CN112322580A - 一种间充质干细胞无血清培养基的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了间充质干细胞无血清培养基的应用，包含基础培养基和添加在基础培养基中的添加成分，所述添加成分包括L‑谷氨酰胺、非必须氨基酸、L‑抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、乙醇胺、氢化可的松、胰蛋白酶抑制剂、人转铁蛋白、人胰岛素、bFGF、TGF‑β1和PDGF‑BB，该培养基克服了现有技术中无血清培养基存在的细胞贴壁性差，组分相对复杂，不支持原代细胞培养等问题。

Description

一种间充质干细胞无血清培养基的应用
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及到一种间充质干细胞无血清培 养基。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一类来源于中胚层的成 体干细胞，具有自我更新、多向分化的潜能以及低免疫原性。在体外，间充 质干细胞可以诱导分化为上皮、骨、软骨、脂肪、神经、心脏等多种组织细 胞，具有促进血管形成、保护神经和细胞替代治疗作用。在临床造血支持、 促进干细胞植入和免疫调控等方面，间充质干细胞也具有潜在的临床应用前 景。
虽然间充质干细胞来源比较丰富，如脂肪、脐血、脐带、胎盘等组织均 可作为其来源，但间充质干细胞是成体干细胞，在体内原始浓度很少，为了 满足临床治疗的应用，需要在体外进行快速扩增培养，同时还需保持多向分 化潜能和未分化状态，即非分化性增殖成为间充质干细胞进入临床阶段亟待 解决的问题。
目前，体外扩增间充质干细胞最常使用的培养基大都含一定浓度的胎牛 血清(FBS)。但是，FBS属异种蛋白，成分比较复杂，在临床应用上存在潜 在风险。一些临床研究使用人血清或血清衍生物来代替FBS培养间充质干细 胞，这些成份虽然来源于人不会引起异种蛋白的免疫，但这些人源成分化学 成分不明确，不利用进行间充质干细胞的深入研究，而且目前人血清、血小 板资源来源少，对间充质干细胞大规模扩增有一定局限性。因此，发展无血 清培养基是干细胞走向临床应用的必然趋势。
目前市场上提出了些无血清培养基，其主要由基础培养基和取代血清的 添加剂成分组成。但现有技术中的无血清培养基存在细胞贴壁性差，组分相 对复杂，不支持原代细胞培养等问题。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理 解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术 人员所公知的现有技术。
发明内容
为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种间充质干细胞无 血清培养基，该培养基克服了现有技术中无血清培养基存在的不能有效维持 间充质干细胞的分化潜能，组分相对复杂，不支持原代细胞培养等问题。
为实现上述目的，本发明提供了一种无血清培养基，包含基础培养基和 添加在基础培养基中的添加成分，其中所述添加成分包括L-谷氨酰胺、非必 须氨基酸、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、乙醇胺、氢化可的松、胰蛋 白酶抑制剂、人转铁蛋白、人胰岛素、bFGF、TGF-β1和PDGF-BB。
其中，L-谷氨酰胺：是一种必需氨基酸，也是培养基的主要成分，作为 间充质干细胞增殖的主要能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。
非必须氨基酸：含7种细胞培养所需非必需氨基酸，能有效改善细胞培 养基配比。降低间充质干细胞培养时细胞自身生产非必须氨基酸的副作用。
L-抗坏血酸：是体内一种重要的辅酶和抗氧化剂,可参与细胞内呼吸链作 用，从而有利于细胞的完整存活和生长发育。最新研究表明抗坏血酸与许多 生长因子有协同作用，可显著增加其它生长因子对间充质干细胞的增殖效应。
