratón como un indicador. Fueron utilizados seis ratones SCID en estos experimentos. Una suspensión de 2 millones de UCMC fue inyectada con una aguja 25G estéril dentro del músculo del muslo de cada ratón SCID. Los animales fueron mantenidos hasta 6 meses y se evaluó la formación del tumor. No se observó formación del tumor en estos ratones (datos no mostrados) . Esto indica que las células de la invención son seguras y no tienen ninguna capacidad para formar tumores, benignos o de otro modo.

Ejemplo 4 : Cultivo de células madre/progenitoras en medio libre de suero Las células UCMC fueron cultivadas en DMEM que contenía 10 FCS y en medios libres de suero, PTT-1, PTT-2 y PTT-3. Los tres medios PTT-1, PTT-2 y PTT-3 fueron preparados por uno de los presentes inventores, el Dr. Phan. En resumen, estos 3 medios no contienen suero fetal bovino o humano, pero contienen diferentes citocinas y factores de crecimiento tales como IGF, EGF, TGF-beta, Activina A, BMPs, PDGF, transferrina, e insulina. Los componentes del factor de crecimiento varían entre los medios para evaluar las características de crecimiento diferencial. El cultivo fue llevado a cabo como sigue: diferentes proporciones de los factores de crecimiento y citocinas fueron agregadas en medio basal. Las UCMC fueron congeladas y mantenidas en estos medios por 10 días. La proliferación celular fue monitorizada bajo microscopía de luz . La figura 13 muestra buen crecimiento de UCMC en los 4 diferentes grupos de medios (figura 13-1 a figura 13-5) , mientras que la morfología de las células UCMC es diferente dependiendo de la proporción de citocinas o de los factores de crecimiento presentes en los medios respectivos. En contraste, las células mesenquimales derivadas de la médula ósea y de adiposis no desarrollaron bien en estos medios libres de suero (figura 13-6 y figura 13-7). En consecuencia, el buen crecimiento de las UCMC demuestran la robustez de las células de la invención y su alta viabilidad indicando que sus características de crecimiento son superiores a las fuentes convencionales de células madre mesenquimales como las células mesenquimales derivadas de la médula ósea y derivadas de adiposis. A este respecto, hay que hacer notar que se utilizó el medio libre de suero (bovino) en esos experimentos y que la mayoría de las células mesenquimales humanas no se desarrollan bien en sistemas de medios libres de suero. De este modo, el uso de las células de la invención en conexión con las tecnologías de medios libres de suero definidas, es una gran ventaja en la terapia celular, ya que los riesgos de utilizar suero fetal bovino para el cultivo de células y la expansión de células, son eliminados. (Aunque ha sido practicado el uso de suero bovino por un tiempo prolongado y típicamente optimiza el crecimiento celular, los problemas de su uso han sido evocados para la transmisión de zoonosis como la encefalopatía espongiforme bovina (enfermedad de las vacas locas) ) .

