CN113817674A - 一种适用于宫血干细胞高效扩增的培养基及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适用于宫血干细胞高效扩增的培养基及应用，所述培养基由基础液和添加物组成，基础液为DMEM/F12，添加物包含：UltraGROTM1.5‑6％(V/V)，胰岛素转铁蛋白硒10‑16ug/ml，抗坏血酸120‑180ug/ml，丙酮酸钠0.1‑0.3umol/ml，非必需氨基酸10‑12mmol/ml，亚油酸4‑10ug/ml，干细胞外泌体2‑8ug/ml，EX‑CELL糖基化调节剂(V/V)0.5‑2％，人纤维连接蛋白0.060‑0.120ug/ml。本培养基成分明确，不含血清和异源动物成分，通过干细胞外泌体替代外源重组因子，明显降低细胞的传代周期，提升宫血干细胞的体外扩增效率。

Description

一种适用于宫血干细胞高效扩增的培养基及应用
技术领域
本发明涉及一种适用于宫血干细胞高效扩增的培养基及应用，具体为干细胞培养技术领域。
背景技术
宫血干细胞是一种从女性月经血中分离获得的成体干细胞，它主要分布于子宫内膜功能层和基质层的血管外周围，随着子宫内膜周期性的脱落而排出体外。宫血干细胞在体外特定诱导条件下可定向分化为骨、软骨、脂肪、神经、肝、心肌等多种组织细胞，因其取材简单、无创伤、来源广泛、较强的分化潜能和自我更新能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。
现有的细胞培养基在培养过程一般加入血清或高浓度的血清替代物和多种外源重组细胞因子等维持干细胞的体外增殖，但随着细胞传代的增多细胞增长速度减慢，细胞表型不稳定，形态不均一。
发明内容
本发明的目的在于获得足够数量且安全的适用于临床研究的宫血干细胞，提供了一种适用于宫血干细胞高效扩增的培养基，该培养基可以连续将宫血干细胞扩增30代以上，细胞的形态均一、增殖周期稳定和表型稳定，有效地解决现有培养基不适合宫血干细胞的技术缺陷。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种适用于宫血干细胞高效扩增的培养基由基础液和添加物组成，所述基础液为DMEM/F12，所述添加物包含：UltraGROTM1.5-6％(V/V)，胰岛素转铁蛋白硒10-16ug/ml，抗坏血酸120-180ug/ml，丙酮酸钠0.1-0.3umol/ml，非必需氨基酸10-12mmol/ml，亚油酸4-10ug/ml，干细胞外泌体2-8ug/ml，EX-CELL糖基化调节剂(V/V)0.5-2％，人纤维连接蛋白0.060-0.120ug/ml；
优选的，所述的添加物的最优浓度为UltraGROTM(v/v)4.5％，胰岛素转铁蛋白硒14ug/ml，抗坏血酸160ug/ml，丙酮酸钠0.2umol/ml，非必需氨基酸11mmol/ml，亚油酸8ug/ml，干细胞外泌体6ng/ml，EX-CELL糖基化调节剂(GAL+)(V/V)1.5％，人纤维连接蛋白0.100ug/ml；
优选的，所述的干细胞外泌体的制备方法为：收集P3-P10代无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞培养上清，10000-15000g，离心8-10min，收集上清，将上清液通过分子量为50KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器进行干细胞上清液的浓缩，接着将浓缩液通过分子量为3KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器，收集截留液，纯化3KD-50KD的蛋白质，其中包含PDGF-BB(分子量12-13.5KD)，bFGF(分子量17.2KD)，EGF(分子量6KD)，VEGF(分子量34-46KD)等细胞因子和生长因子，将截留液再经过120000g，离心50-70min，收集底部沉淀，即为干细胞外泌体。
所述的培养基用于宫血干细胞的扩增，能连续将宫血干细胞扩增30代以上，细胞的形态均一、增殖周期稳定和表型稳定。
本发明中胰岛素转铁蛋白硒含有人胰岛素、转铁蛋白及亚硒酸钠，为细胞体外培养提供充足的因子，可降低多种细胞常规维持和低密度贴壁所需的血清度，促进细胞生长。
丙酮酸钠在细胞体外培养中是必需物质，在培养基中起到替代碳源的作用，参与细胞营养代谢。