亚硒酸钠：是无血清培养基的配方常含有抗氧化剂，硒是谷胱甘肽产生 的合作因子，促进过氧化物和超氧化化的水解，在代谢解毒中起重要作用。 过氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培养基中的过氧化物和超氧化物的累 积。
纤连蛋白：是细胞外基质的粘着糖蛋白，能使用细胞和细胞外基质互相 粘连，铆钉细胞，同时又介到细胞运动迁移。
乙醇胺：可参与精胺合成，精胺与亚精胺都存在于大多数细胞中，促进 细胞增殖的重要物质，使DNA分子具有更大的稳定性与柔韧性，是细胞培养 基中重要组分之一。
氢化可的松：是由肾上腺外皮质层分泌的一种原发性糖皮质激素，主要 功能在于通过糖异生作用增加血糖水平；以及促进脂肪，蛋白质和碳水化合 物的代谢活动。
胰蛋白酶抑制剂：是抗蛋白酶成分，起到中和作用，可以终止传代过程 中胰蛋白酶的消化作用。
人转铁蛋白：能结合铁离子，减少基对细胞毒性，并及时被干细胞利用， 促进细胞生长。
人胰岛素：促进细胞利用葡萄糖和氨基酸，对间充质干细胞中糖代谢、 脂肪代谢和蛋白代谢起着关键调节作用,对间充质干细胞的增殖和存活起到促 进作用。
bFGF：为一种多肽类生长因子,具有多种生物活性,能刺激大量中胚层和神 经外胚层来源细胞的生长,是一种有效的有丝分裂原和分化抑制因子，bFGF 可促进间充质干细胞增殖并增强间充质干细胞的多向分化潜能。
TGF-β1:可增强间充质干细胞增殖和分化能力。
PDGF-BB:是一种重要的促有丝分裂因子，具有酪氨酸蛋白激酶活性， 可调控细胞的生命活动，可刺激间充质干细胞分裂、增殖等能力。
上述无血清培养基在另一种实施方式中，所述基础培养基为DMEM/F12 培养基。
上述无血清培养基在另一种实施方式中，所述L-谷氨酰胺的浓度为 1-5mM，非必须氨基酸的浓度为1-5mM，L-抗坏血酸的浓度为32-80mg/L， 亚硒酸钠的浓度为7-20ug/L，纤连蛋白的浓度为5-50mg/L，乙醇胺的浓度为 1-5mg/L，氢化可的松的浓度为5-20mg/L，胰蛋白酶抑制剂的浓度为1-2mg/L， 人转铁蛋白的浓度为5-20mg/L，人胰岛素的浓度为10-30mg/L，bFGF的浓度 为10-30ug/L，TGF-β1的浓度为1-10ug/L，PDGF-BB的浓度为1-20ug/L。
上述无血清培养基在另一种实施方式中，所述L-谷氨酰胺的浓度为 1-2mM，非必须氨基酸的浓度为1-2mM，L-抗坏血酸的浓度为40-60mg/L， 亚硒酸钠的浓度为10-18ug/L，纤连蛋白的浓度为15-30mg/L，乙醇胺的浓度 为1-4mg/L，氢化可的松的浓度为7-15mg/L，胰蛋白酶抑制剂的浓度为 1-1.5mg/L，人转铁蛋白的浓度为7-15mg/L，人胰岛素的浓度为10-15mg/L， bFGF的浓度为20-30ug/L，TGF-β1的浓度为3-7ug/L，PDGF-BB的浓度为 7-15ug/L。
上述无血清培养基在另一种实施方式中，所述L-谷氨酰胺的浓度为1mM， 非必须氨基酸的浓度为1mM，L-抗坏血酸的浓度为58mg/L，亚硒酸钠的浓度 为14ug/L，纤连蛋白的浓度为25mg/L，乙醇胺的浓度为3mg/L，氢化可的松 的浓度为10mg/L，胰蛋白酶抑制剂的浓度为1mg/L，人转铁蛋白的浓度为 10mg/L，人胰岛素的浓度为10mg/L，bFGF的浓度为20ug/L，TGF-β1的浓度 为5ug/L，PDGF-BB的浓度为10ug/L。
上述无血清培养基在另一种实施方式中，添加成分还包含辅酶A、丙酮 酸钠和EGF中的至少一种。
其中，辅酶A：是乙酰化反应的辅酶，对糖、脂肪和蛋白质的代谢起着 重要作用。
EGF:是人体内的一种活性物质，由53个氨基组成的活细胞，其作用机 制为EGF与EGF受体结合刺激细胞(包括多种组织来源的上皮细胞、各种间 质细胞)进入细胞分裂周期,参与调控细胞内一系列活动,作用于各种组织对调 节细胞生长、增殖和分化起着重要作用胞。其最大特点是能够促进间充质干 细胞的增殖分化。
上述无血清培养基在另一种实施方式中，辅酶A的浓度为80-120mg/L， 丙酮酸钠的浓度为1-5mM，EGF的浓度为5-20ug/L。
上述无血清培养基在另一种实施方式中，辅酶A的浓度为100mg/L，丙 酮酸钠的浓度为1mM，EGF的浓度为10ug/L。
上述无血清培养基在另一种实施方式中，所述无血清培养基的pH值为 7.2-7.4，渗透压为260-320mosm，内毒素为0-0.5EU/mL。