Ejemplo 5: Caracterización del perfil de expresión del gen de células madre epiteliales y mesenquimales de cordón umbilical El perfil de expresión génico de las células madre epiteliales y mesenquimales del cordón umbilical fue analizado utilizando un microarreglo de DNA. Para este propósito, las UCMC y UCEC fueron cultivadas en medios de crecimiento a 37°C, 5% de C02 hasta 100% de confluencia. Las células fueron sincronizadas en medio basal por 48 horas y luego reemplazadas con medio basal fresco por otras 48 horas. El RNA total fue cosechado y enviado a Sillicon Genetics Microarray Service. El análisis de datos fue realizado utilizando GeneSpring 7.2). La figura 14 resume la expresión génica global. Las UCEC expresaron un total de 28055 genes y la UCMC expresaron un total de 34407 genes. Existen 27308 genes traslapados que expresan en ambos tipos celulares. 747 genes expresados fueron únicos para UCEC y 7099 genes expresados fueron únicos para UCMC. Los genes seleccionados de interés son presentados en la figura 14. Ambos tipos de células madre expresaron 140 genes relacionados a las células madre embrionarias y al desarrollo embrionario, apoyando además que las células de la invención tienen propiedades similares a las células madre embrionarias: Nanog; proteína fetal alfa; factor 3 de transcripción de leucemia de células Pre-B; laminina alfa 5; antígeno carcinoembrionario 1; dominio de abhidrolasa que contiene 2; 3 similar a delta (Drosofila) ; similar a músculo ciego (Drosofila) ; locus complejo de GNAS; molécula de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario 3; tioesterasa 3 de palmitoil-proteína; beta-1-glucoproteína 2 específica del embarazo; antígeno carcinoembrionario similar a 1; desarrollo de ectoderma embrionario, cinasa de cremallera de leucina embrionaria materna; hormona 2 de somatomamotropina coriónica; caja D3 cabeza de tenedor; homólogo de margen radical (Drosofila) ; miembro IB de la familia de cinesina; miosina; polipéptido pesado 3; músculo esquelético, embrionario; malformación de mano/pie dividido (ectrodactililo) tipo 3; miembro 3 de la familia del dominio de TEA; laminina, alfa 1; hormona 1 de somatomamotropina coriónica; lactógeno placentario; receptor 1 de hormona de liberación de corticotropina; factor embrionario tirotrófico; translocador nuclear del receptor de aril-hidrocarburo; proteína membranal relacionada al cabello crespo; colágeno de neurorregulina 1; tipo XVI, alfa 1; neurregulina 1; hormona 1 de somatomamotropina coriónica (lactógeno placentario) ; repetición de triplet CUG, proteína 1 de enlace al RNA; hormona 1 de somatomamotropina coriónica (lactógeno placentario) similar a Bistin; inhibidor de la familia de MyoD; 2 inducido por ácido retinoico; locus complejo de GNAS; factor 4 de transcripción de leucemia de células pre-B; laminina; alfa 2 (merosina, distrofia muscular congénita) ; SMAD, madres contra el homólogo 1 de DPP (Drosofila) ; secuencia transcrita por Homo sapiens con similitud moderada a la proteína pir:D28928 (H. sapiens), glucoproteína beta-1 de IB específica del embarazo D28928, abortivo-humano (fragmento) ; miembro IB de la familia de cinesina; 4 similar a Bruno, proteína de enlace al RNA (Drosofila) ; proteínas específica del cerebro embrionario; inhibidor de crecimiento inducido por embarazo; SMAD, madres contra homólogo 5 DPP (Drosofila) ; hormona 2 de somatomamotropina coriónica; polipéptido 1 de activación de la adenilato-ciclasa (pituitaria) ; molécula de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario; laminina, alfa 3; proteína de O-fucosiltransferasa 1; mellado 1 (síndrome de Alagille) ; homólogo 2 de gastrulación torcida (Drosofila) ; ELAV (letal embrionario, visión anormal, Drosofila) -similar 3 (Hu antígeno C) ; factor embrionario tirotrófico; familia 43 de portador de soluto, miembro 3; inversina; nefronoftisis 2 (infantil) ; inversión de la vuelta embrionaria; inversina de Homo sapiens (INVS) , variante 2 del transcrito, mRNA; secuencia transcrita de Homo sapiens; caja D8 de Horneo; sustrato asociado a Fyn-embrionario; 1 similar a ELAV (letal embrionario, visión anormal, Drosofila) (Hu antígeno R) ; clase B que contiene el dominio básico de hélice bucle-hélice-2; receptor de oxitocina; factor 1 de crecimiento derivado de teratocarcinoma; tirosina-cinasa 1 relacionada a Fms (factor de crecimiento endotelial vascular/receptor del factor de permeabilidad vascular) ; adrenomedulina; repetición en triplete 6-CUG del coactivador del receptor nuclear, proteína 1 de enlace al RNA; homólogo 1 de gastrulación torcida (Drosofila) ; molécula de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario 4; fosfatasa de tirosina proteica, tipo receptor, R; ortólogo de la región mínima de letalidad embrionaria Acrg (ratón) ; receptor A3 de EPH; delta similar a 1 (Drosofila) ; factor LHRH embrionario nasal; factor CP2 de transcripción similar a 1; malformación de mano/pie dividido (ectrodactililo) tipo 3; mellado 2; secuencia transcrita de Homo sapiens; neurregulina 1; malformación de mano/pie dividido (ectrodactililo) tipo 1; familia 43 de portadores de soluto, miembro 3; hidroxiacil-coenzima A-deshidrogenasa/3-cetoacil-coenzima A tiolasa/enoil-coenzima A-hidratasa (proteína trifuncional) , subunidad alfa; fucosiltransferasa 10 (alfa (1, 3) flucosiltransferasa; ortólogo de la región mínima de letalidad embrionaria Acrg (ratón) ; molécula 7 de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario; nucleofosfimina/nucleopas ina 2; fragmento Fc de IgG, receptor, transportador, alfa; homólogo 1 de gastrulación torcida (Drosofila) ; Homo sapiens similar a la clasificación 35 de la proteína vacuolar; maternal-embrionario 3 (LOC146485) , mRNA; dominio de hidrolasa que contiene 2; homólogo de T, brachiuri (ratón) ; dominio 10 de desintegrina y de metaloproteinasa A; proteína ribosomal L29; enzima 2 de conversión de endotelina; 1 similar a ELAV (letal embrionario, visión anormal, Drosofila) (Hu antígeno R) ; trofinina; caja Homeo B6; laminina, alfa 4; caja Homeo B6; proteína hipotética FLJ13456; NACHT, repetición rica en leucina y PYD que contiene 5, 1 similar a ELAV (letal embrionario, visión anormal, Drosofila) (Hu antígeno R) ; factor 1 de transcripción de células embrionarias no diferenciadas; proteína A de plasma asociada al embarazo, papalisina 1; Secretoglobina, familia ÍA, miembro 1 (uteroglobina) ; hormona similar a la hormona paratifoidea; molécula 1 de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario (glucoproteína biliar); Laminina, alfa 1. Ambos tipos de células madre también expresados miles de genes relacionados a la biología del desarrollo, al crecimiento celular y a la diferenciación, la homeostasis celular, la reparación y regeneración de células y tejidos, los ejemplos de tales factores de crecimiento y sus receptores es como sigue: (G-CSF, FGFs, IGFs, KGF, NGF, VEGFs, PIGF, Angiopoyetina, CTGF, PDGFs, HGF, EGF, HDGF, TGF-beta, Activinas e Inhibinas, Folistatina, BMPs, SCF/c-Kit, LIF, WINTs, SDFs, Oncostatina M, Interleucinas, Quimiocinas y muchas otras) ; MMPs, matrices extracelulares TIMPs (colágenos, lamininas; fibronectinas, vitronectinas, tenascinas, integrinas, sindecanos, decorina, fibromoludina, proteoglicanos, sparc/osteonectina, mucina, netrina, glipicano, proteína asociada al cartílago, matrilina, hialuronano, fibulina, ADAMTS, biglucano, discoidina, componentes de desmosoma, ICAMs, cadherinas, cateninas y muchas otras) ; citoqueratinas . Existen grupos de genes presentes únicamente en UCMC. Estos genes están relacionados a los siguientes: procesos fisiológicos normales (factor 1 de crecimiento similar a insulina (so atomedina C) ; 4 similar a insulina (placenta) ; relaxina 1; Plasminógeno; factor 1 de crecimiento similar a insulina (somatomedina C) ; 5 similar a insulina; factor 1 de crecimiento similar a insulina (somatomedina C) ; factor 2 de crecimiento similar a insulina (sometomedina A) ; Homeostasis (1 similar a cabeza de rayo radial; Hemocromatosis; Quimiocina (porción C-C) ligando 5; receptor A de la interleucina 31; ligando 12 de la quimiocina (porción C-X-C) (factor 1 derivado de células estromales) ; subfamilia 3 del receptor nuclear, grupo C, miembro 2; Hemocromatosis; ligando 23 de la quimiocina (porción C-C) ; ligando 23 de quimiocina (porción C-C) ; ferritina mitocondrial; receptor activado proliferativo de peroxisoma, gamma, coactivador 1, alfa; surfactante, proteína D asociada al pulmón; ligando 11 de quimiocina (porción C-C) ; ligando 3 de quimiocina (porción C-C) ; homólogo 2 de Egl nueve (C. elegans) ; receptor activado proliferativo de peroxisoma, gamma, coactivador 1, beta; ligando 1 de quimiocina (porción C-C) ; ligando 12 de quimiocina (porción C-X-C) (factor 1 derivado de células estromales) , ATPasa, transporte de Na+/K+, polipéptido alfa 2 (+); ligando 2 de quimiocina (porción C) ; Hemopexina; receptor 3 de rianodina) , morfogénesis (espectrina, alfa, eritrocítica 1 (eliptocitosis 2) ; Homeo caja D3; homólogo 1 ausentes de ojos (Drosofila) ; familia de genes homólogos a Ras, miembro J; transcrito 1 específico de leucocito; receptor de ectodisplasina A2; glipican 3; gen 7 de caja apareada; corina, proteasa de serina, desalineado, homólogo 1 de dsh (Drosofila) ; familia de genes homólogos de Ras, miembro J; T-caja 3 (síndrome mamario lunar); condroitina-beta-1, 4-N-actilgalactosaminiltransferasa; condroitina-beta-1, 4-N-acetilgalactosaminiltransferasa; SRY (región Y de determinación del sexo) -caja 10; miosina, polipéptido pesado 9, no muscular; receptor de hormona Luteinizante/coriogonadotropina; homólogo del margen radical (Drosofila) ; proteína 5 secretada relacionada al pelo crespo; familia del sitio de integración de MMTV tipo sin ala, miembro 11; homólogo 2 ausente de ojos (Drosofila) ; similar a músculo ciego (Drosofila) ; T-caja 5; 1 similar a Mab-21 (C. elegans); 2 específico de detención del crecimiento; peine sexual sobre el homólogo 1 de pata intermedia (Drosofila) ; T-caja 6; proteína 1 LIM de enlace a la fila ina; molécula de adhesión a células de melanoma; homólogo de torcimiento 1 (acrocefalosindactilia 3; síndrome de Saethre-Chotzen) (Drosofila) ; Homeo caja All; Queratocan; factor 1 de crecimiento de fibroblastos (ácido) ; carboxipeptidasa M; proteína efectora CDC42 (enlace a la GTPasa Rho) 4; factor 1 de transcripción de homeocaja LIM, beta; homólogo 1 dentado; carboxipeptidasa M; factor 8 de crecimiento del fibroblasto (inducido por andrógeno) ; factor 18 de crecimiento de fibroblastos; transcrito 1 específico de leucocitos; endotelina 3; factor 1 de transcripción de homeodominio similar al apareado) ; desarrollo embrionario (beta-1-glucoproteína 3 específica del embarazo; 4 similar a ELAV (letal embrionario; visión anormal, Drosofila) (Hu antígeno D) ; receptor 10 acoplado a la proteína G; receptor A2 de ectodisplasina; cásete de enlace a ATP, subfamilia B (MDR/TAP) , miembro 4; beta-1-glucoproteína 11 específica del embarazo; factor LHRH embrionario nasal; relaxina 1; homólogo 4 de muesca (Drosofila) ; beta-1-glucoproteína 6 especifica del embarazo; pih-2P; proteína relacionada al síndrome de hipertensión inducida por embarazo a Homo sapiens (PIH2) ; glucoproteína oviductal 1, 120kDa (mucina 9, oviductina); proteína endometrial asociada al progestágeno; miosina, polipéptido ligero 4, álcali; atrial, embrionario; Prolactina; homólogo 4 de muesca (Drosofila) ; factor 1 de transcripción de leucemia de células Pre-B; homólogo del margen radical (Drosofila) ; hormona de liberación de corticotropina; subfamilia 3 de receptores nucleares, grupo C, miembro 2; Neurregulina 2; similar a músculo ciego (Drosofila) ; miosina, polipéptido ligero 3, álcali; atrial, embrionario; cDNA FLJ27401 de Homo sapiens, clon WMC03071; similar a Homeo caja 1 de espermatogénesis, extrae brionario, 4 similar a insulina (placenta) ; gen de la glucoproteína (PSG12) específica del pseudo-embarazo procesado por humanos, exon B2C que contiene 3' no traducidas de 2 sitios de empalme alternativos Cl y C2; tirosina-cinasa 1 relacionado a Fms (factor de crecimiento endotelial vascular/factor del receptor de permeabilidad vascular) ; factor 1 de transcripción de leucemia de células pre-B; beta-1-glucoproteína 3 específica del embarazo; molécula 1 de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario (glucoproteína biliar) , sulfatasa esteroide (microsomal); arilsulfatasa C, isozima S; Homeo caja B6; proteína O-fucosiltransferasa 1; factor 1 de transcripción de homeo caja LIM, beta; molécula 1 de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario (glucoproteína biliar) ; hormona estimulante del folículo, polipéptido beta; Angiotensinógeno (inhibidor de la serina (o cisteína) proteinasa, clade A (antiproteinasa alfa-1, antitripsina) , miembro 8) ; molécula 6 de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario (antígeno de reacción cruzada no específica) ; proteína cinasa C, proteína de enlace alfa; miembro 10 de subfamilia de coiectina (lectina tipo C) ; Laminina, alfa 1) , espacio extracelular (carboxilesterasa 1 (esterasa de serina 1 de monocito/macrófagos) ; factor 5 de crecimiento de fibroblastos; Progastricsina (pepsinógeno C) ; antígeno 11 asociado a los espermatozoides; proproteína convertasa de subtilisina/quexina tipo 2; proteína 2 de enlace al hialuronano; dominio Sema, dominio de inmunoglobulina (Ig) , dominio básico corto, secretado (semaforina) 3F; Interleucina 2; similar a quimotripsina; enfermedad de Norrie (pseudoglioma) ; mucina 5, subtipos A y C, traqueobronquial/gástrico; carboxipeptidasa B2 (plasma, carboxipeptidasa U) ; homólogo del margen radical (Drosofila) ; beta-1-gluco?roteína 11 específica del embarazo; Meprina A, alfa (hidrolasa peptídica PABA) ; Taquicinina, precursor 1 (sustancia K, sustancia P, neurocinina 1, neurocinina 2, neuromedina L, neurocinina alfa, neuropéptido K, neuropéptido gamma) ; factor 8 de crecimiento de fibroblastos (inducido por andrógeno) ; factor 13 de crecimiento de fibroblastos; Hemopexina; cáncer de mama 2, inicio temprano; factor 14 de crecimiento de fibroblastos; Retinoesquisis (ligado a X, juvenil) 1; 1 similar a quitinasa 3 (glucoproteína 39 de cartílago) ; Distonina; Secretoglobina, familia ID, miembro 2; Nogina; dominio 2 del núcleo de cuatro disulfuro de WAP; similar al antígeno CD5 (familia rica en cisteína del receptor depurador) ; proteína 1 que responde a Scrapie; homólogo de Gremlin 1, superfamilia del nudo de cisteína (Xenopus laevis) ; interleucina 16 (factor quimioatrayente de linfocitos) ; ligando 26 de quimiocina (porción C-C) ; nucleobindina; factor 18 de crecimiento de fibroblastos; proteína 1 de enlace al factor de crecimiento similar a insulina; Surfactante, proteína Al asociada al pulmón; homólogo 1 similar a Delta (Drosofila) ; transcrito regulado por la cocaína y anfetamina; Meprin A, beta; interleucina 17F; factor H del complemento; proteína 2 secretora rica en cisteína; Distonina; dominio 1 del núcleo de cuatro disulfuro de WAP; Prolactina; Surfactante, proteína B asociada al pulmón; factor 5 de crecimiento de fibroblastos; homólogo 2 de Dickkopf (Xenopus laevis) ; antígeno 11 asociado al espermatozoide; ligando 11 de quimiocina (porción C-C) ; Meprina A, alfa (hidrolasa peptídica de PABA) ; 2 similar a la quitinasa 3; factor de crecimiento inducido por C-fos (factor de crecimiento endotelial vascular D) , ligando 4 de quimiocina (porción C- C) ; receptor de Poliovirus; Hialuronoglucosaminidasa 1; glucoproteína oviductal 1, 120 kDa (mucina 9, oviductina) ; ligando 9 de quimiocina (porción C-X-C) ;proteína 5 relacionada al pelo crespo, secretada; Amelogenina (amelogénesis imperfecta 1, ligada a X) ; Relaxina 1; Sparc/osteonectina, dominios similares a cwcv y cazal de proteoglicano (testican) ; ligando 26 de quimiocina (porción C-C) ; factor 1 de crecimiento de fibroblastos (ácido) ; 2 similar a angiopoyetina; cinasa 1 de tirosina relacionada a Fms (factor de crecimiento endotelial vascular/receptor de factor de permeabilidad vascular) ; distonina; 4 similar a insulina (placenta) ; transcobala ina II; anemia macrocítica; ligando 1 de quimiocina (porción C-C) ; proteína de enlace al factor de crecimiento similar a insulina, subunidad lábil al ácido; factor H del complemento; beta~l-glucoproteína 6 específica del embarazo; homólogo de plata (ratón); proteoglicano 4; factor 16 de crecimiento de fibroblastos; proteína C17 similar a la citocina; granulisina; angiopoyetina 2; cromagranina B (secretogranina 1) ; dominio Sema, dominio de inmunoglobulina (Ig) , y ancla de la membrana GPI, (semaforina) 7A; Pleyotrofina (factor 8 de crecimiento de enlace a la heparina) ; factor 1 de promoción del crecimiento de neuritas; canal de cloruro, activado por calcio, miembro 3 de la familia; Secretoglobina, familia ID, miembro 1; Fibulina 1; receptor 1 de fosfolipasa A2, 180 kDa) , y la matriz extracelular (1 similar a ADAMTS; Periostina, factor específico de osteoblastos; Glipican 5; repetición rica en leucina neuronal 3; Transglutaminasa 2 (polipéptido C, proteína-glutamina-gamma- glutamiltransferasa) ; metaloproteasa y similar a la desintegrina A (tipo reprolisina) con la porción tipo 1 de trombospondina; proteína 4 asociada a las microfibrillas; glipican 3; colágeno, tipo V, alfa 3; inhibidor tisular de etaproteinasa 2; queratocan, proteína de matriz oligomérica de cartílago; Lumican; proteína 3 de enlace al Hialuronona y al proteoglicano; Estaterina; similar a la desintegrina A y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción 3 tipo 1 de trombospondina; Espondina 1, proteína de matriz extracelular; 1 similar a Quitinasa 3 (glucoproteína 39 de cartílagos) ; Colágeno, tipo IV, alfa 3 (antígeno de Goodpasture) ; familia del sitio de integración de MMTV tipo sin ala, miembro 7B; colágeno, tipo VI, alfa 2; Lipocalina 7; proteína 4 de enlace al Hialuronano y la proteoglicano; similar a desintegrina A y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción tipo 1 de la trombospondina, 5 (agrecanasa 2) ; fibronectina 1; Matrilina 1, proteína de matriz del cartílago; proteína hipotética FLJ3710; condroitina-betal, 4-N- acetilgalactosaminiltransferasa; metaloproteinasa 16 de matriz (insertada en la membrana) ; factor de Von Willebrand; Colágeno, tipo VI, alfa 2; proteasa transmembranal, serina 6; metaloproteasa de matriz 23B; metaloproteasa de matriz 14 (insertada T? la membrana) ; repetición rica en leucina neuronal 3; 1 similar a SPARC (mast9, hevina) ; Sparc/osteonectina, proteoglicano de los dominios similares a cwcv y cazal (testican) 3; Der atopontina; colágeno, tipo XIV, alfa 1 (undulina) ; Amelogenina, ligada a Y; Nidogen (enactina) ; 2 similar a ADAMTS; proteína 2 de enlace al hialuronano y al proteoglicano; colágeno, tipo XV, alfa 1; Glipican 6; metaloproteinasa de matriz 12 (elastasa de macrófagos) ; Amelogenina (a elogénesis imperfecta 1, ligada a X) ; similar a la desintegrina A y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción del tipo 1 de la trombospondina, 15; proteasa transmembranal, serina 6; similar a la desintegrina y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción de trombospondina tipo 1, 16; Sparc/osteonectina, proteoglicano de los dominios similares a cwcv y cazal (testican) ; similar a la desintegrina A y la metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción del tipo 1 de trombospondina, 20; Colágeno, tipo XI, alfa 1; proteína de enlace 1 al Hialuronano y al proteoglicano; condroitina beta 1, 4-N-acetilgalactosaminiltransferasa; Asporina (LRR clase 1) ; Colágeno, tipo III, alfa 1 (tipo IV del síndrome de Ehlers-Danlos, dominante autonómico) ; fosfoproteína 1 secretada (osteopontina, sialoproteína ósea 1, activación 1 de linfocito T temprano) ; proteína Gla de Matriz; Fibulina 5; colágeno, tipo XIV, alfa 1 (undulina) ; inhibidor tisular de metaloproteinasa 3 (distrofia del fondo de Sorsby, pseudoinflamatorio) ; Colágeno, tipo XXV, alfa 1; proteína de matriz oligomérica de cartílago; Colágeno, tipo VI, alfa 1; Condroadherina; Colágeno, tipo XV, alfa 1; similar a la desintegrina A y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción tipo 1 de trombospondina, 16; Colágeno, tipo IV, alfa 4; fosfoproteína acida de la matriz de la dentina; Colágeno, tipo IV, alfa 1; repetición de trombospondina que contiene 1; metaloproteinasa de matriz 16 (insertada en la membrana); Colágeno, tipo 1, alfa 2; Fibulina 1; Tectorina beta; Fosfolipasa DI específica del Glucosilfosfatidilinositol; Suprarregulada en el gen 1 del cáncer colorrectal) . Citoesqueleto: (Filamina B, beta (proteína 278 de enlace a la actina) ; Centrina, proteína de mano EF, 1; dominio FERM que contiene 3; integrador 3 de formación de puente; Parvina, gamma; factor de intercambio de nucleótido guanina de Rho (GEF) 11; Tirosina-cinasa 2; 4 similar a Kelch (Drosofila) ; Espectrina, beta, eritrocítica (incluye esferocitosis, clínica tipo 1) ; proteína Arg/Abl- interactina; ArgBP2; Advillina; que contiene repetición de Espectrina, envoltura nuclear 1; Catenina (proteína asociada a la cadherina) delta 1; banda 4.1 de la proteína membranal de eritrocitos similar a 5; Catenina (proteína asociada cadherina), alfa 2; ligando 3 de quimiocina (porción C-C) ; Sarcoglicano, gamma (glucoproteína asociada a la distrofina de 35 kDa) ; Nebulina; Timosina, beta, identificada en células de neuroblastoma; cinasa 1 proteica dependiente de 3-fosfoinosituro; proteína de interacción con la proteína del síndrome de Wiskott-Aldrich, Distonina; proteína 1 de interacción con Huntington; producto del gen KIAA0316; Tropomodulina 4 (músculo) ; Suprimida en el cáncer hepático 1; similar a Vilina; Sintrofina, beta 1 (proteína Al asociada a la distrofina Al, 59 kDa, componente básico 1) ; proteína cinasa, dependiente cGMP, tipo I; Homo sapiens similar a queratina 8; citoqueratina 8; queratina, tipo II citoesquelético 8 (LOC345751) , mRNA; Aducina 1 (alfa) ; proteína cinasa C y sustrato de cinasa de caseína en neuronas 3; Distonina; grupo sanguíneo de Kell; proteína 1 de interacción con la filamina A; 2 específica de detención del crecimiento; estructura 1 de lectura abierta del cromosoma 1; 2 similar a estatmina; Espectrina, alfa, eritrocítica 1 (eliptocitosis 2); gen FKSG44; miembro 1C de la familia de la Cinesina; Tensina; Kaptina (proteína de enlace a la actina) ; Neurofibromina 2 (neuroma acústico bilateral) ; homología de plecstrina; Sec7 y dominios 2 enrollados (citohesina 2) ; proteína Ti relacionada a la actina; similar al síndrome de Wiskott-Aldrich; 4 similar a Kelch (Drosofila) ; homólogo 1 de Fascina, proteína de agrupamiento de actina (Strongilocentrotus purpuratus) ; Anfifisina (síndrome de Stiff-Man con el autoantígeno de cáncer de mama de 128kDa) ; 1 similar a la enfermedad 2 de riñon poliquístico; Anquirina 2, neuronal; cinasa alfa de la proteína de enlace a CDC42 (similar a DMPK) ; proteína hipotética FLJ36144; proteína ArgBP2 de interacción con Arg/Abl; 3 similar a formina; catenina (proteína asociada a la cadherina), beta 1, 88 kDa; Profilina 2; similar a la sinaptopodina 2; Sintrofina, gamma 2; Fosfolipasa D2; Englobamiento y motilidad celular 2 (homólogo de ced-12, C. elegans) ; péptido ligero de 68 kDa de Neurofilamento; Distonina; 7B similar a la Actina; miembro ÍC de la familia de Cinesina; dominio 3 de PDZ y LIM; Aducina 2 (beta) ; obscurina, calmodulina citoesquelética y RhoGEF de interacción con la fitina; Tubulina, parálogo del polipéptido beta; proteína 1 de interacción con la Filamina A; Talina 1; Homo sapiens similar a [Segmento 1 de 2] proteína Piccolo (Aczonina) (LOC375597) ; proteína efectora CDC42 (enlace a la GTPasa de Rho) 4 ; Sindican 1; Filamina A, alfa (proteína 280 de enlace a la actina); Profilina 2; dominio Cl similar a la tensina, que contiene fosfatasa; proteína hipotética MGC33407; GTPasa 1 de la familia Rho; Flavoproteína-oxidorreductasa MICAL2; activador de secreción dependiente de Ca2+; similar a Rabfilina 3A (sin dominios C2) ; Miosina XVA; proteína-cinasa, dependiente de cGMP, tipo 1; proteína de interacción con la cadena ligera reguladora de miosina; miembro de la familia de Cinesina 13B; homólogo del encogen RAS muscular; Espectrina, beta, no eritrocítico 1; TAO cinasa 2; Filamina B, beta (proteína 278 de enlace a la actina) ; Neurofibromina 2 (neuroma acústico bilateral) ; Catenina (proteína asociada a la cadherina) , alfa 3; obscurina, calmodulina citoesquelética y RhoGEF de interacción con la titina; Coronina, proteína de enlace a la actina, ÍA; 1 similar a la banda 4.1 de la proteína membranal de eritrocito; Espectrina, beta, no eritrocítica 4; Timosina, beta 4, ligada a Y; Tectina 2 (testicular) ; familia de genes homólogos a Ras, miembro J, cinasa de serina/treonina con dominios de homología a Dbl y la plecstrina; Distrobrevina, beta; Actina, gamma 2, músculo liso, entérica; proteína similar a Tara; Caspasa 8, proteasa de cisteína relacionada a la apoptosis; dominio de repetición Kelch y BTB (POZ) que contiene 10; Mucina 1, transmembrana; proteína tau asociada a los microtúbulos; Tensina; familia de genes homólogos Ras, miembro F (en filopodia) ; Aducina 1 (alfa); Actinina, alfa 4; banda 4.1 de la proteína de la membrana de eritrocitos (eliptocitosis 1, ligada a RH) ; homólogo 2 bicaudal D (Drosofila) ; Anquirina 3, nodo de Ranvier (anquirina G) ; Miosina VIIA (síndrome de Usher IB (autosóraico recesivo, severo) ) ; Catenina (proteína asociada a la cadherina), alfa 2; de Homo sapiens similar a la queratina 8, tipo II citoesquelética-humana (LOC285233) ; homólogo 3 de Fascina, proteína de agrupamiento de actina, testicular; familia de genes homólogos de Ras, miembro J; proteína 2 estructural de filamento en esferas, facinina; Desmina; Miosina X; gen 1 asociado a la proliferación inducida por señales; Scinderina; similar 1 a la Coactosina (Dictioestelium) ; Englobamiento y motilidad celular 2 (homólogo de ced-12, C. elegans) ; tubulina, beta 4; activador de secreción dependiente de Ca2+; dominio de FERM que contiene 4A; Actina, alfa 1, músculo esquelético; Talina 1; Caldesmon 1; proteína 1 LIM de enlace a Filamina; proteína tau asociada a los Microtúbulos; Sintrofina, alfa 1 (proteína Al asociada a la distrofina, 59 kDa, componente ácido) ; Aducina 2 (beta) ; proteína 1 de interacción con la Filamina A; PDZ y dominio 3 de LIM; banda 4.1 similar a 4B de la proteína membranal de eritrocito; proteína de enlace a FYN (FYB-120/130) ; integrador de formación de puente 3) . Extracelular: (similar a la desintegrina A y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción del tipo 1 de la trombospondina, 20; 1 similar a SPARC (mast9, hevina) ; inhibidor de la proteinasa de Serina (o cisteína) , clade G (inhibidor de Cl) , miembro 1 (angioedema, hereditario) ; Urocortina; similar a quimiotripsina; polipéptido del factor beta de crecimiento derivado de plaquetas (homólogo al oncogen viral del sarcoma de simio (v-sis) ) ; proteína propulsora de regulador endotelial de enlace BMP; factor H del complemento; 1 similar a la hormona somatomamotropina coriónica; ligando 18 de quimiocina (porción C-C) (pulmonar y regulada por activación) ; Fibronectina 1; beta-1- glucoproteína 3 específica del embarazo; similar a la desintegrina A y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción del tipo 1 de la trombospondina, 3; CocoaCrisp; 4 similar a insulina (placenta) ; familia del sitio de integración MMTV tipo sin ala, miembro 11; proteína de matriz oligomérica de cartílago; proteasa transmembranal, serina 6; factor de crecimiento inducido por C-fos (factor D de crecimiento endotelial vascular) ; Familia con similitud secuencial 12, miembro B (epididimal) ; fosfatasa proteica 1, subunidad reguladora 9B, espinofilina; Transcobalamina II; anemia acrocítica; factor V de coagulación (proacelerina, factor lábil); Fosfolipasa A2, grupo IID; factor de necrosis Tumoral, proteína 6 inducida por alfa; colágeno, tipo XV, alfa 1; proteína 3 de enlace al hialuronano y al proteoglicano; Colágeno, tipo XIV, alfa 1 (undulina) ; interleucina 19; Inhibidor 15 de proteasa; receptor colinérgico, nicotínico, polipéptido 1 beta (muscular) ; 3 similar a la lisil-oxidasa; proteína 5 de enlace al factor de crecimiento similar a insulina; hormona 1 del crecimiento; Caseína beta; 2 similar a NEL (pollo) ; factor I (complemento) ; ligando 23 de quimiocina (porción C-C) ; Inferieron, alfa 2; metaloproteinasa de Matriz 16 (insertada en la membrana) ; metaloproteinasa de Matriz 12 (elastasa de macrófagos) ; glipicano 5; beta 1-glucoproteína 3 específica del embarazo; factor 6 de crecimiento de fibroblastos; homólogo de Gremlin 1; superfamilia de nudo de cisteína (Xenopus laevis) ; proteína S (alfa) ; condroitina betal, 4-N-acetilgalactosaminiltransferasa; fosfolipasa DI específica del Glucosilfosfatidilinositol; factor 1 de crecimiento de fibroblastos (ácido) ; Spondina 1, proteína de matriz extracelular; proteína 1 morfogenética ósea; Surfactante, proteína B asociada al pulmón; fosfoproteína acida de la matriz de Dentina; Lipoproteína, Lp(a); Mucina 1, transmembrana; proteasa 1 de serina de lectina de enlace al annano (componente de activación de C4/C2 del factor reactivo Ra) ; Meprina A, beta; Secretoglobina, familia ID, miembro 1; Aspirina (LRR clase 1) ; ligando 25 de quimiocina (porción C-C) ; proteína C17 similar a la citocina; 5 similar a insulina; Meprina A, alfa (hidrolasa peptídica de PABA) ; proteína 1 que responde a Scrapie; factor 18 de crecimiento de fibroblastos; ligando 9 de quimíocina (porción C-X-C) ; inhibina, beta B (polipéptido beta de activina AB) ; factor 8 de crecimiento de fibroblastos (inducido por andrógeno) ; Granulisina; transcrito regulado por cocaína y anfetamina; Colágeno, tipo 1, alfa 2; ligando 17 de quimiocina (porción C-C); ligando 23 de quimiocina (porción C-C) ; Sparc/osteonectina, proteoglicano de dominios similares a cwcv y a cazal (testican) 3; receptor A del ácido gamma-aminobutírico (GABA) ; Defensina, alfa 4, corticostatina; repetición hormonal 3 rica en leucina; Glipican 6; cinasa proteica 2 activada por mitógeno; factor de coagulación XI (antecedente de tromboplastina plasmática) ; ligando 5 de quimiocina (porción C-C) ; Distonina; proteína relacionada al cabello crespo; factor XIII de la coagulación, polipéptido Al; factor 1 de crecimiento celular a insulina (somatomedina C) ; proteína hipotética MGC45438; antígeno 11 asociado al espermatozoide; factor 1 de crecimiento similar a insulina (somatomedina C) ; Periostina, factor específico de osteoblastos; alfa-2-macroglobulina, receptor A del ácido gamma-aminobutírico (GABA) , alfa 5; inhibidor de proteinasa de serina (o cisteína) , clade A (antiproteinasa alfa-1, antitripsina) , miembro 3; homólogo de plata (ratón) ; proteína relacionada al pelo crespo; condroadherina; condroitina-betal, 4-N-acetilgalactosaminiltransferasa; receptor 3 de 5-hidroxitriptamina (serotonina) , miembro familia C; Colágeno, tipo VI, tipo VI, alfa 2; receptor 9 similar a Toll; Amelogenina, ligada a Y; factor B de crecimiento endotelial vascular; 1 similar a cabeza de rayo radial; tirosina-cinasa 1 relacionada a Fms (receptor del factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular); inhibidor 16 de proteasa; Interleucina 2; Clusterina (inhibidor de la lisis del complemento, SP- 40,40, glucoproteína 2 sulfatada, mensaje 2 de próstata reprimido por testosterona, apolipoproteína J) ; hormona estimulante del folículo, polipéptido beta; similar a la desintegrina A y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción del tipo 1 de trombospondina, 16; Lisozima (amiloidosis renal) , homólogo del margen radical (Drosofila) ; proteína 5 de enlace al factor de crecimiento similar a insulina; Taxilina; apoliproteína A-V; factor C de crecimiento derivado de las plaquetas; 1 similar al ligando 3 de quimiocina (porción C-C) ; factor 16 de crecimiento de fibroblastos; Colágeno, tipo VI, alfa 2; Serina (o cisteína) , clade C (antitrombina) , miembro 1; ligando 11 de quimiocina (porción C-C) ; Colágeno, tipo IV, alfa 4; tirosina-cinasa de agammaglobulinemia de Bruton; factor 2 de crecimiento similar a insulina (somatomedina A) ; dominio 1 del inhibidor de proteasa de serina tipo Cazal; Fibrinógeno, polipéptido alfa A; ligando 1 de quimiocina (porción C-C) ; inhibina, beta E; globulina de enlace a hormona sexual; Colágeno, tipo IV, alfa 1; aciltransferasa de Lecitina-colesterol; proteína 2 secretora rica en Cisteína; proteína 1 de enlace al Hialuronano y proteoglicano; precursor C del péptido Natriurético; Ribonucleasa; familia de RNasa A k6; factor 14 de crecimiento de fibroblastos; 2 similar a ADAMTS; Colágeno, tipo IV, alfa 3 (Antígeno de Goodpasture) ; Angiopoyetina 2; Apolipoproteína L, 3; Ligando 12 quimiocina (porción C-X-C) (factor 1 derivado de células estromales) ; proteína 2 de enlace al Hialuronan; Factor VII de la coagulación (acelerador de la conversión de protrombina sérica) ; colágeno, tipo XIV, alfa 1 (undulina) ; glucoproteína Oviductal 1, 120 kDa (mucina 9, oviductina) ; Matrilina 1, proteína de matriz de cartílago; mucina 5, subtipos A y C, traquebronquial/gástrica; Superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro llb (osteoprotegerina) ; Transglutaminasa 2 (polipéptido C, proteína-glutamina-gamma-glutamiltransferasa) ; Queratocan; Colágeno, tipo V, alfa 3; dominio 2 del núcleo de cuatro disulfuro de WAP; ligando 1 de quimiocina (porción C-X3-C) ; inhibidor de proteinasa de Serina (o cisteína) , clade D (cofactor de heparina) , miembro 1; proteína secretora LOC348174; factor X de la coagulación; Interleucina 16 (factor quimioatrayente de linfocitos) ; proteína 2 relacionada a la lipasa pancreática; peptidasa 3 de serina HtrA; receptor de glicina, alfa 3; similar al antígeno CD5 (familia rica en cisteína del receptor depurador) ; proteína hipotética MGC39497; factor VIII de la coagulación, componente procoagulante (hemofilia A) ; dermatopontina; Nogin; 1 que contiene el dominio LY6/PLAUR secretado; 1 similar a ADAMTS; glucoproteína alfa-l-B; estructura de lectura abierta 175 del cromosoma 20; familia del sitio de integración de MMTV tipo sin ala; miembro 8B; Fibulina 1; Fibulina 5; Catepsina S; Nidogen (enactina) ; ligando 26 de quimiocina (porción C-C) ; molécula 1 específica de células endoteliales; 1 similar a la quitinasa 3 (glucoproteína 39 de cartílago) ; receptor A del ácido gamma-aminobutírico (GABA) , beta 1; secretoglobina, familia ID, miembro 2; proteasa de serina 1 de lectina de enlace al mañano (componente de activación de C4/C2 del factor reactivo Ra) ; 1 similar a ADAMTS; dominio de Sema, dominio de inmunoglobulina (Ig) , y ancla membranal GP1, (semaforina) 7A; similar a la desintegrina A y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción tipo 1 de la trombospondina, 15; tipo 2 de subtilisina/quexina de convertasa preproteica; factor 1 de crecimiento similar a insulina (somatomedina C) ; retinosquisis (juvenil ligado a X) 1; similar a la desintegrina A y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción del tipo 1 de trombospondina, 16; ligando 2 de quimiocina (porción C) ; factor 5 de crecimiento del fibroblasto; antigeno 11 asociado a espermatozoide; proteína 4 asociada a las microfibrillas; receptor del poliovirus, cinasa 8 regulada por la señal extracelular; proteasa transmembranal, serina 6; proteína cinasa C, alfa; 2 similar a la quitinasa 3; Interleucina 9; Apolipoproteína L, 6; Surfactante, proteína Al asociada al pulmón; Colágeno, tipo VI, alfa 1; Apolipoproteína L, 6; proteína hipotética FLJ13710; Carboxipeptidasa B2 (plasma, carboxipeptidasa U) ; 2 similar a la proteína de incremento bactericida/permeabilidad; factor 5 de crecimiento del fibroblasto; fosfoproteína 1 secretada/ (osteopontina, sialoproteína ósea I, activación 1 de linfocito T) ; peptidasa 3 de serina HtrA; suprimido en cáncer hepático 1; molécula 1 específica de células endoteliales; factor de Von Willebrand; similar a la desintegrina A y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción del tipo 1 de trombospondina, 5 (agrecanasa-2) ; dominio de Sema, dominio de inmunoglobulina (Ig) , domino básico corto, secretado, (semaforina) 3A; Ligando 12 quimiocina (porción C-X-C) (factor 1 derivado de células estromales) ; estaterina; cinasa 8 regulada por la señal extracelular; inhibidor tisular de metaloproteinasa 3 (distrofia del fondo de Sorsby) ; pseudoinflamatoria; ligando 4 del factor 4 de plaquetas (quimiocina (porción C-X-C) ) ; Surfactante, proteína D asociada al pulmón; factor H del complemento; homólogo 1 similar a Delta (Drosofila) ; dominio 1 del núcleo de cuatro disulfuro de WAP; proteína de enlace al factor de crecimiento similar a insulina; subunidad lábil al ácido; cáncer de mama 2, inicio temprano; gen 1 de linfocito pre-B; hormona de liberación de corticotropina; proteína hipotética DKFZp434B04 ; proteína inducida por prolactina; proteína 4 de liberación de RAS-guanilo; progastricsina (pepsinógeno C) ; dominio de Sema, dominio de immunoglobulina (Ig) , dominio básico corto, secretado, (semaforina) 3F; suprarregulado en el gen 1 del cáncer colorrectal; proteoglicano 4; receptor colinérgico, nicotínico, polipéptido delta; proteína de matriz oligomérica de cartílago; grupo sanguíneo ABO (transferasa A, alfa-4-3-N-acetilgalactosaminiltransferasa; transferasa B, alfa-l-3-galactosiltransferasa) ; Interleucina 12A (factor 1 estimulador de células asesinas naturales, factor 1 de maduración de linfocitos citotóxicos, p35) ; factor 7 de crecimiento del fibroblastos (factor de crecimiento de queratinocitos) ; Kin de 3 similar a IRRE (Drosofila) ; receptor colinérgico, nicotínico, polipéptído alfa 2 (neuronal) ; asociado al carcinoma del epitelio del paladar, del pulmón y nasal; Colágeno, tipo XV, alfa 1; Pleiotrofina (factor VIII de crecimiento de enlace a la heparina, factor 1 promotor de crecimiento de neurita) ; 2 similar a la angiopoyetina; enfermedad de Norrie (pseudoglioma) ; ligando 3 de quimiocina (porción C-C) ; 1 similar a la quitinasa 3 (glucoproteína 39 de cartílago) ; inhibidor H3 de ínter-alfa (globulina) ; amelogenina (amelogénesis imperfecta 1, ligada a X) ; factor de crecimiento epidérmico (beta-urogastrona) ; factor 13 de crecimiento del fibroblasto; familia del sitio de integración de MMTV tipo sin alas, miembro 7B; receptor colinérgico, nicotínico, polipéptido gamma; beta-1- glucoproteína 6 específica del embarazo; metaloproteinasa de matriz 14 (insertada a la membrana) ; ligando 26 de quimiocina (porción C-C) ; Inferieron, alfa 6; Taquicinina, precursor 1 (sustancia K, sustancia P, neurocinina 1, neurocinina 2, neuromedina L, neurocinina alfa, neuropéptido K, neuropéptido gamma) ; proteína 5 secretada relacionada al pelo crespo; proteína 4 de enlace al Hialuronano y al proteoglicano; componente 4B del complemento; metaloproteinasa 16 de matriz (insertada en la membrana) ; factor 7 de crecimiento de fibroblastos (factor de crecimiento de queratinocitos) ; Apolipoproteína C-II; canal de cloruro, activado por calcio, miembro 3 de la familia; Tetranectina (proteína de enlace al plasminógeno) ; Colágeno, tipo III, alfa 1 (síndrome de Ehlers-Danlos tipo IV, dominante autosómico) ; proteína KIAA0556; ligando 4 de quimiocina (porción C-C) ; Hemopexin; inhibidor Hl de ínter- alfa (globulina); Relaxina 1; proteína Gla de matriz; similar a desintegrina A y metaloproteasa (tipo reprolisina) con la porción del tipo 1 de trombospondina, 2; receptor 2 del Inferieron (alfa, beta y omega) ; fosfatasa acida, próstata; proteína de enlace al nucleótido guanina (proteína G) , gamma 8; metaloproteinasa de matriz 23B; Meprina A, alfa (hidrolasa de péptido PABA) ; Hialuronoglucosaminidasa 1; Angiotensinógeno (inhibidor de la proteinasa de serina (o cisteína) , clade A (antiproteinasa alfa-1, antitripsina) , miembro 8) ; proteína de la capa intermedia de cartílago, pirofosfohidrolasa nucleotídica; receptor purinérgico P2X, canal de iones conectada de ligando, 7; Glipican 3; Tectorina beta; Inferieron, alfa 5; Lipocalina 7; variante 1 del factor plaquetario 4; Nucleobindina 1; Colágeno, tipo XI, alfa 1; polipéptido inhibitorio gástrico 1 que contiene la repetición de trombospondina; miembro D de la familia del receptor 3 de 5-hidroxitriptamina (serotonina) ; Colágeno, tipo XXV, alfa 1; factor 9 de diferenciación de crecimiento; proteína hipotética DKFZp434B044; Endotelina 3; ligando 2 de quimiocina (porción C) ; Procineticina 2; Superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral, miembro llb (osteoprotegerína) ; inhibidor tisular de la metaloproteinasa 2; Dístonina; Cromogranina B (secretogranina 1) ; proteína 2 de enlace al Hialuronano y proteoglicano; repetición neuronal 3 rica en leucina; Lumican ; Matrilina 1, proteína de matriz de cartílago; fosfolipasa A2, grupo IIA (plaquetas, fluido sinovial); carboxilesterasa 1 (esterasa de serina 1 de monocito/macrófago) ; Sparc/osteonectina, proteoglicano de los dominios similares a cwcv y cazal (testican) ; homólogo 2 de Dickkopf (Xenopus laevis) ; receptor A del ácido Gamma- aminobutírico (GABA) , alfa 3; beta-1-glucoproteína 11 específica del embarazo; proteína 1 de enlace al factor de crecimiento similar a insulina; Defensina, beta 106; Interleucina 17F; subunidad de los canales de iones introducida al ligando; receptor 1 de fosfolipasa A2, 180 kDa; factor 1 (complemento) ; Distonina; homólogo 1 de aseguramiento de la longevidad de LAG1 (S. cerevisiae); Prolactina; secuencia 264 expresada por testículos, dominio de SEMA, dominio de inmunoglobulina (Ig) , dominio básico corto (semaforina) 3D; proteína 2 secretada relacionada al pelo crespo; proteína 4 secretada relacionada al pelo crespo. Existen grupos de genes presentes únicamente en UCEC. Estos genes están relacionados a los siguientes: Homeostasis (albúmina; receptor detector de calcio; acuaporina 9; lactotransferrina. Morfogénesis: caja Homeo HB9; antígeno 1 similar al epitelial V) . Desarrollo embrionario (Relaxina 2; molécula 8 de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario; Indolamina-pirrol-2, 3-dioxigenasa; receptor A3 de EPH; factor embrionario tirotrófico; beta-1-glucoproteína 1 específica del embarazo; Laminina, alfa 3) , el espacio extracelular (Surfactante, proteína Al asociada al pulmón; beta-1 glucoproteína 1 específica del embarazo; Lactotransferrina; TGF-alfa; Albúmina; FGF-23; proteína A9 de enlace al calcio SlOO (calgranulina B) ) , la matriz extracelular (Laminina, beta 4; Laminina, alfa 3; glucoproteína 4 de la Zona pelúcida. Actividad molecular estructural: estructura de lectura abierta 29 del cromosoma 21; Laminina, alfa 3 proteína 2 asociada a los microtúbulos; Laminina, beta 4 Queratina 6B; Ladinina 1; Queratina 6A; Ocludina Loricrina; banda 4.1 de la proteína membranal de eritrocitos (eliptocitosis 1, ligada a RH) ; Cristalina, beta A2; proteína estructural del cristalino del ojo; 4 similar a la proteína asociada a contactina; Claudina 19; proteína hipotética LOC144501; Queratina 6E; Queratin 6L; proteína 2 membranal intrínseca del cristalino, 19 kDa) , el citoesqueleto (proteína 2 asociada a los microtúbulos; 5 similar a la banda 4.1 de la proteína membranal de eritrocitos; tricohialina Homo sapiens (THH) ; Queratina 6B; Queratina 6A; antígeno similar a epitelial V; homólogo de gancho 1 (Drosofila); Loricrina; banda 4.1 de la proteina membranal de eritrocitos (eliptocitosis 1, ligada al RH) ; Tropomodulina 1; cinasa 1 de regulación de afinidad de MAP/microtúbulos; Queratina 6E; familia de proteínas LIM de enlace a la actina, miembro 2) , moléculas de adhesión celular (Cadherina 19, tipo 2; leucemia de la línea mieloide/linfoide o mixta; estructura de lectura abierta 29 del cromosoma 21; pariente 2 similar a IRRE; Laminina, alfa 3; Sialoadhesina; antígeno CD84 (antígeno leucocitario) ; Lectina, enlace al galactósido, soluble, 2 (galectina 2) ; antígeno 1 similar al epitelial V; antígeno CD96; antígeno de la nefritis tubulointersticial; molécula 8 de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario; IL-18; superfamilia de inmunoglobulina, miembro 1; Integrina, beta 8; Ornitina-arbamoiltransferasa; Integrina, beta 6; 4 similar a la proteína asociada a la contactina; Colágeno, tipo XVII, alfa 1; 26 similar a la cadherina; Mucina y similar a la cadherina) , proteína de diferenciación celular (fosfatasa de tirosina proteica, tipo receptor, polipéptido 1 de Z; Laminina, alfa 3; antígeno CD84 (antígeno leucocitario) ; EDRF2; factor 2 relacionado a la diferenciación eritroide de Homo sapiens; similar a p73 de proteína tumoral; proteína relacionada a la apoptosis/diferenciación de NB4; PNAS-133 de Homo sapiens; Similar a siete en ausencia 2; Interleucina 24; Queratina 6B; Queratina 6A; miembro 9 de la deshidrogenasa/reductasa (familia SDR) ; proteína de unión de espacio vacío, beta 5 (conexina 31.1); proteína 4 de homeo caja de irocuois; homeo caja 2 anterior ventral; Ligando 10 de quimiocina (porción C-X-C) ; miembro 17 de la superfamilia del receptor de factor de necrosis tumoral; canal de calcio, dependiente del voltaje, subunidad beta 2; enfermedad de Parkinson (recesiva autonómica, juvenil) 2, parquín; calicreína 7 (quimotríptica, estracto córnea) ; células gliales que carecen del homólogo 2; AP-2 alfa; tirosina-fosfatasa proteica, tipo receptor, Z polipéptido 1; Troponina TI; Scielina; Glucosaminil- (N-acetil) -transferasa 2, enzima de ramificación en I; Colágeno, tipo XVII, alfa 1; Supresor de la señalización 2 de citocina; homeo caja 1 distal-menos; detención 1 del zigoto; ínterleucina 20; factor 3 de diferenciación de crecimiento; FGF-23; familia del sitio de integración de MMTV tipo sin ala, miembro 8A. Extracelular: estructura de lectura abierta 29 del cromosoma 21; Laminina, alfa 3; Laminina, beta 4; Interleucina 24; beta-glucoproteína 1 específica del embarazo; Ligando 11 de quimiocina (porción C-X-C) ; Surfactante, proteína Al asociada al pulmón; Prepronociceptina; receptor 3B de 5-hidroxitriptamina (serotonina) ; molécula 8 de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario; Ligando 10 de quimiocina (porción C-X-C) ; IL-18 (factor inductor de interferón-gamma) ; Lactotransferrina; albúmina; ligando Fas (superfamilia de TNF, miembro 6) ; receptor colinérgico, nicotínico, polipéptido 4 beta; péptido antimicrobiano de catelicidina; proteasa similar a la tripsina de las vías respiratorias; proteína A9 de enlace al calcio SlOO (calgranulina B) ; TGF-alfa; Calicreína 10; inhibidor de proteasa de serina, tipo 1 de Kunitz; proteína 3 de la vía de señalización inducible por WNT1; Relaxina 2; ínterferón, kapa; Defensina, beta 103A; IL-20; glucoproteína 4 de la zona pelúcida; factor 3 de diferenciación de crecimiento; FGF-23; miembro 8A de la familia del sitio de integración de MMTV tipo sin ala; 5 relacionado al factor H del complemento) , proteínas del desarrollo (EPH receptor A3; cinasa 2 relacionada a NIMA (nunca en mitosis gen a) ; proteína 282 de dedo de zinc; cinasa 1 de enlace a TANK; homólogo A de recombinación meiótica 11 MREll; factor 2 de transcripción de E2F; fosfatasa de tirosina proteica, tipo receptor Z polipéptido 1; mRNA expresado en el clon de mama 161455 de Homo sapiens, proveniente del cromosoma X; Laminina, alfa 3; 1 similar al homólogo del encogen viral de la mieloblastosis v-myb (aviar) ; regulador de la señalización 11 de proteína G; proteína 2 asociada a los microtúbulos; proteína transmembranal 16A; Adeno atosis poliposis coli 2; caja Homeo HB9; proteína F del centrómero, 350/400 ka (mitosina) ; antígeno CD84 (antígeno leucocitario) ; EDRF2; factor 2 relacionado a la diferenciación del eritroide de Homo sapiens; similar a la proteína p73 tumoral; proteína relacionada a la apoptosis/diferenciación de NB4; PNAS-133 de Homo sapiens; P2 de caja cabeza de tenedor; proteína (YA61P) expresada diferencialmente, asociada al sistema gástrico de Homo sapiens; Tenascina N; estructura de lectura abierta 49 del cromosoma 6; proteína 462 de dedo de zinc; proteína 71 de dedo de zinc (Cos26) ; caja 7 de SRY (región de determinación del sexo Y) ; receptor de disparo expresado sobre 4 similar a las células mieloides; Interleucina 24 beta-1-glucoproteína 1 específica del embarazo proteoglicano 5 de sulfato de condroitina (neuroglicano C) Queratina 6B; Queratina 6A; miembro 9 de deshidrogenasa/reductasa (familia SDR) ; antígeno 1 similar al epitelial V; proteína de unión de espacio vacío, beta 5 (conexina 31.1); receptor 51 acoplado a la proteína G; factor 6 regulatorio del Inferieron; Neurotrofina 5 (neurotrofina 4/5) ; antígeno CD96; proteína homeo caja, caja de irocuois; 1 similar al receptor de Interleucina 1; 1 expresado en fase G-2 y S; subfamilia 2 del receptor nuclear, grupo E, miembro 3; homeo caja 2 anterior ventral; proteína 215 de dedo de zinc; segmento de DNA sobre el cromosoma 4 (único) secuencia expresada por 234; molécula 8 de adhesión celular relacionada al antígeno carcinoembrionario; ligando 10 de quimiocina (porción C-X-C) ; IL-18; Indolamina-pirrol-2, 3-dioxigenasa; Albúmina; receptor detector de calcio (hipercalcemia hipocalciúrica 1, hiperparatiroidismo neonatal severo) ; ligando Fas (superfamilia de TNF, miembro 6) ; superfamilia de TNFR, miembro 17; canal de calcio, dependiente del voltaje, subunidad beta 2; enfermedad de Parkinson (recesiva autonómica, juvenil) 2, parquin; Calicreína 7 (quimotrípica, estafo córneo) ; células gliales que carecen del homólogo 2; TGF-alfa; factor embrionario tirotrófico; AP-2 alfa (proteína alfa 2 de enlace al aumentador de activación) ; Calicreína 10; regulador de la señalización 7 de proteína G; fosfatasa de tirosina proteica, tipo receptor, Z polipéptido 1; inhibidor de la proteasa de serina, Kunitz tipo 1; proteína 3 de la vía de señalización inducible por WNT1; miembro 3 heterotáxico 1 de la familia Zic (homólogo apareado impar, Drosofila) ; cinasa proteica TTK; troponina TI, esquelética, lenta; scielina; similar al factor 2 inducido por TGFB, ligado a X; Calicreina 8 (neuropsina/ovasina) ; glucosaminil- (N-acetil) -transferasa 2, enzima de ramificación I; dominio 30A de repetición de anquirina; Relaxina 2; Colágeno, tipo XVII, alfa 1; gen diferencialmente expresado en próstata; regulador 3 de fosfatasa y actina; supresor de la señalización 2 de citocina; subfamilia 4 del receptor nuclear, grupo A, miembro 3; enzima de conversión de angiotensina I (peptidil-dipeptidasa A) 1; proteína hipotética MGC17986; Homeo caja 1 distal-menos; homólogo 3 de aseguramiento de la longevidad LAG1 (S. cerevisiae); detención 1 de zigoto; Interferón; kapa; IL-20; inhibidor de caspasa-1 de ICEBERG; factor 3 de diferenciación de crecimiento; FGF-23; secuencia 15 expresada por testículos; miembro 8A de la familia del sitio de integración MMTV tipo sin ala; caja 7 de SRY (región de determinación del sexo Y) ; asociada a la deficiencia de carnitina, expresada en el ventrículo 1; Procinectina 1; 3 similar a la proteína 3 de enlace al elemento que responde a CAMP; miembro 15 de la familia del dominio de reclutamiento de Caspasa; proteína FLJ23311) .