非必需氨基酸，能有效改善细胞培养基配比，降低细胞培养时细胞自身生产非必需氨基酸的副作用，促进细胞增殖代谢，是细胞培养中常用的添加剂之一。
亚油酸是公认的一种必需脂肪酸，是细胞生长必不可少的成分。
EX-CELL糖基化调节剂是第一种能够快速有效实现N－连接糖基化过程中功能性改变的成品蛋白质补充剂。能够通过增加半乳糖在低聚糖上的占位，从而轻松达到理想的N－连接糖基化目标。
人纤维连接蛋白是一种细胞外大分子非胶原糖蛋白，广泛存在干细胞表面，细胞外液，结缔组织及大部分基底膜上，它对细胞的粘附，生长等生物学行为均能产生影响。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本培养基成分明确，不含血清和异源动物成分，通过干细胞外泌体替代外源重组因子，能够明显降低细胞的传代周期，大大提升宫血干细胞的体外扩增效率，且连续传代30代以上细胞的增殖周期稳定，表型稳定，形态均一，干性保持良好。
附图说明
图1为实施例3中A-F组P5细胞形态图；
图2为实施例3中A-D组P30代细胞形态图；
图3为实施例3中E-F组P10代细胞形态图；
图4为实施例3中C组P5代流式细胞图
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1外泌体的提取
收集P5代无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞培养上清，12000g，离心10min，去除上清液的细胞碎片和杂质，收集上清，将上清液通过分子量为50KD的Vivaflow50回旋流/切向流超滤器进行干细胞上清液的浓缩，去除50KD以上的大分子葡萄糖和蛋白质，接着将浓缩液通过分子量为3KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器，收集截留液，纯化3KD-50KD的蛋白质，其中包含PDGF-BB(12-13.5KD)，bFGF(17.2KD)，EGF(6KD)，VEGF(34-46KD)，等细胞因子和生长因子，将截留液经过120000g，离心50-70min，收集底部沉淀，即为干细胞外泌体，干细胞外泌体经Elisa法测定每ug外泌体中含有PDGF-BB,bFGF，EGF，VEGF的浓度分别为1.5+0.3ng；2.0+0.18ng；3.08+0.1ng；5.15±0.2ng；外泌体中还含有大量的IL-1、IL-4、IL-5、IL-6、IGF、CXCL16、CCL-2\CCL-3和HGF等细胞因子和富含miRNA-125A和miRNA-31用于调节细胞的生长增殖和功能。
实施例2：
首先分离宫血干细胞，分离方法具体步骤如下：使用月亮杯采集女性经期第2-3天的宫血，5-20ml，将采集的宫血放入0.5-1倍体积的含有保存液(0.9％NaCl注射液+2-4％三抗(北京百奥莱博科技有限公司，货号GL0018)+200-400IU/ml肝素锂)的无菌管内，2-8度保存，72h内在无菌环境下按2步分离法分离获得种子细胞，第1步将宫血与红细胞沉降液按体积比2-4：1的比例混合，放入恒温振荡器，50rpm，5min，将混悬液420rpm离心6min，吸取上层液体，第2部将15-25ml上层液体加入到淋巴分离管(厂家深圳达科为，容量50ml,淋巴分离管中的筛板管主要组成成分是聚蔗糖、泛影酸及PP或PE材质筛板)内2000rpm，离心10min，取白膜层，补充生理盐水至50ml，2000rpm，离心8min，弃上清即获得原代种子细胞。
通过细胞计数本方法获得的干细胞回收率高达80％以上，红细胞去除率为90％，将种子细胞加入无血清培养基放入37℃，5％的CO2培养箱培养，培养2h计算细胞的贴壁率，本方法细胞贴壁率在95％以上，见表1。
表1分离方法对干细胞回收的影响
Figure BDA0003270844000000041
Figure BDA0003270844000000051
实施例3
宫血干细胞培养方法：将分离获得的种子细胞以0.5-1×104/ml的密度加入无血清培养基，每3天换液一次，原代培养过程加入1％青链霉素，传代培养过程加入80-100U/ml的庆大霉素。待细胞长至80-90％融合度时对细胞进行连续30次传代，多余细胞冻存，并对第5、10、15、20、25、30代的细胞进行细胞形态观察、数量测定、细胞表型检测。