本发明还提供了一种上述无血清培养基在间充质干细胞培养中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本培养基加入了L-抗坏血酸、亚硒酸钠、人转铁蛋白、人胰岛素、bFGF、 TGF-β1、PDGF-BB、EGF，可以替代胎牛血清培养间充质干细胞；
2.本培养基含纤连蛋白可以很好促进细胞贴壁生长；
3.本培养基加入组分简单，基础培养基与添加成分可以体外扩增质充质 干细胞具有较长时间增殖能力，且可以长时期维持间充质干细胞主要生物特 性、分化能力及免疫调节功能；
4.本发明的添加成分明确，有利于研究细胞的生理调节机制；
5.在培养间充质干细胞过程中无需进行细胞培养瓶的包被处理；
6.本发明培养基各组分浓度均通过实验优化最佳浓度，适合原代细胞培 养。
附图说明
图1是根据本发明的间充质干细胞无血清培养基培养原代分离脐带间充 质干细胞第12天时细胞从组织爬出形态。
图2是根据本发明的间充质干细胞无血清培养基扩增培养的P2和P7代 人间充质干细胞形态，其中图2-a为P2代人脐带间充质干的细胞形态，图2-b 为P7代人脐带间充质干细胞形态。
图3是根据本发明的三种不同培养基培养P4代人脐带间充质干细胞增殖 曲线图。
图4-a是根据本发明的间充质干细胞无血清培养基培养的P3代人脐带间 充质干细胞表面抗原表达水平。
图4-b是根据本发明的间充质干细胞无血清培养基培养的P7代人脐带间 充质干细胞表面抗原表达水平。
图5是根据本发明的间充质干细胞无血清培养培养的P4代人脐带间充质 干细胞成脂诱导分化染色结果。
图6是根据本发明的间充质干细胞无血清培养培养的P4代人脐带间充质 干细胞成骨诱导分化染色结图；
图7是根据本发明的间充质干细胞无血清培养培养的P4代人脐带间充质 干细胞成软骨诱导分化染色结果。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本 发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
实施例1:间充质干细胞无血清培养基的配制
本实施例提供了一种间充质干细胞无血清培养基，以DMEM/F12为基础 培养基，向基础培养基添加以下成分：
Figure BDA0002670016860000061
Figure BDA0002670016860000071
本实施例中使用的细胞培养试剂和细胞因子生产厂家及货号见下表：
Figure BDA0002670016860000072
Figure BDA0002670016860000081
调整培养基各参数如下：
PH：7.2-7.4
渗透压：260-320mosm
细菌、真菌检测：阴性
衣原体、支原体检测：阴性
内毒素：0-0.5EU/mL
上述配好的完全培养基用0.22um的滤器过滤除菌，-20℃避光保存。
实施例2:人脐带间充质干细胞制备
分别用下述三组培养基分离原代培养：
(1)组一：本发明实施例1的间充质干细胞无血清培养基；
(2)组二：传统含血清培养基(DMEM/F12+10％FBS)；
(3)组三：人间充质干细胞无血清培养基(产家LONZA，货号00190632)。
实验步骤：
(1)在无菌条件下收集健康新生儿脐带(含产妇体检抽血检测结果)， 两端丝线结扎，浸泡于含2％双抗(青链霉素混合液)的保存瓶中。
(2)从生物安全柜内取出脐带，用75％医用酒精消毒脐带表面30-40s， 剪开两端结扎丝线，用含1％双抗的生理盐水反复冲洗以除去其表面附着的血 液。
(3)剔除脐带内部包裹的血管后，使用组织镊撕取脐带基质组织(华通 胶)浸泡于含1％双抗的生理盐水中。
(4)将脐带组织剪碎为约3mm3大小的组织块，装入50mL离心管。离 心去除上层液体，掰断10mL移液管头，吸取组织块至6个T75瓶底(分为 三组，每组2瓶)，分别加入上述三组培养基置于37℃，5％CO2培养箱内 进行原代培养。
(5)第二天将三组分别补充培养基到10mL，以后每3-4天换液1次。 通过组织块贴壁法12-14天后于组织块间隙可见散在分布的纺锤型细胞， 16-18天左右可达80％融合，图1即为采用本发明实施例1的间充质干细胞无 血清培养基培养原代分离脐带间充质干细胞第12天时细胞从组织爬出形态。