Ejemplo 6: Diferenciación directa de las células madre epiteliales de cordón umbilical (UCEC) en queratinocitos epidérmicos de piel Para la diferenciación en queratinocitos epidérmicos de piel, las células madre epiteliales de cordón umbilical, células UCEC, fueron cultivadas de acuerdo al protocolo estándar para el cultivo de queratinocitos. Las técnicas de aislamiento celular fueron como se describen anteriormente. Las UCEC fueron luego cultivadas en medio de crecimiento de queratinocitos libre de suero, KGM, KGM-2 (Cambrex) , EpiLife (Cascade Biologics) o en el medio de Green en presencia de una capa alimentadora embrionaria de ratón 3T3 irradiada o tratada con mitomicinas C a 37°C, 5% de C02) . La morfología de las células UCEC diferenciadas de este modo se asemejó a los queratinocitos epidérmicos humanos . Las células epiteliales tienen morfología similar bajo microscopio de luz y pueden ser fácilmente convertidas en fibroblastos utilizando medios convencionales y comercialmente disponibles (ver figura 2) . El análisis inmunofluorescente muestra que las UCEC cultivadas también expresan marcadores moleculares de queratinocitos epidérmicos tales como queratinas, desmoso a, hemidesmoso a y componentes de la membrana basal (ver también la figura 10 que muestra que las UCEC son calificadas para ser células epiteliales en general por la expresión de una variedad de marcadores celulares epiteliales) . En consecuencia, estos resultados muestran que las células progenitoras/madre epiteliales de cordón umbilical de la presente invención pueden ser diferenciadas en células de piel tales como queratinocitos epidérmicos que pueden ser utilizados para el sanado de heridas y tienen mayor potencial para el desarrollo de equivalentes de piel cultivada.