细胞传代：待细胞达到80-90％融合度，吸掉培养瓶内的培养基，用0.9％的生理盐水洗涤细胞表面1-2次，加入2ml的消化酶，37℃消化1～2min后，显微镜下观察到细胞开始变圆脱落，加入等量培养液终止消化，用移液管吹打细胞，使细胞完全脱落，将脱落的细胞转移到离心管内，1000～1500rpm，离心4～6min，将离心所得的沉淀用无血清培养基重悬，按0.6-1×105/ml的密度接种进行培养
检测：对收集细胞进行流式检测。经流式检测：阳性指标CD44、CD73、CD90、CD105，阴性指标CD34、HLA-DR。
细胞数量通过台盼蓝染色法进行计数。
细胞形态通过olympus的倒置显微镜观察6组实验中，A组、B组、C组、D组采用本发明的干细胞无血清培养基，E组和F组做对照，E组：DMEM/F12作为基础液，加入10％的胎牛血清，10ng/ml的PDGF-BB,10ng/ml bFGF；F组采用的培养基为市售人间充质干细胞无血清培养基作为对照。其中，A组、B组、C组、D组的干细胞无血清培养基由DMEM/F12和添加物构成，添加物含量如表2所示
表2添加物含量表
Figure BDA0003270844000000061
在细胞培养过程中观察细胞生长情况，结果如下：
A组，细胞接种10h后观察到有70-80％的细胞贴壁，细胞圆饼形状，24-72h后细胞呈梭形，开始有细胞分裂，细胞呈梭形，细胞细长，12-15天细胞达到85％以上汇合度，细胞消化后计数后以1.0×104/ml的密度接种在15代以内细胞1：6传代后4-5天可达85％以上汇合度，消化计数每平方厘米可收细胞数量约为6±0.5×104个细胞，而P16-P25细胞的传代周期为5-6天，细胞呈典型的纺锤体型，细胞消化后每平方厘米可收细胞数量分别在：5.3±0.8×104，P26-P30细胞的传代周期为6-7天，细胞消化后每平方厘米可收细胞数量分别在：4.2±0.3×104，随着细胞传代次数的增加细胞的传代周期略有增长，细胞形态呈长梭形略扁。对P5、P10、P15、P20、P25、P30代细胞流式细胞表型检测结果显示,P5、P10、P15代阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥95％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤2％，P20、P25代阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥90％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤5％，P30代阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥85％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤10％，如表4。
B组，细胞接种4h后观察到有80-85％的细胞贴壁，细胞圆饼形状，24-36h后细胞呈梭形，开始有细胞分裂，细胞饱满、折光性强，每3天换液一次，8-12天细胞达到85％以上汇合度，细胞消化后计数后以0.6×105/ml的密度接种在18代以内细胞1：6传代后3-5天可达85％以上汇合度，细胞呈典型的纺锤体型，消化计数每平方厘米可收细胞数量约为7±0.3×104个细胞，而P19-P25细胞的传代周期为4-6天，细胞消化后每平方厘米可收细胞数量分别在：6.1±0.4×104，P26-P30细胞的传代周期为5-6天，细胞消化后每平方厘米可收细胞数量分别在：5.0±0.2×104，随着细胞传代次数的增加细胞的传代周期略有增长，细胞形态呈长梭形略大。对P5、P10、P15、P20、P25、P30代细胞流式细胞表型检测结果显示P5、P10、P15代阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥95％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤2％，P20、P25代阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥95％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤5％，P30代阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥90％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤10％，如表4。