(6)当细胞融合到80％时，用0.25％胰酶消化传代。在显微镜下观察， 一旦胞质回缩则加培养液终止消化，将细胞悬液以1200r/min离心5min，用 生理盐水洗涤1次，原代以1：2的比例进行再次接种培养，记为P1代。P2 代以后按1：5或1：6的比例传代直至贴壁细胞彼此融合，铺满瓶底为止再 重复上述操作，其中图2-a为采用本发明实施例1的间充质干细胞无血清培养 基培养P2代人脐带间充质干细胞的细胞形态，图2-b为采用本发明实施例1的间充质干细胞无血清培养基培养P7代人脐带间充质干细胞的细胞形态。
实施例3:三组培养脐带间充质干细胞增殖能力对比
实验步骤：分别取实施例2中三组培养基培养生长良好的P3人脐带间充 质干细胞，酶解制成单细胞悬液，调整浓度至2.4x 104个/mL，加入12孔板， 分别加入对应三组培养基，每孔1mL，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，从 第2天开始每隔一天分别取各组三孔计算细胞量，求其平均值，连续测8天， 以培养时间为横轴，细胞增殖总数为纵轴绘制细胞生长曲线。如图3所示。
从图3可以看出，采用本发明实施例1的培养基培养间充质干细胞时， 细胞增值速度明显优于传统含血清培养基和人间充质干细胞无血清培养基。
实施例4:本发明培养基培养脐带间充质干细胞表面标记分析鉴定
实验步骤：分别取用本发明培养基培养脐带间充质干细胞P3和P7，去掉 培养液，PBS洗涤1次，用0.05％胰蛋白酶消化收集细胞，调整细胞浓度，制 成浓度为2x 105个/100uL的单细胞悬液，其中，图4-a是根据本发明的间充 质干细胞无血清培养基培养的P3代人脐带间充质干细胞表面抗原表达水平。 图4-b是根据本发明的间充质干细胞无血清培养基培养的P7代人脐带间充质 干细胞表面抗原表达水平。分别加入10uL CD105、CD90、CD73、CD34、 CD45、HLA-DR抗体，混匀，避光孵育30min，用PBS洗涤1次，1200r/min 离心5min，用500uL的PBS重悬浮细胞，然后上流式细胞仪检测，检测结果 如下表：
Figure BDA0002670016860000101
从表中可以看出，用本发明实施例1的无血清培养基培养的脐带间充质 干细胞不论是经过3次还是7次传代培养，都能够很好的保证脐带间充质干 细胞的生物特性不变，且阳性率高于95％，阴性率低于0.1％，说明本发明的 培养基获得的间充质干细胞纯度高，质量好。
实施例5:诱导脐带间充质干细胞成脂分化鉴定
诱导脐带间充质干细胞成脂分化培养基如下：
成脂诱导培养基：DMEM(高糖)+10％FBS+1umol/L地塞米松 +0.5mmol/L IBMX+0.2mmol/L吲哚美辛+10μg/mL胰岛素
实验步骤：用本发明实施例1的培养基培养P4代后的脐带间充质干细胞， 以1×105个/孔接种到6孔板中，待细胞达到70％汇合时更换培养基为成脂 诱导培养基。每3天换液，诱导14天后用油红染色定性观察体外诱导分化结 果。
其中，红油O储存液制备方法如下：称取0.25g油红干粉，溶于50mL 异丙醇中，配成0.5％油红O储存液，闭光保存。油红O储存液的工作浓度为， 油红O：去离子水＝3：2，用0.22um针头滤器过滤。将细胞弃去原培养液， PBS漂洗1遍后使用4％多聚甲醛固定30min，弃去多聚甲醛，用PBS漂洗2 次后加入工作浓度油红O覆盖住板底，染色20min，用75％乙醇漂洗一次再 用PBS多次洗涤，显微镜观察。成脂诱导分化结果如图5所示。
图5结果显示脂肪诱导分化14天后出现了大量的脂滴，油红O染色后细 胞内出现大量红染颗粒。实验表明，本发明的培养基培养脐带间充质干细胞 具有向脂肪诱导分化的能力。
实施例6:诱导脐带间充质干细胞成骨诱导分化鉴定
诱导脐带间充质干细胞成骨分化培养基如下：
成骨诱导培养基：DMEM(高糖)+10％FBS+10nmol/Lβ-甘油磷酸钠+ 1×10-8mol/L地塞米松+50mg/L维生素C
实验步骤：用本发明实施例1的培养基培养P4代后的脐带间充质干细胞， 以5x104个/孔接种到6孔板中，待细胞达到50％汇合时更换培养基为成骨 诱导培养基。每3天换液，诱导21天后，用4％多聚甲醛固定30min，茜素红 -Tris-HCl(PH 8.3)染色20min，蒸馏水冲洗后显微镜观察外钙基质沉积。结 果如图6所示。