Ejemplo 7: Expansión de las células madre epiteliales y mesenquimales de cordón umbilical utilizando explantes titulares repetitivos de tejidos membranales del revestimiento de cordón umbilical Las células madre epiteliales y mesenquimales de cordón umbilical de la invención, fueron expandidos utilizando explantes repetitivos de tejido de la membrana amniótica de cordón umbilical, como sigue. En resumen, en el día 1 del proceso, los explantes tisulares fueron sembrados en placas sobre cajas de cultivo de tejidos en medios de crecimiento (DMEM/10% de FCS, EpiLife, KGM, KGM- 2, o M171) a 37°C, 5% de C02; los medios fueron cambiados cada 2 ó 3 días. Los crecimientos celulares comenzaron y continuaron igrando de los explantes por 7 días. Después de eso, los explantes tisulares fueron transferidos a otras cajas para permitir el crecimiento posterior de las células. Este proceso fue continuado hasta que los explantes habían disminuido de tamaño, previniendo la explantación adicional. En este contexto se nota que los explantes se encogen progresivamente en tamaño hasta que éstos son demasiado pequeños para el explante tisular posterior, ya que durante el proceso de crecimiento de las células y la migración de las mismas de los explantes tisulares, las células producen proteasas para digerir y romper el tejido. La figura 16 ilustra esquemáticamente el proceso de expansión rápida y robusta de las células madre epiteliales y mesenquimales de cordón umbilical, logrado utilizando cierto protocolo. De este modo, este estudio demuestra el alto rendimiento de las células UCMC y UMEC que pueden ser obtenidos a partir de esta fuente, reflejando además la alta viabilidad y las características de pro-crecimiento de estas células en comparación con otras fuentes de células como células madre de médula ósea y derivadas de adiposis. Además, siendo un tejido sólido, la técnica de explante repetitivo exitosa utilizada en la presente, demuestra que las células de la invención pueden ser uniformemente extraídas del tejido completo en vez de únicamente ciertas porciones. Esto permite el número máximo de células que pueden ser derivadas a un pase bajo en vez de pasar las células a través de muchas generaciones, provocando deterioro de las células.