C组，在细胞培养过程中观察细胞生长情况，结果如下：细胞接种2h后观察到有90-95％的细胞贴壁，细胞圆饼形状，24h后细胞呈梭形，开始有细胞分裂，细胞饱满、折光性强，每3天换液一次，6-8天细胞达到85％以上汇合度，细胞消化后计数后以0.5×105/ml的密度接种，连续培养30代，可以观察到30代以内细胞的形态呈典型的梭形或纺锤体型，没有明显变化，细胞传代周期在20代以内为2-3天，细胞消化后每平方厘米可收细胞数量分别在：8.5±1.2×104，而P21-P25细胞的传代周期为3-3.5天，细胞消化后每平方厘米可收细胞数量分别在：6.3±0.8×104，P26-P30细胞的传代周期为4-5天，细胞消化后每平方厘米可收细胞数量分别在：5.2±0.3×104，随着细胞传代次数的增加细胞的传代周期略有增长，对P5、P10、P15、P20、P25、P30代细胞流式细胞表型检测结果显示P5、P10、P15、P20代阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥98％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤2％，P25代阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥95％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤2％，P30代阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥90％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤5％，如表4。
D组，细胞接种2h后观察到有85-95％的细胞贴壁，细胞圆饼形状，24-48h后细胞呈梭形，开始有细胞分裂，每3天换液一次细胞呈梭形，培养过程中可观察到少量神经、内皮细胞，8-10天细胞达到85％以上汇合度，细胞消化后计数后以0.7×105/ml的密度接种，连续培养30代，可以观察到15代以内细胞的形态呈典型的梭形或纺锤体型，没有明显变化，细胞传代周期在15代以内为2-3天，细胞消化后每平方厘米可收细胞数量分别在：7.5±1.2×104，而15代以后细胞形态扁平，折光性弱，P15-P25细胞的传代周期为3-6天，细胞消化后每平方厘米可收细胞数量分别在：5.9±0.8×104，P26-P30细胞的传代周期为5-7天，细胞消化后每平方厘米可收细胞数量分别在：4.8±0.3×104，随着细胞传代次数的增加细胞的传代周期略有增长，对P5、P10、P15、P20、P25、P30代细胞流式细胞表型检测结果显示P5、P10、P15代阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥95％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤2％，P20、P25代阳性指标：CD44、CD90、CD105，阳性率≥90％，CD73阳性率≈88％阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤5％，P30代阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥85％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≈8％，如表4。
E组，细胞接种24h后观察到有75-80％的细胞贴壁，细胞圆饼形状，48h后细胞呈梭形，开始有细胞分裂，每72天换液一次细胞呈扁梭形，15-18天细胞达到85％以上汇合度，细胞消化后计数后以0.8×104/ml的密度接种后，P5代以内4-5天可达85％以上汇合度，消化计数每平方厘米可收细胞数量约为5.8-6.6×104个细胞，连续培养细胞的传代周期为5-8天，连续培养到10代，可以观察到细胞的形态明显变化，细胞开始铺大，核质不清晰，对P5、P10代细胞消化后计数每平方厘米可收细胞数量分别在：6.1×104、4.8×104，对P5、P10代细胞流式细胞表型检测结果显示；P5代细胞：阳性指标：CD90、CD105，阳性率≈90％CD44、CD73≈85％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≈10％；P10代细胞阳性指标：CD90、CD105，阳性率≈85％CD44、CD73≈75％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≈15％,如表4。