观察结果显示，成骨诱导第10天后，在相差显微镜下可观察到脐带间充 质干细胞体积开始增大，形态由梭形逐渐变为不规则形态，具有钙化的趋势。 图6显示诱导第21天，经茜素红染色鉴定可发现成骨细胞内布满被红染颗粒。 实验表明，本发明的培养基培养脐带间充质干细胞具有向骨细胞诱导分化的 能力。
实施例7:诱导脐带间充质干细胞成软骨诱导分化鉴定
诱导脐带间充质干细胞成软骨分化培养基如下：
成软骨诱导培养基：DMEM(高糖)+5mg/L胰岛素+0.1umol/L地塞米 松+50mg/L维生素C+10ng/mL TGF-B1
实验步骤：用本发明实施例1的培养基培养P4代后的脐带间充质干细胞， 以1x106个/mL接种15mL到离心管中，150g/min离心5min，弃上清，加入 成软骨诱导培养基。每3天换液，诱导21天后，石蜡切片后进行阿尔辛蓝染 色，用显微镜观察结果。结果如图7所示。
如图7结果显示成软骨诱导21天后，石蜡切片后进行阿尔辛蓝染色结果 呈阳性反应。实验本发明的培养基培养脐带间充质干细胞具有向软骨诱导分 化的能力。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。 这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述 教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在 于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实 现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。 本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (3)

1.一种间充质干细胞无血清培养基的应用，其特征在于，所述应用为在间充质干细胞培养中的应用；
所述无血清培养基由基础培养基和添加在基础培养基中的添加成分组成，所述基础培养基为DMEM/F12培养基，所述添加成分为L-谷氨酰胺、非必须氨基酸、L-抗坏血酸、亚硒酸钠、纤连蛋白、乙醇胺、氢化可的松、胰蛋白酶抑制剂、人转铁蛋白、人胰岛素、bFGF、TGF-β1、PDGF-BB、辅酶A、丙酮酸钠和EGF；
其中，L-谷氨酰胺的浓度为1-2mM，非必须氨基酸的浓度为1-2mM，L-抗坏血酸的浓度为40-60mg/L，亚硒酸钠的浓度为10-18μg/L，纤连蛋白的浓度为15-30mg/L，乙醇胺的浓度为1-4mg/L，氢化可的松的浓度为7-15mg/L，胰蛋白酶抑制剂的浓度为1-1.5mg/L，人转铁蛋白的浓度为7-15mg/L，人胰岛素的浓度为10-15mg/L，bFGF的浓度为20-30μg/L，TGF-β1的浓度为3-7μg/L，PDGF-BB的浓度为7-15μg/L，辅酶A的浓度为80-120mg/L，丙酮酸钠的浓度为1-5mM，EGF的浓度为5-20μg/L。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，L-谷氨酰胺的浓度为1mM，非必须氨基酸的浓度为1mM，L-抗坏血酸的浓度为58mg/L，亚硒酸钠的浓度为14μg/L，纤连蛋白的浓度为25mg/L，乙醇胺的浓度为3mg/L，氢化可的松的浓度为10mg/L，胰蛋白酶抑制剂的浓度为1mg/L，人转铁蛋白的浓度为10mg/L，人胰岛素的浓度为10mg/L，bFGF的浓度为20μg/L，TGF-β1的浓度为5μg/L，PDGF-BB的浓度为10μg/L，辅酶A的浓度为100mg/L，丙酮酸钠的浓度为1mM，EGF的浓度为10μg/L。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的应用，其特征在于，所述无血清培养基的pH值为7.2-7.4，渗透压为260-320mosm，内毒素为0-0.5EU/mL。
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