Ejemplo 8: diferenciación directa de las células mesenquimales de cordón umbilical (UCMC) en fibroblastos dérmicos de piel Para la diferenciación en fibroblastos dérmicos de piel, las células madre mesenquimales de cordón umbilical, las células UCMC fueron cultivadas de acuerdo al protocolo estándar para el cultivo de fibroblastos. Las técnicas de aislamiento celular fueron como se describen anteriormente en el ejemplo 6. Las UCMC fueron luego llevadas en DMEM o medios de crecimiento de fibroblastos comercialmente disponibles (FGM) . La morfología celular de UCMC diferenciadas de este modo se asemejó a los fibroblastos dérmicos humanos . Las células mesenquimales tienen una morfología similar bajo microscopio de luz y puede ser fácilmente convertido en fibroblastos utilizando medios convencionales y comercialmente disponibles (figura 3) . Habiendo descrito la invención que antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para el aislamiento de células madre/progenitoras a partir de la membrana amniótica de cordón umbilical, el método está caracterizado porque comprende : (a) la separación de la membrana amniótica de los otros componentes del cordón umbilical in vi tro; (b) el cultivo del tejido de membrana amniótica obtenida en el paso (a) bajo condiciones que permiten la proliferación celular; y (c) el aislamiento de las células madre/progenitoras .