F组，细胞接种24h后观察到有85％以上的细胞贴壁，细胞圆饼形状，36-48h后细胞呈梭形，开始有细胞分裂，每3天换液一次细胞呈扁梭形，13-16天细胞达到85％以上汇合度，细胞消化后计数后以0.8×104/ml的密度接种后，P8代以内4-5天可达85％以上汇合度，消化计数每平方厘米可收细胞数量约为6.0-7.3×104个细胞，连续培养细胞的传代周期为5-7天，连续培养到10代，可以观察到细胞的形态明显变化，细胞开始铺大，核质不清晰，对P5、P10代细胞消化后计数每平方厘米可收细胞数量分别在：6.8×104、4.4×104，对P5、P10代细胞流式细胞表型检测结果显示；P5代细胞：阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≥95％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≤5％；P10代细胞：阳性指标：CD44、CD73、CD90、CD105，阳性率≈80％，阴性指标：CD34、HLA-DR，阴性率≈15％,如表4。
其中A-F组P5细胞形态图如图1所示；
A-D组P30代细胞形态图如图2所示；
E-F组P10代细胞形态图如图3所示；
C组P5代流式细胞图如图4所示；
将A-F组细胞生长情况进行汇总如表3所示。
表3A-F组细胞生长情况汇总表
Figure BDA0003270844000000101
流式表型鉴定如表4所示。
表4流式表型鉴定表
Figure BDA0003270844000000102
Figure BDA0003270844000000111
Figure BDA0003270844000000121
由上述结果表明本发明中宫血干细胞分离纯度高，通过本发明的培养基培养后，细胞培养形态典型，具备培养周期短，增殖速度快，细胞表型稳定的优势。
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种适用于宫血干细胞高效扩增的培养基，其特征在于：所述的培养基由基础液和添加物组成，所述基础液为DMEM/F12，所述添加物包含：UltraGROTM1.5-6％(V/V)，胰岛素转铁蛋白硒10-16ug/ml，抗坏血酸120-180ug/ml，丙酮酸钠0.1-0.3umol/ml，非必需氨基酸10-12mmol/ml，亚油酸4-10ug/ml，干细胞外泌体2-8ug/ml，EX-CELL糖基化调节剂(V/V)0.5-2％，人纤维连接蛋白0.060-0.120ug/ml。
2.根据权利要求1所述的一种适用于宫血干细胞高效扩增的培养基，其特征在于：所述的添加物的最优浓度为UltraGROTM(v/v)4.5％，胰岛素转铁蛋白硒14ug/ml，抗坏血酸160ug/ml，丙酮酸钠0.2umol/ml，非必需氨基酸11mmol/ml，亚油酸8ug/ml，干细胞外泌体6ng/ml，EX-CELL糖基化调节剂(V/V)1.5％，人纤维连接蛋白0.100ug/ml。
3.根据权利要求1所述的一种适用于宫血干细胞高效扩增的培养基，其特征在于：所述的干细胞外泌体的制备方法为：收集P3-P10代无血清培养基培养的人脐带间充质干细胞培养上清，10000-15000g，离心8-10min，收集上清，将上清液通过分子量为50KD的Vivaflow50回旋流/切向流超滤器进行干细胞上清液的浓缩，接着将浓缩液通过分子量为3KD的Vivaflow 50回旋流/切向流超滤器，收集截留液，纯化3KD-50KD的蛋白质，其中包含PDGF-BB(分子量12-13.5KD)，bFGF(分子量17.2KD)，EGF(分子量6KD)，VEGF(分子量34-46KD)等细胞因子和生长因子，将截留液再经过120000g，离心50-70min，收集底部沉淀，即为干细胞外泌体。
4.一种基于权利要求1所述的适用于宫血干细胞高效扩增的培养基的应用，其特征在于：该培养基用于宫血干细胞的扩增，能连续将宫血干细胞扩增30代以上，细胞的形态均一、增殖周期稳定和表型稳定。
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