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende además: (a") la separación de las células del tejido membranal amniótico antes del cultivo mediante un método seleccionado del grupo que consiste de la separación enzimática y el explante tisular directo.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque las células madre/progenitoras tienen propiedades similares a las células madre embrionarias.

4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las células madre/progenitoras son células madre/progenitoras epiteliales y/o mesenquimales.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque comprende: (d) cultivar las células madre/progenitoras bajo condiciones que permiten que las células sufran expansión clonal.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque comprende además: (e) el cultivo de las células madre progenitoras bajo condiciones que permiten la diferenciación de las células en células epiteliales y/o células mesenquimales; y (f) el aislamiento de las células diferenciadas.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las células epiteliales son seleccionadas del grupo que consiste de: células epiteliales de piel, células foliculares pilosas, células epiteliales de la córnea, células epiteliales de la conjuntiva, células epiteliales retinales, células epiteliales del hígado, células epiteliales renales, células epiteliales pancreáticas, células epiteliales esofágicas, células epiteliales del intestino delgado, células epiteliales del intestino grueso, células epiteliales pulmonares, células epiteliales de las vías respiratorias, células epiteliales de la vejiga, y células epiteliales uterinas.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las células mesenquimales se seleccionan del grupo que consiste de: fibroblastos de piel, condrocitos, osteoblastos, tenocitos, fibroblastos de ligamentos, cardiomiocitos, células del músculo liso, células del músculo esquelético, adipositos, células derivadas de las glándulas endocrinas, células neuretodérmicas, y todas las variedades y derivados de las células neurectodérmicas .

9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende: (g) la preservación de las células madre/progenitoras aisladas para el uso posterior.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque la preservación es llevada a cabo mediante el uso de criopreservación.

11. Una célula madre/progenitora, caracterizada porque es aislada a partir de la membrana amniótica del cordón umbilical, por medio del método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un banco de células, caracterizado porque comprende una célula madre/progenitora aislada por medio del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

13. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende una célula madre/progenitora o un extracto celular de las mismas, aislado de la membrana amniótica de cordón umbilical por medio del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

14. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque la composición farmacéutica está adaptada para la aplicación sistémica o tópica.

15. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizada porque la composición farmacéutica adaptada para la aplicación tópica se selecciona del grupo que consiste de un ungüento, una crema y una loción.

16. Un método para tratar un sujeto que tiene un trastorno, caracterizado porque comprende administrarle al sujeto una cantidad efectiva de una célula madre/progenitora aislada por medio del método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

17. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el trastorno se selecciona del grupo que consiste de enfermedad neoplásica, enfermedad de la piel, deficiencia endocrina visceral, y un trastorno neural.

18. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el trastorno tisular es una deficiencia tisular congénita o adquirida.

19. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la deficiencia endocrina visceral se selecciona del grupo que consiste de deficiencia de insulina, diabetes melitus asociada con deficiencia de insulina, deficiencia de testosterona, anemia, hipoglucemia, hipergiucemia, deficiencia pancreática, deficiencia adrenal y anormalidad de la tiroides.

20. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el trastorno neural es enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Jacob Kreutzfeld, enfermedades de Lou Gehrig, y enfermedad de Huntington.

21. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la enfermedad de la piel es el envejecimiento acelerado o una herida.

22. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la enfermedad neoplásica es el cáncer.

23. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el cáncer es uno seleccionado del grupo que consiste de carcinoma de células escamosas, carcinoma ductal y lobular de mama, carcinoma hepatocelular, carcinoma nasofaríngeo, cáncer de pulmón, cáncer de huesos, cáncer pancreático, cáncer de piel, cáncer de la cabeza o cuello, melanoma maligno cutáneo o intraocular, cáncer uterino, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de la región anal, cáncer de estómago, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer testicular, cáncer uterino, carcinoma de los tubos falopianos, carcinoma del endometrio, carcinoma el cervix, carcinoma de la vagina, carcinoma de la vulva, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, cáncer del esófago, cáncer del intestino delgado, cáncer del sistema endocrino, cáncer de la glándula tiroides, cáncer de la glándula paratiroidea, cáncer de las glándulas adrenales, sarcoma de tejido suave, cáncer de la uretra, cáncer del pene, cáncer de próstata, leucemias crónicas agudas, tumores sólidos de la niñez, linfoma linfocítico, cáncer de vejiga, cáncer de riñon o del uréter, cáncer de células renales, carcinoma de la pelvis renal, neoplasma del sistema nervioso central (CNS) , linfoma del CNS primario, angiogénesis tumoral, tumor del eje espinal, glioma del tallo cerebral, adenoma de pituitaria, sarcoma de Kaposi, cáncer epidermoide o cualquier combinación de tales cánceres, incluyendo formas diseminadas (en metástasis) .

24. El uso de una célula madre/progenitora de conformidad con la reivindicación 11, para la producción de una molécula biológica.

25. El uso de conformidad con la reivindicación 24, en donde la molécula biológica se selecciona del grupo que consiste de una proteína, un péptido, una molécula orgánica pequeña, un oligosacárido, un polisacárido, un proteoglicano y un lípido.

26. El uso de una célula madre/progenitora de conformidad con la reivindicación 11, como capa alimentadora en el cultivo de células de mamífero.

27. Un método de cultivo de células madre/progenitoras, de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque comprende: obtener un explante tisular de la membrana amniótica del cordón umbilical; cultivar el explante tisular en medios de cultivo adecuados y condiciones de cultivo adecuadas en un periodo adecuado de tiempo.

28. El método de tratamiento de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque comprende la exposición del explante tisular a medio de cultivo fresco y continuando el cultivo bajo condiciones adecuadas en un periodo adecuado de tiempo.

29. El uso de medios de cultivo de células, libres de suero, para cultivar células madre mesenquimales obtenidas mediante un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.